专利名称：Jucara和acai果实基营养补充剂的制作方法
本申请是国际申请日为2004年3月22日提交的国际申请号为PCT/US2004/008739，中国申请号为200480013855.2，发明名称为“JUCARA和
果实基营养补充剂”的分案申请。
发明领域
本发明涉及制备稳定的、可口的、冻干的水果基营养补充剂(fruit-based dietary supplement)的方法及其应用。
背景技术：
在过去的几十年里，关于自由基对人类健康和疾病的重要性的认识开始增强。许多常见病和威胁生命的疾病，包括动脉硬化、癌症和衰老，都有自由基反应作为潜在的损伤机制。经过这段时期，我们对自由基与生命体相互作用的概念上的理解已经发展并提供了空前的机遇以促进人类生命的质量甚至延长其长度。
一类最普通的自由基是活性氧物质(ROS)。这是正常细胞呼吸和代谢的产物，通常受体内产生的抗氧化剂调节。由于污染等环境因子和吸烟或运动等生活方式因素的影响，自由基的生成会增加。这种增加会打破机体平衡，尤其是当机体衰老和抗氧化剂生成机制丧失了其以必要速率生成那些化合物的能力时，导致氧化应激。由此导致的损伤范围可包括生物过程的破坏、杀死细胞和遗传物质的变异，后者将导致癌症发生。
营养补充剂在抵御氧化应激效应和退行性疾病进展及衰老中的潜在应用在过去的二十年中已成为越来越多的研究的主题。如今市场上有许多产品包含不同水平的抗氧化剂。这些形成了食物、液体和营养补充剂的形式。这些重要的营养物通常富含于拥有维生素C、维生素E、β-胡萝卜素及其它化合物的水果和蔬菜中。
抗氧化剂假说假定补充营养抗氧化剂能够减轻与疾病相关的氧化还原不平衡。抗氧化剂行使结合自由基、使其稳定并将其清除出系统的功能，从而减少了自由基可能造成的损伤。
目前已开发了合成的抗氧化剂如BHA(丁基化羟基苯甲醚)，BHT(丁基化羟基甲苯)和NDGA(去甲二氢愈创木酸)。天然抗氧化剂的例子有抗氧化酶类，如超氧化物岐化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，以及非酶类抗氧化剂如生育酚(维生素E)、抗坏血酸(维生素C)、类胡萝卜素和谷胱甘肽。
然而，合成的抗氧化剂可能因在其体内的强毒性而导致过敏反应和肿瘤形成，并且由于温度敏感性而易于分解。另一方面，虽然天然抗氧化剂在体内比合成的抗氧化剂安全，但却有效果弱的问题。因此，要求开发在使用中无安全问题同时又具有优秀抗氧化活性的新天然抗氧化剂。
许多研究阐明了多酚黄酮类化合物的保护功能。黄酮类化合物的抗诱变、抗癌变和免疫刺激功能已有报道。黄酮类化合物是一大类天然存在的多酚化合物，发现于水果、蔬菜、谷物、树皮、茶叶和酒中，已被证实有体内清除自由基的潜力。
花色素苷是天然存在的化合物，是许多水果、蔬菜、谷物和花朵呈红色、紫色和蓝色的原因。例如，如蓝莓、欧洲越桔(bilberry)、草莓、覆盆子、波森莓、marionberries、酸果蔓等浆果的颜色，归因于许多不同的花色素苷。在自然界中已鉴定了超过300种结构不同的花色素苷。因为花色素苷是天然存在的，它们作为食物和饮料的着色剂的应用引起了许多兴趣。原花色素苷是在水果和蔬菜中发现的另一类黄酮类化合物，虽然无色，但具有抗氧化活性。
最近，对花色素苷色素的兴趣加强了，因为其作为营养补充剂对健康可能有好处。例如，欧洲越桔(Vaccinium myrtillus)中的花色素苷长期以来一直被用来增进视敏度和治疗循环障碍。有实验证据表明某些花色素苷和黄酮类化合物具抗炎症功能。另外，有报道称口服花色素苷对治疗糖尿病和溃疡有好处，许多还有抗病毒和抗微生物活性。黄酮类化合物这些理想性质的化学基础据信与其抗氧化能力有关。因此，与浆果及其它水果和蔬菜的抗氧化特性归结于它们的花色素苷含量。
如今的市场上有许多产品含有不同水平的抗氧化剂。这些形成了食物、液体和营养补充剂的形式。这些重要的营养物通常富含于拥有维生素C、维生素E、β-胡萝卜素及其它化合物的水果和蔬菜中。抗氧化剂行使结合自由基、使其稳定并将其清除出系统的功能，从而减少了自由基可能造成的损伤。
由于许多水果和蔬菜中都含有这些重要的营养物，所以能够评估这些食品中抗氧化剂吸收自由基的能力就十分重要。在Tufts大学的USDA研究者开发了一种称为ORAC(Oxygen Radical AbsorbanceCapacity，氧基吸收能力)的实验室检测，对不同食物依其抗氧化剂含量和结合自由基能力进行分级。通过这种检测，不同食物的抗氧化能力可进行比较和分析。
需要鉴定具高ORAC分值的水果或蔬菜和基于其上的营养补充剂的开发和生产。
发明概述
本发明涉及具有高ORAC分值和环加氧酶抑制活性的
果实和Jucara果实的鉴定。一方面本发明提供一种营养补充剂组合物，包含冻干的果浆，其中总花色素苷(anthocyanin)浓度大于约1毫克/克总重，该组合物具有大于约350微摩尔TE/克总重的ORACFL值和小于约3％总重的残留水含量。在一个实施方案中，该营养补充剂组合物中的冻干果浆是冻干的
果浆。在另一个实施方案中，该营养补充剂组合物中的冻干果浆是冻干的Jucara果浆。在一个实施方案中本发明的营养补充剂组合物进一步包含一种药用载体。在一个优选实施方案中，本发明营养补充剂中花色素苷总浓度为从约1毫克/克总重到约500毫克/克总重。在另一个优选实施方案中，营养补充剂中的总花色素苷浓度为从约1毫克/克至约100毫克/克总重。在还有另一个优选实施方案中，营养补充剂中总花色素苷浓度为从约1毫克/克到约10毫克/克总重。在另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物具有从约350微摩尔TE/克总重到约10毫摩尔TE/克的ORACFL值。在另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物具有从约350微摩尔TE/克总重到约5毫摩尔TE/克的ORACFL值。在还有另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物具有从约350微摩尔TE/克总重到约1毫摩尔TE/克的ORACFL值。在一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的残留水含量为从总重的约0.01％到约3％。在另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的残留水含量为从总重的约0.1％到约3％。在还有另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的残留水含量为从总重的约1％到约3％。
另一方面，本发明提供一种包含冻干果浆的营养补充剂组合物，其中组合物具有大于约15阿司匹林(Aspirin)_毫克当量/克总重的环加氧酶抑制活性和低于约3重量％总重的残留水含量。在一个实施方案中，该营养补充剂组合物中的冻干果浆是冻干的
果浆。在另一个实施方案中，该营养补充剂组合物中的冻干果浆是冻干的Jucara果浆。在一个实施方案中本发明的营养补充剂组合物进一步包含一种药用载体。在一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的环加氧酶抑制值为从约15阿司匹林_毫克当量/克总重到约10,000阿司匹林_毫克当量/克总重。在另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的环加氧酶抑制值为从约15阿司匹林_毫克当量/克总重到约1,000阿司匹林_毫克当量/克总重。在还有的另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的环加氧酶抑制值为从约15阿司匹林_毫克当量/克总重到约100阿司匹林_毫克当量/克总重。在一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的残留水含量为从总重的约0.01％到约3％。在另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的残留水含量为从总重的约0.1％到约3％。在还有另一个优选实施方案中，营养补充剂组合物的残留水含量为从总重的约1％到约3％。
另一方面本发明提供了生产稳定和美味的水果基营养补充剂组合物的方法，该方法包含收获果实；称重果实；用水清洗果实；在约75℃至约100℃的温度下用水洗涤果实为期约5秒钟至10分种；给果实去壳(hulling)以从果实中分离果浆；将果浆冻至约-5℃以下；冻干果浆，其冻干条件能产生残留水含量低于3重量％的颗粒状、冻干果浆粉末，其中冻干果浆比果浆制剂更稳定和可口。在一个实施方案中，果实是
果实。在另一个实施方案中，果实是Jucara果实。在一个实施方案中，清洗步骤包括用0.1％(v/v)的卫生水清洗果实。在另一个实施方案中，柠檬酸在冰冻前被加入到果浆制剂中。在另一个实施方案中，洗涤步骤包括在温度为约80℃下在水中清洗果实为期约10秒钟。在还有另一个实施方案中，去壳步骤包括对果实机械去壳为期约2分钟至5分钟，去壳步骤使用每2千克果实约1升水。在还有另一个实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物具有高于约350微摩尔TE/克总重的ORCAFL值。在另一个实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物具有约从350微摩尔TE/克总重到约10毫摩尔TE/克总重的ORCAFL值。在另一个实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物具有从约350微摩尔TE/克总重到约5毫摩尔TE/克总重的ORCAFL值。在还有另一个实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物具有从约350微摩尔TE/克总重到约1毫摩尔TE/克总重的ORCAFL值。在另一个优选实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物具有大于约15阿司匹林_毫克当量/克总重的环加氧酶抑制值。在一个优选实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物的环加氧酶抑制值为从约15阿司匹林_毫克当量/克总重到约10,000阿司匹林_毫克当量/克总重。在另一个优选实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，该组合物的环加氧酶抑制值为从约15阿司匹林_毫克当量/克总重到约1,000阿司匹林_毫克当量/克总重。在还有另一个优选实施方案中，制作营养补充剂组合物的方法产生一种水果基营养补充剂组合物，营养补充剂组合物的环加氧酶抑制值为从约15阿司匹林_毫克当量/克总重到约100阿司匹林_毫克当量/克总重。
在还有的另一方面，本发明提供一种方法，预防或治疗哺乳动物体内由病理性自由基反应导致的疾病或损伤，该方法包括给该哺乳动物施用有效量的本发明的水果基营养补充剂组合物，其中该组合物猝灭(quench)自由基并减少病理性自由基导致的损伤。在一个实施方案中，所述疾病或损伤选自由下列各项组成的组癌症、结肠癌、乳腺癌、炎性肠病、局限性回肠炎(Crohn′s disease)、血管病、关节炎、溃疡、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤、神经变性疾病、自闭症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肠胃病、炎症导致的组织损伤以及环境毒素导致的组织损伤。
在还有的另一方面，本发明提供一种减轻哺乳动物内病理性自由基反应的有害效应的方法，所述哺乳动物遭受疾病或损伤，该疾病或损伤是由哺乳动物中的病理性自由基反应所导致的，所述方法包括向该哺乳物施用有效量的本发明的水果基营养补充剂组合物，其中该组合物猝灭自由基并减少病理性自由基导致的损伤。在一个实施方案中，所述疾病或损伤选自由下列各项组成的组癌症、结肠癌、乳腺癌、炎性肠病、局限性回肠炎(Crohn′s disease)、血管病、关节炎、溃疡、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤、神经变性疾病、自闭症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肠胃病、炎症导致的组织损伤以及环境毒素导致的组织损伤。
在还有的另一方面，本发明提供一种方法以抑制哺乳动物体内环加氧酶活性，该方法包括给该哺乳动物施用有效量的本发明的水果基营养补充剂组合物。在一个实施方案中，该水果基营养补充剂组合物中进一步包含药用载体。在另一个实施方案中，该水果基营养补充剂组合物通过选自下组的施用途径施用口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、关节内、动脉内、大脑内、小脑内、支气管内、鞘内、局部的、和气溶胶途径。
另一方面，本发明提供一种方法以预防或治疗与哺乳动物体内环加氧酶活性增强相关的疾病或损伤，该方法包括给该哺乳动物施用有效量的本发明的水果基营养补充剂组合物。在一个实施方案中，该水果基营养补充剂组合物中进一步包含药用载体。在另一个实施方案中，该水果基营养补充剂组合物通过选自下组的施用途径施用口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、关节内、动脉内、大脑内、小脑内、支气管内、鞘内、局部的、和气溶胶途径。在一个实施方案中，所述疾病或损伤选自由下列各项组成的组癌症、结肠癌、乳腺癌、炎性肠病、局限性回肠炎(Crohn′sdisease)、血管病、关节炎、溃疡、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤、神经变性疾病、自闭症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肠胃病、炎症导致的组织损伤以及环境毒素导致的组织损伤。
本发明的这些以及其它目的将在本发明下面提供的详细描述中显现。
附图简述
参照下述附图本发明可被更充分地理解，图表只起说明作用。
图1显示了冻干
粉的典型吸收谱。
图2显示了由LC/MS/MS色谱技术测定的冻干Jucara粉的花色素苷谱图(profile)。
图3是一幅示意图，显示了冻干Jucara粉的花色素苷的化学结构。
图4显示了由LC/MS/MS色谱技术测定的冻干
粉的花色素苷谱图。
图5是一幅示意图，显示了冻干
粉内花色素苷的化学结构。
图6显示了由HPLC和质谱色谱技术测定的冻干Jucara粉内酚化合物的谱图。
图7是一幅示意图，显示了冻干Jucara粉内酚化合物的化学结构。
图8显示了由色谱技术测定的冻干
粉和冻干Jucara粉内原花色素苷(proanthocyanin)的谱图。
图9是示意图，显示了冻干
粉和冻干Jucara粉内原花色素苷化合物的化学结构。
图10是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的所选蔬菜的抗氧化活性。
图11是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的所选新鲜水果的抗氧化活性。
图12是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的所选新鲜水果的抗氧化活性。
图13是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的冻干
粉和冻干Jucara粉与所选新鲜水果的抗氧化活性。
图14是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的冻干
和所选新鲜水果的抗氧化活性。
图15是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的冻干
粉和所选新鲜蔬菜的抗氧化活性。
图16是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的所选水果、蔬菜和坚果的抗氧化活性。
图17是柱状图，比较了曲ORAC分析技术测定的所选坚果的抗氧化活性。
图18是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的脱水
和所选脱水水果和蔬菜的抗氧化活性。
图19是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的冻干
粉和所选新鲜蔬菜的抗氧化活性。
图20是柱状图，比较了由ORAC分析技术测定的脱水
和所选脱水水果和蔬菜的抗氧化活性。
图21是一柱状图，比较了由ORACHO分析技术测定的水果、蔬菜的抗氧化活性。
图22是流程示意图，详述了
果汁制备。
图23是用于
果汁制备的去壳设备示意图。
图24是流程示意图，详述了冻干
粉的制备方法。
发明详述
因此应当理解下面在不同细节水平所述发明的某方面、方式、实施方案、变化和特征是为了提供对本发明充分的理解。通常，这些公开内容提供了有益的营养补充剂组合物、这些组合物与其它营养补充剂组合物的组合以及其生产和应用的方法。
因此，本发明的多个方面涉及到某特定营养补充剂组合物的治疗或预防性应用以预防或治疗由病理性自由基反应引起的疾病或损伤。本发明的多个方面进一步涉及到特定营养补充剂组合物的治疗或预防性应用以预防或治疗与环加氧酶酶活性增强相关的疾病或损伤。因此，后附多个阐明这些方面的详细实施方案。
应当理解所述对医学病症的治疗和预防的多种方式意指“充分”，即包括全部但也包括不完全治疗或预防，从中获得了一些生物学和医学相关的结果。
定义
此处所述“受试者”，优选指哺乳动物，如人类，但也可以是动物，如家养动物(如狗、猫之类)、农场动物(如牛、羊、猪、马之类)和实验动物(如大鼠、小鼠、豚鼠之类)。
化合物的“有效量”，如此处所述，指足以获得理想治疗和/或预防效果的数量，例如，可导致对所处理疾病产生预防或使其相关症状得到减轻的数量。给受试者施用的化合物的量将取决于疾病的种类和严重性以及个体的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重及耐药性。用量还将取决于疾病的程度、种类和严重性。熟练技术人员能够根据这些及其它因素决定合适的剂量。典型地，本发明中化合物的有效量，足以获得治疗或预防效果，范围从每天约0.000001mg/千克体重到每天约10,000mg/千克体重。优选地，剂量范围从每天约0.0001 mg/千克体重到每天约100mg/千克体重。本发明的化合物也可以彼此组合施用，或者与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。
是巴西北部Para地区特有的众所周知的棕榈树种。
以细的树干和圆蛋形簇状果实为特征，其果实为深紫色，有时熟后甚至接近于黑色。
的拉丁名称为阿萨依(Euterpe oleracea)，Martius；科，棕榈科(Palmaceae)。英文也称为“卷心棕榈(Cabbage Palm)”。在巴西称为
Amazonas，palmito Acai，acaizeiro，acal，assai，jicara，Jucara，palmiteiro，piria在哥伦比亚称为assai和manaca；及uacai；在苏里南称为manaka，pinapalm，prasara，wapoe，和wasei。
一词还包括另一种Euterpe亚种，E.catinga Wallace，其在巴西也有发现并称为
最后，
也包括另一个Euterpe亚种，E.precatoria Martius，发现于玻利维亚并为南美地区所知，也称为
和″jucara″。
″Jucara″是另一种棕榈树。Jucara的拉丁名为阿沙依(Euterpeedulis)，Martius；科，棕榈科。在巴西也称为assai，acai，plamito，palmito doce，iucara，palmito Jucara，ripeira，icara，Jucara，ensarova，palmiteiro。Jucara一词还包括另一个Euterpe亚种，E.espiritosantensis Femandes，其在巴西也有发现并称为″Jucara″。最后，
也包括另一个Euterpe亚种，E.precatoriaMartius，发现于玻利维亚并为南美地区所知，也称为
和″Jucara″。
所有本申请中引用的参考文献在此结合作为参考。
抗氧化性能及其应用
本发明鉴别出两个科的棕榈树(
和Jucara)的果实，具有比其它任何检测的水果或蔬菜显著更高的ORAC分值。
已知
果实含有高比例的单不饱和及多不饱和脂肪酸，以及相对低浓度的饱和脂肪和反式脂肪酸。还已知
果实富含类脂、纤维和蛋白，并含有维生素E和花色素苷，两种已知的抗氧化剂。然而，这些果实在过去没有被充分利用，因为
果实非常易于因氧化和细菌、真菌及酵母等微生物污染而迅速腐败。因此，由
果实制备的水果和果汁腐败很快，迅速失去其可口性和抗氧化功能-几乎一半的花色素苷在果实采摘后两天内分解。为了能将产品推向更广大的市场，在克服
果实和果汁迅速腐败的努力中，一些公司已经尝试将果浆冷冻。然而，用这种方式对
果实进行简单冷冻需要密切监视温度-即使是微小的温度偏差也将导致变质酶和发酵剂的活化。另外，当融化这样冷冻的果浆以使用时，这些试剂仍然被活化并导致果浆粗糙(grittiness)。
前述问题，与其它问题一起，被本发明所解决。明确地，如实施例中所描述，本发明提供了稳定的和可口的
基营养补充剂组合物，其具有比其它任何检测的冷冻水果或蔬菜显著更高的花色素苷浓度和更高的ORAC分值。
作为本发明的结果，目前已明确
果实提供了一个营养补充剂的很好的来源。在本发明之前，该水果主要用作能量饮料或作为具短暂架上保存期的冷冻处理物(frozen treat)的一部分。本发明的
基营养补充剂组合物提供了稳定的和可口的产品，具有显著更长的架上保存时间，同时显著提高了
果实的抗氧化性能。本发明使该水果的高营养特性不但得到保持，而且显著增强，并放心享用而不必担心快速腐败。
虽然前述讨论主要集中于
果实和由其衍生的营养补充剂，本发明还提供了Jucara-基营养补充剂组合物，该组合物也具有比其它任何所测定的冻干果实或蔬菜组合物显著更高的花色素苷浓度并产生更高的2ORAC分值。如下将述，Jucara果实，及由其衍生的营养补充剂，也含有极高水平的原花色素苷类并对羟基自由基(hydroxyl radical)和过氧化亚硝酸盐显示高抗氧化活性。
根据本发明，
果实和Jucara果实、果汁、营养补充剂及其它由
果实和Jucara果实衍生的组合物用于治疗、逆转、和/或预防自由基和氧化应激的有害效应。
自由基和氧化应激
在过去的几十年里，自由基，具高度反应性及因此所导致高度破坏性的分子，其对人类健康和疾病的重要性已越来越多地被认识。许多常见病和威胁生命的人类疾病，包括动脉硬化症、癌症和衰老，都以自由基反应作为潜在的损伤机制。
自由基是一个在外围轨道上具有一个或多个未配对电子的分子。这些分子种类中许多都是以氧(有时是氮)为中心的。实际上，我们呼吸的氧分子就是一个自由基。这些高度不稳定的分子倾向于与邻近分子迅速反应，贡献、吸引或甚至共享它们的外围电子。这个反应不但改变了邻近的靶分子，有时是以意义深远的方式，而且还经常通过靶分子传递未配对电子，产生次级自由基或其它ROS，其可继续与新的靶分子反应。实际上，ROS的高活性许多是源于其产生了这样的分子链式反应，将其效果有效地放大了许多倍。抗氧化剂能提供保护是因为它们能清除在ROS对许多生物分子造成损伤前将其清除，或防止氧化损伤扩散，例如，通过打断脂质过氧化作用的自由基链式反应。
ROS和人类健康
由于我们的身体持续地暴露于来自外部的(阳光、其它形式的射线、污染)和内源性自由基及其它ROS中，ROS介导的组织损伤是大量疾病发生的最后共同通路。
射线损伤
射线损伤代表了一种重要的ROS介导的疾病的原因。极端的例子包括太阳内部和热核爆炸中心的物理化学反应。至于更常遇到的射线水平，取决于具体情况，所受损伤的约三分之二并非由射线本身介导，而是由继发产生的ROS导致。这并有仅仅适用于射线损伤的急性毒性形式，还适用于慢性、诱变(和由此导致的致癌)效果。
这个原理一个重要的临床应用在癌症放射性治疗中常常遇到。大型肿瘤经常生长得超出了其血液供应的能力而使中心的肿瘤细胞死亡，尽管周围的细胞仍然能得到良好的氧供应。在这两个区域之间是一个供氧贫乏的肿瘤区域，但仍能保持存活。这类肿瘤的放射性治疗对周围区域特别有效，在这些区域有充足的氧浓度供应以形成杀肿瘤性ROS。氧贫乏的中心区所受损伤程度显著减小。虽然在中心的死细胞无论如何不能存活，但在这两个区域之间的氧供应贫乏、但仍活着的细胞可在放射性治疗中存活安全的数量，并因此导致肿瘤的后期局部复发。这就是为什么许多大肿瘤通过放射性治疗(以在其边缘杀死肿瘤)和手术切除包括这些特别危险的残存细胞在内的瘤体相结合的方式进行治疗的原因。
癌症和其它恶性肿瘤
癌症和其它恶性肿瘤都有基于细胞遗传信息改变而导致的不受约束的细胞生长和增殖。大多数情况下，例如，通常约束细胞生长和复制的一个或多个基因发生突变，或者是发生失活。这些遗传缺陷直接引起遗传密码的缺失和序列改变，遗传密码即是细胞内的DNA基团。这种DNA损伤常见的最终通常原因是自由基损伤。我们的DNA以每天计所受的无数损伤中，大多数被胞内的正常DNA修复机制所修复，尽管其中一些导致了细胞死亡。由于这些损伤是零星发生的并在基因组内呈一定随机分布，大多数致死性DNA损伤是临床无关性的，仅导致在上百万细胞中损失一些细胞。然而，如果在影响生长调节的损伤中有一个细胞存活，它就可以不受约束地增殖并迅速生长通过正向自然选择而占据细胞数量的主要部分。其结果就是肿瘤，常常是恶性的，其中生长和增殖机制显著缺失。因此，对遗传物质的自由基损伤是致癌的主要最后共同通路。
ROS在胞内的产生不仅可通过外部的放射性源，也可作为体内正常代谢过程的副产物而生成。内源性自由基的一个重要来源是某些药物、污染物及其它化学试剂和毒品的正常代谢，这些物质通称异生素。虽然这些中的一部分具有直接毒性，但许多其余物质通过这些机体对其解毒的代谢过程产生大量自由基流。一个例子是对除草剂百草枯的代谢。曾有一段时间，药品实施管理局(drug enforcement authorities)使用这种除草剂来杀灭大麻植物。种植者意识到他们能够在大麻枯萎前收获喷洒过药物的植株。许多吸食这类产品者随后死于急性肺损伤。幸运地，该方法已经被作为解决此毒品问题的特别不人道的方式而废止了。
百草枯的故事是自由基毒性代谢机制特别突出的例子，许多经常遇到的异生素，包括香烟的烟雾、空气污染物、和甚至酒精也是有毒的，它们在我们体内分解代谢产生的自由基的效果，常常在很大程度上是致癌的。此外，越来越多的证据表明饮食中富含水果和蔬菜，这富含天然抗氧化剂，少含饱和脂肪酸(特别易受ROS攻击而损伤的靶体)，降低了动脉硬化和癌症的风险。
动脉硬化症
动脉硬化是发达社会中死亡和过早伤残的主要原因。此外，目前的预测估计到2020年心血管病，尤其是动脉硬化，将成为全球总疾病负担的最主要原因，总疾病负担定义为从健康寿命中因伤残或早死所减去的年数。动脉硬化是一个复杂的过程，可导致心脏病发作、中风、和因动脉粥样硬化斑堵塞动脉而导致的肢体丧失。这种硬化斑是氧化了的脂肪的一种形式。当自由基与脂质反应，其后果是脂质过氧化，与黄油暴露于空气中的氧时变得腐臭是同样的过程。虽然许多因素影响动脉硬化的发展和严重性，一个主要的因素是ROS-介导的我们低密度脂蛋白(LDLs，或″坏胆固醇″)的过氧化反应。预防心脏病和中风的食疗方法就是部分基于在降低脂肪本身摄取的同时，加入食物抗氧化剂以限制LDL的氧化。这些方法已经使心脏病的死亡率显著降低，但本发明的组合物在将来可以提供一个安全的药学预防，而不必象食疗和运动一样依赖于人的意志。
神经疾病和神经变性疾病
神经疾病和神经变性疾病影响了数以百万的美国人。这包括抑郁症、强迫性神经疾病、阿尔茨海默氏病、过敏、厌食、精神分裂症，以及其它由神经递质水平的不适当的调节或免疫系统功能不适当的调节导致的神经性病症，以及如ADD(注意力缺陷障碍)和ADHD(注意缺陷障碍[伴多动])等行为失常。大量的这类疾病似乎都有ROS毒性作为其神经细胞破坏基本机理的重要组成部分，包括，但不限于，肌萎缩性侧索硬化(ALS，或Lou Gehrig’s病)、帕金森氏病和阿尔茨海默氏症。
缺血-再灌注损伤
当某个器官缺少血液供应(缺血)时会被损伤，这不仅是由暂时性缺氧导致，还由与再灌注血液恢复供应时而再引入的氧发生反应所产生的ROS所导致。在某些临床表现中，这种损伤可通过施用抗氧化剂而预防，给药有时甚至可在缺血期后，但要在再灌注之前。例如，在含有抗氧化剂和其它试剂的溶液中保存肾脏、肝脏及其它器官如今是移植前的常规程序。另一个例子是心脏外科手术中阻止心跳前阻断自由基产生酶功能的药物的应用。这些药物辅助预防当心脏重新启动和血流恢复后的再灌注损伤。这种再灌注损伤机制还被发现在外伤、大手术或休克后的多器官衰竭病人中起重要作用。多器官功能衰竭目前是重症护理室中最主要的致死因素，正进行广泛努力以更好地了解ROS是如何在此症候中起作用的。
衰老
衰老是一个非常复杂的科学认识尚相对模糊的过程。目前有证据表明衰老是一系列的过程，即，一系列受控的机制，并不仅仅是长年累月里磨损和损伤的被动积累。如果衰老是一系列的过程，这些过程中的一些是可能被控制的，或至少是可更改的。这些过程中最重要者包括由自由基和其它ROS介导的分子损伤的积累。最近的研究显示ROS代谢的治疗操作确实能够显著地延长小鼠的总寿命。
孤独症
已开发了许多不同的对孤独症的治疗方法。然而这些治疗方法中许多都是针对疾病的症状而不是原因。例如，从精神分析学到精神药理学的疗法已被应用于孤独症的治疗。尽管某些临床症状可经这些治疗而减轻、案例中的较小部分显示最好也只不过是有一定的改善作用。只有一小部分孤独症患者变得能够象自信的成年人那样生活。
在初步研究中，一种
基的营养补充剂被提供给一个言语非常有限的孤独症儿童，随后报道该儿童的言语有了显著提高。
环加氧酶抑制剂的性质和应用
本发明鉴定出两个科的棕榈树(
和Jucara)的果实，对环加氧酶的两种异构体，COX-1和GOX-2，都具有显著的抑制功能。环加氧酶(有时称作前列腺素内过氧化物合酶)与前列腺素的合成有关。COX-1表达被认为是组成型的，因为观察到基底水平的COX-1的mRNA和蛋白的存在并产生前列腺素以完成正常的生理功能。相反地，COX-2的表达是诱导型的。
根据本发明，
果实和Jucara果实、果汁、营养补充剂、和其它由
果实和Jucara果实衍生的物质用于治疗、逆转、和/或预防与环加氧酶活性增加相关的疾病或损伤。
胃十二指肠粘膜防御
胃上皮处于一系列内生性有毒因子的持续攻击之下，这些因子包括HCl、胃蛋白酶原/胃蛋白酶、和胆汁酸盐。此外，稳定的外源性物质流如药物、酒精、细菌遇到胃粘膜。一个高度复杂的生物系统在适当地提供防御以避免粘膜损伤或修复可能发生的损伤。
前列腺素类在胃上皮防御/修复中起重要的作用。胃粘膜含有丰富的前列腺素。这些花生四烯酸的代谢物调节粘膜碳酸氢盐和粘液的释放，抑制胃壁细胞分泌，并对保持粘膜血流和周围细胞重建很重要。前列腺素类是衍生自酯化的花生四烯酸，该酸由磷脂(细胞膜)经磷脂酶A2的作用而形成。控制前列腺素合成中限速步聚的一个关键酶是环加氧酶(COX)，该酶以两种异构形式存在(COX-1，COX-2)，每一种都在结构、组织分布和表达上有独特的特征。COX-1在包括胃、血小板、肾和内皮细胞等的组织宿主内表达。此异构体能组成型的方式表达并在保持肾功能完整、血小板聚集和胃肠粘膜完整中起重要作用。相反地，COX-2的表达可被炎症刺激所诱导，而且它被表达于巨噬细胞、白细胞、成纤维细胞和滑膜细胞中。用于组织炎症的非类固醇类消炎药(NSAIDs)的有益效果归因于COX-2的抑制。COX-2-抑制剂具有将胃肠道毒性最小化的同时提供降低组织炎症的有益效果的潜力。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎(RA)是一种不明病因的慢性多系统疾病。尽管有许多系统性表现，RA的典型特征是持续性炎性滑膜炎，通常涉及对称分布的外周关节。滑膜炎炎症导致关节破坏和骨腐蚀及继发性关节完整性改变的可能是此病的标志。
RA医学处理的第一步是应用非类固醇类抗氧化药物(NSAIDs)和简单镇痛剂以控制局部炎症进程的症状和迹象。这些药剂在减轻病征和症状上是快速有效的，但它们在疾病的发展上似乎只有很小的效果。NSAIDs阻断了Cox酶的活性并因此阻断了前列腺素类、环前列腺素、和血栓素类的生成。结果，它们具有了镇痛、消炎和退热的功能。此外，这些药剂可能发挥其它消炎效用。由于这些药剂都与广泛的毒副作用谱有关，本发明的天然营养补充剂组合物可提供NSAIDs的无毒替代物。
癌症
环加氧酶已在许多癌症中有所研究，COX-1或COX-2似乎在几种癌症形式中有作用。例如，COX-1和COX-2都显示出在肺癌小鼠中被高度表达(Bauer等.，2000，Carcinogenesis 21，543-550)。据报道COX-1在人巨噬细胞中被烟草致癌物质所诱导并与NFκB的激活相关(Rioux&Castonguay，2000，Carcinogenesis 21，1745-1751)。据报道COX-1但不是COX-2在人卵巢癌中被表达(Dor et al.，1998，J.Histochem.Cytochem.46，77-84)。根据Ryu等人(2000，Gynecologic Oncology 76，320-325)的研究，COX-2的表达在子宫颈癌一期的表达很高。据报道COX-2在人子宫颈癌中被过量表达(Kulkami et al.，2001，Clin.Cancer Res.7，429-434)。最后，据报道COX-1在子宫颈癌中被正调控并提议用COX-1抑制剂来治疗子宫颈肿瘤病症。Sales等，US专利申请20030220266。
根据本发明，
果实和Jucara果实、果汁、营养补充剂、和其它由
果实和Jucara果实合成的物质用于治疗、逆转、和/或预防与环加氧酶活性增加相关的癌症。
药用组合物和制剂
本发明的水果基营养补充剂可单独用于饮料、保健品、输注液、或食物原料，或与其它营养补充剂或治疗剂相结合。本发明的水果基营养补充剂可单独使用或进一步与药用化合物、载体、或具有有利传递性能(即适于传递给受试者)的辅剂制成制剂使用。这样的组合物典型地包含本发明的水果基营养补充剂和药用载体。此处术语“药用载体”倾向于包括任何及所有与药用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和缓释化合物，以及类似物质。合适的载体见述于最新版的Remington′s药学》，业内的标准参考书，在此一并作为参考。这种载体或稀释剂的优选实施例包括，但不限于，水、生理盐水、林格氏液、葡萄糖溶液、以及5％人血清白蛋白。脂质体和非水性载体如非挥发性油也可使用。用这些介质和化合物制备药学活性物质是业内周知的。除非任何常规介质或化合物与该活性成分不相容，否则将其用于此组合物都是计划中的。附加的活性化合物也可被结合到此组合物中来。
本发明的药用组合物制成与计划施用途径相容的制剂。施用途径的例子包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、关节内、动脉内、大脑内、小脑内、支气管内、鞘内、局部的、和气溶胶途径。pH可用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。
口服组合物通常包括一种惰性稀释剂或可食用载体。它们可被包被于凝胶胶囊、囊片中或压缩至片剂中。为了达到经口治疗施用的目的，本发明的水果基营养补充剂可整合于赋形剂中并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可利用流动载体制备以用作漱口剂，其流动载体中的化合物经口应用发出嗖嗖声(swished)并被吐出或咽下。药物相容性粘合化合物，和/或赋形物质可包括进来作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂之类可含有任意的下列组合物，或具相似性质的化合物粘合剂如微晶纤维素、西黄蓍胶、或凝胶；赋形剂如淀粉或乳糖，分散剂如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶状二氧化硅；甜味化合物如蔗糖或糖精；或调味化合物如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味剂(orange flavoring)。
本发明中水果基营养补充剂也可制成栓剂形式的药用组合物(如，与常规栓剂基质如可可脂和其它甘油酯一起)或用于直肠传递的保留灌肠剂。
在一个实施方案中，本发明的水果基营养补充剂与能保护化合物不被机体快速清除的载体共同制备，这些载体如可控释放制剂，包括植入物和微囊传递系统。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类(polyorthoesters)、和聚乳酸。制备这些制剂的方法对专业技术人员将是熟知的。这些材料还可从Alza公司和Nova医药公司以商业途径获得。Liposomal悬液也可用作药用载体。这些可根据业内周知的方法制备，例如，如美国专利No.4,522,811中所述。
制成剂量单位形式的口服制剂或肠道外制剂对易于施用和剂量均匀特别有利。术语剂量单位形式指适合作为对治疗对象的单位剂量的物理不连续的单元，每个单位包含经计算与所需药用载体联合能产生理想治疗效果的预定剂量的活性化合物。本发明剂量单元形式的规格确定于和依赖于水果基营养补充剂的独特性质和要获得的特定治疗效果，以及这些个体治疗用活性化合物混合技术中固有的限制。药用组合物可与施用说明书一起置于容器、包装或分配器内。
本发明经参考下面实施例进一步说明，这些实施例并不意味着限制本发明的范围。本领域技术人员将熟知许多修改，无论是对材料还是方法，可在不偏离本发明目的和权利的情况下实施。
实施例
实施例1冻干
的组成分析
冻干
OPTACAI；Lot#231003/0410-C的组分分析详述于下面表1和表2。
表1
表2
除非另有说明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述进行。待测样品的含水量依AOAC方法参考#926.08测定。待测样品蛋白含量依AOAC方法参考#991.20E测定。待测样品脂肪含量依AOAC方法参考#933.05测定。待测样品灰分含量依AOAC方法参考#935.42测定。待测样品碳水化合物含量根据差异计算。待测样品的热量含量应用Atwarter因子计算。糖含量用AOAC方法参考#982.14测定。待测样品内总食物纤维素用AOAC方法参考#991.43测定。待测样品胆固醇含量用AOAC方法参考#994.10测定。待测样品脂肪酸谱用AOAC方法参考#969.33测定。待测样品钠、钙和铁含量用AOAC方法参考#984.27测定。待测样品内维生素C含量用AOAC方法参考#967.22测定。待测样品内维生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法测定。微生物测定基本按实施例36(见下文)中所详述进行。痕量矿物质/金属用IBC实验室(Integrated BiomoleculeCorporation，Tucson，AZ)的IPC/MS(Aligent HP-7500a)方法分析。
实施例2 冻干
组成分析
冻干
FD浆果粉(lot# 231003/0410-C)成分分析由IBC实验室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)进行。结果详见下面表3。
表3
除非另有说明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述进行。待测样品的含水量依AOAC方法参考#926.08测定。待测样品蛋白含量依AOAC方法参考#991.20E测定。待测样品脂肪含量依AOAC方法参考#933.05测定。待测样品灰分含量依AOAC方法参考#935.42测定。待测样品碳水化合物含量根据差异计算。待测样品的热量含量应用Atwarter因子计算。糖含量用AOAC方法参考#982.14测定。待测样品内总食物纤维素用AOAC方法参考#991.43测定。待测样品胆固醇含量用AOAC方法参考#994.10测定。待测样品脂肪酸谱用AOAC方法参考#969.33测定。待测样品钠、钙和铁含量用AOAC方法参考#984.27测定。待测样品内维生素C含量用AOAC方法参考#967.22测定。待测样品内维生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法测定。痕量矿物质/金属用IBC实验室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)的IPC/MS(AligentHP-7500a)方法分析。
实施例3冻干
营养分析 [O117]一份100克冻干
的营养分析由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547501)进行。结果详见于下面表4。
[O118]表4
除非另有说明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述进行。待测样品的含水量依AOAC方法参考#926.08测定。待测样品蛋白含量依AOAC方法参考#991.20E测定。待测样品脂肪含量依AOAC方法参考#933.05测定。待测样品灰分含量依AOAC方法参考#935.42测定。待测样品碳水化合物含量根据差异计算。待测样品的热量含量应用Atwarter因子计算。糖含量用AOAC方法参考#982.14测定。待测样品内总食物纤维素用AOAC方法参考#991.43测定。待测样品胆固醇含量用AOAC方法参考#994.10测定。待测样品脂肪酸谱用AOAC方法参考#969.33测定。待测样品钠、钙和铁含量用AOAC方法参考#984.27测定。待测样品内维生素C含量用AOAC方法参考#967.22测定。待测样品内维生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法测定。
实施例4冻干Jucara果实的营养分析
100g份量冻干Jucara果实的营养分析由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378581)进行。结果详见于下面表5。
表5
除非另有说明，所有方法依Official Methods of Analysis ofAOAC International，17版，2000年(下文，AOAC)中所述进行。待测样品的含水量依AOAC方法参考#926.08测定。待测样品蛋白含量依AOAC方法参考#991.20E测定。待测样品脂肪含量依AOAC方法参考#933.05测定。待测样品灰分含量依AOAC方法参考#935.42测定。待测样品碳水化合物含量根据差异计算。待测样品的热量含量应用Atwarter因子计算。糖含量用AOAC方法参考#982.14测定。待测样品内总食物纤维素用AOAC方法参考#991.43测定。待测样品胆固醇含量用AOAC方法参考#994.10测定。待测样品脂肪酸谱用AOAC方法参考#969.33测定。待测样品钠、钙和铁含量用AOAC方法参考#984.27测定。待测样品内维生素C含量用AOAC方法参考#967.22测定。待测样品内维生素A含量依Reynolds和Judds，Analyst，109489，1984所述方法测定。
实施例5冻干
粉中甾醇类的定量分析
冻干
粉(#001
Powder；Flora ID No.210823003)中甾醇成分用高分辨气相色谱(HRGC)(Flora Research Laboratories，Grand Pass，OR)测定，如表6所述。
表6
待测样品中固醇含量用配备了FID和自动进样器的HewlettPackard 5890 II系列气相色谱仪测定，采用INA方法109.001。用5-α-胆甾烷作标准物(Matreya，Inc.Pleasant Gap，PA)。这些分析所用的柱子是Restek Rtx-5，5％二苯基-95％二甲基聚硅氧烷，60m×0.25mm，0.25μm膜厚。
实施例6冻干
残留水含量(Residual Humidity)分析
制剂的残留水含量在冻干前后用Instituto Adolfo Lutz(1976)(UNIVERSIDADE DE
PAULO，Faculdfáde do Ciencias FarmacéuticasDenartamento de Alimentos e Nutricilio Experimental Laboratorio de Analistede Alimentos)方法测定。
果浆粗制品的水含量为85.37+/-0.14％。冻干
果浆的残留水含量为1.06％。antocianinas总共(mg/100g
果浆)为239.32+/-0.74，用Francis & Fuleki，(J.Food Sci，V.33，p.72-77，1968)方法测定。图1显示了冻干
粉的典型吸收谱。
实施例7 Jucara和
制剂中花色素苷和酚类化合物分析
I.概述
A原花色素类(proanthocyanidins)
原花色素可能有助于解释“法国悖论”，或为什么低冠心病发病率存在于法国以脂肪类食物和红酒消费高而知名的省份中。红酒可被认为是一些有效的黄酮类化合物的酒精浸出液，这些黄酮类化合物包括葡萄籽中的原花色素类。在一个挑战性的研究中，Fulvio Ursini，M.D.，来自意大利Padova大学，对志愿者喂以配有或不配有红酒的高脂肪餐。他发现在那些喝红酒者体内餐后血浆内过氧化物水平要低得多(Ursini F，等Post-prandial plasma peroxidesa possible link between diet andatherosclerosis.Free Rad Biol Med 1998；25250-2.)。
伴有疫学证据的一系列动物和体外研究以及少量的初级人体研究揭示了与这些化合物相关的大量保健效果。这些益处中主要的是对心脏病和癌症的抗氧化性保护。
原花色素类-更专业地称为原花色素低聚物，并由此称为OPC-是一类黄酮类化合物。以前称为“缩合单宁”，所有原花色素都是化学相似的，区别仅在于它们聚酚环的形状及连接物的轻微变化。自然中，一大堆不同的原花色素总是被同时发现，范围从单个单元到许多相连单元(低聚物)的复杂分子。
原花色素是一组高度特异的生物类黄酮，从1960年代后期开始因其血管壁增强功能和自由基清除活性而得到广泛研究。原花色素是已知最具潜力的自由基清除剂，具有比维生素E高达50倍和比维生素C高达20倍的抗氧化能力。原花色素还具对细胞膜的亲和性，这为降低毛细血管通透性和脆性提供了营养支持。尽管生物类黄酮在自然界中广泛分布，强效的原花色素化合物是最丰富的并可从海岸松树皮和葡萄种子或果仁中得到。
欧洲越桔浸出物含有声称具增视功能和已证明有血管增强功能的花色素类。据称欧洲越桔能降低视觉疲劳并通过其对视紫红质-视蛋白系统的亲和而改善从亮处到暗处的调节性，视紫红质-视蛋白系统是介导亮和暗视觉和昏暗处视觉适应的色素系统。然而，在以色列和美国做的两项军用研究并未能从欧洲越桔浸出物中发现任何这种好处。无论如何，该浸出物可能促进了视网膜自身的酶学抗氧化防御。
在血管系统中花色素浸出物通过增加细胞内维生素C水平来支持血管壁的完整性，降低了某些蛋白水解酶/溶酶体酶的透化效果，稳定细胞膜，并刺激胶原和结缔基质组织的合成。
葡萄籽(种子)是原花色素或pycnogenols的潜在资源。JacquesMasquelier，Ph.D.，原花色素研究的开创者和术语″pycnogenol″的创造者，在其第二阶段的原花色素研究中使用了葡萄种子浸出物。
体外研究认为OPC类还提供了癌症保护。Vaccinium-科浆果中的OPC类，包括蓝莓、越橘(lingonberry)和酸果蔓，能阻断肿瘤生长，这通过阻止肿瘤细胞内蛋白合成而防止其增殖而实现(Bomser J，和Madhavi D.L.In vitro anticancer activity of fruit extracts from Vacciniumspecies.Planta Med，1996；62212-6.)。同样是在实验室中，大麦麸中的OPC使为骨髓白血病细胞转变为非癌性(Tamagawa K，和Fukushima S.Proanthocyanidins from barley bran potentiate retinoic acid-inducedgranulocytic and sodium butyrate-induced monocytic differentiation of HL60cells.Biosci Biotechnol Biochem，1998；621483-7.)。另一个体外实验发现一种获得专利的葡萄种子浸出物杀死了癌细胞，抑制了人乳腺癌、肺癌、胃癌和骨髓性白血病细胞的达73％的细胞生长，并提高了正常细胞的生长(Ye，X.和Krohn.R.L.The cytotoxic effects of a novel 1H636 grape seedproanthocyanidin extract on cultured human cancer cells.Mol Cell Biochem，1999；19699-108.)。
原花色素可保护机体免受许多潜在毒性试剂的损伤。醋氨酚，泰诺林TM中的活性组合物，是潜在的肝毒素，在美国每年导致75,000例需住院治疗的中毒。动物实验显示用100mg/kg的一种专利葡萄种子浸出物预处理一周防止了醋氨酚对肝脏的损伤。器官的损伤通过研究肝细胞受损状况和监测动物的健康来评估(Ray SD，等A novel proanthocyanidin 1H636 grape seed extract increases in vivo bcl-XI expression and preventsacetaminophen-induced programmed and unprogrammed cell death in mouseliver. Arch Biochem Biophys.，1999；369(1)42-58.)。
原花色素类可能比预防疾病做得更多；它们能帮助延缓衰老并减少衰老的可见迹象。氧化损伤导致了我们皮肤上大多数衰老的可见迹象。通过防止这种损伤，皮肤将保持年轻的样子。达到这个目的的一个方法是减少紫外(UV)线的损伤效果。防晒产品已经合并了多种抗氧化剂意在它们将防止阳光对皮肤的损伤。在一项研究中，葡萄种子的OPC类独自发挥了与维生素E有相同效果的抗氧化作用一可保护不同多不饱和脂肪酸免受紫外线导致的过氧化反应(Carini M.，等The protection ofpolyunsaturated fatty acids inmicellar systems
UVB-inducedphoto-oxidation by procyanidins from Vitis vinifera L.，and the protectivesynergy with vitamin E.Infl J Cosmetic Sci.，1998；20203-15.)。同样是在该研究中，葡萄源OPC类与维生素E协同作用，使其失活形式转变为活性形式并因此起到有效的维生素E补充剂的作用。
衰老过程的一部分是弹性蛋白酶对皮肤的降解，该酶与炎症反应有关。OPC类特异性地阻断弹性蛋白酶，因此保持了弹性蛋白的完整性(Meunier MT，和Villie F.The interaction of Cupressus sempervirens L.proanthocyanidoiic oligomers with elastase and elastins.J Pharm Beig.，1994；49453-61.)。
如果动物实验的结果可适用于人类，OPC类甚至能帮助长出一头更浓密的头发。日本研究者给小鼠剃毛后发现它们毛发中的40％能自然生长回复。然而，当将三种花色素中的任一种的1％溶液施用于皮肤，70％到80％的毛发生长回复了。试管实验证实OPC类确实刺激了毛发角质形成细胞生成比对照多三倍的毛发(Takahashi T，et al.Procyanidin oligomersselectively and intensively promote proliferation of mouse hair epithelial cellsin vitro and activatehairfollicle growth in vivo.J Invest Dermatol.，1999；112310-6.)。
B.酚类化合物藤黄菌素-4’-葡萄糖苷
抑制巨噬细胞中促炎症反应细胞因子的生成。抗癌类黄酮毒性真核DNA拓扑异构酶I
II.冻干JUCARA粉中花色素苷的测定
冻干Jucara粉中的花色素苷谱用LC/MS/MS测定并显示于图2。图2中LC/MS/MS的峰结果总结于表7。
花色素苷和OPC分析(酚类化合物)按下面详述进行。简要地，粉状样品同时差别地被水和乙酸乙酯萃取。收集各层并过滤除去固体。完整的花色素苷从水层用HPLC在Zorbax 5μm 150×4.6mm的C-18柱上以梯度流动相(1ml/分钟流量)分析，流动相包括A(0.5％磷酸)、B(水∶乙腈∶乙酸∶磷酸-50∶48.5∶1∶0.5)，梯度程序为初始100％A，20分钟80％A，30分钟40％A，36分钟80％A。用外部标准物进行定性/定量。低聚原花色甙从乙酸乙酯层在蒸发干燥并复溶于无水乙醇后分析。色谱在Phenyl-hexylLuna 3μm 250×3.5mm柱上用梯度流动相进行，流动相包括。A(水∶乙腈∶乙酸-89∶9∶2)、B(水∶乙腈-20∶80)，梯度程序为初始100％A，25分钟60％A，32分钟100％B，40分钟100％A。通过基于母体表儿茶酸和儿茶酸环结构的消光系数的原理进行鉴定/定量。
表7
冻干Jucara粉中的花色素苷类的结构见图3
III.冻干
粉中花色素苷的测定
冻干
粉中的花色素苷谱用LC/MS/MS测定并显示于图4。图4中LC/MS/MS的峰结果概括于表8。
表8 依前所述进行分析
冻干
粉中的花色素苷类的结构见图5。
IV.冻干Jucara粉和冻干
粉中花色素苷的含量
冻干Jucara粉和冻干
粉中花色素苷的含量概括于表9。
表9花色素苷的含量
依前所述进行分析。
V.冻干Jucara粉中各种酚类的鉴定
用HPLC和质谱分析冻干Jucara粉中各种酚类谱系并示于图6。
图6中的HPLC峰结果概括于下面表10。
表10酚类峰鉴别及其质谱数据
冻干Jucara粉中存在的各酚类化合物的结构显示于图7。冻干
粉中未发现有大量的酚类化合物。分析依前文所述进行。
VI.冻干
粉和冻干JUCARA粉中原花色素类的测定
冻干
粉和冻干Jucara粉的原花色素类谱用色谱法测定并显示于图8。如图8所详示，原花色素谱。B1是表儿茶精和儿茶素。从B2到B8的峰代表从二聚体到八聚体的B类原花色素苷。A2是由质谱显示具有一个A类黄烷间键的二聚物。图8所显示的峰结果总结于表11。
表11冻干样品中的原花色素含量
Jucara含有非常高水平的原花色素，以及，抗羟基自由基和过氧化亚硝酸盐的高抗氧化活性。图9显示了冻干
粉和冻干Jucara粉中检测到的原花色素类的典型结构。分析依前文所详述进行。
实施例8冻干
浆果粉中花色素苷含量组成分析
冻干
FD浆果粉(lot# MAL001)中花色素苷成分的分析由IBC实验室(Integrated Biomolecule Corporation，Tucson，AZ)完成。结果详示于下面表12。
表12
花色素苷和OPC分析依Brunswick实验室所用方法进行。简要地，粉状样品同时分别用水和乙酸乙酯萃取。收集各层并过滤除去固体。完整的花色素苷从水层用HPLC在Zorbax 5μm 150×4.6mm的C-18柱上以梯度流动相(1ml/分钟流量)分析，流动相包括A(0.5％磷酸)、B(水∶乙腈∶乙酸∶磷酸-50∶48.5∶1∶0.5)，梯度程序为初始100％A，20分钟80％A，30分钟40％A，36分钟80％A。用外部标准物进行定性/定量。低聚原花色甙从乙酸乙酯层在蒸发干燥并复溶于无水乙醇后分析。色谱在Phenyl-hexyl Luna 3μm 250×3.5mm柱上用梯度流动相进行，流动相含有A(水∶乙腈∶醋酸-89∶9∶2)B(水∶乙腈-20∶80)，采用下述程序-初始100％A，25分钟60％A，32分钟100％B，40分钟100％A。通过基于母体表儿茶酸和儿茶酸环结构的消光系数的第一原理进行鉴定/定量。
实施例9冻干
的脂肪酸分析
冻干
果浆的脂肪酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547512)完成。结果详述于表13、表14和表15。
表13
表14
表15
除非另有说明，所有方法依Official Methods of Analysis of AOAcIntemational，17版，2000年(下文，AOAC)中所述进行。待测样品的脂肪酸谱依AOAC方法参考#969.33测定。
实施例10冻干Jucara果实的脂肪酸分析
冻干Jucara果实的脂肪酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378575)完成。结果详述于表16、表17和表18。
表16
表17
表18
除非另有说明，所有方法依Official Methods of Analysis of AOAcInternational，17版，2000年(下文，AOAC)中所述进行。待测样品的脂肪酸谱依AOAC方法参考#969.33测定。
实施例11冻干
的氨基酸分析
通过离子交换色谱和柱后衍生化分析氨基酸
氨基酸分析依下述常规步聚进行。
A.原理
本方法用6N盐酸水解后再用离子交换色谱定量测定氨基酸含量。邻苯二甲醛(O-phthaldehyde)被用于柱后衍生及随后的荧光检测。
B.范围
本方法适用于配料、含有混合饲料蛋白的物质。
f0190]C.关键点
干燥样品时避免蒸发时间过长。可能会发生某些氨基酸的损失。
D.试剂和药品及方法 1.水，HPLC级，EM Science EM WA0004-1或家用水纯化系统 2.邻苯二甲醛，试剂级，Anresco 0317。
3.氨基酸标准溶液，2.5pmol/mL，Sigma A9531。
4.甲醇，HPLC级，chempure 831-295或相当产品 5.Brij 3溶液，30％(w/w)，Sigma 430Agr.6 6.2-巯基乙醇，(2-羟基乙硫醇)，Sigma M-6250。
7.L-正亮氨酸，SigmaN-6877。
8.皮氏缓冲液，pH 2.2、3.28和7.40，Picketing laboratories Na 220、Na 328和Na 740。
9.氢氧化钾，颗粒，Chempure 831-706。
10.氢氧化钠，颗粒，Chempure 832-050。
11.盐酸，6N标准溶液，Chempure RR-155。
12.乙二胺四乙酸EDTA四钠盐，水合物，Sigma ED4SS。
13.氮源 14.硼酸，Chempure 830-314。
15.正亮氨酸内标-在分析天平上称重0.1mg，0.1640g的正亮氨酸。转移到1000mL容量瓶中。加入250mL HPLC级水。加入1mL浓盐酸并混匀。用HPLC级水补齐体积，混合并超声处理。此溶液将含1.25 pxn/mL L-正亮氨酸。冷藏以避免细菌生长。
16.氨基酸标准溶液-将氨基酸标准溶液瓶暖至室温。吸取5.0 mL到50ml容量瓶中。吸取10.0mL的1.25pm/mL L-正亮氨酸内标到相同的50ml容量瓶。用HPLC级水补齐体积。充分混全并超声处理几分钟。转移标准溶液入4mL Waters样品瓶中，0℃保存。
17.氢氧化钾溶液，50％-在最大载量天平上，称150g的氢氧化钾置入称重过的1升Nalgene容器中。用150g去离子水溶解，如有必要则搅拌。用前使溶液冷却至室温。
18.硼酸缓冲液-称122克硼酸入称重过的2000ml烧杯并加入1800ml的HPLC级水。用50％氢氧化钾溶液调pH到11.0。转移此溶液至4升玻璃水壶中用HPLC级水充满(4升)并充分混合。终溶液的pH应在10.4。
19.皮氏缓冲液流动相 a.pH 3.28-此缓冲液可从瓶中取出使用。用0.45pm过滤膜过滤并在用于HPLC前真空超声脱气。
b.pH 7.40-此缓冲液可从瓶中取出使用。用0.45pm过滤膜过滤并在用于HPLC前真空超声脱气。
20.氢氧化钠，0.2N-称16克氢氧化钠颗粒入一个2升容量瓶。加入约1000mL HPLC级水并混合至氢氧化钠溶解。称0.5g EDTA，加入此容量瓶。用HPLC级补剂体积，混合并用0.45mm滤膜过滤。用塑料加仑壶作为HPLC用的容器。定期过滤。
21.邻苯二甲醛-称1.4g邻苯二甲醛(OPA)晶体入50mL烧杯。加20mLHPLC级甲醇并超声处理至晶体溶解。将溶液加入到一个约含1500ml硼酸缓冲液的2升容量瓶中混匀。在通风橱中，加入4.0mL 2-巯基乙醇(恶臭！)。用硼酸盐缓冲液补齐体积并混匀。用0.45pm滤器过滤溶液。将滤过的溶液倾入两个1升的Nalgene瓶中并在每个瓶中加3.0mL Brij-35。用氮盖住瓶子并充分混合。冷藏至需用。OPA溶液在此条件下稳定约1周(可延长至2周)。
E.设备及仪器 1.Waters 712B型自动注射器或等价产品。
2.Waters 6000型泵(2)，Water 2100或等价产品。
3.Digital Pro380附Waters Expert软件或等价产品。
4.Kratos FS-950荧光检测器或等价产品。
5.Kratos URS 051柱后泵或等价产品 6.Fiatron柱加热器，Eppendorf CII-30或等价产品。
7.Fisher Isotemp炉，215P型或等价产品。
8.Savant Speed Vac浓缩器，SVC-20011型。
9.Savant冷凝疏水器，RT-490型。
10.Savant化学疏水器，SCT-120型。
11.Savant一次性酸蒸汽中和仓，DC12OA型。
12.Precision直驱真空泵，Dd-310型或等价产品。
13.真空计，Waters Pico-Tag工作站或等价产品。
14.Glass-Col小型脉冲旋涡器，58216型或等价产品。
15.Beckman pH140计，Beckman 123118或等价产品 16.Mettler分析天平，AE16O型或等价产品 17.Millipore溶剂过滤器，Waters 85116 18.Interaction-载钠离子交换柱，带保护柱。Interaction色谱仪AMI 1. 19.Bransonic超声水浴220型 20.Mettler顶加载天平，P-1000型 21.Pipeman。Gilson，1ml和5ml，Rainin P4000和P-5000 22.通用lit pipes枪头，1mL SoS mL，Rainin 23.带Luer-Lok的Plastipak注射器，3cc×1/10cc，BI)9585或等价产品。
24.针式滤器，聚丙烯，聚四氟乙烯，0.45微米，Nalgene 199-2045。
25.Magna尼龙66膜，47mm直径，0.45微米孔径，Fisher N045PO410。
26.RepipetII分配器，S mL，Fisher 13-687-62A。
27.Universal fir pipes枪头，200-100C)d.VWR 53508-819。
28.一次性培养管，12×75mm，硼硅酸盐玻璃，VWR 60825-550或等价产品。
29.样品瓶组，4mL，包括接头和PFET隔膜，Waters 73108 30.带弹簧的低体积插入物，塑料，4mL样品瓶用，Waters 72163。
31.Firestone阀，快速冲洗，Ace Glass mc，8766 32.培养管，一次性，20×150mm，螺口盖，硼硅酸盐玻璃，VWR60826.280。
33.一次性培养管的螺口盖，20mm 0])，PTFB垫，VWR 60828-570。
34.Brinkman离心磨碎机，ZM-1型(带0.5ruin screen)或等价产品。
F.样品制备
样品被尽可能研磨细以保持最小失水。用Brinkman离心磨碎机(型号ZM-1)或等价产品研磨样品，用0.5mm筛得到研细的研磨物。
G.步骤 1.分析天平校正并归零。
2.在氨基酸分析称重前对样品的蛋白含量有所了解是有帮助的。对此有所了解后，在分析天平上称出相当于含20mg蛋白的样品(参见FreeAmino Acid Determination附录)。对于几乎纯净的样品，称大约38mg。在实验室记事本上记录所称重量。样品随后定量地转移入有标记的20×150旋转螺口培养管。
3.用Repipet II分配器，将15mL 6N盐酸加入每个培养管。因为样品经过研磨且数量很少，避免使用可能造成培养管内样品损失的汲出(drafts)。
4.在通风橱内，将75微升2-巯基乙醇加入每个培养管(注1)。这能够更好的测定L-蛋氨酸峰。
5.将每个培养管firestone化(注2)，在氮气(10-12 psi)和真空间至少每种切换5次。
6.样品在氮下时旋上PTFE-表面的盖子。
7.培养管置于炉内110℃±2℃24小时。
8.组装Savant蒸发系统。使用前至少2小时前开启系统电源，这样冰箱单元才能有足够的时间达到-92℃的工作温度。真空泵油彻底脱气。如果需要，这一点通过打开泵上载气阀和打开泵进行。通常一小时是足够的。完成后合上载气阀并关闭泵。
9.24小时后，从炉中取出培养管并冷却至室温。
10.向每个培养管中加入5mL HPLC级水。旋上盖子充分混合。
11.向每个培养管中加入5mL正亮氨酸内标(1.25 pm/mL)(注3)。(在此如必要的话分析可暂停至下一天进行。如需保存过夜则将培养管保存于0℃。) 12.使用1mL的pipetman，将2mL水解产物转移至有标记的12×75mm一次性培养管。
13.打开高速真空浓缩器的盖子，将含2mL水解产物的试管围绕转子置入位置以使负载良好平衡。
14.关上盖子，打开通风口开始离心。当转子达到其操作转速进时，关闭真空计的通风口打开真空泵。如有必要，蒸发过程可能需过夜进行。当在一天的晚些时候蒸发许多样品将会是这样。
15.样品干燥后(真空计读数小于500毫升)，缓慢打开通风口向箱内通入空气。关闭泵，当箱内彻底通气后立即关闭离心机，取出试管。
16.将3mL皮氏钠稀释剂220加入每个试管并在旋涡混合前作短暂超声处理。
17.在3mL注射器上附0.45pm滤器。制备的水解产物滤至一个有标记的含有带弹簧的Waters低体积插入物的4mL小瓶中，然后置于712B上。
18.HPLC条件 a.所有缓冲液和OPA溶液真空超声脱气。缓冲液管置入相应的缓冲液中，OPA管置入OPA溶液中。用3.28缓冲液以0.5mL/分钟的流速平衡柱子至少20分钟。
b.荧光计的灵敏度档设到450，范围为0.5，时间常数为1秒，背景抑制为′to″。
c.柱加热器温度设为60℃并在运行中监控。
d.开启OPA泵并将流速设为0.50mL/分钟(如有必要在下游调节)。
e.将标准样置于WISP的位置#1和#2上。建立多个方法和/或方法表并注入20 F1标准样。用60分钟完成运行。观察结果的色谱。如色谱不满意则注射第三次。
f.每测5个样品作一个标准样。更新了的响应系数将会产生并被应用于随后的进样。
g.如果谱峰超出了窗口，重处理样品并在校正表中调整保留时间以march该样品的保留时间。打印并保存更正过的新谱图。
h.用2种缓冲液进行梯度洗脱使用Waters软件，用2个缓冲液建立一个令人满意的梯度以洗脱氨基酸。泵表19如下
表19标准泵表
J.计算 响应因子＝氨基酸量(mg)x正亮氨酸面积(内标) 氨基酸面积 然后RF×样品氨基酸面积＝氨基酸浓度(mg) 正亮氨酸内标面积 由于样品体积决定了最终浓度，氨基酸浓度乘以样品体积＝最终氨基酸浓度
K.注释 1.如果必要，可以用巯基乙酸替换-如果所用Brij-35不能很好保留Lrs quek。
2.Firestone步骤包括在超声浴内交替抽空和用氮气清洗酸-样品溶液。这使溶液脱气并在酸上面创造了一个惰性气体氛围从而使水解过程中氨基酸的氧化达到最小。
3.用一个5mL的pipetman，用室温水校至5.000B±0.005g。
4.在良好真空下，样品会在管内冻结。如果是这样，约45至60分钟后，取出试管并在含热水的烧杯内加热水解产物。将试管放回转子继续蒸发。
L.确认
M.质量控制 1.依照质量保证手册中所详述的标准品质量保证规范 2.对照标准品(第二标准品)应包括于每次样品检测中。目前使用酪蛋白作为对照品。
3.对照标准品的结果将被记录于实验室记录本中。
4.标准品重复测定误差不得超过8％。
5.记录本由进行检测的分析员初始化并注明日期。
6.记录本登记由本部门内另一分析员检查、了解、初始化并注明日期。
N.参考文献 1.JAOACVol 65，No.2，1982，pp 496-497.Calculated ProteinEfficiency Ration. 2.Degussa-Literature Digest for the Feedstuffs Industry-Amino AcidAnalysis.Chemie/Anwendungstechnik HanauStadtteil Wolfgang，Fed.Rep.ofGermany. 3.The Peptides，Vol.4，Amino Acid Analysis of Peptides，Ch 5.pp217-259，JR Benson，P.C.Louie and LA.Bradsbaw.Copyright 1981，AcademicPress，Inc. 4.USDA Chemistry Laboratory Guidebook，G-41 5.IAOAGVol.68，No.5，1985，pp811-821.Sample Preparation forChromatography of Amino AcidsAcid Hydrolysis of Proteins.
II.冻干
果浆的氨基酸分析
冻干
果浆的氨基酸分析由Silliker，Inc.Illinois Laboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.170547512)完成。结果详见表20。
表20
实施例12冻干Jucara果实的氨基酸分析
冻干Jucara果实的氨基酸分析由由Silliker，Inc.IllinoisLaboratory(Chicago Heights，IL；laboratory ID No.171378575；如实施例11所详述)完成。结果详见表21。
表21
实施例13用ORACFL分析对冻干Arai和所选蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
I.常规ORAC分析
ORAC分析是Cao等人开发，并最初报道于1993年″Cao G，Alesslo HM，Cutler RG，Oxygen radical absorbance capacity assay forantioxidant.Free Rad.Biol.Med.199314303-11″。为使分析过程自动化进行了一些修改并报道于1995年″Automated Assay of Oxygen RadicalAbsorbance Capacity with the COBAS FARA II Guohua Cao，Carl P.Verdon.Akin H.B.WU，Hong Wang和Ronald L.Prior，CLINICAL CHEMISTRY，Vol.41，No.12，1995″。
从那以后，自动化了的ORAC分析得到广泛覆盖和应用，并且因此，ORAC值已经变得常见于研究中和天然产物市场。BrunswickLaboratories于1997年购买了两台COBAS FARA 11分析仪，复制了由Cao、Prior等人开发的自动化方法，如今，已经建立了一个包含超过5000个点的数据库，包括了水果、蔬菜、饮料、谷物、功能性/工程性食物、浸出物以及其它天然产品资源的ORAC数据。
Brunswick Laboratories，与USDA一起，引进了一种新的荧光探针，荧光素，在与β-藻红蛋白进行并行比较下已经在几百个样品中进行了检测。荧光素，不象β-PE，不与待测样品相互反应，并且作为合成的化合物，荧光素没有可检测到的批间差异。最重要的是，在相同条件下进行多次检测的样品保持了一致和可重复的结果
以荧光素作为荧光探针的ORAC分析的开发已经通过与初始自动化ORAC分析的开发者们合作而被实施了，初始的自动化ORAC分析以β-PE为荧光探针。基于广泛的机械化研究，两个团体都锁定了基于荧光素的ORAC分析作为新的ORAC方法标准。此处所述这两种ORAC分析方法通过使用下标区分藻红蛋白使用PE，ORACPE，荧光素使用FL，ORACFL。
II.对冻干
粉的分析及其和和所选蔬菜的的比较
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104.；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(图10)。冻干
粉的ORAC值测定为442μmolTE/g。这个值比紫甘蓝高出10倍(42μmol TE/g)(图10)。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例14用ORACFL分析对冻干
和所选新鲜水果的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brumswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选新鲜水果的抗氧化活性(如上所述)(图11)。如图11所示，冻干
粉的ORAC值(536μmole TE/g)比无论是新鲜
(185μmole TE/g)还是黑树霉(black raspberry)(164μmole TE/g)的ORAC值都高2倍以上。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例15用ORACFL分析对冻干
和所选新鲜水果的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选新鲜水果的抗氧化活性(如上所述)(图12)。冻干
粉的ORAC值测定为442μmole TE/g。这个值是黑树霉(164μmole TE/g)的2倍以上。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例16用ORACFL分析对冻干
和所选水果的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选水果的抗氧化活性(如上所述)(图13)。如图13所示，冻干
粉的ORAC值为442μmol TE/g。冻干Jucara粉的ORAC值为1193 TE/g。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例17用ORACFL分析对脱水
和所选新鲜水果的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(23100/0410-C；Brunswick Lab ID 03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选新鲜水果的抗氧化活性(如上所述)(图14)。如图14所示，冻干Aqai粉的ORAC值(536μmol TE/g)是黑树霉(164μmol TE/g)ORAC的3倍以上。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例18用ORACFL分析对冻干
和所选新鲜蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选新鲜蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(图15)。如图15所示，冻干
粉的ORAC值(536μmol TE/g)是紫甘蓝的ORAC值(42μmol TE/g)的10倍以上。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例19用ORACFL，分析对所选水果、蔬菜和坚果的抗氧化能力进行的比较分析
图16显示用ORAC分析技术测定的水果、蔬菜和坚果的抗氧化活性(Brunswick Laboratories，Wareham，MA；如上详述)。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例20用ORACFL分析对冻干
和所选坚果的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉(Brunswick Lab ID.02-0104；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选坚果的抗氧化活性(如上所述)。冻干
粉的ORAC值为442μmol TE/g。这个值是美洲山核桃的ORAC值(164μmol TE/g)的4倍以上(图17)。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例21用ORACFL分析对脱水
和所选脱水水果和蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了脱水
(BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选脱水水果和蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(图18)。如图18所示，脱水
粉的ORAC值(536μmolTE/g)比脱水黑树霉(340μmol TE/g)ORAC值高。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例22用ORACFL分析对脱水
和所选新鲜蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了脱水
(BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选新鲜蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(图19)。如图19所示，脱水
粉的ORAC值(536μmol TE/g)比紫甘蓝的ORAC值(42μmol TE/g)高出10倍以上。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例23 ORAChydro分析对脱水水果和蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
表22总结了脱水水果和蔬菜(Brunswick Laboratories，Wareham，MA)经ORAChydro分析技术测定的抗氧化活性(如上所述)。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
表22
实施例24 ORAChydro分析对脱水水果和蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
表23总结了脱水水果和蔬菜(Brunswick Laboratories，Wareham，MA)经ORAChydro分析技术测定的抗氧化活性(如上所述)。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
表23
实施例25用ORACFL分析对冻干
和所选脱水水果和蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
用ORACFL分析技术测定比较了冻干
粉末(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Bnmswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性和所选脱水水果和蔬菜的抗氧化活性(如上所述)(图20)。如图20所示，冻干
粉的ORAC值(536μmol TE/g)高于脱水黑树霉的ORAC值(340μmol TE/g)。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例26用Trans-Reveratrol分析对冻干
粉进行的抗氧化能力分析
冻干
粉(231003/0410-C；Brunswick Lab ID.03-2096；Brunswick Laboratories，Wareham，MA)的抗氧化活性经Trans-Resveratrol分析(如上所述)测定为1.1μg/g。
使用HP1100系列HPLC用HPLC色谱法分析样品，配有带2个条形预过滤器和自动取样器/进样器的Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl(250×4.6mM)，二元HPLC泵，柱加热器，二极管阵列检测器，和荧光探测器。流动相A2是去离子水∶乙腈∶乙酸(89∶9∶2 v/v)。流动相B2是乙腈∶去离子水(80∶20v/v)。所有生物样品存放于-80℃冷冻机内至分析用。所有干燥的和水果样品用20ml甲醇(MeOH)萃取。萃取后的样品用超声处理1小时。将所有样品在4℃下以14000rpm离心5分钟。以1ml/min的流速用35分钟的运行时间和10分钟运行后时间来分析样品。保留时间大约是26分钟。梯度如下设置10分钟处0％B；25分钟处40％B；32分钟处100％B；35分钟处100％B。监测280nm处的光吸收。用HPLC定量化合物是在已知溶液中测定化合物未知浓度的过程。这包括向HPLC注入一系列已知浓度的Resveratrol标准化合物溶液进行检测。这些已知浓度的谱图将给出一系列与所注化合物浓度相关的谱峰。
实施例27 Jucara和
制剂中对羟基和过氧化亚硝酸盐的抗氧化活性分析
I.概述
A.过氧化亚硝酸盐
过氧化亚硝酸盐是一氧化氮(NO)和过氧化物的细胞毒产物。过氧化亚硝酸盐是非常强的氧化剂，比一氧化氮或过氧化物分别作用的毒性大得多。
多种病理与过氧化亚硝酸盐的形成有关，过氧化亚硝酸盐是NO和过氧化物反应形成的强氧化剂。此反应是迄今已知最快的NO反应，将两个相对非反应性的基团转变为一个更具活性的氧化剂，过氧化亚硝酸盐。当更多NO生成时，和/或当发生O2-水平上升时，就不可逆地生成过氧化亚硝酸盐。
过氧化亚硝酸盐是包含于许多病理生理过程中的强氧化剂。过氧化亚硝酸盐可在细胞脂膜间自由运输。过氧化亚硝酸盐的渗透系数计算值可与水良好比拟并且比过氧化物高约400倍，因此是一种重要的生物效应分子，这不仅是因为其活性，还因为其扩散性(Lee，J.，Maria，S.S.Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid membranes.Proc Natl Acad Sci.，1997.)。
考虑到这些，糖尿病、动脉硬化症和缺血-再灌注损伤等病理与以O2水平升高为特点的氧化应激相关，O2-可导致过氧化亚硝酸盐形成。最近的证据还显示多种硬化症和阿尔茨海默症与过氧化亚硝酸盐形成有关。另外，过氧化亚硝酸盐还包含于缺血和再灌注、败血症和成人呼吸性窘迫症中。缺血和再灌注相伴于分别由黄嘌呤氧化酶和NAPDH氧化酶活化而导致的过氧化物水平升高。因此，过氧化亚硝酸盐似乎与许多存在着NO和O2-不平衡的病理有关。过氧化亚硝酸盐的形成对非特异性免疫很理想，但对在NO的信号传递过程中可能不好。
生物学上过氧化亚硝酸盐从一氧化氮和过氧化物的反应中形成。过氧化物岐化酶(SOD)降低了过氧化物并预防过氧化亚硝酸形成(见我的综述Pryor，W.A.和Squadrito，G.L.(1995).Am.J.Physio.(Lung Cell.Mol.Physiol.12)268，L699-L722).The chemistry of peroxynitritea productfrom the reaction of nitric oxide with superoxide)。过氧化亚硝酸盐是强氧化剂，其自身可氧化许多生物分子。然而，在生物系统中，它通常与二氧化碳相结合以形成反应性中间产物，如ONOOCO2-、O2NOCO2-、COO3-和NO2-。在这些中间产物中，只有COO3-和NO2-参与了与生物靶分子的双分子反应；CO2的加合物ONOOCO2-和O2NOCO2-寿命太短而在能发生双分子反应前就降解了。
已知由过氧化亚硝酸盐等导致的氧化应激损伤血管上皮，此过程导致动脉硬化(Thom，S.R.和Ischiropoulos，H.Mechanism of oxidativestress from low levels of carbon monoxide.Health Effects Institute ResearchReport，number 80，1997.)。
B.羟基自由基(hydroxyl radical)
如果自由基的功能是破坏分子和组织，那么羟基自由基就是自由基中的自由基。它与其路径上发现的实际上是任何分子以扩散速率发生反应，包括DNA、膜脂、蛋白和糖类等大分子。以DNA来说，羟基自由基可引起链断裂以及脱氧核糖和嘌呤及嘧啶碱基中的化学变化。
受损伤的蛋白，其中的许多是神经元的关键酶，丧失了其功效，细胞功能衰退。许多组织内的蛋白氧化，包括大脑，已被提出作为与衰老有关的功能缺陷的原因。
羟基是衍生自过氧化氢(H2O2)的第三代基团，依次地，过氧化氢衍生自超氧化物岐化酶反应产生的过氧化物基团。
过氧化氢在铁或铜等转换金属的存在下被谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶还原成羟基。
II.结果
冻干
粉和冻干Jucara粉(Brunswick Lab ID.BrunswickLaboratories，Wareham，MA)的抗氧化能力经ORAC分析技术测定(如上所述)并在概括于下面表24。
表24抗羟基和过氧化亚硝酸盐的抗氧化活性的测定
表24的HORAC结果表达为微摩尔没食子酸当量/克。表24中的NORAC结果表达为微摩尔Trolox当量/克。
实施例28
和Jucara制剂类似超氧化物岐化酶的活性和环加氧酶抑制活性的分析
I.过氧化物(O2-)清除活性(SOD)分析
A.背景
据估计成人(70kg体重)总耗氧的1％被转化为过氧化物阴离子。在休息状态下一个成人利用3.5mL O2/kg/min，这将导致0.147mol/天O2-。O2-据信是其它反应性氧化物如过氧化氢、过氧化亚硝酸盐和羟基(来自过氧化氢)产生的原因。因此，人体内O2-清除能力是抵御氧化应激的第一道防线。实际上，据报道在转基因蝇内超氧化物岐化酶和过氧化氢酶的过表达使寿命延长达三分之一，也许，归因于减少了的氧化应激，这种减少可从低蛋白羰基含量得到反映(Orr和Sohal，Science 2631128-1130，1994)。血内过氧化物清除能力是一个人抗氧化状态的非常重要的参数。本分析是设计用来以高通量的方式对此参数进行精确定量。
B.实验方法
仪器
Precision 2000八通道液体处理系统和来自Bio-tek Inc.(Winooski，VT)的Synergy HT microplate UV-VWAS和荧光仪。
试剂
Hydroethidine来自Polysciences，Inc.(Warrington，PA)。黄嘌呤氧化酶(源于酪乳，目录号X4875)、黄嘌呤、超氧化物岐化酶(源于牛红细胞，目录号S 2515)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
i.试剂准备
缓冲液。缓冲液包括含100μM二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的75mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。为制备此缓冲，称取0.0393g二乙烯三胺五乙酸(DTPA)加入10mL ORAC缓冲液工作溶液。这产生了10mL的10mMDTPA贮存液。接下来，向2mL DTPA贮存液中加入198mL ORAC缓冲液工作溶液。这产生了200mL的100μM含DTPA的O2-缓冲液工作溶液。
黄嘌呤氧化酶。购自Sigma的黄嘌呤氧化酶悬液(存于冰箱)用缓冲液稀释20倍以形成均匀溶液。取19mL O2-缓冲液并加入1mL黄嘌呤氧化酶悬液。这产生了20mL的黄嘌呤氧化酶工作溶液，每天新鲜配制。
黄嘌呤溶液。称取黄嘌呤(15mg)置于干净的玻璃瓶内。加5mL0.1N氢氧化钠(0.1N NaOH)，旋涡混合并超声处理溶液至固体溶解。加95mL O2-缓冲液并旋涡混合。这产生了100mL的黄嘌呤溶液。此溶液存放于室温以避免黄嘌呤沉淀。黄嘌呤溶液每天新鲜配制。
Hydroethidine(HE)工作溶液。二氢乙锭贮存液-将0.04g二氢乙锭加入20mL乙腈中。这产生了20mL的HE贮存液(2mg/mL)，分装于小瓶中-80℃保存。然后，将0.125mL二氢乙锭(HE)贮存液加入到24.875mL黄嘌呤溶液中。超声处理并加热至溶液澄清。这产生了25mL的Hydroethidine(HE)工作溶液，每天新鲜配制。
超氧化物岐化酶工作溶液(SOD)。将三万单位SOD(Sigma)重构于10mL缓冲溶液中。将此溶液分装成小份(0.4mL每小瓶，贮存液)并保存于-20℃。这产生了3000单位，被稀释至30单位备用(见下)。200μL SOD3000单位贮存液加入19.8mL O2-缓冲液中以制备20mL SOD 30单位工作液。
对照。贮存液锰(III)5，10，15，20四氯化物储存液1144μM，保存于-80℃。为了制备工作溶液，用O2-缓冲液将贮存液稀释100倍并旋涡混合。取9.9 mL O2-缓冲液加入100μL锰贮存液，10mL的11.44μM锰工作液，置于G1孔和G12孔作为对照。
分析方法
此分析在配有96-孔微孔板的Precision 2000液体处理系统上进行，采用下面步骤 ●在一号板(聚丙烯)中，将200μL样品加入孔B1、C1、E1、F1和B12、C12、E12、F12。
●将200μL SOD工作溶液加入D1和D12孔中。
●将200μL O2-缓冲液加入到A1、H1、A12，和H12孔中。
●将200μL锰工作液加入G1和G12孔中。
●试剂依如下方式载入precision 2000中B架上的杯中 B1中20mL O2-缓冲液 B2中20mL HE B4中20mL黄嘌呤氧化酶溶液 ●在Precision2000上进行A×2稀释(ORAC×2)。进行稀释以使所有样品、标准品、和空白都稀释2、4、8、16、32倍。
●将每个孔中的25μL溶液转移到反应板中(聚苯乙烯，320μL)然后加入150μL HE工作溶液。
●在37℃下温育读数板20分钟。
●温育结速后，通过运行AAPH附加(B4)程序加入黄嘌呤氧化酶。这使得20μL黄嘌呤氧化酶工作液被加入到2号板的所有孔中。
●加入黄嘌呤氧化酶后，将板置于读板仪下。
●在激发光滤光器在485±25nm和发射光滤光器在590±30nm下每分钟读取反应板和荧光连续十分钟，读数参比于下面设为5000单位的D1孔。2号板设计(聚丙烯)每孔含150μL HE工作溶液，25μL样品，和25μL黄嘌呤氧化酶(在预热后30分钟加入)。
C.数据处理
从原始数据中得到线性曲线，通过用来控制读板仪的KC-4程序计算曲线斜率。输出斜率并用微软Excel软件进一步计算。
简化的化学动力学
O2-经下面由黄嘌呤氧化酶催化的反应持续产生。过氧化物生成的速率是恒定的并对黄嘌呤是伪零级，黄嘌呤对于黄嘌呤氧化酶是大量过剩的。
黄嘌呤+O2 尿酸+O2-(1)
所形成的过氧化物或者与HE反应或者被超氧化物岐化酶清除。
HE+O2- 氧化型HE (2) 2O2- O2+H2O2 (3) O2-+样品 P(4)。
假设稳态O2-浓度、O2-清除剂(SOD)不存在(Vo)和存在(V)情况下的荧光增长速率具有下列关系 Vo/V＝1+k3[SOD]/(k2.[He]) (5)
对Vo/V和[SOD]绘图将给出一条截距在(0，1)且斜率为k3/k2[HE]的直线。对于未知样品，未知样品和标准样品间斜率的比为 {k3/k2[HE]}/-{ks/k2[HE])＝k3/ks(6)
方程(5)将根据对一个样品Vo/V和浓度作图曲线中所用的浓度，以SOD测定当量/克或每升样品为单位，给出一个样品的相对SOD活性。
II.环加氧酶分析
A.简介
炎症是我们的免疫系统对因病毒和微生物等病原体以及化学或物理创伤造成的侵入物的响应。有时会疼痛，炎症通常是发热反应。但在一些例子中炎症发展到慢性状态，与关节炎、多发性硬化症甚或癌症等衰老性疾病相关。实验生物学和系统生物学研究已阐明了复杂的炎症过程。在许多其它方式中，控制炎症的一种方式是抑制与炎症直接相关的环加氧酶-2(COX-2)的活性。还发现非固醇类消炎药(NSAIDs)是优良的COX抑制剂。NSAID类的有益效果可联系到对COX-2和COX-1的抑制。这些合成的COX抑制剂包括阿司匹林、布洛芬、napoxen和塞来考昔(celebrexTM)。更多的研究成果已经发现了更具选择性和活性的COX-2抑制剂作为新一代NSAIDs。
从历史看，炎症用的草药已经被用了几千年。实际上，Celsus围绕AD40定义“发红、灼热、疼痛、瘤”(红、热、痛和肿)是，目前，炎症症状。只是在最近植物浸出物的反应机理才在分子生物学水平有所研究，采用COX-1和COX-2抑制剂分析作为从草药混合物中分离有效组合物的指导。这个方法还在营养药物工业中使对镇痛和消炎草药补充剂的效果得以更好评估和优化。为了满足工业上植物源样品COX抑制能力的测定要求，采用了一种体外COX-1和COX-2抑制剂筛选分析法，加以改进以提高效率和降低成本。此处所述是适用于植物产品的COX-1和COX-2抑制活性分析的细节。
B.分析原理
COX-1和COX-1都催化花生四烯酸的氧化生成前列腺素类(图1)。酶活性可通过耗氧速率进行测定。实际上，酶的活力单位被定义为“一单位酶37℃下在0.1M tris-HCl缓冲液pH 8.0中，含100mM花生四烯酸、5mM EDTA、2mM苯酚和1mM血色素，每分钟消耗1nmol氧气”。用Oxytherm实时监测氧浓度(图2)，Oxytherm是一种氧浓度测定系统，购自Hansatech。初始耗氧速率得自动力学曲线。在抑制剂存在下，初始速率下降。IC50，初始耗氧速率下降50％时的浓度，被用来表示COX-1和2的抑制活性。选择性表示为COX-1和COX-2的IC50的比值。样品通常溶于二甲基亚砜(DMSO)、乙醇或水中。
C.实验细节
(1)分析条件 仪器Oxytherm 缓冲液0.1M Tris-HCl，pH 8.0，含5mM EDTA，2mM苯酚和1mM血红素 温度37℃ 初始[O2]212mM 酶体积5mL(或～100单位) 总体积0.5mL 样品体积5mL 底物5μL花生四烯酸(浓度10mM溶于0.01M NaOH溶液) 血红素5 mL(终浓度1 mM) 数据记录速度每秒5次读数
(2)实验步骤
加入半毫升Tris缓冲液(37℃烘箱温育)到反应箱内后再加入5mL溶于DMSO的100mM血红素。向此溶液中加入5mL COX-1(或10mLCOX-2)酶溶液(直接使用获自供应商的产品)。混合物温育1分钟。加入五毫升样品(溶于DMSO或乙醇)并温育1分钟。加入五毫升花生四烯酸并观察反应速率。通过动力学曲线获得初始速率。
样品萃取和溶解固体样品根据其溶解性用二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、50％丙酮水溶液或水萃取。水基液体样品直接检测或必要时用水稀释。油基样品溶解于DMSO或乙醇用于分析。
质量控制
IC50当50％的酶活被抑制时的样品浓度。较低的IC50意味着高活性。IC50比此数值表示样品对COX酶抑制的选择性。当比值为1时，无选择性。如果比值小于1，样品对COX-1的抑制强于COX-2。如果比值大于1，样品对COX-2的抑制更强。标准偏差为约20％。
D.参考文献 1.Nathan，Nature 2002，420846-52. 2.Tracey，Nature 2002，420853-59. 3.Couzer and Marnett，Chemical Rev.2003，ASAP. 4.Wu et al.，J.Agri.Food Chem.，2002，50701-05. 5.Smith and Marnett，Biochim，Biophys.Acta 1991，1083，1-17. 6.Johnson等，Arch.Biochem.Biophys.1995，32426-34. 7.Culmacz and Lands W.E.M.Requirements forhydroperoxide by thecydooxygenase and peroxidaseacitivties of andin H synthase.Prostaglandins1983，25，531-40.
III.
和冻干Jucara粉的过氧化物阴离子清除能力
冻干
粉和冻干Jucafra粉的过氧化物阴离子清除能力如上所述测定(Brunswick Lab ID.Brunswick Laboratories，Wareham，MA)。研究得最多的天然来源的超氧化物岐化酶(SOD)是小麦芽SOD。小麦芽的SOD活性是每克基质160至500单位。比较而言，冻干
粉和冻干Jucafra粉的氧化物清除能力非常强，如下表25所概括。
表25
如上详述测量在冻干
粉和冻干Jucara粉(Brunswick Lab ID.Brunswick Laboratories，Wareham，MA)存在或不存在时环加氧酶(COX)活性(1类COX，即，COX I和2类COX，即，COX II)的活性。如表25(见上)和表26(见下)所总结，冻干
粉和冻干Jucara粉抑制了COX酶。如表26所示，冻干
粉和冻干Jucara粉抑制了COX I和COX II两种同功酶。冻干
粉和冻干Jucara粉，因此在预防和治疗与COX I和COXII活性相关的炎症疾病中，如关节炎，是有效的。
表26
实施例29用ORACno分析对水果和蔬菜的抗氧化能力进行的比较分析
图21显示了用ORAC分析技术(Brunswick Laboratories，Wareham，MA；如上所述)测定的水果和蔬菜的抗氧化活性。ORACFL分析，以荧光素作为荧光探针，提供了抗氧化剂对过氧化氢残基清除能力的测定方法，过氧化氢残基是体内最常见的反应性氧化物(ROS)之一。ORAChydro反应了水溶性抗氧化剂的能力。Trolox，一种水溶性维生素E类似物，被用作校正标准物，所得ORAC结果表示为微摩尔Trolox当量(TE)/克。
实施例30
果汁制备
图22详述
果汁制备的流程图，包括水果洗涤和其巴氏消毒。对果实和果汁更好的保存将使该食物的消费得以保持其营养价值并将易于其在收获季节之间的商品化组织。
果汁的制备和处理过程见图22。
果实去壳(hulling)可通过若干不同方式进行，软化条件依不同的产品而变化。
I.果浆提取过程优化-软化和机械去壳
果实去壳可通过若干方式进行，每个生产商都有其自己的方式处理
(软化时间和温度，每千克果实用水量，果实停留在机器内的时间)。为了保持我们实验中的重复性并确保良好的结果，有必要优化和系统化果实提取过程。
大多数情况下，
果实去壳在一种有垂直轴的、特别精制的用于
果实的去壳机上。典型机械去壳机的图片见图23。该机器设计每次处理2千克
以使每批处理的果实数量能最小。
浸泡果实的时间和水温依供货商的不同而不同。果实可在搅拌前在室温流水下浸泡几个小时或者也可在温水中短时间(10或20分钟)内被软化。
在实验室中，考查了几个软化时间(0，5，10，15，20，30分钟)和浸泡水温(30，40，45，50和60℃)。尽管结果提示不同软化条件之间没有显著性差异，观察到当
在45℃水中软化20分钟时有更大的产量。
总去壳时间，以及其间的用水量和用水方式，构成了对产量和果汁密度的十分重要的变量。考查了5个总去壳时间(从2:30到5:00变化)并且对于每个总时间，考查了首次注水前的不同去壳时间，以及将水注入去壳机的不同方式(去壳过程末期果汁的滴落时间设为45秒)。总用水量为1升每2公斤果实(为了得到理想的果汁，不很浓，不很淡)。
根据这些研究，注意到去壳总时间和去壳机内的置水方式对干物质中的产量有非常显著的效果。根据这些经验，设置如下果汁制备步骤 1.称取2千克原料
2.准备5个容器，每个装有200mL水。
3.将
置入机器中，在时间0处开机。
4.去壳1分钟后，立即放置第一个200mL水容器。
5.在1分30秒；2分；2分30秒；和3分钟后，分别加入其余四个容器中的一个。
6.让其滴落45秒至3分45秒。
分析了部分果汁的再循环效果。尽管此制备果汁的技术十分普遍，未发现干物质产量的差别。
II.
果实收获后微生物学性状的演化
当比较收获期和收获间期时
的特性和质量，发现在味觉质量和科学指标的数据上(微生物学，重量，颜色)有显著变化。例如，在Belm出售的收获期的
便宜又丰富。它具有好的质量，因为它来自于Beim附近的地区，没有遭受运输过程中的变化。另一方面，在收获间期，
生产数量少，其味觉特性不如收获期的
并且更贵。收获间期出产的
来自远得多的地区(Maranho，Maraj岛)，在到达Belm港前经历了漫长旅途。果实收获至出售/消费间的时间间隔十分重要(水果收获后在室温下维持的最长时间有48小时就很长了)。
发现购自收获间期的
比收获期的有更多的微生物载量。在收获期，每克新鲜
的平均微生物载量为106微生物/克干果浆-相当于10ml果汁。在收获间期，每克的微生物平均载量上升到109，表明高出1000倍的微生物载量。因此，有必要确定导致污染增加的原因主要是因为那些地区低质量的棕榈树、不良运输条件，还是因为在收获后的时间增加，导致新鲜水果中已经存在的微生物的自然生长。研究了收获和处理之间时间间隔的影响并将其与微生物载量相关联。
30小时期间内在不同时间间隔处检测新鲜水果(取自收获后10小时)中微生物载量。结果显示水果原始微生物载量有可检测的和规律性的增加。刚收获后每克干果浆的微生物载量为约105-106微生物(细菌，霉菌和酵母)而40小时后达到最大值，稍高于每克干果浆109微生物。由于收获后40小时观察到的微生物载量十分相似于收获间期的值，可能可以推断收获期内外微生物载量的不同主要是由于果实表面微生物的自然生长，而不是那些地区棕榈树的低质量。
因此，
就在刚刚收获后使用，在微生物载量有明显增加之前，以避免产品质量的变化(不仅是微生物增加导致的性质改变还有因为为保存产品而必需采用热辐射处理而导致的变化)。然而，下面评估了降低微生物载量的方法。
III.清洗
研究了清洗方法对降低果汁中微生物载量的效果。研究使用了收获间期的
这意味着具有严重污染水平的
在处理之前，用0.1％(v/v)浓度的卫生水(hygienic water)清洗水果，使得微生物载量降低2到400倍(考虑用没加化学物质的饮用水清洗)。
IV.洗涤
洗涤过程被作为
果汁制备的初始步骤，因为它在处理
之前降低了微生物载量，而没有明显改变其质地。对于
果实，在处理步骤前的洗涤已被描述作帮助保持果汁的质量和完整性，从而，保持了
果汁的感官特征、质地和营养等品质(Toumas，1994)。
洗涤包括在处理前将果实在热水或沸水中或蒸汽中置一段时间(Cruess，1995)。选择此处理，旨在降低果实表面存在的污染剂，被果实的物理结构所解释。此果实只有一小层浅层果浆，果浆与热水或蒸汽间的短暂接触可使不是十分高温或长时间的处理产生积极的效果。
研究的进行不仅采用了收获期的
还采用了收获间期的
尝试了一些不同温度(从75℃到100℃)和几个洗涤时间(从5秒到10分钟)(Rogez et al.，1996)。处理对微生物载量(细菌，霉菌和酵母)的降低有显著影响。然而，洗涤条件对过氧化物酶的失活没有效果，因为这些酶更加抗热。只有更高的洗涤温度和更长的时间才能部分降低过氧化物酶的活性(达20％)。但更苛刻的处理(即温度高于80℃且时间长于10秒)导致见于果汁的表面的果汁中脂肪物质(微黄色的油)的分离。这种质地的改变降低了消赞者对产品的接受程度，因为其外观。
由于更多的激烈洗涤造成的口感特点的损失高得多，且不能进一步减少微生物载量，所以选用温度80℃时间10秒作为
果实的更好的洗涤条件。
实施例31
饮料制备的方法和制备标准
I.混合指导
14∶1脱水需要重量比为13份水/液体与1份脱水物。使用
的可能的饮料种类几乎是无限的。下面提供3个例子 混合物1将二十五克
粉加入到325ml冷水中。中速混合混合物至少30秒以充分水化粉末。如果混合可持续约1分种将增进其质感。
混合物2将二十五克
粉加入到200ml水和125克冰中，混合30秒。混合可持续一分钟。
混合物3用125ml奶或奶油替代冰产生美味的smoothie。
因为
含糖和维生素C量低，所以很少需要预防氧化/发酵。推荐加入糖和维生素C。纯
的味道相当温和，颜色是很深的栗色。1-2匙糖或其它甜味剂的加入很好地美化了风味。颜色可通过加入维生素C(一种酸)而变得更红。加入红色食物色素也将创造出更开胃或吸引人的外观。而且，在混合物内加入一支香蕉，以及喷洒水果格兰诺拉麦片干配菜，也能为
饮料制备提供创造性的改变。
II.仪器
混合器；Gram天平；毫升测量装置
III.
果浆鉴定和质量标准
1.目的
本规则目的是建立用于饮料的适于
完整果浆和
的最小鉴定和质量标准。本规则不适于用于其它任何用途的
果浆。
2.定义
完全果浆和
是
树(Euterpe oleracea，Mart.)果实的可食用部分用适当技术性方法软化后的提取产物。
3.分类
产品将根据向果浆中加入水/液体量进行分类，如下 3.1
完全果浆是未加水而从
提取的果浆，用机械方法，未过滤。它可进行物理储存过程。
3.2稠或特制
(A类)是加水提取的果浆，含14％以上总固体量并且外观非常浓稠。
3.3中等或正常
(B类)是加水提取的果浆，含11％至14％总固体量并且外观浓稠。
3.4稀或普通
(C类)是加水提取的果浆，含8％至11％总固体量并且外观不浓稠。
4.基本配料
完全果浆和
得自新鲜、成熟和健康的果实，根据前述规格，且无任何使本产品不适于消费的尘土、寄生虫或微生物。
5.可选配料
5.1水
用于果浆提取的水必须是可饮用水。
5.2 Acidulante
对于经巴氏消毒保存于室温的
可根据“生产管理规范”(GMP)加入柠檬酸。
6.组成
6.1
完全果浆和
必须保有符合该水果特征的组成，没有变更、与其它品种水果混合或任何非法操作。
6.2
完全果浆必须符合下列物理、化学和感官特征
6.2.1物理和化学
表27
6.2.2感官特征
体观面糊状，从包括果实的表面中呈深色点颜色紫色
果肉的纯紫色和绿色
果肉浅绿色味道特征性的(见下)
6.3
(特级、正常或普通)必须符合下列物理、化学和感官特征。
6.3.1物理和化学特征
表28
6.3.2感官特征
体观乳浊液必须在加热甚至到80℃时保持稳定。颜色对紫
果浆为Violet紫色，对绿
果浆为浅绿色。气味特征性(见下)
6.4完全
果浆和
可能含有限制水平以内的果实非食用部分，该限制水平不改变产品的质量和感官特征。完全
果浆和
必须符合《一般水果果浆质量标准》内指定的所有其它物理、化学、显微镜、微生物和感官特征。
6.5
完全果浆和
中霉菌和酵母总数的上限是5×103。
7.添加剂
用于直接消费的最大1千克包装的完全
果浆和
必须通过物理过程保存，禁止使用化学防腐剂或色素物质，除非从
果实中得到的色素。
实施例32冻干
的制备
一种制备冻干
粉的方法详见图24。如其所示，采集
果实并去核。然后取出果浆并冰冻。来自许多
果实的果浆被冻干以产生冻干粉。冻干的
粉比未处理的
果实果浆制剂稳定，后者在数小时内即迅速降解，这使它们变得不好吃。在处理过程中和冰冻前向
果实果浆加柠檬酸对进一步稳定果实果浆制剂是有用的。柠檬酸可用于稳定其它经本发明中方法处理的水果果浆制剂，如Jucara。
由于酶和与从果实取出的果浆数量相比在果皮上的高比例的发酵剂载量，
的生产是一个特别不可逆的事件序列。由于这个原因，
生产传统上限于本地并立刻消费。
冰冻果浆必须保存在-5℃或更低的温度。在更高温度下，酶类和发酵剂变得活跃并改变果浆的特征。一个效应是产生不可溶化合物，前述的grit，这在最后一批中是明显的。这些不溶物见于第一批
脱水物(来自两个处理器)并发现是由脱水制备过程中解冻所引起的。这个问题通过不使冰冻的
果浆在经冰冻干燥脱水前预融而得到解决。就是说，一旦Azurai果浆冰冻后，在冻干脱水前不能使其在-5℃以上的温度融化。脱水前未预融制备的
果浆产生颗粒状、冻干的
粉，脱水十分成功并保持了质量、色泽、品质和风味。因此，本发明提供了一种方法制备水果基营养补充剂，其中果浆的制备方法中一旦果浆被分离和冰冻在脱水前就不得预融。本方法对从许多水果中制备冻干实果粉是有用的，比如，但不限于，
果实和Jucara果实，可被再脱水并保持优质颜色、品质和味道。
这种颗粒，冻干的果实粉避光储存于塑料纹的箔袋中直至使用。
实施例33冻干
制剂对所选微生物稳定性的攻击性检测
I.目标
本研究的目标是实施初步的攻击检测以评估产品在受酵母、霉菌、乳酸菌、沙门氏菌和葡萄球菌中的每一株攻击时的微生物稳定性(Silliker Laboratories Research Center，South Holland，IL)。
II.应用
本研究提供了一种对可能的酸败生物和两种病原体的产品筛查。它适于收集关于产品的原始数据和/或在开发中比较许多产品制剂。
III.限制
每种攻击生物只使用一个菌株，存在产品对该菌株生长有抗性但对其它菌株易感的可能性。生长于对照产品内的攻击生物中，不到研究结束不进行检测。本研究受限于时间间隔、储存温度和报道的范围。本研究不预期超出四周的结果。
IV.材料与方法
A.受检产品
从客户处得到标有
果实-冻干”的一个3.5千克的可封口箔袋的产品。产品保存于环境温度至研究开始。
B.攻击菌
用来自Silliker Research Culture Collection(SRCC)的冻干的Aspergillus niger(霉菌)、Zygosaccharomyces bailii(酵母)、Lactobacillusfructivorans(乳酸菌)、Salmonella typhimurium和Staphylococcus aureus攻击产品，如表29所列。用平板计数法检验存活的细胞或孢子数量。
表29
C.待测样品制备和储存
将产品无菌依100克小份分装入6个无菌容器内。一份用作阴性对照。其余小份接种约每克10000克隆形成单位浓度的培养物。接种后，充分混合样品并储存于75_。
D.样品分析
在第0天和第28天分析未接种的对照份的攻击菌。在第0、7、14、21和28天分析被接种的各份。在每个时间段从每份中取出一个单独的11-克样品用平板计数法分析攻击菌。
V.结果和讨论
食品的微生物稳定性可通过对其用酸败性和病原性微生物进行攻击而测定。如果攻击生物的水平在储存过程中没有增加，则产品制剂可抗微生物生长并认为其是微生物学稳定的。
结果显示于30和表31。如数据所示，在储存过程中酵母、霉菌、乳酸菌、细菌、沙门氏菌和葡萄球菌在对照或接种了的小份中没有增加。这样，当储存于75_并用酵母、霉菌、乳酸菌、细菌、沙门氏菌和葡萄球菌攻击下，
果实冻干产品至少28天内是微生物学稳定的。如下所示，本产品在攻击下是稳定的。
表30
果实-冻干的未接种对照样
表31
果实-冻干的接种样
VI.冻干AAI的贮存期研究
冻干
制剂贮存期的研究由Silliker Laboratories实施并列于下面表32内。
表32 贮存期研究结果
一种食品的味道、气味和外观(感官质量)是消费者用以判断食品可接受程度的根本标准。这些品质在食品内的微生物区系-细菌、酵母和霉菌-生长并代谢可用营养时开始变化。感官性变化在微生物数量很高以前一般不易觉察。引起酸败所需微生物的数量依食品种类和其中生长的微生物种类不同而不同。但是，通常，贮存期末限制了存放时间。因此，冻干
果实产品的贮存期为存于75_至少12个月。
实施例34大鼠内14天处理后观察期研究’
果浆-冻干’急性口服毒性(限制检测)
进行大鼠内14天施用后观察期的研究以评估冻干
果浆的急性口服毒性(研究代码PCDL-0221；Pharmaceutical Control andDevelopment Laboratory Co.Ltd.，9.Mexik6i Street Budapest，H-1149)。
I.一般信息
A.剂量
2000mg/kg体重的单次口服限制剂量的
果肉冻干物(批号22.10)通过强饲法口服施用于大鼠。观察实验动物的死亡率和中毒症状14天。在第15天开展总病理检查。实验动物的体重对应于它们的种类和在研究过程中的年龄。口服施用2,000mg/kg剂量的’
果浆-冻干’未发生死亡。未观察到中毒的临床症状。第15天进行的预定的尸体解剖揭示没有毒性总病理变化。可得出结论2000mg/kg单口服剂量的
果实冻干物在雄性和雌性大鼠内未发现副作用。
B.目的
开发在大鼠体内单剂量口服施用冻干
果浆的潜在毒性效果的数据。受检物预期用于营养补充剂。
C.研究类别
临床前毒理研究符合美国药品食品监督管理局的非临床实验研究实验管理规范和Hungarian Act 1998XXVIII.管理动物保护的原则。限制实验。
D.对研究草案的偏离
i.用于已消失的生产商的T61材料的特征
原始草案Hoechst Veterinar GmbH
最终报告Intervet International
原因生产商名称变更
ii.死亡率
原始草案施用4小时后进行观察，之后每天两次。
最终报告施用4小时后进行观察，之后在工作日开始和结束的时候每天进行两次，周末每天进行一次，直到第15天早晨。
原因过程被描述得比原来更为精确。
iii.一般状态，外观，行为和临床症状
原始方法在施用后期间，对动物每天两次检查直至第15天早晨。
最终报告在施用后期间，除周末对动物每天两次检查直至第15天早晨，周末检查一次。
原因过程被描述得比原来更为精确。
II.待检物和参考物
A.待检物特征
待检物特征详见下面表33。
表33
B.微生物分析
C.用于悬浮待检物的物质特征
i.甲基纤维素
甲基纤维素(批号127H1066；有效期02/2003)购自Sigma并在使用前存于室温。
ii.蒸馏水
蒸馏水(批号A0010102；有效期03/2003)购自PCDL并在使用前存于室温。
iii.验尸前过麻醉用品的特征
T61(批号09W008；有效期05/2006)，每升含有0.2g乙甲丁酰胺，0.005g terracing盐酸盐和0.05g美贝碘铵，购自Intervet International并在使用前存于室温下毒品用安全盒内。
iv.待检物配制
在不早于施用前30分钟称取必要量的待检物悬浮于含1％甲基纤维素的溶液中。制备下列悬液 2000mg/kg正常剂量5.0g
果浆加50ml 1％甲基纤维素溶液。在处理中用OP-951型Radelkis磁力搅拌器搅拌悬液。
v.配制的待检物的浓度控制
取配制好的待检物样品检查浓度和均一性。浓度和均一性检查通过称重法进行。所测悬液上部、中部和下部(均一性检查)的三份三平行样本的浓度在可接受的±10％范围内，即，上+4.4±4.6％，中+4.0±4.8％，下+5.4±2.8％
III.检测系统
A.动物
Sprague Dawley大鼠，CrlCD BR(到达时6-7周龄)被用于本研究。雄性体重范围从143.9g到159.4g。雌性体重从140.5g到161.4g。定购的动物群30(雄性15只，雌性15只)。研究中所用动物数量20(雄性10只，雌性10只)。大鼠购自Charles River Hungary Ltd。到达时动物是SPF并在研究过程中保存于常规环境。根据国际惯例通常用大鼠进行毒理实验。Sprague Dawley株是具有充足谱系数据的周知的实验模型。
用耳朵标号鉴别动物并以5只同性的数量养于笼中。笼子贴有标签，注明大鼠的ID号、研究编号、给药途径、性别和实验期结束日期。
动物饲养条件列于表34。环境条件列于表35。
表34动物饲养条件
表35环境条件
连续记录温度和相对湿度。除了给药前的禁食期、给药期间和给药后观察的最初二小时，动物可自由获得标准大鼠和小鼠鼠食VRF-1。食物的组成受控于制造商Altromin GmbH，D-4937 Lage/LippeLange Str.42。食品依制造日期区分(30.09.2002)，稳定性4个月。大鼠经饮水瓶可自由获得自来水。饮用水由PCDL微生物系每月检查。给药前观察动物5天。只有无任何临床症状的健康的动物才用于本研究。
动物分组按计算机产生的随机表格进行。动物基于其体重被随机分组，从而使每个组中的体重分布相似。
IV.实验设计
剂量水平和分组列于表36。
表36
剂量选择的原理如下所述。预计人
果浆的日剂量为大约1000mg每天，对应于一个成人(70千克)14mg/kg体重或一个4岁儿童(20kg)50mg/kg。本研究所用2000mg/kg限制剂量对应于一个成人消费的140倍的日剂量或40倍儿童剂量，如果儿童的体重以5g计的话。
V.给药
施用是强饲口服。施用途径依国际惯例选择。口服途径是接受待检品的人类的预期途径。待检品的施用以单剂量实施。待检品以20mg/kg体重的量施用。实验期包括5天环境适应、给药日、包括给药日在内的14天给药后观察期，和第15天尸检。
VI.观察，检测
A.致死率
施用4小时后进行观察，之后在工作日开始和结束的时候每天进行两次，周末每天进行一次，直到第15天早晨。死亡时间应尽可能精确记录。
B.一般状态，外观，行为和临床症状
受药前进行一次仔细的大鼠临床观察，然后，在给药6小时后连续进行。在其后的时期里，除了周末检查一次外，每天检查两次检查动物直到第15天早晨。记录要被观察的症候，包括皮肤、毛发、眼睛和可见粘膜的变化；分泌物和排泄物的出现和自律活性(例如，流泪、竖毛、腹泻、瞳孔尺寸、非正常呼吸方式)。此外，步态、体态和对抓取的反应的潜在变化以及发生嗜睡、战栗、痉挛或紧张的运动，重复或怪异的行为。
C.体重
在动物刚到实验室时、随机分组那天、给药日和尸检前实验的第2、8、和15天对其称重。
VII.尸和组织检查
A.尸检
所有给药后观察期结束时存活的大鼠在T61过麻醉下解剖检查。仔细观察和记录外部和内部状态。未进行器官的显微境检查。
VIII.评价，统计分析
雄性组和雌性组分别评价
A.参数值
计算了关于体重的平均值和标准偏差。
B.非参数值(致死率和临床症状)
制表列出死亡率、临床症状和粗查结果。
IX.方法
实验依照现行药物控制和开发实验室有限公司(Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co.Ltd.)毒理部的标准操作程序进行。
X.动物保护
为了动物的利益避免对动物不必要的使用。命令对明显垂死的动物的温柔杀死由研究的主管人员负责。本方法(限制性检测)使用了相比于其它已知和承认的急性毒理实验减少了的实验动物数量。
XI.数据记录和归档
如标准操作程序所指示，以如下正确的形式保存所有原始数据 待检品重量 动物房日志 体重日志 死亡和临床观察日志 尸检记录
研究所得数据收集于研究文件夹中。研究记录，所有研究中和研究结果的数据，与研究有关的所有文档和信息，待检样品的对照样和最终报告将在PCDL的档案中保存至少15年然后提供给资助者。
Xll.结果
A.死亡率
给药后观察期的14天内观察到的死亡率概括于下面表37。
表37
表38概括了
果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中给药后观察期的14天内雄性受检对象的单独的死亡数据。
表38雄性
表39概括了
果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中给药后观察期的14天内雌性受检对象的单独的死亡数据。
表39雌性
给大鼠单剂量口服施用2,000mg/kg剂量的
果浆-冻干’后未发生死亡。所有雄性和雌性存活至14天观察期结束。
B.临床症状
在14天给药后观察期内观察到的临床症状概括于下面表40
表40
表41概括了
果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中14天给药后观察期内雄性受检对象的单独的临床症状。
表41雄性
表42概括了
果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中14天给药后观察期内雌性受检对象的单独的临床症状。
表42雌性
在给药日和14天给药后观察期内未观察到任何给药组动物中毒。
C.体重
在14天给药后观察期内观察到的雄性体重概括于下面表43。
表43雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性对象体重概括于下面表44。
表44雌性
在14天给药后观察期内观察到的雄性受检对象体重变化概括于下面表45。
表45雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性受检对象体重变化概括于下面表46。
表46雌性
在14天给药后观察期内观察到的雄性受检对象个体体重概括于下面表47。
表47雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性受检对象个体体重概括于下面表48。
表48雌性
在14天给药后观察期内观察到的雄性受检对象个体体重变化概括于下面表49。
表49雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性受检对象个体体重变化概括于下面表50。
表50雌性
D.宏观病理学
受检动物的宏观病理学结果概括于表51。
表51
受检雄性动物的宏观病理学结果概括于表52。
表52雄性
所有动物存活至预期在第15天的尸检，所有动物检验证明没有毒理学变化。
E.评价
单剂量口服施用2,000mg/kg
果浆-冻干’剂量后未发生死亡。未发生中毒临床症状。按计划在第15天进行的尸检揭示无中毒性宏观病理学变化。结论是未发现2,000mg/kg的单口服剂量
果浆-冻干’在雄性和雌性大鼠内的副作用。
实施例35对Jucara果浆‘冻干’的急性口服毒性的大鼠内14天给药后观察期研究(限制检测)
进行大鼠内14天施用后观察期的研究以评估冻干Jucara果浆的急性口服毒性(研究代码PCDL-0222；Pharmaceutical Control andDevelopment Laboratory Co.Ltd.，9.Mexikói Street Budapest，H-1149)。
I.一般信息
A.剂量
2000mg/kb体重的单口服限制剂量的’Jucara果浆-冻干’(批号2208)通过强饲法口服施用于大鼠。观察实验动物的死亡率和中毒症状14天。在第15天开展总病理检查。实验动物的体重对应于它们的种类和在研究过程中的年龄。口服施用2,000mg/kg剂量的’Jucara果浆-冻干’未发生死亡。未观察到中毒的临床症状。第15天按计划进行的尸体解剖揭示没有中毒性总病理变化。结论是2000mg/kg单口服剂量的’Jucara果浆-冻干’在雄性和雌性大鼠内未发现副作用。
B.目的
开发在大鼠体内单剂量口服施用Jucara果浆-冻干的潜在毒性效果的数据。受检物预期用于营养补充剂。
C.研究类别
临床前毒理研究符合美国药品食品监督管理局的非临床实验研究实验管理规范和Hungarian Act 1998XXVIII.管理动物保护的原则。限制级实验。
D.对研究草案的偏离
i.用于已消失的生产商的T61材料的特征
原始草案Hoechst Veterinar GmbH
最终报告Intervet Intemational
原因生产商名称变更
ii.死亡率
原始草案施用4小时后进行观察，之后每天两次。
最终报告施用4小时后进行观察，之后在工作日开始和结束的时候每天进行两次，周末每天进行一次，直到第15天早晨。
原因过程被描述得比原来更为精确。
iii.一般状态，外观，行为和临床症状
原始方法在施用后期间，对动物每天两次检查直至第15天早晨。
最终报告在施用后期间，除周末对动物每天两次检查直至第15天早晨，周末检查一次。
原因过程被描述得比原来更为精确。
II.待检物和参考物
A.待检物特征
待检物特征详见下面表53。
表53
B.微生物分析 [05491微生物限制检测由PCDL的微生物部依c.USP实施。
C.用于悬浮待检物的物质特征
i.甲基纤维素
甲基纤维素(批号127H1066；有效期02/2003)购自Sigma并在使用前存于室温。
ii.蒸馏水
蒸馏水(批号A0010102；有效期03/2003)购自PCDL并在使用前存于室温。
iii.验尸前过麻醉用品的特征
T61(批号09W008；有效期05/2006)，每升含有0.2g乙甲丁酰胺，0.005g terracing盐酸盐和0.05g美贝碘铵，购自Intervet International并在使用前存于室温下毒品用安全盒内。
iv.待检物配制
在不早于施用前30分钟称取必要量的待检物悬浮于含1％甲基纤维素的溶液中。
制备下列悬液2000mg/kg正常剂量5.0g Jucara果浆加50ml 1％甲基纤维素溶液。在处理中用OP-951型Radelkis磁力搅拌器搅拌悬液。
v.配制的待检物的浓度控制
取配制好的待检物样品检查浓度和均一性。
浓度和均一性检查通过称重法进行。所测悬液上部、中部和下部(均一性检查)的三份三平行样本的浓度在可接受的±10％范围内，即，上+9.4±4.2％，中+9.4±4.6％，下+6.6±2.0％
III.检测系统
A.动物
Sprague Dawley大鼠，CrlCD BR(到达时6-7周龄)被用于本研究。雄性体重范围从143.8g到151.9g。雌性体重从144.2g到161.6g。定购的动物群30(雄性15只，雌性15只)。研究中所用动物数量20(雄性10只，雌性10只)。大鼠购自Charles River Hungary Ltd。到达时动物是SPF并在研究过程中保存于常规环境。根据国际惯例通常用大鼠进行毒理实验。Sprague Dawley株是具有充足谱系数据的周知的实验模型。
用耳朵标号鉴别动物并以5只同性的数量养于笼中。笼子贴有标签，注明大鼠的ID号、研究编号、给药途径、性别和实验期结束日期。
动物饲养条件概括于下面表54中。
表54
环境条件概括于下面表55中。
表55
连续记录温度和相对湿度。
除了给药前的禁食期、给药期间和给药后观察的最初二小时，动物可自由获得标准大鼠和小鼠鼠食VRF-1。食物的组合物受控于制造商Altromin GmbH，D-4937 Lage/Lippe Lange Str.42。食品依制造日期区分(30.09.2002)，稳定性4个月。大鼠经饮水瓶可自由获得自来水。饮用水由PCDL微生物系每月检查。给药前观察动物5天。只有无任何临床症状的健康的动物才用于本研究。
动物分组按计算机产生的随机表格进行。动物基于其体重被随机分组，从而使每个组中的体重分布相似。
IV.实验设计
剂量水平和分组列于表56
表56
剂量选择的合理性如下所述。预计人Jucara果浆的日剂量为大约1000mg每天，对应于一个成人(70千克)14mg/kg体重或一个4岁儿童(20kg)50mg/kg。本研究所用2000 mg/kg限制剂量对应于一个成人消费的140倍的日剂量或40倍儿童剂量，如果儿童的体重以5g计的话。
V.给药
施用是强饲口服。施用途径依国际惯例选择。口服途径是接受待检品的人类的预期途径。待检品的施用以单剂量实施。待检品以20ml/kg体重的量施用。实验期包括5天环境适应、给药日、包括给药日在内的14天给药后察期，和第15天尸检。
VI.观察，检测
A.致死率
施用4小时后进行观察，之后在工作日开始和结束的时候每天进行两次，周末每天进行一次，直到第15天早晨。死亡时间应尽可能精确记录。
B.一般状态，外观，行为和临床症状
受药前进行一次仔细的大鼠临床观察，然后，在给药6小时后连续进行。在其后的时期里，除了周末检查一次外，每天检查两次检查动物直到第15天早晨。记录要被观察的症候，包括皮肤、毛发、眼睛和可见粘膜的变化；分泌物和排泄物的出现和自律活性(例如，流泪、竖毛、腹泻、瞳孔尺寸、非正常呼吸方式)。此外，步态、体态和对抓取的反应的潜在变化以及发生嗜睡、战栗、痉挛或紧张的运动，重复或怪异的行为。
C.体重
在动物刚到实验室时、随机分组那天、给药日和尸检前实验的第2、8、和15天对其称重。
VII.尸和组织检查
A.尸检
所有给药后观察期结束时存活的大鼠在T61过麻醉下解剖检查。仔细观察和记录外部和内部状态。未进行器官的显微境检查。
VIII.评价，统计分析
雄性组和雌性组合物分别评价
A.参数值
计算了关于体重的平均值和标准偏差。
B.非参数值(致死率和临床症状)
制表列出死亡率、临床症状和粗查结果。
IX.方法
实验依照现行药物控制和开发实验室有限公司(Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co.Ltd.)毒理部的标准操作程序进行。
X.动物保护
为了动物的利益避免对动物不必要的使用。命令对明显垂死的动物的温柔杀死由研究的主管人员负责。本方法(限制性检测)使用了相比于其它已知和承认的急性毒理实验减少了的实验动物数量。
XI.数据记录和归档
如标准操作程序所指示，以如下正确的形式保存所有原始数据 待检品重量 动物房日志 体重日志 死亡和临床观察日志 尸检记录
研究所得数据收集于研究文件夹中。研究记录，所有研究中和研究结果的数据，与研究有关的所有文档和信息，待检样品的对照样和最终报告将在PCDL的档案中保存至少15年然后提供给资助者。
Xll.结果
A.死亡率
给药后观察期的14天内观察到的死亡率概括于下面表57。
表57
表58概括了‘Jucara果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中给药后观察期的14天内雄性受检对象个体的死亡数据。
表58雄性
表59概括了‘Jucara果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中给药后观察期的14天内雌性受检对象的单独的死亡数据。
表59雌性
给大鼠单剂量口服施用2,000mg/kg剂量的‘Jucara果浆-冻干’后未发生死亡。所有雄性和雌性存活至14天观察期结束。
B.临床症状
在14天给药后观察期内观察到的临床症状概括于下面表60
表60
表61概括了‘Jucara果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中14天给药后观察期内雄性受检对象的单独的临床症状。
表61雄性
表62概括了’Jucara果浆-冻干’大鼠内急性毒理研究(限制性检测)中14天给药后观察期内雌性受检对象的单独的临床症状。
表62雌性
在给药日和14天给药后观察期内未观察到任何给药组动物中毒。
C.体重
在14天给药后观察期内观察到的雄性体重概括于下面表63
表63雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性对象体重概括于下面表64
表64雌性
在14天给药后观察期内观察到的雄性受检对象体重变化概括于下面表65
表65雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性受检对象体重变化概括于下面表66
表66雌性
在14天给药后观察期内观察到的雄性受检对象个体体重概括于下面表67
表67雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性受检对象个体体重概括于下面表68。
表68雌性
在14天给药后观察期内观察到的雄性受检对象个体体重变化概括于下面表69。
表69雄性
在14天给药后观察期内观察到的雌性受检对象个体体重变化概括于下面表70。
表70雌性
动物的体重和体重增加对应于其种类和研究中的年龄。
D.宏观病理学
受检动物的宏观病理学结果概括于表71。
表71
受检雄性动物的宏观病理学结果概括于表72。
表72雄性
受检雄性动物的宏观病理学结果概括于表73。
表73雌性
所有动物存活至预期在第15天的尸检，所有动物检验证明没有毒理学变化。
E.评价
单剂量口服施用2,000mg/kg’Jucara果浆-冻干’剂量后未发生死亡。未发生中毒临床症状。按计划在第15天进行的尸检揭示无中毒性宏观病理学变化。结论是未发现2,000mg/kg的单口服剂量‘Jucara果浆-冻干’在雄性和雌性大鼠内的副作用。
等价方案
尽管本发明已结合其特定的实施方案描述，应当理解它能被进一步改进。此外，本申请意欲覆盖本发明的任何改变、应用或改编，包括这些从本公开内容的偏离，该偏离在本发明所属领域内已知或者通过常规实践获得，而属于后附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种营养补充剂组合物，包含冻干的阿萨依(Euterpe oleracea)
果浆，其中组合物
(a)包含总浓度大于约1毫克/克总重的花色素苷；
(b)ORACFL值大于约350微摩尔TE/克总重；和
(c)残留水含量小于总重的约3重量％。
2.一种营养补充剂组合物，包含冻干的
果浆，其中所述组合物
(a)环加氧酶抑制值大于约15阿司匹林_mg当量/克总重；和
(b)残留水含量小于总重的约3重量％。
3.权利要求1或2中的组合物，其中的营养补充剂组合物进一步包含药用载体。
4.一种生产稳定的和可口的
基营养补充剂组合物的方法，该方法包括以下步骤
(a)收获
果实；
(b)称重
果实；
(c)用水清洗
果实；
(d)用水在约75℃到100℃的温度下洗涤
果实约5秒到10分钟的一段时间；
(e)给
果实去壳以从
果实中分离
果浆；
(f)将
果浆冷冻至低于约-5℃的温度；和
(g)在产生颗粒状的、残留水含量低于3重量％的冻干
果浆粉末的条件下冻干
果浆；
其中冻干
果浆粉末比
果浆制剂更稳定和更可口。
5.权利要求4所述的方法，其中清洗步骤包括用0.1％(v/v)的卫生水清洗
果实。
6.权利要求4所述的方法，其中洗涤步骤包括在约80℃的温度下在水中洗涤
果实约10秒钟的一段时间。
7.权利要求4所述的方法，其中去壳步骤包括将
果实机械去壳约2分种到约5分钟的一段时间，去壳步骤的进行使用约1升水/2千克
果实。
8.权利要求4所述的方法，其中
基营养补充剂组合物的ORACFL值大于约350微摩尔TE/克总重。
9.权利要求4所述的方法，其中
基营养补充剂组合物具有的环加氧酶抑制值大于约15阿司匹林_毫克当量/克总重。
10.一种预防或治疗哺乳动物中由病理性自由基反应所导致的疾病或损伤的方法，该方法包括向该哺乳动物施用有效量的权利要求1-3中任何一项的
基营养补充剂组合物，其中该组合物猝灭自由基并减少由病理性自由基所导致的损伤。
11.权利要求10所述的方法，其中的疾病或损伤选自由下列各项组成的组癌症、结肠癌、乳腺癌、炎性肠病、局限性回肠炎、血管病、关节炎、溃疡、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤、神经变性疾病、自闭症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肠胃病、炎症导致的组织损伤以及环境毒素导致的组织损伤。
12.一种减轻哺乳动物内病理性自由基反应的有害效应的方法，所述哺乳动物遭受疾病或损伤，该疾病或损伤是由哺乳动物中的病理性自由基反应所导致的，所述方法包括向该哺乳物施用有效量的权利要求1-3中任何一项的
基营养补充剂组合物，其中该组合物猝灭自由基并减少由病理性自由基所导致的损伤。
13.权利要求12所述的方法，其中的疾病或损伤选自由下列各项组成的组癌症、结肠癌、乳腺癌、炎性肠病、局限性回肠炎、血管病、关节炎、溃疡、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤、神经变性疾病、自闭症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肠胃病、炎症导致的组织损伤以及环境毒素导致的组织损伤。
14.一种抑制哺乳动物内环加氧酶的方法，该方法包括向该哺乳物施用有效量的组合物，该组合物包含权利要求1-3中任何一项的
基营养补充剂组合物。
15.权利要求14所述的方法，其中组合物进一步包含药用载体。
16.权利要求14所述的方法，其中组合物通过选自下组的施用途径施用口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、关节内、动脉内、大脑内、小脑内、支气管内、鞘内、局部的、和气溶胶途径。
17.一种预防或治疗哺乳动物体内与环加氧酶活性升高相关的疾病或损伤的方法，该方法包括向该哺乳物施用有效量的组合物，该组合物包含权利要求1-3中任何一项的
基营养补充剂组合物。
18.权利要求17所述的方法，其中组合物进一步包含药用载体。
19.权利要求17所述的方法，其中组合物通过选自下组的施用途径施用口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、关节内、动脉内、大脑内、小脑内、支气管内、鞘内、局部的、和气溶胶途径。
20.权利要求13中所述方法，其中的疾病或损伤选自由下列各项组成的组癌症、结肠癌、乳腺癌、炎性肠病、局限性回肠炎、血管病、关节炎、溃疡、急性呼吸窘迫综合征、缺血-再灌注损伤、神经变性疾病、自闭症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肠胃病、炎症导致的组织损伤以及环境毒素导致的组织损伤。
全文摘要
本发明涉及稳定的、可口的、冻干的水果基营养补充剂。明确地，本发明涉及Aai果实和Jucara果实的具高抗氧化性能和环加氧酶抑制活性的组合物及其应用。本发明进一步提供从Aai果实和Jucara果实中制作稳定的、可口的、冻干的水果基营养补充剂的方法。
文档编号A61K36/889GK101238895SQ20071018231
公开日2008年8月13日 申请日期2004年3月22日 优先权日2003年3月21日
发明者K·A·默多克, A·G·绍斯 申请人:K2A公司