专利名称：作为药用产品的对切昆贡亚热特异的免疫球蛋白的浓缩物的制作方法
作为药用产品的对切昆贡亚热特异的免疫球蛋白的浓缩物本发明涉及用于治疗切昆贡亚热(Chikungunya)的新的药用产品，即 对切昆贡亚热特异的免疫球蛋白的浓缩物，以及其制备方法。前言切昆贡亚热(缩写为CHIK)是由虫媒病毒(披膜病毒科(Togaviridae)家族曱病毒属(Alphavirus))引起的通过伊蚊(Je&力属蚊子传播的传染性热带疾病。所述名称来自班图语，意思是弯曲的人、巻曲的人、或弯曲人的疾病，因为它引起非常严重的关节疼痛并且合并僵硬，这使被感染的患者呈现出极典型的弯曲表征。在其循环中利用节肢动物媒介的病毒被归于通用术语上的虫媒病毒。虫媒病毒被WHO定义为基本上或主要通过借助吸血节肢动物的易 感脊推动物宿主间的生物性传播存在于自然界的病毒；在外潜伏期之后， 它们在脊推动物体内繁殖并引发病毒血症，在节肢动物的组织内增殖并 通过叮咬昆虫被传播到另 一脊推动物。所述病毒乂人病毒血症宿主向成年雌蚊的传4番经由叮咬发生时被吸出 的血液发生。所述病毒在蚊子体内繁殖，穿过该动物的胃屏障，在唾液 腺中被发现。通过刚好在蚊子叮入血管之前释方文的抗凝唾液实现对健康 人的感染。窗口期〗又有几天，在此期间人是发病前的病毒血症宿主。在超过950种的蚊子中，有几种能够传播切昆贡亚热，但到目前为 止只有埃及4尹蚊(Jecfes aegy/^)和白纟丈^尹蚊("ed^ a/6o/ /"M力寻皮确定为流 行性的传病媒介，因为它们适应人类居住的区域。这些相同的物种还与 其它的虫媒病毒的传播有关登革热、登革出血热(HDF)、黄热病等。临床特征主要表现为与登革热(登革热经常被误认为是切昆贡亚热， 反之亦然)发热近似的高热，且合并有导致失去活动能力的关节疼痛，以 及有时出现的皮渗。然而，还有直到现在仍被忽视的一些严重形式爆 发性肝炎、心脏病发作、脑膜脑炎等。诸如罗斯河病毒(Ross River)、阿 尼昂尼昂病毒(O，nyong-nyong)、马雅罗病毒(Mayaro)的几种其他的曱病毒属虫媒病毒(约30-KD衣壳，且3'端聚腺苷酸化的RNA)与相似的症状有 关。疾病的潜伏期平均持续4至7天。病毒血症延续大约5天，该阶段 病毒存在于血液中，因此可能引起传播。随后抗体产生。病毒仍存留于 血液中。因此通常是获得终生免疫或至少持续一年(参见下面的II期实 验)。现有技术目前没有杀病毒治疗，也没有获得上市核准的疫苗。 治疗纯粹是针对症状进行的，以减轻发热和减轻疼痛。 在美国，针对切昆贡亚热疫苗的I期和II期实验已被美军传染病医 学研究所实施。II期(Edelman R et al""Phase II safety and immunogenicity study of live chikungunya virus vaccine"("活切昆贡亚热病毒疫苗的II期安全和免疫 原性研究")TSI-GSD-218. June 2000; Am J Trop Med Hyg, 62:681-5)的 随机、双盲、安慰剂对照研究包括板上活的纯化的切昆贡亚热(CHIK)疫 苗的安全性和免疫原性研究，该研究在73名健康的成年志愿者中进行。 59名志愿者通过皮下注射CHIK疫苗被免疫一次，14名志愿者被注射安 慰剂。58名接种疫苗的志愿者中有57名(98%)在第28天产生了抗-CHIK 中和抗体，并且在此后一年有85%的接种疫苗的个体仍然是血清反应阳 性的。两种抗病毒化合物的组合物，利巴韦林(ribavirin)和干扰素a，也已 经-故测试用于切昆贡亚热(Briolant S et al., "In vitro inhibition of Chikungunya and Semliki Forest viruses replication by antiviral compounds: synergistic effect of interferon-alpha and ribavirin combination(抗病毒化合 物对切昆贡亚热和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)复制的体外抑 制干扰素-a和利巴韦林组合的协同作用)",Antiviral Res, 2004年2月；61 (2): 111-7)。 IFN-a2b和利巴韦林的这种组合对切昆贡亚热呈现出协同的 抗病毒作用，其非常有希望被考虑应用于治疗。然而，这种治疗将会是极其昂贵的并需要重复，而且还会引起许多已知的干扰素副作用。 发明概述面对缺乏建立的治疗方法，在短期内不会研制出的疫苗，以及让人 难以负担的抗病毒治疗，本申请人寻求提供针对切昆贡亚热的新疗法。本申请人以令人惊喜的方式表明，对切昆贡亚热特异的免疫球蛋白 的浓缩物的给药可以用于解决这一技术问题。定义术语"浓缩物"指通过去除特定成分获得的产物。免疫球蛋白浓缩物 通过去除血浆中的特定成分获得，以得到富含免疫球蛋白的血浆部分。术语"免疫球蛋白，，(Ig)指天然的球蛋白，主要存在于血浆中，具有抗 体功能，其可以被用于治愈性或预防性治疗。免疫球蛋白是由通过二硫键连接的2条重链和2条轻链组成的异源 二聚体。每条链都由N端的可变结构域或区(轻链由重排的V-J基因编码， 重链由重排的V-D-J基因编码)和C端的恒定区组成，所述可变结构域或 区对抗体针对的抗原是特异的，所述恒定区由轻链的单一 CL结构域或重 链的三个结构域(CH1、 CH2和CH3)组成。重《连和轻《连的可变结构域以及 CH1和CL结构域的组合形成了 Fab部分，所述Fab部分由极具弹性的 铰链区连接到Fc区，所述铰链区允许每个Fab结合到其靶抗原的同时， 使介导抗体的效应特性的Fc区仍然能够接近诸如FcyR受体和Clq的效 应分子。IgG是数量最多的免疫球蛋白(占循环抗体的75%到80%)。它们保护 机体抵'抗在血液和淋巴液中循环的细菌、病毒和毒素。另外，它们迅速地结合到补体(免疫系统的一个组分)。它们还参与记忆应答，所述记忆应 答是免疫的基础，疫苗接种的机制就是建立在其上的。最后，免疫球蛋 白G穿过胎盘屏障，从而在胎儿体内建立被动免疫。IgA被发现主要在诸如唾液、肠液、汗液和母乳的分泌物中。免疫球 蛋白A的主要作用是阻止致病体结合到细胞上，特别是结合到组成粘膜 和表皮的保护细胞上。IgM是人体与抗原初次接触时分泌的免疫球蛋白。它们是由浆细胞 释放的第一类免疫球蛋白。IgM在血液中的存在提示现症感染。免疫球蛋白经木瓜蛋白酶酶性蛋白水解产生2个相同的被称为 Fab(抗原结合片段)的片段和一个Fc片段(可结晶部分)。Fc片段提供了免 疫球蛋白的效应功能。经胃蛋白酶蛋白水解，产生了 F(ab')2片段，其中所述两个Fab片段 仍然通过两个二硫键保持结合，而所述Fc片段被裂解成几个肽。所述 F(ab') 2片段从两个Fab'片段(一个Fab'片段由一个Fab和绞链区组成)形 成，通过相互悬链的二硫键连接以形成F(ab') 2。术语"色语层析"指分离混合物组分的方法，所述方法基于它们被合 适介质的选l奪性保留。发明详述首先，本发明涉及作为药用产品的、对切昆贡亚热病毒特异的免疫 球蛋白的浓缩物。自,人Cohn开发了乙醇沉淀方法(Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncley et al. 1949, J. Am. Chem. Soc. 71， 541),使用富含免疫球蛋 白的人类血浆部分治疗各种感染或先天性免疫缺陷已为人所知。特别地，本发明所述的浓缩物由作为药用产品的特异性针对切昆贡 亚热病毒的免疫3求蛋白A、 G和M的浓缩物组成，或只由特异性针对切 昆贡亚热病毒的免疫球蛋白G的浓缩物组成，或只由特异性针对切昆贡 亚热病毒的免疫球蛋白m的浓缩物组成。特别优选地，本发明所述的浓缩物包括至少50%的IgG免疫球蛋白， 以及90%至98%的与特异针对人体免疫球蛋白的抗体进行反应的蛋白。除了完整的对切昆贡亚热病毒特异的免疫球蛋白之外，本发明所述 的浓缩物还可以包含对切昆贡亚热病毒特异的F(ab)'2和/或Fab片段，特 别包含5%至50%的F(ab)'2和/或Fab,特别包含至少50至60 g/L的Ig 和片段用于药物制备。这种包含抗体结合部位的F(ab)'2或Fab片段可能已经失去了衍生它 们的完整抗体的某些特性，例如结合到Fcy受体的能力。除了完整的对切昆贡亚热病毒特异的免疫球蛋白之外，本发明所述的浓缩物可以包含只来自于IgG和IgM的对切昆贡亚热病毒特异的 F(ab)'2或Fab片段。根据本发明，1至10 mmol的镁和/或锌可以添加到浓缩物中。本发明的另 一个主题在于使用本发明所述的浓缩物制备用于治疗切 昆贡亚热的药用产品。这种治疗是预防性和/或治愈性的。它用于向在传染病地区未被感染 的人提供被动免疫，或者用于治疗已经被病毒感染的患者。所述药用产品可以通过局部、皮下、口服、粘膜、肌内或静脉内途 径给予。这种给药在几周内有效，大约是21天，超过了这个时间，如果传染 病或症状仍存在，必须重复给药。本发明还涉及制备本发明的浓缩物的方法。这种方法的第一步包括建立一个至少由1000份捐献的血浆组成的血 浆库，每份捐献的血浆都包含足够滴度的抗-切昆贡亚热Ig。例如，当通 过酶联免疫吸附测定方法测定滴度时，包含足够滴度的血清相当于被稀 释到1/1000后抗-切昆贡亚热的抗体#:测仍呈现阳性的血清。这些捐献的血浆来自于已经接触所述疾病的人或已经产生所述疾病 的患者。可以按照在C. van de Water et al.， Journal of Immunological Methods, 166(1993)， 157-164中描述的操作进行滴定。为了使所述血浆库富含免疫球蛋白，被称为"脂类和蛋白污染物"的 血浆的其他组分以一步法被沉淀。这种通过一步法沉淀的纯化可以通过 才艮据Steinbuch (Steinbuch M., Archiv. Biochem. Biophys.， 134, 279-284)的 沉淀条件下稀释血浆并加入辛酸进行。它还可以通过在诸如例如磷酸三 4丐和鸟粘土等吸附剂存在的条件下，加入诸如利凡诺、氯化铝、西吡氯 铵、辛酸、多聚磷酸盐的沉淀剂来获得。由沉淀产生的上清液可以构成本发明所述的免疫球蛋白浓缩物。因 此，它包含IgG 、 IgA和IgM的混合物。这种上清液^皮回收，例如通过离 心或过滤，4壬选i也通过加入至少一种过滤添加剂。然后可以将由离心或过滤产生的上清可以进行病毒灭活处理，例如利用溶剂/去污剂(Triton XI OO)进行常规的病毒灭活处理。如果实施的沉淀是如上所述的辛酸沉淀，上清中的辛酸残留物用 P04钩去除。为了得到IgG、 IgA或IgM的浓缩物，可以应用专利申请EP1385886 中描述的方法，特别是对应于PH值调节、吸附到预载柱、将包含免疫球 蛋白和伴随蛋白的上清吸附到柱、洗柱以及如诸如例如IgG、 IgA或IgM 的各种类型免疫球蛋白的连续洗脱的操作。病毒灭活步骤之后，所述上清接着经过碱性pH下进行的通过阴离子 交换器色谱层析的附加纯化步骤。特别地，上清的pH值被预先调整到 8.9至9.1的pH值范围，且用pH范围为8.9至9.1的緩沖液装载所述柱。 色谱层析步骤使免疫球蛋白吸附到柱上并使未被截留蛋白进入流出液。 色镨层析可以在例如结合了 DEAE、 TMAE或QAE基团的网状多糖或乙 烯聚合物凝胶上进行。用与装载緩冲液相同的緩冲液洗柱去除未截留蛋白后，免疫球蛋白G 被用pH值为4至7，优选pH 6.2的磷酸盐緩冲液洗脱。用pH值为6至6.3,补充有100至175 mM，优选为150 mM的氯化 钠的相同磷酸盐緩冲液进行的可任选的后续洗脱可以被用于收集IgA。用pH值净皮调整到6至7且补充有250至350 mM，优选为300 mM 氯化钠的相同磷酸盐緩冲液进行的可任选的后续洗脱可以被用于收集 IgM。通过混合如上所述的浓缩物，可以得到IgA、 IgG和IgM间的任何一 种混合物。如此洗脱和收集的免疫球蛋白可以通过超滤方法浓缩，例如先通过 常规的灭菌过滤，然后通过孔隙从100降至15纳米的纳米过滤器过滤。向经过浓缩和过滤的免疫球蛋白的所述溶液中加入一种药学上可接 受的稳定剂，例如在专利申请WO2004/091656中描述的那些。然后将这 一溶液包装为无菌溶液并且任选地将其冷冻和/或冻干。纳米过滤技术的应用使去除那些抵抗病毒灭活溶剂/去垢剂处理的病 毒成为可能。为了制备对切昆贡亚热病毒特异的Ig及F(ab)'2或Fab片段的浓缩 物，免疫球蛋白的浓缩物(l),即IgA、 G和M的混合物或IgG和IgM的 混合物或只有IgG或只有IgM，如上所述被制备，然后在第二步中，将 得到的Ig浓缩物的一部分经受蛋白水解，以获得F(ab)'2或Fab片段(2)。 最后在第三步中，混合浓缩物(1)和(2)。为了得到F(ab)'2片段，在pH4.0、 35°C条件下用1%的胃蛋白酶进 行蛋白水解，所述百分比对应于胃蛋白酶与浓缩物中蛋白重量的总重的 重量比(IGLOO操作)。为了得到Fab片段，用1%的木瓜蛋白酶进行蛋白水解，该百分比对 应于木瓜蛋白酶与浓缩物中蛋白重量的总重的重量比。免疫球蛋白G、 A和/或M的蛋白水解还可以通过使用纤溶酶和/或 胰蛋白酶进行，这些蛋白酶的实际应用为本领域的技术人员所熟知。下面公开的实施例描述了本发明的特定实施方案，但并不应该被认 为限定其范围。实施例1:抗-切昆贡亚热的免疫球蛋白浓缩物的制备 1-1.血浆库的建立从近期被切昆贡亚热病毒感染且被从疾病征状中治愈的志愿捐献者 中采集1升富含抗-切昆贡亚热抗体的血浆。抗体滴度通过酶联免疫吸附 测定方法测定，所述方法在于将病毒抗原固定于^f敖量滴定板上，然后通 过针对免疫球蛋白的辣根过氧化物酶标记试剂显示特异抗体。为建立所 述的血浆库，在使用"特异的，，酶联免疫吸附测定方法的情况下，至少 1/1000稀释的阳性测定样本才能4皮保留。1-2.免疫球蛋白的制备经1-1步骤得到的血浆库被冷却到-3。C,并且在冷却过程中加入一定 体积的乙醇，所述乙醇体积足以得到8%的终乙醇浓度。弃除由此形成的 沉淀。然后将上清的pH值调整到5.9，如通过加入乙酸緩冲液，冷却到-5。C， 最后加入一定体积的乙醇，所述体积足以得到19%的终乙醇浓度。由此形成的沉淀通过例如离心法被收集，且重悬于例如乙酸緩冲液中以获得4.7至4.9的终pH值。然后在20。C下加入辛酸，强烈搅拌，以获得20g/l的终辛酸浓度。由此形成的沉淀通过离心法或冲积过滤被分离并弃除。将磷酸三4丐 或活性炭加入到上清中，然后通过深床过滤澄清混合物。将包含从澄清步骤得到的上清的免疫球蛋白的pH值通过例如添加 氢氧化钠/甘氨酸緩冲液调整到pH 9，并将上清应用到阴离子交换柱(例如 Fractogel TMAE),所述阴离子交换柱在pH为9的条件下用pH为9的甘 氨酸/氯化钠緩冲液装载。用加载缓冲液进行冲洗直至所述柱流出液在280nm处的OD接近在 确立基线时一皮测量的OD280。然后用pH值为6.2的第 一磷酸钠缓冲液进行IgG洗脱。用补充有300 mM氯化钠的磷酸盐緩沖液进行第二次洗脱。相应的洗脱物包含IgA、 IgM和部分IgG4。在EP 1385886中公开了 纯化的具体操作过程。1-3.抗切昆贡亚热的活性浓缩物的制备回收包含IgG的第一洗脱物的25%,并将其加入到包含IgG4、 IgA 和IgM的洗脱物。这种免疫球蛋白的混合物通过在薄膜上进行超滤，被 浓缩到50 g/1，所述薄膜的截留阈值等于或小于30kD。通过针对pH值为3.8至4.2的柠檬酸盐緩冲液的透析过滤调整所述 浓缩混合物的pH值，以获得包含在这一范围内的酸性PH值。然后在所 述溶液中加入胃蛋白酶(10000 FlP/mg),以使胃蛋白酶的量达到浓缩混合 物中包含的蛋白总量的1%。然后将所述溶液在无菌条件下于0.2 jam处 过滤，并在37。C下孵育20小时。孵育后，中和蛋白水解液，例如通过添加pH值为6.2+/-0.2的氮氧 化钠。中和的蛋白水解液被针对pH值为6.2+/-0.2的甘氨酸緩沖液进行 透析过滤，直到OD，达到约0.005,所述OD28o在30kD截留阈值膜的过 滤线上被测量。经胃蛋白酶水解产生的大小等于或小于30 kD的肽在经过截留阈值膜时被弃除。由此得到的蛋白水解物包含Fab片段、F(ab)'2片段，但缺 少Fc片段。然后将得到的蛋白水解物与包含IgG的第一洗脱物的剩余75%混合。 接着将所述混合物通过超滤方法浓缩，依赖于所选择的给药途径，达到 范围在50至160 g/1的终浓度。浓缩物的滴度依照在如Edelman, R等 (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 62(6)， 2000, 第 681-685页)中描述的方法被测量。由此得到的浓缩物中抗-切昆贡亚热特 异的抗体的滴度高于初始血浆的至少3至10倍。1-4.制备物的用途经1-3步得到的所述浓缩物通过与包含药学上可接受的赋形剂的制 剂混合被稳定，所述赋形剂是诸如例如终浓度为0.22M的甘氨酸，或诸 如在专利申请WO 2004/091 656中描述的那些。加到浓缩物中的所述制 剂的pH值与获得液体混合物是一致的，所述pH值范围为4.2至5.6。依赖于接受者的静脉状态，可以通过例如静脉内、皮下或肌内的途 径给予得到的液体混合物。给予的剂量对应于0.2至0.8ml/kg，在流行病的情况下，作为预防措 施可以每3周一次给予特殊暴露的患者，如老人、孕妇或新生儿。
权利要求
1.作为药用产品的对切昆贡亚热病毒特异的免疫球蛋白的浓缩物。
2. 如权利要求1所述的浓缩物，其中它包含免疫球蛋白A、 G和M 的浓缩物。
3. 如权利要求1所述的浓缩物，其中它包含免疫球蛋白G的浓缩物。
4. 如权利要求1所述的浓缩物，其中它包含免疫球蛋白M的浓缩物。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的浓缩物，包括90%至98%的免疫球蛋白。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的浓缩物，其中它还包含对切昆 贡亚热病毒特异的F(ab)'2片段。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的浓缩物，其中它还包含对切昆 贡亚热病毒特异的Fab片段。
8. 如权利要求7所述的浓缩物，其中包含5%至50%的F(ab)'2和/ 或Fab。
9. 如权利要求6、 7或8所述的浓缩物，其中F(ab)'2或Fab片段是 IgG和IgM的F(ab)'2或Fab片段。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的浓缩物，其中将1至10 mmol 的镁加入其中。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的浓缩物，其中将1至10 mmol的锌加入其中。
12. 如权利要求1至11中任一项所定义的浓缩物用于制备治疗切昆贡亚热的药用产品的用途。
13. 如权利要求12所述的制备药用产品的用途，所述药用产品以通 过局部、皮下、口服、肌内或静脉内途径给药的形式存在。
14. 制备如权利要求1或2中所述的浓缩物的方法，其中所述方法包 括下述步骤-建立至少由1000份捐献的血浆组成的库，每份捐献血浆包含足够 滴度的抗-切昆贡亚热的Ig，-以一步法沉淀脂类和蛋白污染物， -在上清中回收Ig浓缩物。
15. 制备如权利要求1至5中任一项所述的浓缩物的方法，其中所述 方法包括下述步骤-建立至少由1000份捐献的血浆组成的库，每份捐献血浆包含足够 滴度的抗-切昆贡亚热的Ig,-以一步法沉淀脂类和蛋白污染物，-在碱性pH条件下于阴离子交换器上对上清进行色谱层析， -用pH值为4至7,优选为6.2的磷酸盐緩冲液洗脱IgG,, 陽4壬选地，随后用添加了 100至175mM，优选为150mM的氯化钠的相同磷酸盐緩沖液在pH值为6至6.3的条件下洗脱IgA，-任选地，随后用pH值为6至7且添加了 250至350mM氯化钠的相同磷酸盐缓沖液洗脱IgM,-任选地，混合IgG、 IgA和IgM浓缩物。
16.如权利要求15中所述的方法，其中将上清的pH值调整到8.9至 9.1,并且在色谱层析之前将色i瞽层析柱用pH值为8.9至9.1的緩沖液装载。
17. 制备如权利要求6、 7或8所述的浓缩物的方法，其中所述方法 包括下述步骤(1) 制备如权利要求14或15所述的Ig的浓缩物，或者如权利要求 15或16所述的IgG的浓缩物，或者如4又利要求15或16所述的IgM的浓缩物，(2) 将初期的浓缩物的一部分经受蛋白水解，以获得F(ab)'2或Fab 片段，(3) 混合(1)部分和(2)部分。
18. 制备如权利要求9所述的浓缩物的方法，其中所述方法包括下述 步骤(1) 制备如权利要求15或16所述的IgG的浓缩物，(2) 制备如权利要求15或16所述的IgM的浓缩物，(3) 混合(1)部分和(2)部分，(4) 将初期的混和物的一部分经受蛋白水解，以获得IgG和IgM的 F(ab)'2或Fab片段，(5) 混合(3)和(4)。
19. 如权利要求17或18所述的方法，其中所述蛋白水解在胃蛋白酶 占蛋白重量的1%、 pH值为4、 35°C的条件下发生以获得F(ab)'2片段的。
20. 如权利要求17或18所述的方法，其中所述的获得Fab片段的蛋 白水解发生在木瓜蛋白酶存在时。
21. 如权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述沉淀是辛酸 的沉淀，并且其中通过P04钙去除上清中的辛酸残留物。
22. 如权利要求14至21中任一项所述的方法，其中所述沉淀物在加入至少一种过滤添加剂后^皮过滤分离。
23. 如权利要求14至22中任一项所述的方法，其中所述上清用溶剂 /去垢剂处理。
24. 如权利要求15至23中任一项所述的方法，其中所述洗脱的免疫 球蛋白通过超滤方法浓缩，先进行常规的灭菌过滤法，然后再通过孔隙 从100纳米缩小至15纳米的纳米过滤器过滤。
25. 如权利要求15至24中任一项所述的方法，其中将药学上可接受 的稳定剂添加到经浓缩和过滤的免疫球蛋白的溶液中，然后将所述溶液 包装成无菌溶液并且可任选地将其冷冻和冻干。
全文摘要
本发明涉及用于治疗切昆贡亚热的新的药用产品，即对切昆贡亚热特异的免疫球蛋白的浓缩物，以及其制备方法。
文档编号A61K39/42GK101410138SQ200780011158
公开日2009年4月15日 申请日期2007年4月2日 优先权日2006年3月31日
发明者罗兰·施米特赫斯勒尔 申请人:分馏及生物技术法国实验室股份公司