专利名称：：广玉兰叶总黄酮提取物的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药领域，具体涉及一种广玉兰总黄酮提取物的制备方法及其应用。
背景技术：
：广玉兰(MagnoliagrandiflomL.)，又名荷花玉兰，为木兰科木兰属植物，常绿乔木。广玉兰原产北美洲东南部，19世纪末20世纪初引入我国，目前在长江流域及以南各城市广为栽培。广玉兰属阳性树种，喜光，耐半阴，是优良的绿化观赏树种，抗S02、氯气等能力强，其叶入药少，主要用于高血压病(1、中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志<第三十巻第一分册>北京科学出版社.1996:125;2、斐鉴，等.中国药用植物志<第五册>.北京科学出版社，1957:31)。广玉兰叶中含有多种生物碱及萜类成分(吴征镒，等.新华本草纲要<第一册〉.上海上海科学技术出版社，1988:58.)。陈兴荣(陈兴荣，等.荷花玉兰化学成分研究.中药材[J].2000,23(3):159-160)分离出四个成分，包括丁香树脂醇、小白菊内酯、闭鞘姜酯、|3-谷甾醇。王琪(王琪，李洪玲.木兰属植物花蕾总黄酮含量测定及其提取工艺研究.现代中药研究与实践[J].2003，17(2):32-33.)采用微波提取法测定总荷花玉兰花蕾中的总黄酮含量为5.125%。对广玉兰叶总黄酮的研究极少，未见相关报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种广玉兰总黄酮提取方法，本发明提取工艺简便，易操作，适合工业化生产。采用本发明方法提取广玉兰总黄酮，所得提取物总黄酮的含量为30°/。80%，本发明提取方案可以通过如下方式实现(1)、取广玉兰叶，剪成小碎片，以极性溶剂提取14次，得提取液；(2)、提取液减压浓縮至浸膏状，加浓度为8%~20%的乙醇，用量为每毫升乙醇中含广玉兰药材0.71.0g，充分溶解分散，冷处放置过夜，析出沉淀，过滤，沉淀以上述醇洗12次，合并滤液和洗液，备用；(3)、步骤(2)所得的溶液减压浓縮，至相对密度为1.051.35,加95%乙醇调醇的浓度为50%~70%，充分搅拌均匀，室温静置过夜，析出不容物，过滤，不容物以60%的乙醇洗涤1~2次，滤液与洗液合并，备用；(4)、将步骤(3)所得的溶液减压浓縮无醇味，相对密度为1.15~1.30，浓縮液上已处理好的树脂柱，先用去离子水洗脱至Molish反应呈阴性，改用30%~70%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓縮，干燥，得总黄酮含量为30%~80%的广玉兰叶总黄酮提取物。本发明所用的极性溶剂可以是水、乙醇、含水乙醇、甲醇、含水甲醇、丙醇、含水丙醇、异丙醇、含水异丙醇、丙酮、含水丙酮中的任一种或两种的混合。优选水和含水乙醇。本发明提取总黄酮工艺中，可以至步骤(3)终止，醇沉时选择两次醇沉，所得到的提取物总黄酮含量相对较低，在30%左右。当采用树脂吸附处理后，提取物的总黄酮含量可以得到较大的提高，含量在60%左右。本发明中，在步骤(4)所得到的总黄酮再经过Sephadex-LH20凝胶处理后，达到80%左右。在具体操作时，可根据用药需要，采用适当的提取纯化方法。本发明中，所用的吸附树脂，可以是大孔吸附树脂，也可以是聚酰胺吸附树脂。所用的大孔吸附树脂，可以是HP-20型、D-101型、AB-8型、NKA-9型等一些非极性或中极性树脂。本发明所得的总黄酮中，以黄酮醇及其苷为主，异黄酮及二氢黄酮醇很少，如有山萘素、槲皮素及其苷。本发明所得的总黄酮提取物，经药理学研究证明，具有较好的降压作用，本发明广玉兰总黄酮，可以作为活性成分单独应用，也可以与其它具有类此功能的活性成分联合使用，加入药学上可接受的辅料或载体，制成适当的药物剂型。具体实施例实施例1取广玉兰叶碎片lkg，10倍量水煎煮提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至每毫升溶液含广玉兰药材约0.85g，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以水洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.15，加95%的乙醇使含醇量为50%,充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，浓縮，真空干燥，得总黄酮含量为25%的广玉兰提取物。实施例2取广玉兰叶碎片lkg，8倍量40%的乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至乙醇浓度约为10%,每毫升溶液含广玉兰药材约0.75g，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以10%低乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.15，加95%的乙醇使含醇量为50%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，上清液继续浓縮至相对密度约为1.30，加95°/。的乙醇使含醇量为70%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，浓縮，真空干燥，得总黄酮含量为35%的广玉兰提取物。实施例3取广玉兰叶碎片2kg，8倍量60%的乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至乙醇浓度约为15%，每毫升溶液含广玉兰药材约0.80g，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以15%低乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.15，加95%的乙醇使含醇量为50%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，上清液继续浓縮至相对密度约为1.20，上已处理好的AB-8型大孔吸附树脂，先用水洗脱至Molish反应成阴性，改用30%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，干燥，得中黄酮含量为46%的广玉兰叶提取物。实施例4取广玉兰叶碎片lkg，10、8、8倍量甲醇回流提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至浸膏状，加入浓度为5%的乙醇，5%的乙醇加入量为每毫升含广玉兰药材约0.70g，回流溶解，室温放凉，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以5°/。的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.10，加95%的乙醇使含醇量为55%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，沉淀以55。/。d乙醇洗涤2次，并入到上述上清液中，上清液继续浓縮至相对密度约为1.20，上已处理好的HP-20型大孔吸附树脂，先用水洗脱至Molish反应成阴性，改用50%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，干燥，得中黄酮含量为51%的广玉兰叶提取物。实施例5取广玉兰叶碎片lkg，10、8、8倍量丙酮浸泡提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至浸膏状，加入浓度为8%的乙醇，8%的乙醇加入量为每亳升含广玉兰药材约0.90g，回流溶解，室温放凉，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以10%的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为U5，加95%的乙醇使含醇量为70%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，上清液继续浓縮至相对密度约为1.30，上己处理好的D-101型大孔吸附树脂，先用水洗脱至Molish反应成阴性，改用70%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩，干燥，得中黄酮含量为53%的广玉兰叶提取物。实施例6取广玉兰叶碎片lkg，10、8、8倍量丙醇浸泡提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至浸膏状，加入浓度为8%的乙醇，8°/。的乙醇加入量为每毫升含广玉兰药材约0.90g，回流溶解，室温放凉，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以10%的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.15，加95%的乙醇使含醇量为70%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，上清液继续浓縮至相对密度约为1.30，上已处理好的NDA-9型大孔吸附树脂，先用水洗脱至Molish反应成阴性，改用65%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，干燥，得中黄酮含量为48%的广玉兰叶提取物。实施例7取广玉兰叶碎片5kg，8倍量60%的乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至乙醇浓度约为10%，每毫升溶液含广玉兰药材约0.80g，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以10%的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.15，加95%的乙醇使含醇量为50%,充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，上清液继续浓縮至相对密度约为1.30，浓縮液上已处理好的聚酰胺树脂柱，先用5%的乙醇洗脱至稀土液颜色变淡，改用50%的乙醇洗脱，收集50%的乙醇洗脱液，50%的乙醇洗脱液浓縮，真空干燥，得总黄酮含量为62%的广玉兰提取物。实施例8取广玉兰叶碎片20kg，10、8、8倍量60%的乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至乙醇浓度约为15%，每毫升溶液含广玉兰药材约1.0g，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以15%的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.15，加95%的乙醇使含醇量为60%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，沉淀继续以60%的乙醇洗涤2次，并入到上述上清液中，上清液继续浓縮至相对密度约为1.20，浓縮液上已处理好的聚酰胺树脂柱，先用15%的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用60%的乙醇洗脱，收集60%的乙醇洗脱液，60%的乙醇洗脱液浓縮，喷雾千燥，得总黄酮含量为67%的广玉兰叶提取物。实施例9取广玉兰叶碎片2kg，10倍量70%的乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至乙醇浓度约为15%,每毫升溶液含广玉兰药材约0.80g，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以15%的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.20，加95%的乙醇使含醇量为70%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，沉淀继续以70%的乙醇洗涤2次，并入到上述上清液中，上清液继续浓縮至相对密度约为1.25，浓縮液上已处理好的聚酰胺树脂柱，先用10%的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用60%的乙醇洗脱，收集60%的乙醇洗脱液，60%的乙醇洗脱液浓縮至相对密度约为1.20，上Sephadex-LH20凝胶色谱柱，先用10%的乙醇洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用60%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓縮，冷冻干燥，得总黄酮含量为79%的广玉兰叶提取物。实施例10取广玉兰叶碎片lkg，10、8、8倍量甲醇浸泡3次，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至浸膏状，加入浓度为10%的乙醇，10%的乙醇加入量为每毫升含广玉兰药材约0.70g，回流溶解，室温放凉，冷处放置24小时，析出沉淀，过滤，沉淀以10%的乙醇洗2次，并入到上滤液中，减压浓縮至相对密度约为1.10，加95%的乙醇使含醇量为60%，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，沉淀以60%的乙醇洗涤2次，并入到上述上清液中，上清液继续浓縮至相对密度约为1.20，上已处理好的HP-20型大孔吸附树脂，先用水洗脱至Molish反应成阴性，改用50%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮至相对密度为1.15，上Sephadex-LH20凝胶树脂柱，先以8°/。的乙醇洗脱，至洗脱液颜色变淡，改用75%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓縮，干燥，得总黄酮含量为73%的广玉兰叶提取物。实施例11本发明胶囊剂实施例广玉兰叶总黄酮提取物(黄酮含量35%)8g淀粉12g将广玉兰总黄酮提取物粉碎，与淀粉混匀，将入2号胶囊，每个胶囊状0.2g，即得本发明以广玉兰为活性成分的胶囊剂。实施例12广玉兰总黄酮与其它或活性成分组合制成的胶囊剂广玉兰叶总黄酮提取物(黄酮含量51%)5g山楂总黄酮5g大豆异黄酮3g软磷脂2g将上述活性成分充分混匀后装入3号空心胶囊，每各胶囊状0.15g,即得本发明活性成分和其它活性成分组合是降压、降血脂制剂。实施例13以下从药理实验来说明本发明的效果对应激性高血压大鼠的降压实验Wistar大鼠在指定的环境中适应1周后，将其放入MG-2型迷宫刺激器的不同风格中，以间断性交流电，强度2-4mA，持续时间为50ms，每次通电的间隔由计算机程序控制，2次电击间隔在3-30s之间的任意时间长度，电流的输出无规律可循，从而增强了应激强度，使之产生高度精神及情绪上的紧张，为了更加减少躯体性伤害刺激而增加精神紧张刺激，在给予电击的同时伴随一个噪音信号(80100ds，时程50ms)以建立条件反射，应激动物每天应激2次，上午和下午各1次，每次2h，2次间隔在4小时以上，连续应激15d，以2c/。NaCl溶液代饮用水正常喂养，并观察血压变化，待血压平均升高2.0kPa以上，视为造模成功。将40只造模成功的Wistar大鼠随机平均分为5组，模型组；盐酸维拉帕米注射液(Ver)12.25mg/kg剂量给药组；广玉兰总黄酮15、30、60mg/kg3个剂量组，将未造模的8只大鼠设为空白对照组(Sham)，不做任何处理，三味降压片各组大鼠每日灌胃1次，连续15天，模型组给予10mL/kg生理盐水灌胃。降压结果见表1表l广玉兰叶总黄酮对应激性高血压大鼠的血压影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01由上表结果可知，各应激大鼠应激后平均动脉压与应激前相比，血压显著升高。给予动物应激刺激时，大鼠出现紧张和恐惧、呼吸加快、尖叫、颤抖、直立、逃避等行为表现。灌胃给药15d后，Control组大鼠应激后平均动脉压升高到(21.45±1.38)kPa,与应激前大鼠血压比较，血压升高显著。广玉兰叶总黄酮60mg/kg组大鼠应激后平均动脉压为(17.56±0.75)kPa，较模型组大鼠应激后平均动脉压升高幅度值明显降低，PO.Ol，广玉兰叶总黄酮三个剂量组较模型组大鼠应激后平均动脉压升高幅度值均有显著降低，并成剂量依赖关系。权利要求1、一种广玉兰叶总黄酮提取物，其特征是由下述方法制得(1)取广玉兰叶，剪成小碎片，以极性溶剂提取1～4次，得提取液；(2)提取液减压浓缩至浸膏状，加浓度为8％～20％的乙醇，用量为每毫升乙醇中含广玉兰药材0.7～1.0g，充分溶解分散，冷处放置过夜，析出沉淀，过滤，沉淀以上述醇洗1～2次，合并滤液和洗液，备用；(3)步骤(2)所得的溶液减压浓缩，至相对密度为1.05～1.35，加95％乙醇调醇的浓度为50％～70％，充分搅拌均匀，室温静置过夜，析出不容物，过滤，不容物以60％的乙醇洗涤1～2次，滤液与洗液合并，备用；(4)将步骤(3)所得的溶液减压浓缩无醇味，相对密度为1.15～1.30，浓缩液上已处理好的树脂柱，先用去离子水洗脱至Molish反应呈阴性，改用30％～70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得总黄酮含量为30％～80％的广玉兰叶总黄酮提取物。2、如权利要求1所述的总黄酮提取物，其特征是所述的极性溶剂可以是水、乙醇、含水乙醇、甲醇、含水甲醇、丙醇、含水丙醇、异丙醇、含水异丙醇、丙酮、含水丙酮中的任一种或两种的混合。3、如权利要求2所述的总黄酮提取物，其特征是所述的剂型溶剂为水或含水乙醇。4、如权利要求1所述的总黄酮提取物，其特征是所述的树脂为大孔吸附树脂或聚酰胺吸附树脂。5、一种药用组合物，其特征在于含有治疗有效量的权利要求1所述的广玉兰叶总黄酮提取物与药学上可接受的载体。6、如权利要求5所述的药用组合物，所述的广玉兰叶总黄酮提取物还可以作为活性部位与其它活性药物组合。7、如权利要求1所述的广玉兰叶总黄酮提取物在制备具有降压作用药物中的应用。全文摘要本发明涉及广玉兰叶总黄酮提取物的制备方法和应用。广玉兰叶碎片经极性有机溶剂萃取、水沉、醇沉和吸附填料纯化后，总黄酮含量可达到30％～80％，本发明提取纯化方法简单可控，适合工业化生产，所得的总黄酮具有降压效果，可做为活性成分单独或与其它活性成分联合用于制备降压、降脂药物。文档编号A61K36/575GK101269121SQ20071017565公开日2008年9月24日申请日期2007年10月10日优先权日2007年10月10日发明者张树祥,熊国裕申请人:北京星昊医药股份有限公司