专利名称：：广玉兰叶挥发油在制药上的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及广玉兰叶挥发油的用途，尤其涉及其在制备抗菌、镇痛药物上的应用。
背景技术：
：玉兰为木兰科(^^^"0//""^)植物中重要的分类群之一，是一类速生林、特用经济林、水土保持林和城乡风景生态林的优良种，很有发展和开发利用前景。木兰禾斗植物望春花(M3g"o"a6!'o"必尸amp.)、玉兰(她gno,/ac/e做(i3teofesr.)或武当玉兰(M^o/Za^re"ger/尸flw/.)的干燥花蕾为中药辛夷的药用部位，临床上用来治疗风寒头痛、鼻塞等感冒症状。文献(赵利琴.望春玉兰萜类成分及其生物活性研究进展.时珍国医国药[J].2005.16(4):298-230)记载，玉兰中富含萜类成分，主要为单萜和倍半萜及其含氧衍生物。陈兴荣等(陈兴荣，等.荷花玉兰化学成分研究.中药材[J].2000,13(3):159-160)等对荷花玉兰进行化学成分研究，从中分离鉴别了三个倍半萜内酯类化合物，分别为丁香树脂醇、闭鞘姜酯和小白菊内酯。文献(TwonewgermacranolidesfromM3g"o//agra顺ora.J.AsianNatProdRes.2001，3(2):95-102)报道了从广玉兰中分离的倍半萜内酯类化合物，其中包括2-a-羟基-二氢小白菊内酯、小白菊内酯、木香内酯等内酯类化合物。
发明内容对玉兰叶挥发性成分的研究，目前尚少，尤其是其在制药、食品添加剂、香料中的应用。本发明的目的之一是提供玉兰叶挥发性活性成分在制药上的应用，尤其是在抗菌、镇痛药物中的应用。本发明以玉兰叶挥发油为原料，可将其作为活性成分与制药上可接受的载体或药用辅料开发成相宜的抗菌、镇痛制剂，如注射剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、乳浊液、脂质体等。本发明玉兰叶挥发油原料即可单独使用，也可与其它原料混合使用制成所需剂型。广玉兰叶中含有多种植物性香料，如水芹烯、莰烯、蛇床烯、(3-新丁子烯等，它们都广泛用于香料工业、化妆品和食品中，在香精中的价值日臻重要。因此，广玉兰叶除可用于制备抗菌、镇痛药物中外，还可用于食品添加剂、化妆品、香料中。本发明中，广玉兰叶挥发油采用常用的水蒸气蒸馏法、溶剂提取法或超临界萃取法等适于工业化生产的方法进行制备。得到的广玉兰叶挥发油呈淡黄色，主要含有大根香叶烯-D(Gemacrene-D)、檀紫三烯(Santolinatriene)、石竹烯(Caryophyllene)、3，7-二甲基誦1,3，7三烯(1，3，7-Octatriene誦3,7醫dimehtyl-)、莰烯(Camphene)、蔽烯(Pinene)、水开烯(Phellandrene)、D-柠檬烯(D-Limonene)、a'陽松油醇(a-terpineol)、罗汉柏烯(Thujopesene)、蛇床烯、a-金合欢烯(a-Farnesene)、橙花醇等，占总油的90%以上，广玉兰叶的含油量为.25%-0.40%,即每100g生药含挥发油0.35-0.5mL。上述水蒸气蒸馏法提取挥发油的方案主要是通过油水分离器分离挥发油，其步骤为按重量份计算，取广玉兰叶l-20份，加水5-200份，先浸泡至透，水蒸气蒸馏3-8小时，温度控制在85-105'C，起始时温度可设置高些，待沸腾后，适当调低温度，以保持水为微沸，进行油水分离，得到含水广玉兰叶挥发油,j《挥发油以乙醚萃取，乙醚萃取部分加无水硫酸钠干燥(24小时以上)、过滤，去除水相，蒸去乙醚，即可得到广玉兰叶挥发油。上述的溶剂提取法，其步骤为取广玉兰叶l-20份，加入有机溶剂正己烷或环己烷6-120重量份，进行回流提取，温度控制在50-70°C，回流2-3小时，待回流液温度降至室温时，放出回流液，回收有机溶剂，即可得到挥发油粗品；在粗品中加入无水乙醇0.01-0.1重量份，与挥发油粗品从分混合，放置-2(TC冰箱中，24h以上，将混浊液过滤除去，继续放置冰箱中重复此步骤，直到液体澄清为止，将含有挥发油的乙醇溶液浓縮，即可得到广玉兰叶挥发油。上述所述的超临界萃取法，其步骤为取广玉兰叶，粉碎成粒径为0.5-lmm的碎粉，萃取斧的压力为10-30Mpa，温度为20-5(TC，进行超临界002萃取，萃取时间为30-90分钟，从萃取斧出来的C02进入分离系统，一级分离温度为35-50°C，压力为15-25Mpa;二级分离温度为20-30°C,压力为4-8Mpa，得到广玉兰叶挥发油，<:02流速为10-20L/h，分离出来的C02再经过滤和制冷系统加压后循环利用。为了更好的理解本发明的实质，以下从广玉兰叶挥发油的抑菌和镇痛实验来说明本发明在制备抗菌和镇痛药物中的应用。一、体外抑菌实验1、菌种产酸克雷伯菌、肠炎沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌。2、培养基M-H肉汤培养基加0.3%的琼脂，制成半固体培养基。3、MIC的测定采用微量琼脂稀释法测定MIC(徐淑云.药理学实验方法学[M].北京人民卫生出版社.1985,1066-1070)。将2%广玉兰油水溶液(乳浊液)做1:2-128倍比稀释，取20u1加入培养孔中，再分别加入用肉汤琼脂稀释的各菌液(约107/ml)200lU，混匀，于37。C培养24h，重复实验1次，结果见表l。表l广玉兰叶挥发油的最低抑菌浓度实验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"一"表示无细菌生长，"+"表示有细菌生长。体外抑菌实验表明，2%的广玉兰叶挥发油做1/4倍稀释后，对产酸克雷伯菌、肠炎沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌均有显著的抑菌作用，做l/8倍稀释后，对痢疾志贺氏菌、表皮葡萄球菌仍有显著抗菌作用，且比1%的黄连素强。说明广玉兰叶挥发油的最低抑菌浓度为2%的广玉兰溶液做l/4倍稀释，即0.5%浓度的溶液(V/V)。二、体内抗菌实验1.实验前接种细菌于10ml营养肉汤中，孵育24h为菌原液，继续用5%高活性干酵母制成所需浓度，以预实验是选定的使小鼠死亡率达80%-100%的菌液(大肠杆菌的稀释度为10—1,金黄色葡萄球菌的稀释度为10_2)作为感染菌量，小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半，各组小鼠腹腔注射各菌液0.5ml感染；给予不同剂量的广玉兰叶挥发油液(挥发油浓度为2%(V/V))，腹腔注射0.03ml/kg和0.015ml/kg，灌胃O.lml/kg和0.05ml/kg，空白对照组给生理盐水，对照组腹腔注射40U/kg庆大霉素，给药第二天，第七天统计各组小鼠死亡数量，结果见表2。表2广玉兰叶挥发油的体内抑菌实验(n-10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.急性毒性实验取小鼠随机分组，分别腹腔注射和灌胃给予广玉兰叶挥发油，结果腹腔注射LD5G为0.75mL/kg，灌胃LD5G为4.86mL/kg。三、对小鼠镇痛作用的影响配药所得广玉兰挥发油以5%的吐温-80配成所需浓度。小鼠热板、法健康昆明种小鼠，雌性，18~22g，于实验前l天放入(55±0.5)'C水浴烧杯中，记录从放入到出现舔后足的时间，即痛阈值，取痛阈值为5~30s的合格小鼠40只，随机分为4组，每组10只。实验前禁食16h，不禁水。给药前再测一次痛阈值，作为正常痛阈值。阳性对照组腹腔注射阿司匹林10mg/kg，阴性对照组腹腔注射等体积(0.2mL/20g)的5%吐温-80溶液，药物实验组给药挥发油0.15、0.3ml/kg，测15、30、60、90min痛阈值，比较给药前后痛阈值大小。结果见表3。表3广玉兰叶挥发油对小鼠痛阈反应的影响^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与阴性对照组比较，*P<0.01，**P<0.05实验结果表明，广玉兰挥发油对小鼠有明显的镇痛作用，与阴性对照组相比，差异显著(P<O.Ol)。具体实施例方式下述实施例用以进一步说明本发明，但并不由此限制本发明范围。实施例1取广玉兰新鲜叶500g，加10倍量水，水蒸气蒸馏5小时，用油水分离器分离含水挥发油，含水挥发油以乙醚少量多次萃取后，用无水硫酸钠脱水干燥过夜，过滤浓縮得到广玉兰挥发油。挥发油成淡黄色透明状液体，有特殊香味，得油率为0.39%(ml/100g)，即得广玉兰挥发油1.95mL。挥发油少量氯仿溶解后进行GC-MS分析，结果见表4。色谱条件石英毛细管柱HP-5MS(30mX0.25mmX0.25um)，载气为氦气，柱流量lml/min升温至260°C;质谱条件EI电离源，电离能量70eV，离子源温度230°C，扫描范围30-500amu，进样量1.0uL，分流比10:1。表4广玉兰叶挥发油成分分析结果(水蒸气蒸馏法)^il化合物名称分子量相对含量/%相似度/%1a-旅烯a-Pinene1362卩-水芹烯e-Phellandlrene1363e-羅烯日-Pinene13642-蒈烯2-Carene1365D-柠檬烯D-Limonene1366P-月桂烯e-Myrcene1367a-松油醇a-terpineol1548古巴烯Copaene2049P-新丁子香烯P-Neclovene20410莰烯Camphene13611石竹烯Caryohpyllene20412绿叶烯Patchoulene20413a-金合欢稀a-Famesene20414a-石竹烯a"Caryophyllene20415马兜铃烯Aristolene20416大根香叶烯-DGemacrene-D20417擅紫三烯Santolinatriene13618罗汉柏烯-13Thulopene20419a-荜澄莂烯a-Cubebene20420S-开子烯S-Selinene204213，7-二甲基-1，3，7辛三烯I,3，7-OCtatriene,3，7-dimethyl-13622e-蛇床烯e-Humulene20423(-)-蓝桉醇(-)-Globulol22224喇叭醇Ledol22225愈创醇Guaiol22226新异长叶烯Neoisolongifolene222273-环己烯甲酸乙酯Ethyl3-Cyclohexenechrboxylate154614740962297400968955060584299999989999889899008998999991479226026P5160;^M64014180057实施例2取广玉兰叶1000g，粉碎成粒径约为0.5-1.0mm的粗粉，投入到萃取斧中，萃取斧压力为35Mpa，温度为35"C;—级分离温度为为40°C，压力为15Mpa，二级分离温度为20°C，压力为6Mpa。超临界流体静态浸泡原料lh，设备稳定后进行动态萃取，由接收器收集产品。最后得广玉兰叶挥发油4.2mL，挥发油成淡黄色透明液体，有特殊香味，得油率为0.42°/。(ml/100g)。挥发油加少量氯仿溶解后进行GC-MS分析，结果类似水蒸气蒸馏相似。权利要求1、广玉兰叶挥发油在制备抗菌、镇痛药物中的应用。全文摘要本发明涉及广玉兰叶挥发油在制药上的用途。广玉兰叶先采用常规的挥发油提取分离方法提取后，可得到玉兰挥发油。药理研究表明，广玉兰叶挥发油具有良好的抗菌抑菌作用，还具有较强的镇痛作用，可用于制备抗菌、镇痛药物。文档编号A61K36/185GK101406521SQ20071017565公开日2009年4月15日申请日期2007年10月10日优先权日2007年10月10日发明者张树祥,熊国裕申请人:北京星昊医药股份有限公司