专利名称：：水蔓菁中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，特别是水蔓菁中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质。二
背景技术：
：前列腺炎是中青年男性的多发病、常见病，属于中医学的"淋症"、"精浊"、"白淫"等范畴。据中国性学会中医专业委员会对中国部分省市的统计，20岁以上男性，3140%患有慢性前列腺炎，约占泌尿外科门诊疾病的1/4。随着社会生活节奏的加快，人们工作压力的增大、精神紧张以及不良的生活习惯，其发病率在逐年增高，而且发病年龄有年轻化的趋势['—2]。前列腺炎是一组临床症候群，又称为前列腺炎综合征(Prostatitissysndrome,PS)美国国立卫生研究院(NIH)近期指定的新分类方法将前列腺炎为分四类w:①类急性细菌性前列腺炎；②类慢性细菌性前列腺炎；③类男性病因不明的慢性盆腔疼痛综合症；④类无症状前列腺炎，常与良性前列腺肥大有关。III型慢性前列腺炎，亦称慢性骨盆痛综合征(chronicplevicpainsydrome,CPPS)更为常见，据一项研究表明，在600例CP中，CPPS占31%w。后三种均属慢性前列腺炎(CP)。慢性前列腺炎(chronicprostate,CP)多发生于青壮年，是泌尿外科常见的疾病，在美国占泌尿外科门诊量的8%,目前尚无有效的治疗手段[5]。急性细菌性前列腺炎和慢性细菌性前列腺炎大约占前列腺炎的5%，慢性非细菌性前列腺炎占前列腺炎的64%。近些年来，关于这方面的研究很多，提出了很多假说，如微生物因素、免疫反应、尿液返流、心理因素等，但都未取得里程碑式的突破。急性前列腺炎一般为细菌性前列腺炎，其治疗与慢性细菌性前列腺炎相同，主要采用抗菌和对症治疗，慢性非细菌性前列腺炎的治疗，由于病因和发病机制尚未明确，多以对症治疗为主，亦有针对可能发病机制的治疗，如a-受体阻滞剂、花粉制剂、非甾体抗炎药、皮质类固醇以及物理疗法，抗菌治疗，精神疗法等，方法虽多，但实际的临床效果却令人失望。水蔓菁为民间草药，玄参科婆婆纳属植物水蔓菁VeronicalinariifoliaPall-exLinksubsp.Dilatata(NakaietKitag.)Hong的干燥全草，始见于《救荒本草》，气微，味苦，微寒，具有清热解毒、利尿、止咳化痰的功能。临床用于支气管炎，肺脓疡，急性肾炎，尿路感染，疖肿的治疗，外用治痔疮，皮肤湿疹，风疹搔痒。已收载于《中华人民共和国药典》1977年版一部中。近年来的研究表明，水蔓菁中含有环烯醚萜苷、黄酮苷、黄酮苷元及挥发油等成分。勒马回片是以水蔓菁为原料制成的中成药，具有清热润肺，止咳化痰，利尿通淋的功效。临床用于肺痨咳血、咳嗽痰喘、小便不利、热淋涩痛收到一定效果，并发现其对泌尿系统感染、慢性前列腺炎、前列腺增生及泌尿系结石有一定疗效。人们的前期研究亦表明其有较好的抗炎作用。但目前其有效成分尚不明确，亦未见有关其这方面药效学研究的报道。因此，有必要对其有效成分进行进一步的提取纯化，深入研究其有效成分的药理作用及作用机制，以期开发出一种疗效显著的抗前列腺疾病的药物。三
发明内容针对上述情况，本发明之目的就是提供从水蔓箐中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质，有效用于解决制备治疗前列腺炎和前列腺增生的药物问题，其解决的技术方案是，取水蔓菁药材，切碎，置烧瓶中，加10倍量乙醇(95浸泡20-40min后，在18-35'C下，回流提取50-90min，过滤，药渣加8倍量乙醇(95%)再回流提取两次，每次lh,滤过，合并3次滤液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏加适量水溶解，用石油醚萃取3次，取水层浓縮后加入聚酰胺柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含黄酮类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干，即得水蔓菁总黄酮活性物质，总黄酮活性物质得率1-1.5%，纯度为90-92%,该物质有效用于制备治疗前列腺炎和前列腺增生的药物，开辟了水蔓菁制备药物的新领域，是中药物上的一大创新，造福于人类。四具体实施例方式以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。在实际制备中，本发明是采用100g的水蔓菁切碎，置于圆底烧瓶中，加质量浓度为95W的乙醇lkml，浸泡30min后，在25'C下回流提取60分钟，过滤，得药液备用，药渣加质量浓度为95%的乙醇800ml，回流提取2次，每次60min,过滤得药液，合并三次药液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏加水溶解(加水量只要充分溶解为适宜)，用石油醚萃取3次，取水层浓缩后加入聚酰胺柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用95W乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含黄酮类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干，即得水蔓菁总黄酮活性物质1.144g，纯度91.07%。本发明达到了临床药理用药要求，并为实验所证实。一、水蔓菁总黄酮对小鼠前列腺炎模型的影响1实验动物小鼠，昆明，雄性，20~23g,动物合格证号0015560,许可证号SCXK(冀)2003-1-003,由河北省医学实验动物中心提供。2、实验药物水蔓菁总黄酮，本发明提取所得；戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20030816;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号X0511332;0.9%氯化钠注射液，郑州永和制药股份有限公司，批号20060302;消痔灵注射液，北京双鹤药业股份有限公司，批号20060415;前列康，浙江康恩贝制药股份有限公司，批号20060301;甲醛，中国莱阳市双双化工有限公司，批号20040519。3、实验仪器FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂。4、实验方法取2629g雄性小鼠60只，随机均匀分为6组，分别为空白组、模型组前列康片组、大剂量水蔓菁总黄酮组、中剂量水蔓菁总黄酮组、小剂量水蔓菁总黄酮组。将空白组做假手术，其余5组造小鼠前列腺炎模型，每只小鼠分别称重，按50mg/kg剂量，腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉成功后，常规消毒皮肤，于无菌条件下进行手术；空白组做假手术处理，造模各组动物下腹正中切口达腹腔，暴露膀胱背侧前列腺(背侧叶)，分别注入25W消痔灵注射液0.02ml/只，分别缝合肌肉皮肤，肌肉注射青霉素20万u/kg防感染。从造模后第8天起，前列康片组灌服前列康片混悬液(1.5g/kg，用生理盐水水配成O.075g/ml，0.2ml/10g，相当于临床用量的15倍)，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组灌服大、中、小剂量的水蔓菁总黄酮混悬液(180、90、45mg/kg，用生理盐水配成9、4.5、2.25mg/ml的混悬液，0.2ml/10g)，空白对照组和模型组均灌服同体积的生理盐水，每天给药1次，连续给药21天。小鼠24h内饮水量分别于实验的第14天、第28天测小鼠的饮水量(测每组小鼠24h内总的饮水量)。白细胞计数以及卵磷脂小体密度评分于最后1次给药lh后(禁食12h)称重，然后处死小鼠，迅速取出前列腺组织，取10mg左右前列腺组织，精密称重，剪碎，加20倍蒸馏水，充分振摇，然后进行白细胞计数以及卵磷脂小体密度评分。白细胞计数采用显微镜直接观察计算；卵磷脂小体密度按评分标准进行评分满视野为4分，3/4视野为3分，1/2视野为2分，1/4视野为1分。前列腺及相关组织的形态学检査取一部分前列腺组织以及睾丸、附睾、肾固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察各组前列腺、睾丸、附睾、肾的组织形态学变化。数据分析用SPSS10.0forwindows统计软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析，等级资料采用Ridit分析5、实验结果表1水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠饮水量的影响(ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从上表可看出，模型组小鼠在第14天和第28天饮水量比空白对照组少，分别减少5.7%和18.8%，说明随着造模时间的延长，模型小鼠前列腺炎症状加重。与模型组比，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组在第14天和第28天饮水量分别增加5.7%、20.5%,3.8%、16.0%，0、11.5%,说明随着给药时间延长，对前列腺炎症状减轻越明显。表2水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠前列腺液中白细胞数及卵磷脂小体密度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*与模型组比/^0.05,**与模型组比尸<0.01从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺匀浆中白细胞数显著增加(户<0.01)、卵磷脂小体密度积分显著减少(户<0.01),说明造前列腺炎模型成功。与模型组比，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组和前列康片混悬液组均可显著减少前列腺匀浆中白细胞数(尸<0.01),大、中剂量水蔓菁总黄酮组和前列康片混悬液组均可显著增加前列腺卵磷脂小体密度积分(尸<0.01)，小剂量水蔓菁总黄酮组可明显增加前列腺卵磷脂小体密度积分(户<0.05)。表3水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠前列腺组织的影响_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>皮呈现扁平状，腺体周围少有纤维增生和少量的炎细胞浸润；"++"前列腺腺体明增生、腺腔扩张，腺上皮扁平状，间质有少量纤维增生和炎细胞浸润；"+++"前列腺腺体明显增生、腺腔扩张，腺上皮扁平状，间质有明显的纤维增生和炎细胞浸润。对前列腺组织观察可见空白对照组前列腺腺体正常，腺上皮均呈皱折状排列，少数腺腔内含有红色分泌物；模型组前列腺出现明显增生，腺腔扩张，腺上皮变平，间质有少量的炎细胞浸润和纤维的增生；前列康片组前列腺腺体不扩大，腺上皮细胞呈皱折状排列，而腺体周围出现明显纤维增生和少量的炎症细胞；大剂量水蔓箐总黄酮组前列腺腺体不扩大，腺上皮细胞呈皱折状排列，腺体不扩张，间质有少量炎症细胞；中剂量水蔓菁总黄酮组前列腺未出现明显增生，腺体上皮细胞大部分呈皱折状排列，间质中有少量的纤维增生和炎症细胞；小剂量水蔓菁总黄酮组前列腺出现明显的增生，腺腔明显扩张，上皮变平呈扁平状。从上表可看出，经Ridit检验，与空白对照组比，模型组出现显著的前列腺炎症的病理变化(尸<0.01),与模型组比，大、中剂量水蔓菁总黄酮组均可显著减轻前列腺炎症的病理变化(/^0.01)。表4水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠前列腺组织的影响(I±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺Vv显著性升高(尸<0.01)、S和Sm均显著降低(尸<0.01)，说明造小鼠前列腺炎模型成功；与模型组比，大、中剂量水蔓菁总黄酮组和前列康片混悬液组均可显著降低小鼠前列腺炎模型前列腺Vv(尸〈0.01)，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组和前列康片混悬液组均可显著升高小鼠前列腺炎模型前列腺S和Sm(尸<0.01)，以大、中剂量水蔓菁总黄酮组对小鼠前列腺炎的抑制作用最好。表5水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠肾脏组织的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>肾小管及上皮细胞约有25%细胞出现泡变；"++"肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞约有50%细胞出现泡变；"+++"肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞约有75%细胞出现泡变。对肾脏组织病理观察可见空白对照组肾小球、肾小囊、肾小管及上皮细胞均正常；前列康片组肾小球基本正常，肾小囊未见异常，肾小管上皮细胞出现空泡变性；模型组肾小球、肾小囊、肾小管未见明显的病理改变；大剂量水蔓菁总黄酮组肾小球、肾小囊及肾小管上皮细胞均正常；中剂量水蔓菁总黄酮组肾小球、肾小囊及肾小管未见有明显病理改变；小剂量水蔓菁总黄酮组肾小球、肾小囊及肾小管及上皮细胞均基本正常。从上表可看出，经Ridit检验，各组之间无明显差异，但可看出，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组对肾脏有一定的益处，可减轻潜在的病理变化；前列康片组反使肾脏的病理变化加重。表6水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠曲细精管中精原细胞的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>模型组10前列康片混悬液组10大剂量水蔓菁总黄10酮组中剂量水蔓菁总黄10酮组小剂量水蔓菁总黄10酮组150018090450044266200600"一"睾丸曲细精管精原细胞无嗜酸性改变；"+"睾丸曲细精管精原细胞约有25%出现嗜酸性改变；"++"睾丸曲细精管精原细胞约有50%出现嗜酸性改变；"+++"睾丸曲细精管精原细胞约有75%出现嗜酸性改变。空白对照组睾丸曲细精管各级精原细胞、支持细胞及间质均正常；模型组睾丸曲细精管中各级精原细胞基本正常，而在精子之后出现许多嗜酸性的精原细胞；前列康片组睾丸曲细精管中的精原细胞中有嗜酸性变的精原细胞；大剂量水蔓菁总黄酮组睾丸曲细精管中各级精原细胞均正常；中剂量水蔓菁总黄酮组睾丸曲细精管中有1/3的精原细胞呈现嗜酸性改变；小剂量水蔓菁总黄酮组睾丸曲细精管中的精原细胞大部分呈现嗜酸性改变。从上表可看出，经Ridit检验，与空白对照组比，模型组出现明显的睾丸病理变化(尸<0,05)，与模型组比，大、小剂量水蔓菁总黄酮组均可显著减轻睾丸的病理变化(尸<0.01)，中剂量水蔓菁总黄酮组均可明显减轻睾丸的病理变化(尸<0.05)。表7水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型小鼠附睾组织的影响组别动物数(只)剂量(mg/kg)++++++空白对照组108200模型组100271前列康片混悬液组1015000244大剂量水蔓菁总黄酮组101808200中剂量水蔓菁总黄酮组10904600小剂量水蔓箐总黄酮组10450460"一"附睾腺体周围无纤维增生和炎细胞浸润，均正常；"+"附睾腺体周围有少数纤维增生和炎细胞浸润；"++"附睾腺体周围有明显纤维增生和炎细胞浸润；"+++"附睾腺体周围有大量纤维增生和炎细胞浸润。空白对照组附睾的附睾管和间质均正常；模型组附睾中附睾管内含有丰富的精子，管腔周围出现明显纤维增生和炎细胞浸润；前列康片组附睾管内含有丰富的精子，管腔周围有大量纤维增生和炎细胞浸润；大剂量水蔓箐总黄酮组附睾管和间质细胞均正常中剂量水蔓菁总黄酮组附睾周围纤维增生明显变薄减少，炎细胞明显减少；小剂量水蔓菁总黄酮组附睾周围可见明显纤维增生和少数炎症细胞。从上表可看出，经Ridit检验，与空白对照组比，模型组出现显著的附睾病理变化(尸<0.01),与模型组比，大、中剂量水蔓菁总黄酮组均可显著减轻附睾的病理变化(尸<0.01)，小剂量水蔓菁总黄酮组均可明显减轻附睾病理变化的趋势。6、结论本实验通过大、中、小剂量水蔓菁总黄酮可增加小鼠饮水量、卵磷脂小体密度积分，减少前列腺匀浆中白细胞数，降低前列腺Vv，升高前列腺S和Sm,使前列腺炎症的病理变化显著减轻等方面验证了水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型组小鼠的治疗作用。其中以大、中剂量水蔓菁总黄酮组对小鼠前列腺炎的抑制作用较好，而且大、中、小剂量水蔓菁总黄酮可减轻睾丸、附睾的病理变化，而且对肾脏有一定的益处，可以改善其相应的病理变化。证明了水蔓菁总黄酮对小鼠前列腺炎模型炎性症状干预有效，可改善模型相关组织的病理变化及改善小鼠列腺炎模型引起的继发性机体病变。二、水蔓菁总黄酮对大鼠前列腺炎模型的影响1、实验动物Wistar大鼠，雄性，240260g,由河北省实验动物中心提供，合格证编号701023，由河北省医学实验动物中心提供。2、实验药物水蔓菁总黄酮，本发明提取所得；IL-2测定试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20070125;IL-8测定试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20070125;戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20030816;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号X0511332;0.9%氯化钠注射液，郑州永和制药股份有限公司，批号20060302;消痔灵注射液，北京双鹤药业股份有限公司，批号20060415;前列康，浙,江康恩贝制药股份有限公司，批号20060301;甲醛，中国莱阳市双双化工有限公司，批号20040519;磷酸二氢钠，天津市福晨化学试剂厂，批号20030925;磷酸氢二钠，天津市四通化工厂，批号20030110;戊二醛，天津市科密欧化学试剂开发中心，批号200511109。3、实验仪器FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；电动匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Sn-895B型智能放免y测量仪，上海原子核研究所四环仪器一厂。4、实验方法取250270g雄性Wistar大鼠60只，随机均匀分为6组，其中l组为空白对照组，做假手术，其余5组造大鼠前列腺炎模型。分别给大鼠称重，按45mg/kg剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠，待麻醉后，常规消毒皮肤，于无菌条件下，空白组做假手术处理；造模型5组大鼠于下腹正中切口达腹腔，暴露膀胱背侧前列腺(背侧叶)，分别注入25%消痔灵注射液0.2ml只，分别缝合肌肉及皮肤，肌肉注射青霉素20万u/kg防感染。造模型5组再均分为大、中、小剂量的水蔓菁总黄酮组、前列康混悬液组和模型组。从造模第8天起，分别灌服大、中、小剂量的水蔓菁总黄酮混悬液(120、60、30mg/kg，用生理盐水配成1.5mg/ml、3mg/ml、6mg/ml，lml/100g)和前列康片混悬液(1000mg/kg,100mg/ml,lml/100g，剂量相当于临床用量的10倍)，空白对照组和模型组分别灌服同体积的生理盐水(lml/100g)。5、实验结果表8水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型大鼠饮水量的影响(ml，7±s)组别动物数(只)剂量(mg/kg)10天20天30天空白对照组1024.3±1.766923.4±2.0110**24.7±1.5670**模型组1023.7±2.406014.4±1.712711.2±1.7511前列康片混悬液10100024.2±2.043920.1±1.9119**22.7±1.8885**组大剂量水蔓菁总1012024.7±2.002721.5±2.1730**23.9±1.4491**黄酮组中剂量水蔓菁总106024.6±2.065521.3±1.6363**22.9±1.9119**黄酮组小剂量水蔓菁总103024.4±2.118721.2±2.0439**21.5±2.2730**黄酮组**与模型组比尸<o.01从上表可看出，与空白对照组比，模型组在第IO天饮水略有减少，在第20天和第30天，饮水量显著减少(尸<0.01)，说明造大鼠前列腺炎模型成功。与模型组比，在第10天，各给药组饮水量略有增加，与空白对照组基本一致；在第20天，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组和前列康混悬液组均可显著增加前列腺炎模型的饮水量(尸<0.01)，使其饮水量基本与空白对照组一致，说明前列腺炎情况显著改善。表9水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型大鼠前列腺指数和前列腺中白细胞水平的<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>**与模型组比尸<0.01从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺匀浆中IL-2水平和IL-8水平显著升高(尸<0.01)，说明造大鼠前列腺炎模型成功。与模型组比，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组和前列康混悬液组均可显著降低前列腺炎模型前列腺匀浆中IL-2水平和IL-8水平(尸<0.01)，说明可显著改善前列腺炎症状。表11水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型大鼠前列腺体的比膜面(Sm)的影响(7±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>**与模型组比尸<0.01从上表可看出，与空白对照组比，模型组前列腺Sm显著降低(尸<0.01)，说明造大鼠前列腺炎模型成功，与模型组比，大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组和前列康片混悬液组均可显著增加前列腺炎模型的Sm(尸<0.01)，以大、中剂量水蔓菁总黄酮组对前列腺炎的抑制作用最好。取各组大鼠前列腺，福尔马林固定，切片镜检，结果为空白对照组大鼠的前列腺多数腺体处于静止状态，腺体縮小，腺上皮皱折排列，腺腔内无分泌物，腺腔明显縮小；模型组大鼠前列腺呈显著扩张状态，腺体增大1-3倍，腺上皮呈扁平状，腺腔内充满着大量红色分泌物，腺腔明显扩张，周围可见散在炎症细胞(淋巴细胞)；前列康片混悬液组少部分腺体显著縮小，大部分腺体处扩张状态，分泌物减少，周围可见炎症细胞(淋巴细胞)；大剂量水蔓菁总黄酮组大鼠前列腺部分腺体显著縮小，腺腔有分泌物存在，而大部腺体处于扩张状态，分泌物减少，周围可见少量的炎症细胞(淋巴细胞)；中剂量水蔓菁总黄酮组大鼠前列腺大部分腺体縮小，腺上皮呈皱縮状态，腺腔明显縮小，腔内有分泌物明显縮小，少数腺体扩大，腔内充满大量的红色分泌物；小剂量水蔓菁总黄酮组大鼠前列腺腺体处于明显的扩张状态，腺上皮变薄呈扁平状，腺腔内充满着大量红色的分泌物。各用药组对前列腺炎模型均有不同程度的抑制作用，以大、中剂量水蔓菁总黄酮组对前列腺炎抑制作用最好。6、结论本实验通过大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组可显著增加前列腺炎模型的饮水量，显著降低前列腺炎模型前列腺液中白细胞水平及前列腺匀浆中IL-2水平和IL-8水平及显著增加前列腺炎模型的Sm，中剂量水蔓菁总黄酮组可明显降低前列腺炎模型前列腺指数，结合大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组模型大鼠的前列腺上皮细胞超微结构的观察结果分析等方面阐述了水蔓菁总黄酮对前列腺炎模型大鼠的治疗作用，证明了大、中、小剂量水蔓菁总黄酮组具有增强线粒体能量代谢的作用，改善线粒体结构的恢复，促进蛋白的合成代谢，恢复内质网的结构和功能，特别是粗面内质网。显示水蔓菁总黄酮可显著改善前列腺炎症状，以大、中剂量的水蔓菁总黄酮作用较好。三、水蔓菁总黄酮对前列腺增生小鼠模型的影响1、药品与试剂水蔓菁总黄酮，由本发明提取；丙酸睾酮注射液，上海通用药业股份有限公司，批号040303;癃闭舒胶囊，石家庄科迪药业有限公司，批号060102;睾酮(T)测定试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20060925;雌二醇(E2)测定试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20060925;甲醛2、实验动物小鼠，昆明种，雄性，20~23g,由河南省医学实验动物中心提供。1.3仪器FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；电动匀桨机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Sn-895B型智能放免Y测量仪上海原子核研究所四环仪器一厂。3、实验方法取小鼠72只，雄性，2023g，随机均匀分为6组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、水蔓菁总黄酮低剂量组、中剂量组、高剂量组，模型及各给药组每日按5mg/kg皮下注射丙酸睾酮(溶于大豆油)，连续3周，空白组注射等量溶媒[16'17]。空白组与模型组，从造模第l天起，按0.2ml/10g体重给予蒸馏水灌胃，每日1次，连续3周。阳性对照组从造模第1天起，按0.2ml/10g体重给予癃闭舒胶囊混悬液(0.45g/kg，用蒸馏水配成22.5mg/ml的混悬液，剂量相当于临床用量的15倍)灌胃，每日1次，连续3周。水蔓菁总黄酮高、中、低剂量组从造模第1天起，按0.2ml/100g体重分别给予低、中、高(45、卯、180mg/kg，分别用蒸馏水配成2.25、4.5、9mg/ml的混悬液，剂量分别相当于临床用量的7.5、15、30倍)浓度水蔓菁总黄酮混悬液灌胃，每日1次，连续3周。末次给药后(禁食12小时)lh，称重，睚静脉取血，离心，分离血清，用放免法测血清中睾酮(T)、雌二醇(E2)水平，测定方法按试剂盒说明书操作；然后脱颈椎处死小鼠，迅速取出前列腺组织，称其湿重。计算各组小鼠前列腺湿重的平均值及前列腺指数(前列腺指数-前列腺湿重mg/鼠体重g)。将前列腺组织固定于10%福尔马林溶液中，4'C冰箱保存，石蜡包埋，切片，厚4nm，HE染色，光镜下观察各组前列腺组织形态的变化。4、实验结果表12水蔓菁总黄酮对前列腺增生模型小鼠前列腺重及前列腺指数的影响^土s)组别动物数前列腺重(mg)前列腺指数(mg/g)空白组1015.160±1.957"0.452±0.072**模型组1019.720±3.2740.657±0.1072癃闭舒组1016.610±2.242*0.503±0.039**水蔓菁大剂量组1018.340±3.4120.502±0.067**水蔓菁中剂量组1017.910±2.3640.508±0.046**水蔓菁小剂量组_1021.810±2.7320.590±0.042*"表示与模型组比P<0.01,*表示与模型组比P<0.05由上面表、图可以看出，与空白组相比，模型组小鼠的前列腺湿重及前列腺指数均明显增加(户O.Ol),表明模型组小鼠前列腺明显增生，模型复制成功。与模型组相比，癃闭舒组组可明显降低前列腺增生模型小鼠的前列腺湿重(PO.05),可显著降低模型小鼠的前列腺指数(PO.01);水蔓菁总黄酮大、中、小剂量组对前列腺增生模型小鼠的前列腺湿重影响不明显，但水蔓菁大、中剂量组可显著降低模型小鼠的前列腺指数(户O.Ol)，水蔓菁小剂量组可明显降低前列腺增生模型小鼠的前列腺指数(尸<0.05)。实验结果表明，癃闭舒及大、中、小剂量水蔓菁总黄酮均具有抑制丙酸睾酮致前列腺增生模型小鼠前列腺增生的作用。表13水蔓菁总黄酮对前列腺增生模型小鼠血清睾酮、雌二醇水平的影响(5土s)组别动物数睾酮(ng/dL)雌二醇(pg/mL)空白组10130.433±43.184**0.255±0.034模型组10755.982±126.0830.258±0.013癃闭舒组10301.824±36.327**0.271±0.008水蔓菁大剂量组10502.749±133.125**0.282±0.028*AA水蔓菁中剂量组10321.334±80.417**0.274±0.019水蔓菁小剂量组10578.146±131.872**0.269±0.019**表示与模型组比尸<0.01，*表示与模型组比/><0.05,AA表示与空白组比尸0.01从上面表、图可以看出，与空白组相比，模型组小鼠血清中睾酮水平显著升高(尸<0.01)，可能与皮下注射丙酸睾酮注射液有关，而雌二醇水平与空白组相比差异无统计学意义，表明在性腺存在的条件下，通过皮下注射丙酸睾酮注射液，可使大鼠体内睾酮含量显著升高，而对雌二醇水平无明显影响，使模型小鼠的前列腺组织在外源性雄激素的作用下出现增生。与模型组相比，癃闭舒组、水蔓菁大、中、小剂量组均可显著降低模型小鼠血清中的睾酮水平(/<0.01);水蔓菁大剂量组小鼠血清中的雌二醇水平与模型组比明显升高(户<0.05)，与空白组相比显著升高(尸O.Ol),其它各组小鼠血清中的雌二醇水平与模型组及空白组相比差异均无统计学意义。实验结果表明，癃闭舒和水蔓菁总黄酮均具有降低丙酸睾酮致前列腺增生模型小鼠血清中睾酮水平的作用，大剂量的水蔓菁总黄酮具有升高模型小鼠血清中雌二醇水平的作用，提示水蔓菁总黄酮抑制模型小鼠前列腺增生的作用可能与其降低雄激素水平、升高雌激素水平有关，改善模型大鼠体内的雌、雄激素比例，从而发挥抗前列腺增生作用。表14水蔓菁总黄酮对前列腺增生模型小鼠前列腺体密度(Vv)和比表面(S)的影响(S土s)_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>模型组3084.27±7.260.34±0.09癃闭舒组3031.42±10.321.30±0.04水蔓菁大剂量组3049.67士10.281.23±0.08水蔓菁中剂量组3052.79±7.360.72±0.09水蔓菁小剂量组3056.36±8.450.76±0.11通过对实验各组小鼠前列腺病理组织学观察结果分析，可以看出，小鼠前列腺增生动物模型的主要病理改变为前列腺腺体明显扩张、密集、间质明显减少，腺体上皮细胞明显变薄呈扁平状，证明前列腺增生动物模型是成功的。从立体计量学的结果可以看出，模型组小鼠前列腺腺体密度与空白组相比显著增加，腺体明显扩张，比表面明显比值变小(比表面是表示球体越大比表面值就越小，球体越小比表面就越大)。用药各组均具有抑制前列腺增生的作用，主要病理改变为使腺体体积縮小，数量减少，间质增宽为特征，立体计量学证明，腺体的体密度减少，比表面值就增大。四、水蔓菁总黄酮对前列腺增生大鼠模型的影响1、药品与试剂水蔓菁总黄酮，由本发明提取；戊巴比妥钠，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20030816;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号X0511332;0.9%氯化钠注射液，，郑州永和制药股份有限公司，批号20060302;丙酸睾酮注射液，上海通用药业股份有限公司，批号040303;癃闭舒胶囊，石家庄科迪药业有限公司，批号060102;睾酮(T)测定试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20061125;雌二醇(E2)测定试剂盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20061125。2、实验动物Wistar大鼠，雄性，280320g，由河北省实验动物中心提供，合格证编号610085。3、所用仪器FA(NyjA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；电动匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Sn-895B型智能放免Y测量仪，上海原子核研究所四环仪器一厂；MultiscanMK3全自动酶标仪，上海雷勃分析仪器有限公司。4、实验方法取SD大鼠72只，雄性，300土20g，随机均匀分为6组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、水蔓菁总黄酮低剂量组、中剂量组、高剂量组，将空白组做假手术，其余五组造模，每只大鼠分别称重，按45mg/kg剂量，腹腔注射戊巴比妥钠，待麻醉成功后，常规消毒皮肤，于无菌条件下，空白组做假手术处理，造模组经阴囊摘除双侧睾丸，残端处结扎，以确保止血，缝合皮肤，肌肉注射青霉素20万u/kg。从去势第8天起，造模组每只大鼠皮下注射丙酸睾酮4mg/kg/d，连续30天18'2()。空白组与模型组，从去势第8天起，按2ml/100g体重给予蒸馏水灌胃，每日1次，连续30天。阳性对照组从去势第8天起，按2ml/100g体重给予癃闭舒胶囊混悬液(0.3g/kg，用蒸馏水配成15mg/ml的混悬液，剂量相当于临床用量的IO倍)灌胃，每日1次，连续30天。水蔓菁总黄酮低、中、高剂量组从去势第8天起，按2ml/100g体重分别给予低、中、高(30、60、120mg/kg)浓度水蔓菁总黄酮混悬液灌胃，每日1次，连续30天。末次给药后(禁食12小时)lh,称重，之后处死大鼠，迅速取出前列腺组织，称其湿重。计算各组大鼠前列腺湿重的平均值及前列腺指数(前列腺指数-前列腺湿重mg/鼠体重g)。取一部分前列腺组织用电子天平称重，按重量加入冰生理盐水，低温匀浆，过滤除去匀浆组织块，以5000rpm/分转速离心10分钟，取上清采用放免法测定前列腺组织睾酮、雌二醇，采用酶联免疫法测定EGF水平，测定方法按照试剂盒说明书操作。另取一部分前列腺组织固定于10%福尔马林溶液中，4'C冰箱保存，石蜡包埋，切片，厚4pm，HE染色，光镜下观察各组前列腺组织的细胞学形态。另取一部分前列腺组织用4%戊二醛磷酸缓冲液固定，用作电镜观察。5、实验结果表15水蔓菁总黄酮对前列腺增生模型大鼠前列腺湿重及前列腺指数的影响()c土s)<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>**表示与模型组比户<0.01由上面表、图可以看出，与空白组相比，模型组大鼠前列腺湿重和前列腺指数都显著增加(尸O.Ol)，表明模型组大鼠前列腺明显增生，模型复制成功。与模型组相比，癃闭舒组、水蔓菁总黄酮大、中剂量组均可显著降低前列腺增生模型大鼠的前列腺湿重及前列腺指数(尸O.Ol)，水蔓菁小剂量组大鼠前列腺湿重及前列腺指数与模型组相比差异无统计学意义，表明，癃闭舒及大、中剂量水蔓菁总黄酮均具有抑制去势加皮下注射丙酸睾酮致前列腺增生模型大鼠前列腺增生的作用。表16水蔓菁总黄酮对前列腺增生模型大鼠前列腺中睾酮、雌二醇水平的影响(x士s)<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>**表示与模型组比/^0.01从上面表、图可以看出，与空白组相比，模型组大鼠前列腺组织中睾酮水平显著升高(尸<0.01)，可能与皮下注射丙酸睾酮注射液有关，而雌二醇水平显著降低(PO.Ol)，表明在去势的条件下，通过皮下注射丙酸睾酮注射液，可使大鼠体内睾酮含量显著升高，雌二醇水平显著下降，从而使大鼠的前列腺组织在外源性雄激素的作用下出现增生。与模型组相比，癃闭舒组、水蔓菁大、中、小剂量组均可显著降低模型大鼠前列腺中的睾酮水平，显著升高模型大鼠前列腺中的雌二醇水平。实验结果表明，癃闭舒和水蔓菁总黄酮均具有降低去势加皮下注射丙酸睾酮致前列腺增生模型大鼠前列腺中睾酮水平，升高模型大鼠前列腺中雌二醇水平的作用，提示水蔓菁总黄酮抑制模型大鼠前列腺增生的作用可能与其降低雄激素水平、升高雌激素水平有关，使模型大鼠体内严重失衡的雌、雄激素比例得到改善，从而发挥抗前列腺增生作用。表17水蔓菁总黄酮对前列腺增生模型大鼠前列腺中表皮生长因子水平的影响(;土s)组别动物数EGF(pg/mL)空白组1079.432±5.036**模型组10594.524±68.461癃闭舒组10187.838±24.796**水蔓菁大剂量组10191.605±26.154**水蔓菁中剂量组10159.840±11.176**水蔓菁小剂量组10227.155±25.776"**表示与模型组比尸<0.01从上面表可以看出，与空白组相比，模型组大鼠前列腺中的表皮生长因子水平显著升高(尸O.Ol)，表明在外源性雄激素的作用下，可以诱导模型大鼠前列腺中的表皮生长因子水平升高。与模型组相比，癃闭舒组及水蔓菁总黄酮大、中、小剂量组大鼠前列腺中表皮生长因子水平均显著下降(户O.Ol)，表明癃闭舒及水蔓菁总黄酮均具有降低丙酸睾酮之前列腺增生模型大鼠前列腺中表皮生长因子水平的作用，提示水蔓菁总黄酮的抗前列腺增生作用可能与其降低模型动物前列腺中的表皮生长因子水平有关。总之，由上述各试验清楚的表明，本发明水蔓菁总黄酮纯度高，具有治疗前列腺炎和前列腺增生的良好作用，为前人所无有，可有效用于制备治疗前列腺炎和前列腺增生的药物，造福于人类，是中药上的一大创造性发明，经济和社会意义巨大。权利要求1、一种水蔓菁中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质，其特征在于，该物质是由水蔓菁切碎，置烧瓶中，加10倍量质量浓度为95％的乙醇浸泡20-40min后，在18-35℃下，回流提取50-90min，过滤，药渣加8倍量质量浓度为95％的乙醇回流提取两次，每次1h，滤过，合并3次滤液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏加适量水溶解，用石油醚萃取3次，取水层浓缩后加入聚酰胺柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含黄酮类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干，即得水蔓菁总黄酮活性物质，总黄酮活性物质得率1-1.5％，纯度为90-92％。2、根据权利要求1所述的水蔓菁中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质，其特征在于，所说的该物质是采用100g的水蔓菁切碎，置于圆底烧瓶中，加质量浓度为95。/。的乙醇lkml，浸泡30tnin后，在25。C下回流提取60分钟，过滤，得药液备用，药渣加质量浓度为95%的乙醇800ml,回流提取2次，每次60min，过滤得药液，合并三次药液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏加水溶解，用石油醚萃取3次，取水层浓缩后加入聚酰胺柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含黄酮类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干，即得水蔓菁总黄酮活性物质1.144g，纯度91.07%。3、权利要求1或2所述的水蔓菁中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质为制备治疗前列腺炎和前列腺增生药物的应用。全文摘要本发明涉及从水蔓菁中提取的一种治疗前列腺炎和前列腺增生的有效物质，有效用于解决制备治疗前列腺炎和前列腺增生的药物问题，其解决的技术方案是，取水蔓菁药材，切碎，置烧瓶中，加乙醇浸泡后，回流提取，过滤，药渣加乙醇再回流提取两次，滤过，合并3次滤液，减压回收乙醇，得浸膏，浸膏加适量水溶解，用石油醚萃取3次，取水层浓缩后加入聚酰胺柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用95％乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含黄酮类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干，得水蔓菁总黄酮活性物质，该物质有效用于制备治疗前列腺炎和前列腺增生的药物，开辟了水蔓菁制备药物的新领域，是中药物上的一大创新，造福于人类。文档编号A61K36/80GK101185698SQ20071019306公开日2008年5月28日申请日期2007年12月5日优先权日2007年12月5日发明者苗明三申请人:苗明三