尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治疗的制作方法

专利名称：尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治疗的制作方法
尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治疗本申请是申请日为2004年11月24日，申请号为200480039029.5 的发明名称是"尼曼-皮克病的基于陪伴分子的治疗，，发明专利申请 的分案申请。发明领域本发明提供一种治疗患酸性鞘磷脂酶缺陷型尼曼-皮克病(即A型 或B型尼曼-皮克病)个体的方法，是通过施用小分子作为与该病相关 的缺陷酸性鞘磷脂酶(ASM)的特异性分子"陪伴分子"。发明背景A型和B型尼曼-皮克病(NPD)是由于酸性鞘磷脂酶(ASM)活性缺 乏，因此鞘磷脂、胆固醇和其他脂类在患病个体的细胞和组织内积累 而引起的溶酶体贮积症(LSD) (Schuchman和Desnick, Niemann-Pick disease types A and B: acid sphingomyelinase deficiencies. In: The metabolic and molecular bases of inherited disease. Schriver CR， Beaudet AL， Valle D, Sly WS编著；New York. McGraw Hill Inc 3589-3610 2001)。 A型NPD患者通常在婴儿期早期被诊断为器官巨大症，接着 发生快速的神经变性过程，到大约3岁时导致死亡。相反，B型NPD 患者极少或者没有中枢神经系统累及，通常存活至成年期。但是，B 型NPD在临床上是不均一的，可能出现多种检查结果，包括肝脾大、 生长迟緩、频发呼吸道感染、疲劳和血液学异常，如高LDL胆固醇 和甘油三酯、低HDL胆固醇和低血小板。另外，已经报道几名B型 NPD患者具有与神经变性相关的中间表型(Elleder和Cihula， Eur J Pediatr 1983; 140:323-328; Elleder等人，J Inherit Metab Dis 1986; 9:357-366)。两种类型的NPD都是在全部人种中发生的，但是报道的大多数A型NPD病例发生在德裔犹太人个体中。相反，B型NPD似乎在北 非、阿拉伯和土耳其人群中更加普遍。迄今为止，已经报道在ASM 基因中有超过70个突变能够引起A型或B型NPD (Simonaro等人，Am J Hum Gen. 2002,71:1413-1419)。其中有少量共同突变预测有特定表 型。例如，在北美和西欧的全部NPD患者的约10-15。/。中发现AR608 突变，其中残基608处的精氨酸缺失(AR608),并且该突变总是与该 疾病的非神经形式(即B型NPD)相关(L evran等人，J Clin Invest. 1991; 88:806-810)。该突变也在北非的约90%的B型NPD患者中发现(Vanier 等人，Hum Genet. 1993;92:325-330)。与AR608突变不同，另外三个突 变，即L302P,其中脯氨酸替换了氨基酸残基302处的亮氨酸，R496L, 其中亮氨酸替换了氨基酸残基496处的精氨酸，和fsP330,其中未成 熟终止密码子被引入氨基酸残基330处的脯氨酸下游，存在于德裔犹 太人群体中90%以上的A型NPD患者中(Levran等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88:3748-3752; Levran等人，Blood. 1992; 80:2081-2087; Levran等人，Hum Mut. 1993;2:317-319)。德裔犹太人群体中这三种突 变的携带频率为约1:80至1:100 (Li等人Am J Hum Genet. 1997; 61 (suppl):A24)。最近，克隆了人ASM基因的三个同种型，并且鉴定了能够可靠 应用于诊断评价德裔犹太人群体中A型和B型NPD杂合体的几个突 变(参见Schuchman等人的美国专利5，773，278和5,686,240)。支持治疗是用于大多数LSD患者的唯一疗法。对于几种LSD, 包括戈谢病、法布里病和I型粘多糖贮积病(MPSI)，已经开发了或者 当前正在开发酶替代疗法(ERT) (Desnick和Schuchman, Nat Rev Genet, 2002; 3:954-966),但是由于这些酶在静脉输注后不能通过血脑屏障， 因此不是用于重度神经累及(例如A型NPD)患者的有效策略。使用小 分子抑制剂来阻止病原性底物合成的底物剥夺疗法(Substrate deprivation therapy)也已经开发或者正在评价用于几种LSD,在欧洲 和美国已经有条件地批准销售用于戈谢病(Butters等人，Philos TransRSocLondB Biol Sci. 2003; 358:927-945)。与ERT相比，这一方法的 一个优点是小分子抑制剂可以通过血脑屏障，从而防止底物在脑中积累。最近开发的另外一种小分子方法称作化学陪伴分子，或活性部位 特异性陪伴分子(ASSC)疗法(Fan等人Nat Med. 1999;5:112-115; Fan, Trends Pharmacol Sci. 2003; 24:355-360)。 ASSC使用低浓度的有效酶 抑制剂来增加特定LSD中突变蛋白的折叠和活性。该方法首先在法 布里病中评价，其中应用oc-半乳糖苷酶A的小分子抑制剂l-脱氧-半 乳糖野尻霉素(DGJ)提高来自法布里病患者的细胞系中的残余oc-半乳 糖苷酶活性(参见Fan等人的美国专利6，274，597)。 Fan等人的美国专 利6，583，158进一步举例说明了用于大量其他溶酶体贮积症，包括戈 谢病和GMl神经节苷脂贮积症的ASSC策略，并且证明了使用有效 竟争性抑制剂作为化学陪伴分子来提高患者细胞中残余酶活'性的这种治疗策略不仅限于法布里病患者，而可以用于多种酶缺陷疾病，特 别是LSD。现在正在开发用于包括戈谢病在内的几种LSD的ASSC疗法， 它与ERT或底物剥夺疗法相比具有几个优点。最重要的是，由于在 ASSC中使用的活性部位抑制剂是引起疾病的酶特异性的，因此这种 疗法针对单一蛋白质和代谢途径，这不同于抑制整个合成途径的底物 剥夺疗法。同底物剥夺疗法一样，用于ASSC的小分子抑制剂具有通 过血脑屏障的能力，因而能够用于治疗神经LSD形式。除了提高与LSD相关的缺陷酶的活性以外，还证明了 ASSC能 够提高相应野生型酶的活性(参见，Fan等人的美国专利6,589,964), 因此能够作为酶替代疗法的共同治疗用于LSD患者。A型NPD是ASSC的一个重要的候选者。首先，所有A型NPD 患者都发展到大约3岁时导致死亡的严重的神经学表型。对于这种疾 病的神经学特征现在还没有治疗方法。但是，使用ASM敲除小鼠模 型的研究已经表明，将残余ASM活性提高最多正常活性的约5%能够 完全防止脑病的发生，并且导致寿命正常，提示低水平的功能性ASM防止了 A型NPD患者的神经变性(Marthe等人，Hum Mol Genet. 2000; 9:1967-1976)。另外，造成大多数德裔犹太人A型NPD患者的这三个 突变中的两个(L302P和R496L)是可能适合ASSC的点突变。另外， 世界上大约15%的B型NPD患者带有至少一个拷贝的AR608突变。 因此，实质上需要这种形式的小分子疗法。发明概述本发明提供一种治疗A型或B型NPD患者的方法，是通过施用 小分子神经酰胺类似物或含磷鞘磷脂或核苷酸类似物作为活性部位 特异性陪伴分子(ASSC)。在一个实施方案中，向在人酸性鞘磷脂酶(ASM)基因中具有 L302P突变的个体施用ASSC。在另一个实施方案中，向在人酸性鞘磷脂酶(ASM)基因中具有 R496L突变的个体施用ASSC。在另一个实施方案中，向具有AR608突变的个体施用ASSC。在另一个实施方案中，该小分子是具有下式的鞘磷脂类似物胸<formula>formula see original document page 17</formula>其中每一个R如果存在则独立任选地是取代的Cwo烷基、卤素、 N02、 CN、 OH、 Cw烷氧基；Ri、 R2和R3独立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3，优选2。在另 一个实施方案中，该小分子是具有下式的鞘磷脂类似物<formula>formula see original document page 17</formula>独立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。在 一 个优选实施方案中，该鞘磷脂类似物具有以下结构<formula>formula see original document page 18</formula>在另外一个实施方案中，该小分子是具有下式的神经酰胺类似物<formula>formula see original document page 18</formula>其中Rn如上所述定义，R7是H或OH, Rs是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基，R9是do-20烷基。在一个特定实施方案中，该ASSC是D-MAPP(见

图1)。 在另外一个实施方案中，该小分子类似物是磷核苷酸类似物，如下風<formula>formula see original document page 18</formula>但是，也包括其他磷核苷酸，例如但不限于腺苷一磷酸、胞苷一 磷酸和腺苷二磷酸。在一个实施方案中，该小分子类似物可以施用作为单一治疗。在另外一个实施方案中，该小分子类似物可以与野生型重组ASM 一起施用作为酶替代治疗。随着施用的替代功能性ASM蛋白的稳定 性提高，内源ASM蛋白的稳定性，因而活性，将同时提高。在另外一个实施方案中，该小分子类似物与编码功能性ASM的 重组载体，即基因治疗一起施用。本发明进一步提供一种提高非哺乳动物宿主细胞产生重组ASM 蛋白的方法，是通过将该宿主细胞在含有本发明的小分子类似物的培 养基中接触。本发明还提供含有该小分子类似物和药物可接受的载体的组合物。本发明进一步提供在药物可接受的载体中含有纯化的ASM蛋白 和如此处所述的小分子类似物陪伴分子的组合物。本发明还提供一种预防或治疗已经诊断为或者在遗传学上易发 展为NPD的受试者的方法，是通过单独施用或与酶替代或基因治疗 联合施用小分子类似物。附图简述图1显示本发明的一个优选ASSC，即D-MAPP的结构。 图2A-D。图2A显示可以在本发明中应用的神经酰胺类似物的结 构，而图2B和2C显示能够用于实施本发明的鞘磷脂类似物的结构。 图2D显示作为NPDASCC候选物的鞘磷脂类似物的一个优选实施方 案的结构。图3显示为ASM的抑制剂和ASSC的一种核苦酸类似物的结构。 图4证明D-MAPP抑制野生型ASM活性的Ki 。具体来说，即D-MAPP对纯ASM的活性的影响图5显示D-MAPP对来自A型NPD个体的细胞中ASM活性的影响。具体来说，即D - MAPP对来自R496L突变纯合的A型NPD患者的皮肤成纤维细胞中残余ASM活性的影响。发明详述本发明部分基于神经酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸类似物作为NPDASSC的应用。当在D-MAPP (5-50微摩尔)存在下将来自含有两个拷 贝R496L突变的A型NPD患者的培养皮肤成纤维细胞温育3天时， 残余ASM活性提高最高达3倍，或者提高至正常值的约3%(从不到 正常值1%的起始活性起，见图5)。类似地，当鞘磷脂类似物与正常 成纤维细胞(20微摩尔)一起培养5天时，正常ASM活性抑制90%, 提示它是ASM的有效的陪伴分子。以前Fan等人(美国专利6,274,597; 6,583,158; 6,589,964;和 6,599,919)所描述的ASSC是葡萄糖和半乳糖的亚胺基糖类似物，它 们是公知的糖普酶抑制剂，与之不同，本发明描述的小分子类似物不 是亚胺基糖。本发明的化合物在约50-100 pM的浓度时抑制ASM。 这也不同于Hannun等人在美国专利5,830,916中所述，该专利公开了 此处所述的一种神经酰胺类似物，即D-MAPP,作为石烕性神经酰胺酶 抑制剂通过抑制神经酰胺酶来提高神经酰胺积累的应用。神经酰胺酶 是一种催化神经酰胺水解为鞘氨醇和脂肪酸的酶。Hannun也披露了 D-MAPP对内源鞘磷脂水平没有作用，反对在全细胞中对鞘磷脂酶(降 解鞘磷脂的酶)的作用。(3-葡糖苷酶， 一种催化芳基和烷基(3-D-葡糖苷 在体外(使用全细胞)水解的糖苷酶，也发现类似的作用缺乏。公开的Dagan等人的美国专利申请2003/0133004也描述了作为 各种脂质相关酶的抑制剂的化合物。该申请描述了几种修饰鞘脂合成 或代谢的化合物。具体地，描述了抑制鞘磷脂合成，从而提高细胞中 神经酰胺的浓度，导致细胞凋亡的鞘磷脂类似物。该申请也涉及使用 这些抑制剂通过抑制鞘磷脂治疗糖脂贮积病，鞘磷脂是在某些LSD 如NPD中积累的病理性脂质。这是底物剥夺或减少的一个例子。该 申请描述的 一种化合物显示抑制酸性和中性鞘磷脂酶。定义如此处所用的，术语"活性部位特异性陪伴分子"(ASSC)是指与蛋白质的活性部位可逆地特异性相互作用，并且增强稳定的分子构象形 成的任何分子，包括蛋白质、肽、核酸、碳水化合物等。如此处所用 的，"活性部位特异性陪伴分子，，不包括细胞ER中存在的内源性普通陪伴分子，如Bip、《丐联接蛋白或4丐网织蛋白，或普通的非特异性化 学陪伴分子，如重水、DMSO或TMAO。才艮据本发明，ASSC是神经 酰胺、鞘磷脂或核苷酸类似物和与ASM相互作用的蛋白质。酸性鞘磷脂酶，或ASM,具有如美国专利6，541，218所述的核苷 酸和氨基酸序列。ASM的氨基酸序列显示在下文的SEQIDNO:l中。 该术语也包括A S M的物种直向同源物和变体。如此处所使用的，术语"活性部位"是指与底物或结合配偶体结 合，并且贡献直接参与形成和打断化学键的氨基酸残基的蛋白质区 域。根据本发明，活性部位包括ASM酶的催化结构域。D-MAPP是指D-赤式-2-(N-肉豆蔻酰氨基)-l-苯基-l-丙醇。 D-MAPP在美国专利5，369，030中描述，并在本文的图1中示出。术语"稳定正确构象"指本发明的化合物诱导突变ASM蛋白的构 象使之与野生型ASM蛋白的构象功能上相同的能力。术语"功能上相 同"意思是构象可能有少量变化(实际上几乎所有蛋白质在其生理学 状态下都显示一定的构象柔性)，但是这种构象柔性不会导致(l)蛋白 质聚集，(2)通过内质网相关的降解途径清除，(3)ASM功能的损害， 和/或(4)不当的细胞内转运。该术语也指野生型或功能性ASM如为 ERT产生的ASM的稳定。术语"野生型活性，，是指ASM在细胞内的正常生理功能。此种功 能性可通过已知的用于确定蛋白质功能性的任何方法测试。某些测试 可以评价ASM的性质，该性质可能对应于或者可能不对应于它的实 际体内功能，但却是蛋白质功能性的聚集替代物，并且野生型在这样 的试验中的行为是本发明的蛋白质折叠拯救技术的可接受的结果。根 据本发明的 一种这样的活性是ASM从内质网向溶酶体的适当转运。术语"功能性ASM蛋白，，是指具有以正确构象折叠的能力，到达 其在细胞中的天然位置，并且具有对鞘磷脂和其他脂质底物的催化活性的ASM蛋白。功能性ASM蛋白包括野生型ASM蛋白(见下文的 定义)，例如SEQIDNO:l所示，和具有野生型活性的ASM蛋白。术语"提高ASM的活性，，意思是稳定突变ASM蛋白的正确构象， 使其成为功能性ASM蛋白(即以正确构象折叠，到达其在细胞中的天 然位置，并且具有对鞘磷脂和其他脂质底物的催化活性)。该术语也 指提高外源施用的ASM蛋白的野生型活性，即通过提高野生型ASM 的稳定性及延长其半寿期，从而延长其活性。术语"ASM的抑制剂，，是指在低于药理学剂量的浓度时，相比其他 酶，包括参与鞘磷脂合成的酶，在抑制ASM上表现出更高选择性的 化合物。抑制剂必须特异性抑制ASM。如此处所用的，抑制剂不包 括可在活性部位结合，但是除了在不利于对个体施用的极高浓度下之 外本身不具有抑制活性的化合物。术语"低于抑制ASM所需的浓度，，是指提高ASM活性而不抑制其 活性的本发明化合物的浓度。根据本发明，该浓度的范围为约5-50如此处所用的，术语"突变ASM蛋白"是指由含有基因突变的基 因翻译而来的ASM,该基因突变导致在ER中正常存在的条件下不会 实现天然构象的改变的蛋白质序列。不能实现这种构象导致ASM降 解，而不是通过蛋白质转运系统中的正常途径转运至溶酶体。在一个实施方案中，用本发明的方法拯救的ASM突变是R496L (SEQIDNO:2),即在密码子核苷酸1487处的G向T的颠换突变。还 不清楚碱性精氨酸替换为疏水性更强的亮氨酸残基是否改变了酶的 催化活性、酶的稳定性，或这两者。在另外一个特定实施方案中，用本发明的方法拯救的ASM突变 是核苷酸905处T向C的转换，这导致脯氨酸替换了亮氨酸(L302P -SEQ ID NO:3)。在另外一个特定实施方案中，用本方法的ASSC拯救的ASM突 变是R608的缺失突变(AR608 - SEQ ID NO:4)。分子生物学定义根据本发明，可以应用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA才支术。这些技术在以下文献中充分描述。参见，例如 Sambrook， Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (在此写为"Sambrook等人，1989") ; DNA Cloning: A Practical Approach,第I巻和第II巻(D. N. Glover编，1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait编，1984); Nucleic Acid Hybridization; B. D. Hames和S. J, Higgins编(1985) ; Transcription And Translation; [B. D. Hames和S. J. Higgins,编(1984); Animal Cell Culture; R. I. Freshney，编(1986); Immobilized Cells And Enzymes; IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel等人(编)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。如此处所用的，术语"分离的，，意思是从正常发现的环境中除去参 考物质。因此，分离的生物材料可以没有细胞成分，即发现或产生该 材料的细胞的成分。对于核酸分子，分离的核酸包括PCR产物、分 离的mRNA、 cDNA或限制性酶切片段。在另外一个实施方案中，分 离的核酸优选从可以发现它的染色体上切下，更优选地不再与非调 节、非编码区连接，或者不再与当在染色体中发现时位于该分离的核 酸分子所含基因的上游或下游的其他基因连接。在另外一个实施方案 中，分离的核酸缺少一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入质 粒、粘粒、人工染色体等中的序列。因此，在一个特定实施方案中， 重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可以与在细胞中相结合的其他 蛋白质或核酸或这两种结合，或者如果是膜结合蛋白，则与细胞膜结 合。在一个特定实施方案中，分离的ASM蛋白是由表达载体表达的 重组ASM蛋白。分离的物质可以但不是必须纯化。如此处所使用的术语"纯化的"指在减少或消除无关材料即污染 物的条件下被分离的材料。例如，纯化的ASM优选地基本上没有在细胞内通常与ASM结合的其他蛋白质或核酸。如此处所使用的术语"基本上没有"在材料的分析测试内容中可以操作性地使用。优选地，基本上不含污染物的纯化的ASM为至少50%的纯度；更优选至少90% 的纯度，更优选至少99%的纯度。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免 疫测定、组成分析、生物学试验和本领域已知的其他方法估计出来。术语"大约"和"近似，，通常指根据测量的性质和精度而定的测量数 量的可接受的误差程度。 一般，误差程度的例子为在给定数值或数值 范围的20%以内，优选在10%以内，更优选在5%以内。或者，并且 尤其是在生物学系统中，术语"大约"和"近似"可指给定数值的一个数 量级内的数值，优选在10倍或5倍以内，更优选在2倍以内。除非 另外声明，此处给出的数字的量是近似的，意思是当未清楚说明时， 术语"大约"或"近似"能够是推断的。术语"宿主细胞，，意思是以任何方式选择、修饰、转化、生长或使 用或操作的任何生物体的任何细胞，用于由该细胞产生物质，例如由 细胞表达人ASM基因，包括DNA或RNA序列，或ASM酶。宿主 细胞可以进一步用于ASSC概念的其他试验的初步评价。"重组DNA 分子"是进行分子生物学操作或改造的DNA分子。在本发明的一个实 施方案中，宿主细胞是成纤维细胞。"基因，，是编码"基因产物"的核苷酸序列。通常，基因产物是蛋白 质。然而，基因产物还可以是细胞内其他类型的分子，例如RNA(例 如tRNA或者rRNA)。为了本发明的目的，基因产物还指在细胞内可 以发现的mRNA序列。如此处所用的，基因是指编码野生型或突变 ASM的核苷酸序列。"野生型ASM基因，，是指编码在体内具有功能性生物活性的ASM 蛋白的核酸序列。野生型ASM核酸序列可含有与已知^^布的序列如 美国专利6,541,218公开的序列不同的核苷酸改变，只要这种改变导 致对生物活性影响很小或没有影响的氨基酸置换。如此处所使用的， 术语"野生型，，也可包括经改造而编码相对于内源或天然蛋白质能够 提高或增强活性的ASM蛋白的ASM核酸序列。"野生型ASM蛋白"是指由野生型基因编码的任何蛋白质，当在 体内表达或导入时该蛋白质具有功能性生物活性。这种功能性可通过 已知的用于确定蛋白质功能性的任何方法测试。术语"表达，，意思是指通过活化与相应ASM基因或DNA序列(即 编码ASM的序列)的转录和翻译有关的细胞功能而允许或导致ASM 基因或DNA序列中的信息变成表现形式，例如产生RNA (例如rRNA 或mRNA)或ASM蛋白。ASM DNA序列由纟田胞表达，形成诸如ASM RNA (例如mRNA或rRNA)或ASM蛋白的"表达产物"。表达产物本 身，例如所得的ASMRNA或蛋白质，也可以称作被细胞"表达的"。术语"转染"或"转化，，意思是指将"外来的"，即外部的或细胞外的 基因、DNA或RNA序列，导入宿主细胞内，以致宿主细胞表达导入 的基因或序列以产生目的物质。在本发明中，该目的物质一般是由所 导入基因或序列编码的RNA,以及由所导入基因或序列编码的酶蛋 白质。所导入的基因或序列还可以称作"克隆的"或"外来的"基因或序 列，可以包括调节或控制序列(例如细胞的遗传机制所使用的起始、 终止、启动子、信号、分泌或其他序列)。基因或序列可包括非功能 性序列或未知功能序列。接受并表达所导入DNA或RNA的宿主细胞已经被"转化，，或"转染，，了，并且是一个"转化体"或"克隆"。导入宿主 细胞的DNA或RNA可以来自于4壬何来源，包括与宿主细胞同一属或 种的细胞或不同属或种的细胞。如此处所用的，转染或转化包括编码 功能性ASM的序列向具有突变内源ASM基因的个体中的导入。术语"载体"、"克隆载体"和"表达载体，，意思是指运载体，通过该 运载体可以将ASM DNA或RNA序列(例如外来基因)导入宿主细胞 从而转化宿主和促进所导入序列的表达(例如转录和翻译)。载体包括 任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病 毒体等，当与适当的控制元件相关联时其能够复制，并且能够在细胞 之间转移ASM基因序列。因此，该术语包括克隆和表达运载体，以 及病毒载体。术语"表达系统，，意思是指在适宜条件下的宿主细胞和相匹配的载体，例如用于表达由载体携带的并已导入宿主细胞的外来DNA所编码的ASM蛋白。常用的表达系统包括大肠杆菌(E. coli)宿主细胞和 质粒载体、昆虫宿主细胞例如Sf9、 Hi5或S2细胞和杆状病毒载体和 表达系统、以及哺乳动物宿主细胞和载体。术语"基因治疗"是指通过外源性施用基因，即ASM基因，改变 内源性基因表达的方法。如此处所使用的，基因治疗还指通过将对应 于缺陷或丢失ASM基因的功能性基因或基因的一部分导入需要的个 体的体细胞或干细胞中而对缺陷ASM基因的替代、或者对丢失的基 因的替代。基因治疗可以通过"来自体内"的方法实现，其中分化的或 体干细胞从个体的身体中取出，然后使用病毒载体作为基因递送工 具，将缺陷基因的正常拷贝导入所移出的细胞内。此外，体内转移是 为了达到治疗的结果，使用广泛的病毒载体、脂质体、蛋白质DNA 复合物或棵DNA,将基因原位直接转移到细胞内。术语"重组蛋白"是指由载体携带的治疗性ASM基因编码的ASM 蛋白(基因产物)。通常，接受载体的细胞会缺乏对应于重组蛋白的内 源性ASM蛋白的表达和/或活性，或者即便存在此种内源性ASM蛋 白的表达，它也是突变型的或者水平十分低。在一个实施方案中，重 组蛋白由细胞在组织培养中产生，用于实验和治疗目的。在另外一个 实施方案中，重组蛋白由载体转化的细胞在体内产生，其中该载体或 含有该载体的细胞已经对受试者施用，即基因治疗。在正常个体即该 蛋白质不缺乏的个体中，重组ASM蛋白和野生型蛋白质可能是区分 不开的。治疗应用本发明进一步提供一种预防或治疗A型和B型NPD的方法，该 方法包括在需要这种治疗的受试者或患者中提高突变ASM酶的表达 或活性，或者提高重组野生型替代ASM酶的活性。"受试者，，或"患者，，是已经发展或者可能发展为NPD的人或动物， 更特别地是哺乳动物，优选啮齿动物或灵长类动物，最优选人类。在一个实施方案中，患者是已经诊断为或者已经确定为由于ASM基因 的遗传突变而使发展NPD的危险性提高的德裔犹太人群体的成员。 在另外一个实施方案中，患者是新斯科舍的法裔加拿大人群体的成 员，北非马格里布地区(突尼斯、摩洛哥、阿尔及利亚)的居民(B型)， 或新墨西哥州南部和科罗拉多州的西班牙裔美国人群体的成员。然 而，尼曼-皮克病是在全部人种中发生的，术语受试者包括世界上患 有NPD或者在遗传学上具有发展NPD的危险的任何人。术语"预防"是指疾病发作的预防，意思是预防性地干预导致疾病 的病理才几制。在本发明上下文中，这种病理机制可以是突变蛋白4斤叠 和ASM表达的提高。术语"治疗"意思是治疗性地干预显示该疾病症状的受试者中疾 病的发展。在本发明的上下文中，这样的症状包括但不限于，例如， 网状内皮溶酶体中鞘磷脂的积累，其导致肝脾大、精神运动性阻滞、 肺异常、进行性神经变性。在一些情况下，治疗将防止由NPD引起 的死亡。如此处所使用的术语"治疗有效量，，意思是足以使突变ASM表达 水平提高例如正常细胞中所见水平的约3-5%,优选约10%，更优选约30%的ASSC (即鞘磷脂、神经酰胺或核苷酸类似物)的量或剂量。 优选地，治疗有效量可以改善或防止受试者ASM活性的临床显著的 缺乏。或者，治疗有效量是足以引起受试者临床重要状况的改善，例 如B型NPD患者中进行性神经变性的改善的量。根据本发明，"治疗有效量，，也指提高而不抑制ASM蛋白活性的 小分子类似物的量，即有效量的提高多于抑制，因此净效果是提高。 该有效量一般处于低于ASM抑制剂的IC5o值的某处，或者低于约 50|uM。提高突变ASM表达或活性的小分子类似物有利地用药物可接受 的载体配制在药物组合物中。在上下文中，小分子类似物是活性成分 或治疗剂。活性成分的浓度或量取决于需要的剂量和如下文所述的施用方案。小分子类似物的合适的剂量范围可包括从约1 mg/kg至约 100mg/kg体重每天。 联合治疗ASSC和蛋白质替代。本发明的药物组合物除了鞘磷脂、神经酰 胺或核苷酸类似物以外还可以含有其他生物活性化合物。例如，在一 个实施方案中，可以在替代治疗的酶输注过程中，在含替代野生型(或 功能性)重组ASM的溶液中施用小分子类似物。蛋白质替代治疗通 过以输注方式外源引入野生型或生物功能蛋白质提高了蛋白质的量。 这种治疗已经开发用于许多遗传病，包括戈谢病和法布里病。野生型酶从重组细胞表达系统(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞-见Desnick等人的美国专利号5,580,757; Selden等人的6,395,884和6,458,574; Calhoun等人的6，461 ，609; Miyamura等人的6,210,666; Selden等人 的6,083,725; Rasmussen等人的6,451,600; Rasmussen等人的 5,236,838;和Ginns等人的5,879,680)、人胎盘或动物奶(见Reuser 等人的美国专利号6,188，045)中纯化。输注后，预期外源ASM酶被组织通过非特异性或受体特异性机 制吸收。通常吸收效率不高，外源蛋白质的循环时间较短(Ioannu等 人，Am. J. Hum. Genet. 2001;68:14-25)。另外，外源ASM在循环中不 稳定，被快速细胞内降解。因此，预期与小分子类似物ASM的ASSC 共施用将提高稳定性并防止外源施用的ASM的降解。在另外一个实施方案中，小分子类似物也可以与重组功能性ASM 蛋白一起施用，但不必在同一组合物中施用。在该实施方案中，替代 ASM蛋白和小分子类似物配制在分别的组合物中。该小分子类似物 和替代ASM可以通过相同的途径施用，例如^争月永输注，或通过不同 的途径施用，例如静脉输注替代蛋白，而经口施用ASSC。ASSC和基因治疗。另外，本发明的小分子类似物组合物可以与 编码野生型或功能性ASM基因的重组载体一起施用，即与基因治疗 联合应用。最近，重组基因治疗方法正在临床上或临床前开发用于溶 酶体jie:积病的治疗，参见，例如美国专利号5,658,567,关于法布里病的重组oc-半乳糖苷酶A治疗；美国专利号5,580,757,关于生物活性 ot-半乳糖苷酶A的克隆和表达为融合蛋白；美国专利号6，066，626, 关于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法；美国专利号6,083,725,关于 转染的表达人oc-半乳糖苷酶A蛋白的人细胞；美国专利号6,335,011, 关于利用重组腺伴随病毒病毒体将DNA递送至肌细胞内治疗溶酶体 贝5积病的方法；Bishop, D. F.等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 1986; 83: 4859-4863; Medin， J.A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:7917-7922; Novo, F. J. ， Gene Therapy 1997; 4:488-492; Ohshima, T. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:2540-2544; Sugimoto Y.等人， Human Gene Therapy 1995; 6:905-915; Sly等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99(9):5760-2; Raben等人，Curr. Mol. Med 2002; 2(2): 145-66; Eto等人，Curr. Mol. Med. 2002; 2 (1):83-9; Vogler等人，Pediatr. Dev. Pathol. 2001; 4 (5):421-33; Barranger等人，Expert Opin. Biol. Ther. 2001; l(5):857-67; Yew等人，Curr. Opin. Mol. Ther. 2001; 3(4): 399-406; Caillaud等人，Biomed. Pha麵cother. 2000; 54 (10):505-12和Ioannu等 人，J. Am. Soc. Nephrol. 2000; ll(8):1542-7。重要的是要指出，除了稳定所表达的ASM酶以外，小分子类似 物还会稳定和增强由于阻止在ER内正确折叠和加工的突变所导致缺 陷的任一内源性突变ASM的表达。制剂和施用短语"药物可接受的，，是指当施用于大多数人时能够生理性耐受 的并且一般不产生变应性或类似的不利反应如嘈杂、头晕等的分子和 组合物。优选地，如此处所使用的，术语"药物可接受的"意思是指联 邦政府或州政府管理局批准的或者美国药典或其他用于动物的并且 更特别地用于人的公认的药典中列出的。术语"载体"指与化合物一起 施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药用载体可以是无菌液 体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、豆 油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液、盐溶液和水溶右旋糖和甘油溶液优选用作载体，特别是用于可注射溶液。适当的药用载体在E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中进行了描述。#4居本发明，本发明的药物组合物，例如D-MAPP,可以肠胃夕卜、 经粘膜，例如经口、经鼻或经直肠或经皮引入。肠胃外途径包括静脉 内、^敖动脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内施用。关于与蛋白质替代的联合治疗，在ASCC与替代ASM酶在同一 组合物中施用的实施方案中，该制剂优选地适合肠胃外施用，包括静 脉内、皮下和腹膜内施用，但是，也包括适合其他施用途径如经口 (例 如包封的酶)、鼻内或经皮的制剂。在一个实施方案中，经皮施用通过脂质体实现。脂双层嚢泡是封 闭的、填充流体的微球体，其主要由具有极性(亲水性)和非极性(亲 脂性)部分的各种分子形成。亲水性部分可含有磷酸基、甘油磷酸基、 羧基、硫酸基、氨基、羟基、胆碱或其他极性基团。亲脂性基团的例 子有饱和或不饱和烃，如烷基、链烯基或其他脂质基团。也可以包含 固醇类(例如月旦固醇)和其他药物可接受的佐剂(包括抗氧化剂如ot-生育酚)以提高嚢泡稳定性或赋予其他需要的特性。脂质体是这样的双层嚢泡中的一个亚类，主要由磷脂分子组成， 该磷脂分子含有两条由脂肪酸链组成的疏水尾。在暴露于水后，这些 分子自发排列，形成球形双层膜，各层中分子的亲脂末端在膜中心会 合，相对的极性末端形成双层膜的各自的内表面和外表面。因此，膜 的每一侧都呈现亲水表面，而膜的内部含有亲脂性介质。这些膜可以 排列为由薄水层隔开的 一 系列的同心球形膜，其排列方式与围绕内水 间隙的洋葱层没有不同。通过施加剪切力可以将这样的多层嚢泡 (MLV)转化为单层嚢泡(UV)。根据本发明的方法使用脂质体递送神经 酰胺和鞘磷脂类似物的优点是脂质体可以通过血脑屏障。由于A型 NPD的特征为鞘磷脂积累引起的神经变性，因此向脑部有效靶向是对 于A型的任何治疗方法的关键。适合注射使用的药物制剂包括无菌水溶液(水溶性时)或分散剂 和用于即时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，形式都必须是无菌的，并且必须是易于注射的流体。其在生产和贮存 条件下必须稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载 体可以是溶剂或分散介质，其中含有例如水、乙醇、多元醇(例如， 丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，它们的适当的混合物，和植物油。 例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的 颗粒大小，和通过应用表面活性剂，可维持适当的流动性。微生物作 用的预防可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟苯甲酸酯、 氯代丁醇、苯酚、山梨酸等。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如 糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明 胶，可实现注射型组合物延长的吸收。无菌注射溶液这样制备，将纯化的ASM酶和小分子类似物以需 要的量掺入合适的溶剂中，需要时含有上述各种其他成分，然后过滤 或最终灭菌。通常，分散剂这样制备，将各种灭菌的活性成分掺入含 有基本分散介质和上述所需其他成分的无菌载体中。在用于制备无菌 注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干 燥技术，它们由事先无菌过滤的溶液产生活性成分加需要的任何其他 成分的粉末。优选地，该制剂含有赋形剂。可包含于制剂中的药物可接受的赋 形剂是緩冲液，如柠檬酸盐緩沖液、磚酸盐緩冲液、乙酸盐緩冲液和 碳酸氢盐緩冲液，氨基酸，尿素，醇，抗坏血酸，磷脂；蛋白质，如血清白蛋白、胶原和明胶；盐，如EDTA或EGTA，和氯化钠；脂质 体；聚乙烯吡咯烷酮；糖，如葡聚糖、甘露醇、山梨醇和丙三醇；丙 二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000, PEG-6000);甘油；甘氨酸或其他 氨基酸；和脂类。用于制剂的緩冲系统包括柠檬酸盐、乙酸盐、碳酸 氢盐和磷酸盐緩沖液。磷酸盐緩冲液是优选实施方案。制剂优选地也含有非离子型去污剂。优选的非离子型去污剂包括 Polysorbate 20、 Polysorbate 80、 Triton X-100、 Triton X-114、 Nonidet P_40、辛基oc-葡糖苷、辛基(3-葡糖苷、Brij 35、 Pluronic和Tween 20。对于ASM酶和小分子ASSC制剂的冻干，酶浓度可以为0.1-10mg/mL。可以向冻千混合物中添加膨胀剂，如甘氨酸、甘露醇、 白蛋白和葡聚糖。另外，也可以向冻千混合物中添加可能的冷冻保护 剂，如二糖、氨基酸和PEG。也可以添加以上列出的任何緩冲液、赋 形剂和去污剂。用于吸入施用的小分子类似物制剂(含有或不含ASM)可以含有 乳糖或其他赋形剂，或者可以是可含有聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆 酸盐或脱氧胆酸盐的水溶液。 一种优选的吸入气雾剂的特征在于具有 小质量密度和大尺寸的粒子。质量密度低于0.4克每立方厘米且平均 直径大于5 nm的粒子将吸入的治疗剂有效递送到全身循环中。这样 的粒子被吸入到肺的深部，逃脱了肺的自然清除^li制，直到吸入的粒 子释放它们的治疗负载(Edwards等人，Science. 1997; 276:1868-1872)。 本发明的替代蛋白质制剂可以以雾化形式施用，例如应用如美国专利 号5，654，007、 5,780,014和5,814,607所述的制备方法和制剂，这些专 利在此引用作为参考。用于鼻内施用的制剂可包括用于以滴鼻剂形式 施用或作为鼻内施用凝胶的油性溶液。通过用皮肤病学可接受的载体，如洗剂、乳膏、软膏或皂剂分散 组合物，可以配制用于向皮肤表面局部施用小分子类似物的制剂。特 别有用的是能够在皮肤上形成膜或层从而局部涂敷并且防止清除的 载体。对于内组织表面的局部施用，组合物可以分散在液体组织粘合 剂或已知能增强组织表面吸收的其他物质中。或者，可以使用组织包 被溶液，如含胶质的制剂。在优选实施方案中，本发明的制剂在方便施用预定剂量的制剂的 装置中以液体或粉末制剂的形式提供；这样的装置的例子包括用于皮 下或肌肉注射的无针注射器，和计量气雾剂递送装置。在其他的例子 中，该制剂可以以适合持续释放的形式供应，例如为了经皮施用而对 皮肤施用的贴剂或敷剂，或者通过用于经粘膜施用的可腐蚀装置。在 以片剂或胶嚢形式经口施用制剂例如D-MAPP或其他小分子类似物 的例子中，该制剂可以在具有可移去的盖子的瓶中或在泡罩包装中提 供。在分开施用小分子类似物或者仅施用ASSC作为单一治疗的实施 方案中，小分子类似物可以是适合任何施用途径的形式，包括但不限 于上述所有形式，例如作为无菌水溶液、鼻吸入、经皮或冻干粉，在 重新配制过程中或之后立即加入替代蛋白质的制剂中，以防止施用前 的体外聚集。此外，在一个优选实施方案中，小分子类似物为了经口 施用可以配制为片剂或胶嚢形式，其通过常规方法用药物可接受的赋 形剂如结合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基曱 基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例 如硬脂酸镁、滑石粉或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸 钠)或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)制备而成。 <吏用本领域已知的方法 可以将片剂进行包衣。用于经口施用小分子类似物的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆 或混悬液的形式，或者可以是在使用前用水或其他适当々某介物进行配 制的干产品。此种液体制剂可以用常失见方法使用药物可接受的添加剂 例如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂 (例如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水媒介物(例如杏仁油、油酯类、乙醇或 分馏植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸曱酯或丙酯或山梨酸)来配 制。制剂还可以包含适当的緩冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于 经口施用的制剂可以适当配制，以荻得活性化合物的控制释放。对于与基因疗法的联合治疗(或者作为单一治疗)，小分子类似 物ASSC可以分开配制，用于例如经口、肠胃外、透皮或经粘膜途径 施用，包括但不限于以上所述。在一个优选实施方案中，小分子类似 物作为通过常规方法用如上所述的药物可接受的赋形剂配制的片剂 或月交嚢经口施用。或者，小分子类似物也可以配制成用于通过注射例 如快速注射或连续输注而进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以与添 加的防腐剂 一起以单位剂量形式存在，例如存在于安瓿或多剂量容器 中。组合物可以采用诸如混悬液、溶液或在油或水々某介物中的乳剂的 形式，并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制试剂。在另 外一个实施方案中，小分子类似物可能是粉末的形式，在使用前用适当的媒介物例如灭菌无热原水进行配制。小分子类似物还可配制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂，例 如它们含有诸如可可脂或其他甘油酯的常规栓剂基质。除了前面所描述的制剂外，小分子类似物还可以制剂成贮库制剂(depot preparation)。这种长岁支制剂可以通过才直入(例如皮下或月几内)或 肌肉注射的方法施用。因此，例如小分子类似物可以与适当的多聚物 或疏水材料(例如可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或作为微 溶的衍生物，例如作为微溶盐。时限。当替代ASM蛋白和小分子类似物在分别的制剂中时，施 用可以同时进行，或者小分子类似物可以在ASM替代蛋白之前或之 后施用。例如，当ASM替代蛋白静脉施用时，小分子类似物可以在 之后的0-6小时内施用。或者，小分子类似物可以在该蛋白质之前0-6 小时施用。在一个优选实施方案中，其中小分子类似物和替代蛋白质分开施 用，并且具有较短的循环半寿期(例如小分子)，该小分子类似物可 以经口连续施用，如每日施用，以维持循环中的恒定水平。这种恒定 水平是已经测定对患者无毒并且在施用期间与靶替代蛋白相互作用 方面是最佳的水平，以提供非抑制性的治疗效果。在另外一个实施方案中，小分子类似物在替代ASM蛋白周转所 需的时间期限内施用(施用小分子类似物将延长这个期限)。无论时限如何，施用都必须使ASM蛋白和小分子类似物的浓度 为使得小分子类似物稳定但不阻止或抑制该蛋白质的体内活性。这也 适用于替代ASM蛋白和小分子类似物在同一制剂中施用的情况。对于小分子类似物和基因治疗联合治疗的时限，根据本发明的小 分子类似物的施用通常在ASM基因递送之后进行，以允许靶细胞/组 织表达重组ASM酶。由于ASM基因的表达会维持一段时间，所以只 要该基因是可表达的，小分子类似物就会作为重组ASM酶的陪伴分 子和稳定剂保持有效。因此，小分子类似物的施用有必要持续与基因 表达相同的时间。在一个优选实施方案中，由于小分子类似物具有短的循环半寿 期，小分子类似物优选连续经口施用，例如每日施用，以维持循环中 的恒定水平。此种恒定水平是已经测定对患者无毒并且在与蛋白质相 互作用方面是最佳的水平，它将是持续产生的，以便产生非抑制性的 治疗效果。根据本发明，在治疗性ASM基因补偿了内源性突变ASM基因不 足的活性的情况下，因为有效量能够提高内源性突变ASM的活性并 且提高治疗性ASM基因产物的效果，因此小分子类似物递送的时限 变得不太重要。对于所施用的ASM基因编码的ASM酶，其ASSC如D-MAPP 的存在有利于提高ER内合成过程中的蛋白质加工效率(即通过防止 聚集)并延长循环中和组织中ASM酶的半寿期，从而能够在较长的时 间阶段内维持有效的水平。这会导致临床上受累组织内的表达增强。 这会给NPD患者带来有益的效果，如更好地緩解、减少治疗次数、 和/或降低所施用ASM基因的量。它也会减少治疗费用。基因治疗。用于与本发明的ASSC联合治疗的ASM核酸可以用 任何已知的方法施用，包括本领域可用的用于基因治疗的方法。于是 经鉴定和分离的基因可以插入到适当的克隆载体中。适宜用于基因治 疗的载体包括病毒，例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘、疱疹病 毒、杆状病毒和逆转录病毒、细小病毒、1曼病毒、噬菌体、粘粒、质 粒、真菌载体和其他在本领域中常用的、已经描述用于在多种真核和 原核宿主中进行表达的、并且可用于基因治疗和简单蛋白质表达的重 组载体。在一个优选实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体，特别是腺 病毒载体，可以和阳离子亲水脂分子，例如阳离子脂类、多聚L-赖氨 酸(PLL)和二乙氨乙基葡聚糖(DELAE-葡聚糖)复合，这些阳离子亲水 脂分子提供了提高的病毒对靶细胞感染的效率(见，例如1997年11 月20日提交的PCT/US97/21496,在此引用作为参考)。用于本发明的 优选的病毒载体包括从牛痘、疱瘆病毒、AAV和逆转录病毒4汙生的载体。特别是疱渗病毒，特别是诸如在美国专利号5,672,344所公开(其 公开内容在此引用作为参考)的单纯疱渗病毒(HSV),对于将转基因递 送进入神经细胞是特别有用的。诸如在美国专利号5,139,941 、 5，252,479和5，753,500和PCT公开W097/09441中(其公开内容在此引 用作为参考)公开的AAV载体也是有用的，因为这些载体整合入宿主 染色体，对重复施用载体具有最低的需求。关于基因治疗中的病毒载 体的综述见Mah等人，Clin. Pharmacokinet. 2002; 41 (12):901-11; Scott 等人，Neuromuscul. Disord. 2002; 12 Suppl 1 :S23-9。此外，见美国 专利号5,670,488。欲被递送的基因的编码序列可以有效地连接于表达控制序列，例 如指导基因表达的启动子。如此处所使用的，短语"有效地连接"，指多 核香酸/基因与核苷酸的调节和效应序列例如启动子、增强子、转录和 翻"^终止位点和其他信号序列的功能性关系。例如，核酸与启动子有 效地连接指多核苷酸和启动子之间的物理性和功能性的关系，以致于 DNA的转录被能够特异性识别和结合到启动子上的RNA聚合酶从启 动子处起始，并且其中该启动子指导着从多核苷酸到RNA的转录。在一个实施方案中，使用了其中编码序列和任何其他需要的序列的侧翼是能够促进在基因组的预期部位进行同源重组的区域的载体， 从而提供了由整合到基因组内的核酸分子表达该构建体(Koller和Smithies, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 1989， 86:8932-8935; Zijlstra等人， Nature 1989, 342:435-438)。在一个特定的实施方案中，载体是直接在体内施用的，此时载体 进入生物体的细胞并且介导构建体的表达。这可以通过本领域公知的 和下面描述的多种方法中的任何方法实现，例如通过将其构建为适当 表达载体的一部分并且对其进行施用以致于使它变成细胞内的，例如 使用缺陷型或减毒逆转录病毒或其他病毒载体进行感染(见，美国专 利号4,980,286)，或者通过直接注射棵DNA,或者使用微粒轰击(例 如基因枪；Biolistic, Dupont),或者用脂类或细胞表面受体或转染试 剂进行包被，用生物聚合物(例如聚-(3-l-64-N-乙酰葡糖胺多糖；见美国专利号5,635，493)进行包封，用脂质体、微颗粒或微胶嚢进行包封； 通过连接到已知将进入细胞核的肽或其他配体上进行施用；或者通过 连接到能够发生受体介导的胞吞作用的配体上而施用(见，例如Wu 和Wu, J. Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432)等等。在另一实施方案中， 可以形成核酸和配体复合物，其中配体含有石皮坏内体的致融合病毒 肽，从而使核酸免受溶酶体的降解，或者含有例如从触角 (antennapedia)来源的、可用于转移治疗性DNA进入细月包的阳离子 12mer肽(Mi等,Mol. Therapy 2000,2:339-47)。在另一个实施方案中， 通过靶向特异的受体可以将核酸在体内进行耙向，用于细胞特异的摄 入和表达(见，例如PCT公开号WO92/06180, WO 92/22635, WO 92/20316和WO 93/14188)。最近， 一种叫做磁性转染的技术已经用 于将载体递送进入哺乳动物。该技术将载体和用于在磁场的影响下进 行递送的超顺磁纳米颗粒进行结合。这种应用缩短了递送时间并且提 高了载体的效果(Scherer等，Gene Therapy 2002;9'. 102-9)。在一个特定实施方案中，核酸可以用脂质载体施用。脂质载体可 以与棵核酸(例如质粒DNA)结合，以利于通过细胞膜。阳离子、 阴离子或中性脂质可以用于此目的。但是，优选阳离子脂质，因为它 们已经表现为更好地与通常带有负电荷的DNA结合。阳离子脂质还 显示能够介导质粒DNA的细胞内递送(Felgner和Ringold， Nature. 1989; 337:387)。已经表明向小鼠内静脉内注射阳离子脂质-质粒复合 物导致DNA在肺中表达(Brigham等人，Am. J. Med. Sci. 1989; 298:278)。参见，Osaka等人，J. Pharm. Sci. 1996; 85 (6):612-618; San 等人，Human Gene Therapy 1993; 4:781-788; Senior等人，Biochemica et Biophysica Acta. 1991; 1070:173-179); Kaba,和Kaba丽, Bioconjugate Chem. 1995; 6:7-20; Liu等人，Pha麵ceut. Res. 1996; 13; Remy 等人，Bioconjugate Chem. 1994; 5:647-654; Behr, J-P" Bioconjugate Chem. 1994; 5:382-389;Wyman等人，Biochem. 1997; 36:3008-3017; Marshall等人的美国专利号5,939,401; Scheule等人的 美国专利号6,331, 524。代表性的阳离子脂质包括例如在美国专利号5,283，85和如美国专 利号5，767,099中公开的那些，其公开内容在此引用作为参考。在一 个优选的实施方案中，阳离子脂质是美国专利号5,767,099中公开的 N4-精胺胆固醇氨基曱酸酯(GL-67)。另外的优选的脂质包括N4-亚精 胺胆固醇氨基曱酸酯(GL-53)和l-(Hr精胺)-2，3-二月桂基甘油氨基曱 酸酯(GL-89;)。优选地，对于病毒载体的体内施用，采用了一种与病毒载体例如 腺病毒载体联合使用的适当的免疫抑制处理，以避免病毒载体和所转 染细胞的免疫失活。例如，可以施用免疫抑制细胞因子，如白介素-12 (IL-12)、干扰素-y (IFN-y)或抗-CD4抗体，以阻断对病毒载体的体液 或细胞免疫应答。考虑到这种情况，采用经过工程改造而表达最小数 量抗原的病毒载体是有利的。剂量有效稳定施用的ASM蛋白和/或内源性ASM突变蛋白的小分子 类似物的量可由本领域纟支术人确定。可以通过^(吏用本领域已知的常*见 方法得到药物代谢动力学和药效动力学数据，如半寿期(tm)、血浆浓 度峰值(Cmax)、达到血浆浓度峰值的时间(t丽)、通过曲线下面积(AUC) 测量的替代ASM蛋白和小分子类似物的接触和组织分布、以及关于 小分子类似物与替代ASM蛋白结合的数据(亲和常数、结合常数和解 离常数和效价)，以确定稳定替代ASM蛋白而不抑制其活性，从而提 供治疗效果的适合的量。通过标准的药学方法，例如细胞培养测定或使用实验动物以确定 LDs。和ED50,可以确定组合物的毒性和治疗效果。参数LDsq和ED50 在本领域是公知的，分别指对群体的50%是致死的和对群体的50% 是治疗上有效的化合物的剂量。毒性和疗效的剂量比称为治疗指数， 并且可以表达为比值LD5。/ED5。。治疗有效量最初可以从细胞培养测 定估计，并且在动物模型中进行公式计算以得到包括ICso在内的循环 浓度范围。化合物的IC5Q浓度是实现症状的半数最大抑制的浓度(例如，像从细胞培养测定中确定的那样)。然后使用此种信息可以更精 确地确定在特定个体例如人类患者中使用的合适剂量。通过诸如高效液相层析(HPLC)或气相层析的4支术可以常少见测定 个体如患者的血浆中的化合物。在任何治疗中所使用的特定剂量会在该范围内有所变化，其变化 依赖于诸如采用的特定剂型、采用的施用途径、个体(例如患者)的情 况等等因素。根据现有的方法，替代ASM蛋白的浓度为0.05-5.0 mg/kg体重， 一般每周或每两周施用。该蛋白质可以在0.1昭/kg至约10mg/kg,优 选约0.1 mg/kg至约2 mg/kg的剂量下施用。例如，为了治疗法布里 病，临床上批准的重组a-Gal A的施用剂量一般为0.1-0.3 mg/kg,每 周或每两周施用。在患者生命中定期重复施用蛋白质是必要的。皮下 注射保持较长时间的对药物的系统接触。皮下剂量优选为每两周或每 周0.1-5.0 mg a- GalA每千克体重。ASM优选静脉施用，例如快速静 脉注射、慢速静脉推注或连续静脉注射。连续静脉输注(例如在2-6 小时内)使血液中保持特定水平。小分子类似物的最佳浓度可以根据稳定组织或循环中体内重组 ASM蛋白但不阻止其活性所需要的量、小分子类似物在组织或循环 中的生物利用度、和小分子类似物在组织和循环中的代谢来决定。例 如，通过计算D-MAPP对ASM的IC5o值确定小分子类似物D-MAPP 的浓度，或者低于50(^M。考虑化合物的生物利用度和代谢，在IC50 值左右或略高于IC5Q值的浓度可以根据对ASM活性的影响进行估计， 例如提高ASM活性或延长替代ASM的ASM活性所需要的小分子类 似物的量。实施例通过下面的实施例对本发明进行进一 步的描述。此种实施例的使 用只是例证性的并且无论如何也不能限制本发明或者任何例证性术 语的范围和意义。同样，本发明不限于任何此处描述的特别优选的实施方案。的确，在阅读本说明书后，本领域的技术人员显然可对本发 明进行许多改变和变化，并且可以在不偏离其精神和范围的情况下进 行。因此本发明仅由后附的权利要求书和权利要求书所赋予的等同物 的全部范围进行限制。
实施例1: D-MAPP对ASM活性的恢复
一种小分子，称作D-MAPP的神经酰胺类似物(结构见图1),作 为用于NPD的可能ASSC进行评价。 材料与方法
D-MAPP获自Matreya (Pleasant Gap, PA,目录号1859)，并且在 乙醇中重新配制为2mM的浓度。
重组ASM。为了确定能够用于陪伴分子ASM的D-MAPP的非抑 制浓度范围，测定纯化的野生型ASM的Ki。通过公开的方法(He等 人，Biochim et Biophys Acta. 1999; 1432:251-264),从过量表达中国仓 鼠卵巢细胞的培养基中纯化重组人ASM(rASM)。简要地说，包括通 过DEAE Sephacel、伴刀豆球蛋白A和Superose 12层析。D-MAPP 获自Matreya Inc (Pleasant Gap, PA目录号1859)。
抑制测定。对于使用纯酶的体外研究， 一份母液在氮气下干燥， 然后重悬浮在含有荧光ASM底物BODIPY鞘磷脂(Molecular Probes, Eugene OR)的乙酸钠緩沖液中。超声处理该溶液，加入一份纯rASM。 底物在试验中的终浓度为100微摩尔(iaM)， D-MAPP的浓度为 10-500|aM。测定如前所述进行(He等人，Biochem. 2003; 314:116-120)。
获得(知情同意)具有两个拷贝R496L突变的A型NPD皮肤成 纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞，并在含有10%热灭活的胎牛血清的 标准组织培养基(DMEM， GIBCO)中培养。向培养基中加入不同浓度 的D-MAPP (5-50pM),将细胞温育不同的时间。在温育结束时，将细 胞用胰蛋白酶消化，用乳胶刮刷收获，用盐水洗涤，重悬浮在10mM Tris緩冲液，pH 7.0中。通过超声处理制备细胞提取物，将碎片超声 处理，如以前所述(He等人，Biochem. 2003; 314:116-120)，利用BODIPY鞘磷脂用上清液测定ASM的活性。
结果
图4显示D-MAPP以约50nM的Ki抑制纯ASM的活性。图5显 示当来自含有两个拷贝R496L突变的A型NPD患者的培养皮肤成纤 维细胞在D-MAPP (5-50 iuM)存在下温育三天时，残余ASM活性^提高 最高达3倍，或者提高至正常值的约3%(从不到正常值1%的起始活 性起)。在约10|liM时发现最大提高，在该浓度时对细胞生长或生存力 没有有害作用。因此，D-MAPP,野生型ASM活性的一种小分子抑 制剂，可以用作NPD治疗的ASSC。
实施例2:新鞘磷脂类似物对ASM活性的恢复 材料与方法
预期当对NPD成纤维细胞施用时，此处所述的鞘磷脂类似物将 提高正常的ASM活性，并且拯救突变ASM的活性，因为这些化合物 是竟争性ASM抑制剂(即，它们减少底物结合——数据未示出)。这样 的鞘磷脂类似物显示在图2B-D中。 一种优选的化合物是图2D所示 的类似物。
重组ASM。如上对于D-MAPP所述测定图2D中鞘磷脂类似物 对于野生型重组ASM的Ki。
成纤维细胞测定。也如以上对于D-MAPP在NPD成纤维细月包中 所述测定正常皮肤成纤维细胞中ASM抑制的Ki。
另外，具有两个拷贝的R496L突变的A型NPD皮肤成纤维细胞 和正常皮肤成纤维细胞在以上对于D-MAPP所述的条件下用约 0.5-50pM的图2B-D所示的鞘磷脂类似物处理5天。
结果
鞘磷脂类似物以约70pM的Kj抑制纯重组ASM的活性，而在 20pM时将正常皮肤成纤维细胞中的ASM抑制大约90%。
预计这些类似物将与以上D-MAPP所示相似地提高野生型活性。 也预计这些类似物将拯救突变成纤维细胞中突变ASM的活性。实施例3:向应用酶替代或基因疗法治疗的尼曼-皮克病小鼠中共
施用小分子类似物
材料与方法与结果
ASM缺乏小鼠(NPD KO小鼠)以前已经产生(Dhami等人，Lab Invest 2001; 81 (7):987-99)。这些小鼠的特征在于至IO周龄时它们的 肺空隙中的细胞数显著高于正常小鼠，主要由增大的和通常多核的巨 噬细胞组成。这些小鼠可以在实验中应用，该实验设计为用来证明无 论单独应用还是与基因疗法或酶替代疗法联合应用，小分子神经酰 胺、鞘磷脂或核苷酸类似物都能用于治疗NPD病。
Genzyme公司以及Transkaryotic Therapies (TKT)已经开发了用于 几种溶酶体贮积病的酶替代疗法。预期向通过输注替代酶进行治疗的 ASM敲除小鼠中共施用D-MAPP或其他神经酰胺、鞘磷脂或磷核苷 酸类似物(即ASSC)，如此处所述的那些，会提高替代酶的体内稳定 性，例如半寿期，因为ASSC稳定了酶并且防止降解。按照以前对于 法布里病KO小鼠所述(Ioannu等人，Am JHum Genet. 2001; 68:14-25) 类似的方案，在输注野生型ASM后向KO小鼠经口施用小分子类似 物。在一段时间之后测定包括心脏、肾脏、脾脏、肝脏和肺在内的多 种组织和血清中的ASM活性，并且将其与没有接受ASCC的对照小 鼠和只接受小分子类似物但没有接受酶的小鼠的活性进行比较。延长 的时间表明共施用ASSC能够提高酶替代疗法的疗效。
向应用基因疗法治疗的ASM KO小鼠中共施用小分子类似物会 提高基因治疗的疗效，因为它显著地提高治疗性基因产物的表达，特 别是通过防止在靶细胞的ER中聚集。遵循基因治疗方案的KO小鼠 接受溶解于饮用水中的如此处所述的D-MAPP或鞘磷脂或核苷酸类 似物，并且在一段时间之后测定包括心脏、肾脏、脾脏、肝脏和肺在 内的多种组织和血清中的小分子类似物活性，并且将其与没有接受小 分子类似物的对照小鼠和接受小分子类似物但没有接受基因治疗的 小鼠的活性进行比较。较高的酶活性和较长的保持时间表明共施用小 分子类似物能够提高基因治疗的疗效。本发明不限于此处描述的特定实施方案的范围。的确，除了此处 所描述的那些，从前面的描述和附图来看，本发明的多种改变对于本 领域技术人员是显而易见的。这些改变处于后附的权利要求书的范围 之内。
专利、专利申请、出版物、程序等等在整个本申请中被引用，其 公开内容在此全部引用作为参考。序列表
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〈210> 1
<211〉 629
<212〉 PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400〉 1
Met Pro Arg 1
Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gin Ser Cys Pro Arg Ser Gly 5 10 15
Arg Glu Gin Gly Gin Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp
20
25 30
Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser
35
40 45
Asp Ser Arg Val Uu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro
50
55 60
Gin Gly His Pro Ala Arg L_eu His Arg lie Val Pro Arg Leu Arg Asp
65
70 75 80
Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro lie Cys Lys Gly Leu Phe
85
90 95
Thr Ala lie Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val
100
105 110
Gly Ser Val Ala lie Lys Leu Cys Asn Uu Uu Lys lie Ala Pro Pro
115
120 125
Ala Val Cys Gin Ser lie Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140
Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu
145
150
155 160
Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp lie Phe Ser Ser Trp Asn lie
165
170 175
Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro
180
185 190
Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg lie Uu Phe Leu Thr Asp Leu His
195
200 205
Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro210215220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly225230235240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr 2& 250 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270Val Tyr Trp Thr Gly Asp lie Pro Ala His Asp Val Trp His Gin Thr 275 280 285Arg Gin Asp Gin Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg290295300Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu305310315320Ser lie Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe lie Glu Gly Asn His 325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala T卬Glu Pro Trp 340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg lie Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu lie Ser Leu Asn Met Asn Phe370375380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu lie Asn Ser Thr Asp Pro Ala385390395400Gly Gin Leu Gin Trp Leu Val Gly Glu Leu Gin Ala Ala Glu Asp Arg 405 410 415Gly Asp Lys Val His lie lie Gly His 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Ala Asp Pro 210 215 220Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly 225 23打 235 240Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cvs Asp Leu Pro Uu Arg Thr 24b 2S0 255Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270Val Tvr Trp Thr Glv Asp lie Pro Ala His Asp Val T卬His Gin Thr '275 280 285Arg Gin 290Asp Gin Leu Arg Ala Leu Thr Thr Vai Thr Ala Pro Val Arg 295 300Lys Phe 305Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn 310 315His Glu320Ser lie Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe lie Glu Gly Asn His 325 330 335Ser Ser Arg Trp Leu Tvr Glu Ala Met Ala Us Ala Trp Glu Pro Trp 340 345 350Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg lie Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365Uu Ser Pro Tvr Pro Gly Leu Arg匕eu lie Ser Leu Asn Met Asn Phe 370 375 380Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu lie Asn Ser Thr Asp Pro Ala 3& 390 395 400Gly Gin Leu Gin Trp Uu Val Gly Glu Uu Gin Ala Ala Glu八sp Arg 405 410 415Gly Asp Lys Val His lie lie Gly His lie Pro Pro Gly His Cys Leu 420 425 430Lys 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1.一种提高酸性鞘磷脂酶(ASM)蛋白质活性的方法，该方法包括将该蛋白质在药物可接受的载体中接触有效量的一种为神经酰胺或鞘磷脂类似物的化合物，或为磷核苷酸类似物的化合物。
2. 权利要求1的方法，其中所述鞘磷脂类似物化合物具有下式I:j问-o-0 r3 其中每一个R如果存在则独立地是任选取代的Cwo烷基、卤素、 N02、 CN、 0H、 Cw烷氧基；R!、 R2和R3独立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5, m是l-3。
3.权利要求1的方法，其中所述鞘磷脂类似物化合物具有下式<formula>formula see original document page 2</formula>其中R!、 R2、 R3和m如上所述定义，R4是Cuj-2o烷基，R5和R 独立地是H、 Cwo烷基、芳基或芳烷基。
4.权利要求1的方法，其中所述神经酰胺类似物化合物具有下式<formula>formula see original document page 2</formula>其中Rn如上所述定义，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cw。烷基、芳基或芳烷基，R9是C^.2。烷基。
5.权利要求4的方法，其中所述化合物是D-MAPP,由以下结构 代表
6.权利要求1的方法，其中所述化合物是具有以下结构的核苷酸 类似物
7. 权利要求1的方法，其中所述ASM蛋白是一种突变ASM蛋白。
8. 权利要求7的方法，其中所述突变蛋白是L!3(^P(SEQIDNO:3) 。
9. 权利要求7的方法，其中所述突变蛋白是R496L(SEQIDNO:2)。
10. 权利要求7的方法，其中所述突变蛋白是AR608 (SEQ ID NO:4) 。
11. 权利要求1的方法，其中所述ASM蛋白是野生型ASM蛋白。
12. 权利要求1的方法，其中所述ASM是全长ASM。
13. 权利要求1的方法，其中所述ASM是具有酶活性的截短的 ASM。
14. 一种延长用于和药学上可接受的载体一起施用于个体的纯化 ASM蛋白的半寿期和活性的方法，该方法包括将ASM蛋白接触有效 量的一种为神经酰胺或鞘磷脂类似物的化合物，或为核苷酸类似物的 化合物，其中所述化合物是ASM的抑制剂。
15. 权利要求14的方法，其中所述化合物是一种鞘磷脂类似物并 且具有下式I:<formula>formula see original document page 4</formula>其中每一个R如果存在则独立地是任选取代的Cwo烷基、卤素、 N02、 CN、 OH、 C"烷氧基；R^、 R2和R3独立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
16.权利要求14的方法，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具有下式n:<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rp R2、 R3和m如上所述定义，R4是Cu)-2o烷基，Rs和R6 独立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。
17.权利要求14的方法，其中所述化合物是神经酰胺类似物并且 具有下式III:其中Rn如上所述定义，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cw。烷基、芳基或芳烷基，R9是d。.2Q垸基。
18.权利要求17的方法，其中所述化合物是D-MAPP，由以下结 构代表<formula>formula see original document page 5</formula>
19.权利要求14的方法，其中所述化合物是具有以下结构的核苷 酸类似物跳<formula>formula see original document page 5</formula>
20. 权利要求14的方法，其中所述ASM蛋白与所述化合物共施
21. 权利要求20的方法，其中所述共施用在同一制剂中。
22. —种提高宿主细胞产生重组ASM蛋白的方法，其中该宿主 细胞包含表达载体，该表达载体包含编码该重组ASM蛋白的核酸序 列，该方法包括在含有有效量的神经酰胺或鞘磷脂类似物或为核苷酸 类似物的化合物的培养基中培养该宿主细胞，其中所述化合物是ASM 的抑制剂。
23. 权利要求22的方法，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具 有下式I:<formula>formula see original document page 6</formula>其中每一个R如果存在则独立地是任选取代的Cwo烷基、卤素、 N02、 CN、 OH、 d.6烷氧基；R!、 R2和R3独立地是H、 Cwo烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
24.权利要求22的方法，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具 有下式II:<formula>formula see original document page 6</formula>其中R!、 R2、 R3和m如上所述定义，R4是C,o-2o烷基，R5和Re 独立地是H、 Cwo烷基、芳基或芳烷基。
25.权利要求22的方法，其中所述化合物是神经酰胺类似物并且 具有下式III:<formula>formula see original document page 7</formula>其中Rn如上述定义，R7是H或OH，R8是H、氧、C1-10烷基、芳基或芳烷基，R9是C10-20烷基。
26.权利要求25的方法，基中所述化合物是D-MAPP,由以下结构代表<formula>formula see original document page 7</formula>
27.权利要求22的方法，其中所述化合物是具有以下结构的核苷 酸类似物跳<formula>formula see original document page 7</formula>
28.纯化的野生型ASM以及ASM活性」提高量的为神经酰胺或鞘 磷脂类似物的化合物、或为核苷酸类似物的化合物在制备治疗患尼曼 -皮克病个体的药物中的用途，其中所述化合物是ASM的抑制剂。<formula>formula see original document page 7</formula>其中Rn如上所述定义，R7是H或OH， Rs是H、氧、C^烷基、芳基或芳坑基，R9是Co_20棍基。
29.权利要求28的用途，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具 有下式I:<formula>formula see original document page 8</formula>其中每一个R如果存在则独立地是任选取代的Cwo烷基、卤素、 N02、 CN、 OH、 C^烷氧基；R2和R3独立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
30.权利要求28的用途，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具 有下式II:<formula>formula see original document page 8</formula>其中R4、 R2、 R3和m如上所述定义，R4是C!o-2o烷基，R5和& 独立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。
31.权利要求28的用途，其中所述化合物是神经酰胺类似物并且 具有下式III-.<formula>formula see original document page 8</formula>其中Rn如上所述定义，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cwo烷基、芳基或芳烷基，R9是C^20烷基。
32.权利要求31的用途，其中所述化合物是D-MAPP，由以下结 构代表<formula>formula see original document page 9</formula>
33.权利要求28的用途，其中所述化合物是具有以下结构的核苷 酸类似物<formula>formula see original document page 9</formula>
34. 权利要求28的用途，其中所述个体患有A型尼曼-皮克病。
35. 权利要求28的用途，其中所述个体患有B型尼曼-皮克病。
36. 权利要求28的用途，其中所述个体具有编码突变ASM蛋白 的突变ASM基因。
37. 权利要求36的用途，其中所述突变蛋白是L302P (SEQ ID NO:3) 。
38. 权利要求36的用途，其中所述突变蛋白是R496L (SEQ ID NO: 2)。
39. 权利要求36的用途，其中所述突变蛋白是AR608 (SEQIDNO:4) 。
40. 有效量的为神经酰胺或鞘磷脂类似物的化合物、或为核苷酸类 似物的化合物在制备用于提高个体细胞中重组ASM蛋白体内表达水平的药物中的用途，其中所述化合物是ASM的抑制剂，所述蛋白由已经导入细胞内的表达载体表达。
41.权利要求40的用途，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具 有下式I:<formula>formula see original document page 10</formula>其中每一个R如果存在则独立地是任选取代的d-k)烷基、卤素、N02、 CN、 OH、 Cw烷氧基；Ri、 R2和R3独立地是H、 Cw。烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
42.权利要求40的用途，其中所述化合物是鞘磷脂类似物并且具 有下式II:<formula>formula see original document page 10</formula>其中Rp R2、 R3和m如上所述定义，R4是Cu)-2o烷基，Rs和R^ 独立地是H、 Cw。烷基、芳基或芳烷基。
43.权利要求40的用途，其中所述化合物是神经酰胺类似物并且 具有下式III:<formula>formula see original document page 10</formula>其中Rn如上所述定义，R7是H或OH, Rs是H、氧、Cwo烷基'芳基或芳烷基，R9是Cu).20烷基。
44.权利要求43的用途，其中所述化合物是D-MAPP,由以下结 构代表c筑
45.权利要求40的用途，其中所述化合物是具有以下结构的核苷 酸类似物<formula>formula see original document page 11</formula>其中所述载体是病毒载体。 其中所述病毒载体是腺病毒载体。其中所述个体具有编码突变ASM蛋白
46. 权利要求40的用途
47. 权利要求40的用途
48. 权利要求40的用途 的突变ASM基因。
49. 权利要求48的用途，其中所述突变蛋白是L302 (SEQ ID NO:3) 。
50. 权利要求48的用途，其中所述突变蛋白是R496L (SEQ ID NO: 2)。
51. 权利要求48的用途，其中所述突变蛋白是AR608 (SEQIDNO:4) 。
52. ASM活性提高量的为神经酰胺或鞘磷脂类似物的化合物、或 为核苷酸类似物的化合物在制备用于治疗已患尼曼-皮克病个体或者 在遗传学上易发展为尼曼-皮克病个体的药物中的用途，其中所述化 合物是ASM的抑制剂。
53. 权利要求52的用途，其中所述化合物是下式I的鞘磷脂类似 物化合物<formula>formula see original document page 12</formula>|其中每一个R如果存在则独立地是任选取代的Cwo垸基、卤素、 N02、 CN、 0H、 Cw烷氧基；R!、 R2和R3独立地是H、 Cwo烷基、 芳基或芳烷基；n是0-5， m是l-3。
54.权利要求52的用途，其中所述化合物是下式II的鞘磷脂类 似、物:<formula>formula see original document page 12</formula>3其中R" R2、 R3和m如上所述定义，R4是Cn)-2o烷基，Rs和Re 独立地是H、 Cwo烷基、芳基或芳烷基。
55.权利要求52的用途，其中所述化合物是下式III的神经酰胺类似物<formula>formula see original document page 12</formula>其中Rn如上所述定义，R7是H或OH， Rs是H、氧、Cwo烷基、芳基或芳烷基，R9是Cu).20烷基。
56.权利要求55的用途，其中所述化合物是D-MAPP,由以下结 构代表<formula>formula see original document page 13</formula>
57.权利要求52的用途，其中所述化合物是具有以下结构的核苷 酸类似物<formula>formula see original document page 13</formula>
58. 权利要求52的用途，其中所述个体具有编码突变ASM蛋白 的突变ASM基因。
59. 权利要求58的用途，其中所述突变蛋白是L302 (SEQ ID NO:3) 。
60. 权利要求58的用途，其中所述突变蛋白是R"6L (SEQ ID NO: 2)。
61. 权利要求58的用途，其中所述突变蛋白是AR608 (SEQ ID NO:
全文摘要
本发明提供一种治疗患酸性鞘磷脂酶缺陷型尼曼-皮克病(即A型或B型尼曼-皮克病)个体的方法，是通过施用小分子作为与该病相关的缺陷酸性鞘磷脂酶(ASM)的特异性分子“陪伴分子”。该分子是神经酰胺、鞘磷脂或磷核苷酸的类似物。
文档编号A61K31/685GK101214249SQ200710153520
公开日2008年7月9日 申请日期2004年11月24日 优先权日2003年11月25日
发明者爱德华·H·舒克曼, 罗伯特·J·德斯尼克 申请人:纽约大学西奈山医学院