专利名称：：一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法。技术背景伪狂犬病是多种动物共患性传染病，猪是其自然宿主，感染猪康复后呈隐性感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊，初生仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭直至死亡，死亡率几乎100%,断奶仔猪发病率为20%-40%，死亡率为10°/。-20°/。，该病已成为目前种猪繁殖障碍综合症的主要病因，并明显呈逐年上升趋势。由于成年猪多为隐性感染，并长期带毒和排毒而成为潜在的传染源，给该病的控制和消灭带来极大的困难。目前世界各国对PR的有效预防主要是疫苗免疫接种，现有的猪伪狂犬病疫苗有油乳剂灭活疫苗及传统的弱毒疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗的不足之处在于如油乳剂灭活疫苗安全性好，但免疫效果不理想，注射局部副作用大，血清学检测不能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体；弱毒疫苗免疫效果良好，但不能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体，且存在毒力返强的危险；基因缺失弱毒疫苗免疫效果良好，并能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体，但基因缺失苗可能会因基因重组变为强毒抹等潜在的不安全问题。因此，改进现有的疫苗成为各国研究人员攻克的难题，国外已开展了猪伪狂犬病亚单位ISCOM疫苗的研究，其不足之处在于以强毒为制苗种毒，疫苗制备复杂繁瑣，疫苗的保存期不明确，限制了疫苗的规模化生产和临床应用。
发明内容本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，本发明以伪狂犬病毒弱毒抹(PRV-FB抹)为种毒，提取PRV-FB囊膜蛋白为免疫原，应用新型佐剂QuilA和离心透析相结合的免疫刺激复合物制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，研制出的疫苗可用于猪伪狂犬病的预防和控制，并为动物病毒性重大疫病的新型疫苗研究开拓一条新途径。本发明所述的疫苗的制备方法是将PRV-FB林细胞毒经差速离心后，重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒嚢膜蛋白，以离心方法提取嚢膜蛋白，加入适当的ISC0M基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。本发明是以伪狂犬病毒弱毒抹(PRV-FB抹)为种毒，提取PRV-FB嚢膜蛋白为免疫原，应用免疫刺激复合物(ISC0M)制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，可用于猪伪狂犬病的预防和控制；本发明首次在国内外全面系统测定了该疫苗的生物学特性、疫苗的安全性、免疫原性、保存期、抗体持续期、攻毒保护率和最小免疫量等各项免疫学指标。该疫苗主要含嚢膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潜伏感染问题，安全性好；同时，优化了嚢膜提取技术，简化了生产工艺，ISCOM的应用解决了亚单位疫苗免疫原性差的难题。图1是PRV嚢膜蛋白免疫刺激复合物电镜照片(x10万)复印件。具体实施方式以下通过试验例来进一步说明本发明及本发明的有益效果，(但不是对本发明的限制)。本发明所述的疫苗制备方法是将PRV-FB抹细胞毒经差速离心后，重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-lO裂解病毒嚢膜蛋白，以离心方法提取嚢膜蛋白，加入适当的ISC0M基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。PRV嚢膜蛋白亚单位疫苗不含核酸成份，安全性好，且血清学方法能将自然感染动物和疫苗接种动物区别开，但免疫原性差。为此，本发明人进一步采取如下措施，提高其免疫效果(1)上述PRV-FB弱毒的特征与培养是伪狂犬病毒弱毒抹(PRV-FB林)是经乳兔肾原代细胞连续传180代结合蚀斑克隆和低温诱变技术选育出的弱毒林，PRV-FB抹对猪、牛、羊等家畜已无致病性；对易感家兔和乳猪盲传五代，无返强现象;接种动物同居接触感染末发现水平传播。上述PRV-FB弱毒林能在如CEF、MDEF、PK-15、VER0、RK、Marc-145等多种细胞上生长，本发明考虑到产业化生产的需要，上述PRV-FB弱毒抹选用CEF或Marc-145细胞为病毒培养细胞；PRV-FB病毒的培养是将PRV-FB抹种毒接种CEF或Marc-145单层细胞，接种量为培养液量的1%，37°C旋转培养至细胞病变达80°/时，收获细胞毒。(2)上述病毒抗原的制备为将PRV-FB细胞毒经-20°C冻融3次，5000rpra离心30-60mins，取上清35000rpm离心90-120mins,取沉淀重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度为10-12mg/ml,即为制苗用病毒抗原。(3)上述Mega-IO作用时间和浓度确定是PRV囊膜蛋白的提取，首先需要完全裂解病毒嚢膜，影响PRV囊膜蛋白提取的主要因素是Mega-lO(华美生物工程公司产品)，因此，筛选最适的Mega-10浓度和作用时间是提取嚢膜蛋白的关键。本发明用0.01MpH7.2PBS将上述病毒抗原稀释至蛋白浓度为lOmg/ml,在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至终浓度为l°/。~2%,分别于37°C、室温下作用2-5小时，将病毒液铺到蔗糖垫上(蔗糖垫的上层为PBS配制的10%蔗糖，下层为3(W蔗糖)，35000rpm(超速离心机，RP40转头)20。C离心90-120mins,收集样品层和10%蔗糖层，装透析袋对0.01MpH7.2PBS透析48小时，收获约3ml即为PRV嚢膜蛋白，各取20ul按Bradford法置DyNAQuant200测定仪(Hoefer)测定蛋白浓度(见表1)。结果显示Mega-10对PRV嚢膜蛋白的最适作用浓度为2%,作用时间最佳为在37°C条件下3小时，其次为室温条件下4小时。表1不同浓度的Mega-10对PRV囊膜蛋白提取量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表中数字为囊膜蛋白浓度，单位ug/ml。ND表示未测定。(4)ISCOM基质及QuilA浓度的选择在于PRV-ISC0Ms疫苗的免疫原性强弱与囊膜蛋白、ISCOM基质和QuilA的組成密切相关，ISCOM的形成通常通过负染电镜观察见到典型的笼格状结构(图1)来证实。将收集的嚢膜蛋白样品层和10%蔗糖层混合后分成A、B、C三组，分别加入含0.05%、0.1%、0.2。/。QuilA的ISC0M基质，对PBS透析48hrs并经适当浓缩后，取少许电镜检查混合物中的ISC0M颗粒，同时各免疫5只10—12周龄昆明系小白鼠(普通级，购自福建省医科所实验动物中心)，测定血清抗体。结果通过电镜观察和抗体水平测定比较了ISC0M基质中各成份(QuilA、卵磷脂、胆固醇)不同含量的效果，筛选出较佳组合中的Qui1A适宜浓度为0.1%。(5)上述新型疫苗的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱(SDS-PAGE)是采用12°/。分离胶，4%浓缩胶，凝胶厚度l咖电泳系统，标准分子量蛋白为预染的蛋白(sigma产品)。取经适当浓缩的抗原样品与5x样品緩冲液按5:l混合煮沸3分钟后10000rpm离心5rain,取15ul上清上样，电压150V至样品进入分离胶后降为100V,电泳至溴酚蓝指示剂距底部lcm时终止。取出凝胶置于考马斯亮蓝R250染液中室温染色30min，经脱色液脱色后拍照保存，结果见PRV新型疫苗主要蛋白带4条，分子量约为63、50、34、26.5KD。(6)上述新型疫苗的Westernblot特征是采用一孔梳加样槽，SDS-PAGE样品为PRV-FB抗原，同上电泳后取出凝胶浸泡在转移緩冲液(25mmol/LTris-HCL、192mmol/L甘氨酸、20%甲醇，PH8.3)10min,按照Towbin等方法将蛋白从凝胶上转移到硝酸纤维膜上(4。C100mA1.5小时)，将转移过的硝酸纤维膜用TBST(25画1/LTris-HCL，PH7.5,含150画1/LNaCL，0.05%Tween-20)洗涤后，在封闭液(TBST-10%小牛血清)中4。C过夜或37。C1小时封闭，TBST洗涤3次并将NC膜切成4mm宽的反应条，加入适当稀释的待检鼠血清37。C1小时，同上洗涤后，加入羊抗鼠IgG-AP(工作浓度l:3万)37。Cl小时，洗涤，加底物显色。结果显示，新型疫苗免疫鼠血清能识别PRV的部分蛋白带，分子量约为63、50KD,而鼠抗PRV强毒血清识别的蛋白条带分子量约为95.5、86、63、34KD。提示血清学方法能区分强毒感染动物和免疫接种动物。该疫苗在电镜下呈笼格状结构(见图l),直径30-40nm,结构稳定；免疫学指标测定表明疫苗对小白鼠、断奶仔猪、怀孕母猪均具有良好的安全性，能诱导产生较好的体液免疫和细胞免疫应答，且相当于弱毒苗诱导的抗体水平；疫苗的最小免疫量为断奶仔猪50ug,怀孕母猪1000ug;疫苗在-20。C保存12个月以上其免疫原性不变；断奶仔猪免疫后7天即可诱导产生细胞免疫，抗体持续期4个月以上，攻毒保护率达100%;母猪免疫后能诱导产生比断奶仔猪更强的免疫应答，其有效中和抗体持续6个月。该疫苗主要含囊膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潜伏感染问题，安全性好，免疫原性强，血清学方法能区分疫苗免疫动物和强毒感染动物；并首次在国内外系统测定了新型疫苗的生物学特性和各项免疫学指标，进一步证实本发明的新颖性、创造性和实用性。本发明所述PRV-FB林生物材料样品保藏单位中国典型培养物保藏中心，生物材料样品保藏单位地址湖北省武汉市武汉大学，生物材料样品保藏单位保藏日期2007年10月19日，保藏编号CCTCC-V200710,分类命名伪狂犬病毒弱毒FB林(PRV-FB)。权利要求1、一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，其特征在于所述的疫苗制备方法是将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，病毒重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述PRV-FB抹的特征与培养是PRV-FB抹是经乳兔肾原代细胞连续传180代结合蚀斑克隆和低温诱变技术选育出的弱毒抹，PRV-FB林对猪、牛、羊等家畜已无致病性，对易感家兔和乳猪盲传五代，无返强现象，接种动物同居接触感染末发现水平传播；PRV-FB弱毒林能在CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145多种细胞上生长，所述PRV-FB抹选用CEF或Marc-145细胞为病毒培养细胞；PRV-FB病毒的培养是将PRV-FB抹种毒接种CEF或Marc-145单层细胞，接种量为培养液量的1%,37°C旋转培养至细胞病变达80%时，收获细胞毒。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述病毒抗原的制备为将PRV-FB细胞毒经-20。C冻融3次，5000rpm离心30-60mins,取上清35000rpm离心90-120mins,取沉淀重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度为10-12mg/ml,即为制苗用病毒抗原。4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的Mega-IO作用时间和浓度确定是用0.01MPH7.2PBS将上述病毒抗原稀释至蛋白浓度为10mg/ml,在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至终浓度为1%~2%,分别于37°C、室温下作用2-5小时，将病毒液铺到蔗糖垫上，蔗糖垫的上层为PBS配制的10°/蔗糖，下层为30°/。蔗糖，超速离心机、RP40转头、35000rpm、20°C离心90-120mins,收集样品层和10%蔗糖层,装透析袋对0.01MpH7.2PBS透析48小时，收获约3ml即为PRV囊膜蛋白,各取20ul按Bradford法置DyNAQ画t200测定仪测定蛋白浓度；Mega-10对PRV囊膜蛋白的最适作用浓度为2%，作用时间最佳为在37°C条件下3小时，其次为室温条件下4小时。5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的ISCOM基质及QuilA浓度的选择是将收集的嚢膜蛋白样品层和10%蔗糖层混合后分成A、B、C三组，分别加入含0.05%、0.1%、0.2%QuilA的ISCOM基质，对PBS透析48hrs并经适当浓缩后，取少许电镜检查混合物中的ISCOM颗粒，同时各免疫5只10—12周龄昆明系小白鼠，测定血清抗体；通过电镜观察和抗体水平测定比较ISCOM基质中各成份QuilA、卵磷脂、胆固醇不同含量的效果，筛选出较佳组合中的QuilA适宜浓度为0.1%。6、根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于所述的制备方法的新型疫苗的聚丙烯酰胺凝胶电泳谱SDS-PAGE是PRV新型疫苗主要蛋白带4条，分子量约为63、50、34、26.5KD。7、根据权利要求l所迷的制备方法，其特征在于所述的新型疫苗的Westernblot特征是新型疫苗免疫鼠血清能识别PRV的部分蛋白带，分子量约为63、5OKD,而鼠抗PRV强毒血清识别的蛋白条带分子量约为95.5、86、63、34KD。全文摘要本发明公开了一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，其特征在于所述的制备方法是将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，病毒重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。本发明是以伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)为种毒，提取PRV-FB囊膜蛋白为免疫原，应用免疫刺激复合物(ISCOM)制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，可用于猪伪狂犬病的预防和控制。文档编号A61P31/00GK101332297SQ20071018177公开日2008年12月31日申请日期2007年10月22日优先权日2007年6月26日发明者俞伏松,梅林,林天龙,程晓霞,陈仕龙,陈少莺申请人:陈少莺