穿过上皮和/或内皮层的scFV抗体的制作方法

专利名称：：穿过上皮和/或内皮层的scFV抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有针对组织穿透性的改进特征的scFv抗体，及其在诊断和治疗依赖于选定抗原的过量表达的疾病中的局部应用。本发明尤其涉及特异性结合并灭活所述选定抗原的抗体。相关信息将本申请文件通篇中提到的任何专利、专利申请及参考文献的内容均通过引用整体并入本文。
背景技术：
：可通过局部应用必需能穿透上皮组织的药物实施很多疾病的局部治疗。邻近上皮细胞通过紧密'连接被密封，以防止大多数可溶分子从上皮片层(sheet)的一侧穿到另一侧(Albertsetal"MolecularBiologyofthecell,2nded.)。紧密连接在细胞旁(paracellular)屏障的形成和保持，及简单上皮和内皮中的细胞极性中发挥关键作用。它们还在血脑屏障中发挥重要作用，它们在其中控制出脑或入脑的物质。大分子量药物需要穿过这些组织屏障，以进入它们的作用位点。抗体通常太大，无法穿过上皮细胞层的紧密连接。作为机体正常活性的一部分，紧密连接响应若干种信号(既有细胞内，也有细胞外的)选择性地开闭。这使大分子穿过，或甚至使整个细胞穿过紧密连接屏障。相比注射及其他施用模式而言，粘膜施用治疗化合物通常可提供某些优点，例如在方便性和递送速度方面，及降低或消除涉及通过注射的递送的副作用和依从性问题。但生物活性剂的粘膜递送受到粘膜屏障功能及其他因素的限制。因此，粘膜药物施用一般需要大于注射施用的药物量。其他治疗化合物，包括大分子药物、肽和蛋白通常都是难于粘膜递送的。药物在不借助递送增强剂的情况下透过粘膜表面的能力似乎与多种因素相关，包括分子大小、脂溶性和离子化。小于约300-1000道尔顿的小分子通常能穿透粘膜屏障，但随着分子大小的增加，透过性迅速降低。脂溶性化合物通常比非脂溶性分子更能透过粘膜表面。肽和蛋白的脂溶性差，因此表现出的穿过粘膜表面的吸收性也差。US2006062758提供了组合物和方法，其包含生物活性剂和有效增强生物活性剂在哺乳动物受试者中的粘膜递送的透过性肽。所述透过性肽一般通过调节受试者粘膜上皮表面的上皮连接结构和/或生理而可逆增强粘膜上皮细胞旁运送。能调节上皮紧密连接功能的肽之前已有描述(Johnson,P.H.andQuay,S.C.，2000)。CA2379661提供了细胞旁药物递送系统，其包含源于Caludin-6的肽。Claudin代表了位于紧密连接处且提供屏障功能的整合膜蛋白的超家族。由于抗体能以高亲和力与其抗原特异性结合，因此是用于生物化学和分子生物学研究的强大工具，其广泛应用于医药诊断和治疗。抗体一般由通过二硫键相互共价连接的两条重链和两条轻链构成。包含三个互补区域(CDR)的高度可变结构域位于每条链的N-末端。重链和轻链可变区协同决定抗体的抗原特异性。已通过用编码柔性氨基酸接头的间隔序列连接编码可变重(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的DNA序列而设计出单链抗体(scFv)(Birdetal.,1988)。这种形式优于传统全长抗体，因为scFv由单个基因编码，可易于引入突变，所得scFv可在酵母和原核系统中表达，这使可通过简单的分子生物学方法快速筛选针对几乎任何表位的高亲和力特异性结合子(binder)。由于scFv抗体缺乏效应子功能，它们不会通过抗体依赖性或补体依赖性细胞介导的细胞毒性(分别是ADCC或CDCC)而发挥毒性作用，并与全长抗体不同，scFv抗体表现出良好的組织穿透能力。已针对多种不同抗体产生了很多单链抗体(scFv)，尤其因为可使用诸如噬菌体呈现技术或核糖体呈现技术之类技术易于针对高结合能力对它们进行选择。此外，可在微生物系统中生产scFv抗体，这比生产治疗用全长抗体成本更低。除传统的细胞外和体外应用之外，还已将scFv成功用于细胞内应用(Wiirnetal.2000;AufderMauretal.2002;StocksMR,2004);因此，已开发出针对细胞内抗原的scFv。一般而言，功能性scFv的细胞内表达受其不稳定性、不可溶性及趋于形成聚集物的限制。因此，已使用所谓的"质量控制"筛选法(WO0148017;AufderMauretal.(2001);AufderMauretal.，2004)成功开发出针对尤其在还原条件下(一般用于细胞内环境(例如，核、胞质))可溶且稳定的scFv抗体体内筛选系统，并使可鉴定出用于此类目的的特别稳定且可溶的scFv构架(framework)序列(WO03097697)。此外，这些构架还在细胞外环境中的天然氧化条件下表现出超常表达水平及增强的稳定性和可溶性性质。因此，这些有利的生物物理和生物化学性质导致了有利的高产率，且使这些抗体片段一旦针对特定抗原就能作为蛋白治疗剂在特定治疗领域局部和/或全身应用。对于在很多治疗(尤其是局部应用)中使用抗体而言，一个重要的因素是抗体穿透组织(尤其是上皮组织屏障)的能力。对于在特定位置呈现且无需全身治疗的病症(例如，眼部疾病)的治疗尤需局部应用。前葡萄膜炎葡萄膜炎是急性或慢性葡萄膜炎症，其患病率为每十万人中30-40例(LightmanandKok2002)。可将葡萄膜炎按照位置分为前葡萄膜炎、中葡萄膜炎和后葡萄膜炎。如不治疗，前葡萄膜炎将发展为后葡萄膜炎，接着是并发症，例如白内障、视网膜炎，甚至失明(KokandLightman2004)。在<65岁的老年人中有很多是葡萄膜炎(如糖尿病性视网膜病)造成的法定盲人(KokandLightman2004)。前葡萄膜炎作为眼内炎性疾病最常见的形式，在50%的病例中与组织相容性基因座A等位基因B27(HLA-B27)相关(Poweretal.1998)。在这些患者中，仅约一半患有额外的全身疾病(例如，强直性脊柱炎或慢性炎性肠病)(El-ShabrawiandHermann2002)。治疗葡萄膜炎主要在于控制炎性过程(KokandLightman2004)。目前，主要使用皮质类固醇治疗葡萄膜炎(KokandLightman2004)。重要的是，局部和全身皮质类固醇治疗显著增加了青光眼和白内障的风险，由此限制了其重复使用(El-ShabrawiandHermann2002)。其他治疗(包括曱氨蝶呤、环孢霉素或硫唑噤呤)需要最少6周的治疗以产生效果，这使患者生活质量长期都受到巨大限制(El-ShabrawiandHermann2002,Dicketal.1997)。从上文显而易见可看出明确的医药需求。局部皮质类固醇作为最常用的治疗选择具有显著的副作用，这其实恶化了致盲的长期风险。近来已在葡萄膜炎患者的水状体中发现了浓度15pg/ml的TNFa，而健康个体中的相应水平为0,56pg/ml(Perez-Guijoetal.2004)。用全身应用的TNFa抑制剂进行的多项小的临床研究报道了"立刻的改善"(El-ShabrawiandHermann2002)或"数天内的明显临床改善"(Murphyetal.2004)或"两周内"(Joseph2003)或"首次因福利美(infliximab)剂量后的显著改善，，(BenitezDelCastilloetal.2004)。因此，耙向TNFa的概念在临床上已被很好地确认有效。但仍有关于全身应用TNFa抑制剂的安全关注，也无法判断是否可应用于显著比例的缺少额外的全身疾病表现的葡萄膜炎患者。因此，局部TNFa抑制剂将满足明确的医药需求，尤其是在患有前葡萄膜炎的患者中。由于它们分子量较大，因此不能局部应用市售的TNFa抑制剂(见Thieletal.2002)。贝切特病贝切特病是特发性的、多系统性的、慢性的、反复发作的疾病，其经典特征在于发作性攻击性眼部炎性发作、口腔-生殖溃疡和皮肤损伤。在贝切特病的少数严重病例中，还观察到关节、听觉前庭、胸胃肠(thoracicgastrointestinal)、心血管、肾或CNS被涉及。眼睛是贝切特病最常被涉及的内部器官，且其是患者慢性发病的首要因素。眼部疾病由慢性和复发病程的单侧虹膜睫状体炎(20%)或双侧虹膜睫状体炎(80%)、眼前房积脓或全葡萄膜炎构成。通常，初始恶化趋向于较靠前和单侧，而随后的发作趋向于涉及眼的玻璃体腔和靠后的部分，变成双侧的(Evereklioglu2005)。在来自地域性区域的患者(例如日本和土耳其患者)中，严重的葡萄膜炎是较为常见的症状，其影响该群体中的70-卯％(Ozen1999;Tursenetal"2003;Tugal-Tutkunetal"2004;Yurdakuletal"2004;Evereklioglu2005)。失明风险逐渐增加，在IO年时达到病例中的1/4。此外，法定失明是显著的，在该病高流行性和严重性的国家(例如日本)，超过50%的病例中这最终会继发(Boydetal"2001;Evereklioglu2005)。贝切特病表现出有差别的地理变化，尤其是在日本、韩国、沙特阿拉伯、伊朗和土耳其及沿着古代"丝绸之路，，的国家(包括中国和以色列)中，其地域性地更高(BonfioliandOrefice2005;Evereklioglu2005)。例如，在日本和土耳其，贝切特病在葡萄膜炎中占到20%的比例，与此相比，在美国仅占0.2%。在疾病呈地域性的国家中，其在男性，尤其是年轻的成年男性中更普遍，更严重，具有更高的眼部表现和并发症发作率(Evereklioglu2005)。这种罕见的流行病似乎受遗传(例如与HLA-B51等位基因相关(Sakaneetal"1999;Verityetal,，1999;Evereklioglu2005))、感染物(Direskeneli2001;Evereklioglu2005)和环境因素的组合介导。在地中海国家、中东和远东，贝切特病的发病率估计在1:10,000至1:1000之间。而在日本和沿着丝綢之路的亚洲国家，发病率为每100,000中13-30例，在日本北部最高；在土耳其的某些地方观察到高达每100,000中400的最高总发病率。在美国约有15,000人患有贝切特病(Zierhutetal.，2003;Evereklioglu2005)。对眼的炎性攻击的后果是贝切特病患者慢性发病的首要因素(Evereklioglu2005)。对贝切特病的治疗是按症状进行的和经验性的。如在其他形式的葡萄膜炎中一样，主要通过局部施用、眼周施用和全身施用皮质类固醇来治疗眼部贝切特病。但在患者中使用基于皮质类固醇的治疗形式受到其显著副作用的限制。此外，皮质类固醇很少能在眼部贝切特病中诱导完全的复原(remission)，相当大量的患者随着时间发展出抗固醇的疾病(Evereklioglu2005)。在疾病病程中，治疗通常包括免疫抑制剂，例如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和环孢霉素A。但因为这些试剂也与重要的安全问题相关，因此人们非常需要用于该适应症的高效且安全的新治疗形式。近来的流行病学发现提示TNFa的多态性变化与贝切特病的严重性相关(Verityetal.，1999b)，除此之外，有很多病例报告和小的临床试验描述了因福利美在眼部贝切特病中的用途(Ohnoetal.，2004;Wechsleretal"2004;Giansantietal"2004;Lanthieretal.,2005;Tugal-Tutkunetal"2005;Lindstedtetal"2005)。事实上，所有这些研究都报道了眼部贝切特病的快速且完全的复原，甚至在抗传统疗法的患者中也如是(Tugal-Tutkunetal.，2005)。但在一些研究中，在因福利美治疗的葡萄膜炎患者中，不利事件的发作率和严重性出人意料地高，这显示了全身应用TNFa拮抗剂来治疗该病的潜力(Rosenbaum2004^Suhleretal"2005)。TNFa在眼部贝切特病中作为高度有吸引力的药物靶标的临床确认有效(Ohnoetal"2004;Wechsleretal"2004;Giansantietal"2004;Lanthieretal"2005;Tugal-Tutkunetal"2005;Lindstedtetal"2005)及对在葡萄膜炎患者中全身性的TNFa遏制的明显安全关注(Rosenbaum2004;Suhleretal"2005)揭示人们需要开发可局部应用的TNFa拮抗剂用于眼部贝切特病，尤其是用于具有支配性眼部症状的患者。由于scFv抗体具有良好的组织穿透能力和快速的肾脏清除性，它们是局部应用所优选的。除电荷、亲疏水性(hydropathicity)和分子量之外，可溶性、聚集趋势及热稳定性等性质也会影响分子穿透組织14屏障的能力。例如，高度可溶的抗体片段如果在约37。C的生理温度下形成聚集物的话，就可能不能穿透上皮屏障。scFv构架中单个氨基酸残基的突变可能在一方面提高了其在环境温度下的可溶性，这种突变可能改变热稳定性，因此导致在37'C的解折叠和聚集。此类聚集物分子量较高，因此不能穿过组织屏障。因为组织穿透是高效药物递送(尤其是在局部应用中)的重要因素，人们需要除想要得高稳定性和低抗原性特征之外还具有改进的组织穿透能力的治疗性抗体，尤其是scFv抗体。WO0040262公开了作为药物或诊断工具以分别治疗或诊断眼部病症的抗体片段，例如scFv。以0.2至0.25mg/ml的scFv浓度来进行眼穿透实验。其显示，在无穿透增强剂时scFv能以非常低的速率穿透角膜上皮屏障，而在存在穿透增强剂时scFv能以较高的速率穿透。鉴于穿透增强剂可能具有细胞毒性作用或导致上皮改变，人们需要替代性的和/或改进的方法，通过scFv及其片段来治疗眼部疾病。人们尤其需要具有低程度副作用的、用于通过局部施用进行的受控治疗的抗体，其可以相对高的浓度来施用o本文提到的所有^Hf文本和参考文献都通过引用整体并入本文。
发明内容因此，本发明的一个一般性目的是提供抗体，优选scFv抗体，所述抗体能特异性结合选定抗原，并具有改进的组织穿透能力。现在，为了实现上述目的及本发明的其他目的(随着说明书而将更容易明显)，所述抗体表现为具有下述特征，所述特征在于，其可通过下述方法获得，所述方法包括(i)从可溶且稳定的抗体构架库中选出最匹配于以特定结合特异性抗所述抗原的非人抗体构架的可溶且稳定的构架，(ii)向所述构架提供与所述抗原结合的CDR，或将所述非人抗体的构架朝向所述可溶且稳定的构架的序列进行突变，(m)检测所产生抗体的可溶性和稳定性，及(iv)检测所产生抗体的抗原结合性，针对抗原的结合对产生的抗体力cr以检测。任选在步骤(ii)和(iii)之间加入下述步骤-通过对一个或多个选定CDR和/或构架进行定点或随机诱变来突变所述scFv抗体。本发明还提供了包含可溶的抗原结合多肽的组合物，其中所述抗原结合多肽能在短于约8小时内穿过一层或多层上皮层，例如，内皮层或间皮层。例如，所述抗原结合多肽能在短于约8、7、6、5、4、3、2、1小时或更短时间内穿过一层或多层上皮层。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽能在短于约4小时内穿过一层或多层上皮层。应当理解，上述值和范围内的所有值和范围都被认为包括在本发明的范围内。在其他实施方案中，所述上皮层是眼的，例如，角膜的，例如，角膜的上皮和/或内皮。在一个实施方案中，上皮层是肠的。另一个实施方案中，上皮层是血脑屏障。再其他实施方案中，所述抗原结合多肽能在短于约8小时内穿过完整的哺乳动物角膜。例如，所述抗原结合多肽能在短于约8、7、6、5、4、3、2、1小时或更短时间内穿过完整的哺乳动物角膜。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽能穿过人的角膜。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽能穿过完整的猪或兔的角膜。又其他实施方案中，所述組合物还包含穿透增强剂。在某些实施方案中，所述穿透增强剂选自氮酮⑧、苯扎氯铵(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸钠、辛酸、西吡氯铵、氯己定、胆酸盐、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油(crem叩hor-EL)、环糊精、DMSO、十烃溴铵、脱氧胆酸盐、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE二钠、乙醇、褐霉酸盐、甘胆酸盐、十二烷基硫酸盐、L-a-溶血磷脂酰胆碱(L-a-lysophosphatidylocholine)、醋甲唑胺、N画十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、Pz-肽、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、牛磺胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐。在另一实施方案中，所述穿透增强剂是癸酸钠。再一个实施方案中，所述穿透增强剂包括胶体系统、聚丙烯酸酯和生物粘附性聚合物。在一个优选实施方案中，本发明的分子可在无穿透增强剂的情况下穿过上皮层，例如，目艮(角膜)的上皮层。在一些实施方案中，所述多肽对靶抗原的结合亲和力至少为10E-6M或更佳的kD。在一些方面，本发明提供了pH小于约8的组合物，所述组合物包含抗原结合多肽(例如单链抗体)，其中所述多肽足够可溶到能穿过完整角膜。在一些实施方案中，所述组合物具有约6-约8的范围内的pH。在其他实施方案中，组合物具有约6、6.5、7.0、7.5、8.0或其任何递增值(incrementalvalue)的pH。应当理解，这些值和范围内的任何值和范围都被认为包括在本发明的范围内。在一些方面，本发明提供了pH小于约8的组合物，所述组合物包含抗原结合多肽(例如单链抗体)，其中所述多肽足够可溶到能穿过完整角膜。在一些方面，本发明提供了包含可溶的抗原结合多肽的组合物，其中所述多肽足够可溶到能在短于约8小时内穿过完整角膜，并形成于约8或更小的pH下。在一些实施方案中，所述多肽足够可溶到能在短于约4小时内穿过完整角膜。在其他实施方案中，所述组合物还包含穿透增强剂。在一些实施方案中，所述穿透增强剂选自氮酮、苯扎氯铵(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸钠、辛酸、西吡氯铵、氯己定、胆酸盐、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMSO、十烃溴铵、脱氧胆酸盐、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE二钠、乙醇、褐霉酸盐、甘胆酸盐、十二烷基硫酸盐、L-a-溶血磷脂酰胆碱、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、牛磺胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐。在一些实施方案中，所述穿透增强剂是癸酸钠。在一些实施方案中，所述穿透增强剂是氯己定。在一些方面，本发明提供了包含可溶的抗原结合多肽的组合物，其中所述抗原结合多肽能在短于约8小时内穿过完整角膜的一层或多层。在其他方面，本发明提供了包含浓度大于约2.5mg/ml的抗原结合多肽(例如单链抗体)的组合物，其中所述多肽足够可溶到能在短于约8小时内穿过完整角膜。所述組合物可包含浓度在大于约2.5mg/ml-大于约10.0mg/ml的范围内的抗原结合多肽。例如，所述组合物可包含浓度为约2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml、6.0mg/ml、6.5mg/ml、7.0mg/ml、7.5mg/ml、8.0mg/ml、8.5mg/ml、9.0mg/ml、9.5mg/ml-大于约10.0mg/ml或其任何递增值的抗原结合多肽。应当理解，这些值和范围内的所有值和范围都被认为包括在本发明的范围内。在一些实施方案中，抗原结合多肽处于大于约4.0mg/ml的浓度。在其他实施方案中，抗原结合多肽处于大于约10.0mg/ml的浓度。再一些实施方案中，所述多肽足够可溶到能在短于约4小时内穿过完整角膜。在其他实施方案中，所述组合物还包含穿透增强剂。在一些实施方案中，所述穿透增强剂选自氮酮、苯扎氯铵(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸钠、辛酸、西吡氯铵、氯己定、胆酸盐、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMSO、十烃溴铵、脱氧胆酸盐、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE二钠、乙醇、褐霉酸盐、甘胆酸盐、十二烷基硫酸盐、L-a-溶血磷脂酰胆碱、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、牛磺胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐。在一些实施方案中，穿透增强剂是癸酸钠。在其他实施方案中，穿透增强剂是氯己定。在一些方面，本发明提供了下述抗原结合多肽(例如单链抗体)，其针对粑抗原的结合亲和力至少为10E-6M的KD，且其中所述多肽足够可溶到能穿过上皮的紧密连接，且其中所述多肽在生理条件下保持为单体形式。在其他方面，本发明包含下述组合物，所述组合物包含抗原结合18多肽，其中所述抗原结合多肽在约-80。C-约37。C的温度下是稳定的。例如，所迷组合物可在-80。C、-70。C、-60°C、-50。C、-40。C、-30°C、-20。C、-10。C、0°C、10。C、20。C或30。C或4壬何其递增值的温度下稳定。应当理解，这些值和范围内的所有值和范围都被认为包括在本发明的范围内。在一些实施方案中，所述抗原结合多肽保持稳定至少约8周。在其他实施方案中，所述抗原结合多肽在4。C时保持稳定至少6周。在一些方面，本发明提供了包含抗原结合多肽的组合物，其中所述抗原结合多肽具有本文公开的任何图所示的药效学和药代动力学特征。在其他方面，本发明提供了下述抗原结合多肽，其针对靶抗原的结合亲和力至少为10E-6M或更佳的KD，且其中所述多肽足够可溶到能穿过上皮的紧密连接，且其中所述多肽足够可溶到能在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接。在一些实施方案中，所述多肽足够可溶到能在约4小时或更短时间内穿过上皮的紧密连接。再其他方面，本发明提供了下述抗原结合多肽，其针对靶抗原的结合亲和力至少为10E-6M或更佳的KD，且其中所述多肽具有对应于能在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的抗原结合多肽的穿过动力学的1/2Vmax值。在其他方面，本发明包括足够可溶到能穿过上皮的紧密连接的抗原结合蛋白(在标准Caco-2(人结肠腺癌)单层上皮细胞测定中测量的)，其适合用于治疗。在多个方面，本发明包括足够可溶到能穿过上皮的紧密连接的抗原结合蛋白(在标准小鼠空肠透过性测定中测量的)，其适合用于治疗。再其他方面，本发明包括足够可溶到能穿过上皮的紧密连接的抗原结合蛋白(通过标准的细胞内单杂交(onehybrid)或双杂交(twohybrid)可溶性测定来预测的)，其适合用于治疗。在又一些方面，本发明提供了足够可溶到能穿过上皮的紧密连接的抗原结合蛋白(通过标准的PEG沉淀测定或自身相互作用层析(SIC)测定来预测的)，其适合用于治疗。在其他方面，本发明提供了鉴定下述抗原结合多肽的方法，所述19多肽具有对应于能在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的抗原结合多肽的穿过动力学的1/2Vmax值。所述方法包括在具有可诱导的报告基因系统的宿主细胞中，细胞内表达候选抗原结合多肽，其中，在存在具有所迷穿过动力学的抗原结合多肽时，所迷报告基因系统产生可被记录的信号；及根据可记录的信号来筛选所述细胞，其中所述信号的存在将候选多肽鉴定为具有所述穿过动力学的抗原结合多肽。本发明在一些方面还提供了通过该方法鉴定出的抗原结合多肽。在一些方面，本发明还提供了实施该方法的试剂盒。在其他方面，本发明提供了治疗具有眼部病况的患者的方法，所述方法通过局部施用治疗有效量的本文权利要求中任一项所述抗原结合多肽来实现治疗。在一些实施方案中，眼部病况是葡萄膜炎。在其他实施方案中，眼部病况是年龄相关的黄斑变性。在一些方面，本发明提供了下述抗原结合多肽，其包含具有至少一个抗原结合基序的多肽区域，所述基序侧翼有至少一个支架(scaffold)区域，且其中所述多肽具有足以在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的穿过动力学。在一些实施方案中，所述多肽包含被两个支架区域所夹(flankedby)的一个抗原结合基序；被三个支架区域隔夹(flankedby)的两个抗原结合基序；被四个支架区域隔夹的三个抗原结合基序；或被八个支架区域隔夹的六个抗原结合基序，其中在第四和第五支架区域之间具有居间接头区域。在其他实施方案中，所述抗原结合基序是CDR，所述支架区域时免疫球蛋白构架区域。又其他实施方案中，所述多肽包含三个CDR和四个居间构架区域或六个CDR和八个构架区域和居间接头区域。在一些方面，本发明还提供了能特异性结合靶抗原的抗原结合多肽，且所述多肽具有足以在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的穿过动力学，且其中所述多肽由下式表示Y;或Z;或Y-L-Z;或Z誦L誦Y;其中Y是[F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3F4，Z是[F5-CDR1-F6画CDR2誦F7画CDR3F8；其中，Y的构架区域(Fl-F4)源自一种或多种人轻链构架；Z的构架区域(F5-F6)源自一种或多种人轻链构架；Y的CDR(CDR1-CDR3)源自能结合乾抗原的一种或多种供体CDR;Z的CDR(CDR4-CDR6)源自能结合靶抗原的一种或多种供体CDR;且L是柔性多肽接头。在一些实施方案中，Y和Z由本文公开的序列中的任何序列或其共有序列来表示。此外，在另一实施方案中，也可沿着抗原结合多肽编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变引入突变。"共有序列"是在相关序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker，FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft，Weinheim,Germany1987)。在蛋白家族中，共有序列中的每个位置都被家族中在该位置最频繁出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现的频次相等，则它们都可被包括进共有序列。在一些方面，本发明提供了被配制为达到至少约100ng/ml或更高的眼内浓度的抗原结合多肽。再其他方面，本发明提供了被配制为用于局部施用以得到100ng/ml或更高的眼内浓度的单链抗体(基于本文公开的细胞或动物模型系统)。在其他方面，本发明提供了被配制为用于局部施用的，并能在无穿透增强剂的情况下穿过角膜进入眼内空间的抗原结合多肽。再其他方面，本发明提供了使用任一项权利要求所述多肽来治疗、预防和诊断眼部疾病或病症的方法。附图简述可从下文描述结合附图来完整地理解本发明的前述及其他方面、实施方案、目的、特征和优点。在附图中，类似标识符通常表示多幅图中类似的特征和结构元件。附图并不一定符合比例，而仅用于阐述本发明的宗旨。图1显示了重新折叠步骤后进行的制备型尺寸排阻层析(凝胶过滤)中ESBA105(图1A)、TB-WT(图1B)和lucentis-scFV(图1C)的洗脱情况。mAU:毫吸光度单位。图2显示了制备性凝胶过滤后，对收集到的ESBA105的峰级分进行的分析性凝胶过滤的洗脱情况。图3显示了ESBA105在聚乙二醇(PEG)中的溶解度。图4显示了ESBA105和QC15.2scFv抗体在不同温度和浓度下贮藏两周时的稳定性。通过SDSPAGE来分离抗体，用考马斯亮蓝染色。图5显示了在37。C或-80。Cji&藏8周(都在pH7.4)后通过L929测定法测定的ESBA105浓度。三角形表示在37。C贮藏的ESBA105，方形表示在-8(TC^藏的ESBA105。图6示意性地显示了分别从玻璃体和前房移除液体的注射器。1:玻璃体腔液，2:前眼液，3:虹膜，4:角膜，13:注射器。图7显示了ESBA105在4小时后穿透进入完整兔眼的前房。图8显示了ESBA105在4小时后穿透进入完整兔眼的玻璃体腔。图9显示了ESBA105穿透Caco-2细胞层。图IO显示了在用于肠药物吸收的非翻转嚢(non-evertedsac)模型中对全长IgG形式的抗体(因福利美)和单链形式的抗体片段(ESBA105)通过大鼠空肠的穿透效果的比较。黑方形表示ESBA105浓度(nM)，白圓形表示因福利美浓度(nM)。图lla是在进行实施例7中描迷的实验的过程中采样的大鼠眼的房水中发现的ESBA105的量(ng/ml)的图示。图lib是在进行实施例7中描述的实验的过程中采样的大鼠眼的玻璃体液中发现的ESBA105的量(ng/ml)的图示。图llc是在进行实施例7中描述的实验的过程中采样的大鼠眼的神经视网膜中发现的ESBA105的量(ng/ml)的图示。图lld是在进行实施例7中描述的实验的过程中采样的大鼠眼的血清中发现的ESBA105的量(ng/ml)的图示。图12是大鼠眼中ESBA105的局部体外pK的图示。视网膜提取物500ng/ml。060721ELISA(来自#060718WholeEyeRabbit)，Retina。图13是在玻璃体注射进大鼠眼中后ESBA105局部半衰期的图示。图14图示了施用ESBA105后局部药物蓄积的模型(5滴/天，10mg/mlESBA105，Peff=2.9x105)图15是眼的pK的图示。4:角膜，5:泪膜，6:前房，7:晶状体，8:玻璃体，9:净见网膜，10:巩膜。图16是ESBA105的吸收和清除途径的图示。11:亲水性药物，12:亲脂性药物。图17显示了相关的体内急性单发性关节炎(大鼠)模型中的剂量应答数据。n=3，TNFa,10ngU。图18A显示了局部兔眼应用体内结果的图示。每个数据点表示两只兔(四只眼)的平均值，兔子在最长10小时的处理时间内每20分钟获得1滴(30mcl)10mg/ml的ESBA105(处于pH6.5的PBS溶液中)。液滴应用到瞳孔顶端，随后挤压眼皮除去多余的液体(保留7mcl)。通过ELISA测定房水、玻璃体和血清中的ESBA105浓度。图19显示了局部兔眼应用体内结果的图示。向每只动物的双眼的下眼嚢应用一滴10mg/ml的ESBA105溶液，一天五次，持续可多达6天。取样在指定的时间点应用第二滴后(1、3或6天后)，处死两只动物，对两只眼和血清进行定量ELISA分析。在房水(图19A)、玻璃体(图19B)、神经视网膜(图19C)、脉络膜(图19D)和血清(图19E)中测定ESBA105的水平，如图所示。"Carr，，代表载体，其表示不含ESBA105的緩冲溶液。数据中的杠表示在指定的区室测量到的最大、最小和中位ESBA105浓度，将它们与各自的标准差一起给出。23发明详述为了提供对说明书和权利要求书的清楚理解，下文中方便地提供下述定义。定义术语"抗体"指完整抗体和任何抗原结合片段(即，"抗原结合部分"、"抗原结合多肽，，或"免疫结合子")或其单链。"抗体"指包含通过二硫鍵相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区域(缩写为VH)和重链恒定区域。重链恒定区域包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区域(缩写为VL)和轻链恒定区域。轻链恒定区域包含一个结构域，CL。VH和VL区域还可,皮细分为称为互补性决定区域(CDR)的高度可变区域，其被称为构架区域(FR)的较为保守的区域间隔。每个VH和VL都包含三个CDR和四个FR，它们以下述顺序从氨基末端到羧基末端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区域含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区域可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语"抗原结合性，，指与抗原特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。抗体的"抗原结合部分"这个术语所包括的结合片段包括(i)Fab片段，这是由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab，)2片段，这是包含在铰链区域通过二硫键相连的两条Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域构成，(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域构成(v)单结构域或dAb片段(Wardetal，(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域构成；及(vi)分离的互补性决定区域(CDR)或(vii)两个或多个分离的CDR的組合，它们可任选地通过合成接头相连结。此外，虽然Fv片段的两个结构域——VL和24VH由单独基因编码，但可使用重组方法将它们连结起来，这通过能使它们被制成单条蛋白链的合成接头来实现，其中所述链中，VL和VH区域配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)已知；参见例如，Birdetal.(1988)Science242:423-426;andHustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。^f吏用本领域4支术人员已知的传统技术来获得这些抗体片段，以与完整抗体相同的方式针对效用来篩选所述片段。"免疫球蛋白"可用于表示免疫球蛋白的任何被认可的类或亚类，例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE。免疫球蛋白可源于任"f可物种，例如人、鼠或兔来源。此外，免疫球蛋白可为多克隆的、单克隆的或片段。此类免疫球蛋白片段可包括，例如Fab，、F(ab，)2、Fv或Fab片段或其他抗原识别免疫球蛋白片段。可例如通过蛋白水解酶的消化(例如通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、还原悻烷基化或重組技术来制备此类免疫球蛋白片段。用于制备此类免疫球蛋白片段的材料和方法是本领域技术人员公知的(Parham，(1983)J.Immunology,131:2895;Lamoyietal"(1983)J.ImmunologicalMethods,56:235;Parham，(1982)J.ImmunologicalMethods,53:133;andMatthewetal"(1982)J.ImmunologicalMethods,50:239)。此外，免疫球蛋白可为单链抗体("SCA，，)。它们可由单链Fv片段("scFv")构成，其中可变轻("VL")和可变重("VH")结构域通过肽桥或二硫键相连。此外，免疫球蛋白可由单VH结构域(dabs)构成，其具有抗原结合活性。参见例如，G，WinterandC，Milstein，Nature,349，295(1991);R.Gloekshuberetal"Biochemistry29,1362(19卯)；and,E.S.Wardetal"Nature341，544(1989)。如本文所用术语"多肽"指两个或多个天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。本发明的多肽包含至少一条源于免疫球蛋白(Ig)分子的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的多肽包含非源于免疫球蛋白分子的氨基酸序列或一个或多个部分(moiety)。下文中更详细描述了示例性的修饰。例如，在一个实施方案中，本发明的多肽可包含25柔性接头序列。在另一实施方案中，可通过添加功能性部分(例如PEG、药物或标记)来修饰多舦。本发明的优选多肽包含源于人免疫球蛋白序列的氨基酸序列。但多肽可包含来自另外的哺乳动物物种的一个或多个氨基酸。例如，灵长类的重链部分、铰链部分或结合位点可被包括进本发明的多肽。此外，多肽中也可存在一个或多个鼠科动物的氨基酸。本发明的优选多肽不是免疫原性的。本领域普通技术人员还应当理解，本发明的多肽可被改变，使它们的氨基酸序列与天然存在的或它们所源于的天然多肽有所不同，但同时保留着想要的天然多肽的活性。例如，可在"非关键，，氨基酸残基处制造导致保守取代或变化的核苷酸或氨基酸取代。可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列引入一处或多处核苷酸取代、添加或缺失，以向被编码的蛋白引入一处或多处氨基酸取代、添加或缺失，来制造编码源于免疫球蛋白的多肽(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的经分离的核酸分子。可通过标准技术(例如定点诱变或PCR介导的诱变)引入突变。本发明的多肽可在一个或多个非关键氨基酸残基处包含保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是这样的取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域中已确定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带卩支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氡酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基来代替多肽中的非关键氨基酸残基。在另一实施方案中，氨基酸片断可被结构相似的片断(其中侧链家族成员的顺序和/或组成不同)代替。此外，在另一实施方案中，也可沿着全部或部分免疫球蛋白编码序列26随机引入突变，例如通过饱和诱变来进行，且所得突变可被掺入本发明的多肽，并针对它们结合所需靶标的能力进行筛选。术语"特异性结合"、"选择性结合"、"选择性地结合"和"特异性地结合"指抗体与预定抗原上表位的结合。抗体一般以约小于10-6M的亲和力(KD)结合，例如约小于10-7M、10-8M或10-9M或甚至更低。术语"KD"指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。本发明的抗体一般以小于约10-6M的解离平衡常数(KD)与它们的靶抗原结合，例如小于10-7M、10-8M或10-9M或甚至更^(氐，例如，如在BIACORE仪器中使用表面等离子共振(SPR)技术测定的。本文所用术语"穿过动力学，，或"药代动力学"指与在机体组织或流体内的药物吸收、分布及代谢和/或清除的动力学相关的所有因素。这包括调控多肽运送穿过膜的物理化学因素，因为多肽的吸收、分布、生物转化和排出都涉及到多肽穿过细胞膜。对于临床医师来说，最大的兴趣是多肽的生物可获得性。本文所用该术语指多肽到达它的作用位点的程度或多肽到达多肽的作用位点的生物流。影响生物可获得性的因素包括受试者对多肽的吸收及代谢或清除的速率。很多因素影响吸收，它们包括影响到运送穿过膜的多种物理化学因素，例如多肽可溶性和摄取机制，及诸如多肽的组成和配方(浓度)及施用位点之类的因素。多肽施用的多种途径具有明显不同的吸收特征。这些途径包括口服摄入、肺吸收、非肠道注射(包括肌内、皮下、静脉内、动脉内、胸内或腹膜内注射)及向粘膜、皮肤或眼睛的局部应用。在一个优选实施方案中，将本发明的用于治疗眼病的多肽局部施用到眼表面，例如，以眼药水的形式。可使用例如本文公开的任何细胞或任何基于动物的分子测定本发明的多肽的穿过动力学，且一般选出以适于临床相关穿过血脑屏障、肠或眼的紧密连接。术语"受试者"是本领域已知的，其在本文中使用时除表示人之外还表示温血动物，更优选哺乳动物，例如非人动物，例如大鼠、小鼠、兔、猫、狗、绵羊、马、牛。在一个优选实施方案中，受试者是人。受试者是容易受到用本发明的可溶抗原结合多肽进行的治疗影响的。"穿透增强剂，，或"穿透增强剂"在本文中指能促进穿透上皮连接的分子或化合物。用于本发明的穿透增强剂包括但不限于氮酮、苯扎氯铵(BzCl)、BL画7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸钠、辛酸、西吡氯铵、氯己定、胆酸盐、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMSO、十烃溴铵、脱氧胆酸盐、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE二钠、乙醇、褐霉酸盐、甘胆酸盐、十二烷基硫酸盐、L-a-溶血磷脂酰胆碱、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、牛磺胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐。例如，在一些实施方案中，穿透增强剂是癸酸钠。在其他实施方案中，穿透增强剂是氯己定。本发明第一方面提供了scFv抗体，其特异性结合选定抗原，且具有改进的组织穿透能力。所述抗体特征在于，其可通过下述方法获得，所述方法包括(i)从可溶且稳定的抗体构架库中选出最匹配于以特定结合特异性抗所述抗原的非人抗体构架的可溶且稳定的构架，(ii)向所述构架提供与所述抗原结合的CDR，或将所述非人抗体的构架朝向所述可溶且稳定的构架的序列进行突变，(iii)检测所产生抗体的可溶性和稳定性，及(W)检测所产生抗体的抗原结合性。术语"匹配最好，，表示一级或三级结构上尽可能地接近。本发明的抗体通常包含具有VL和/或VH结构域的构架，通过不依赖于抗原的方法针对酵母细胞中的高细胞内稳定性和可溶性从天然人抗体库的至少一部分选出所述构架。所述方法也被称为对抗体构架的"质量控制，，筛选，并已选出了以高细胞内稳定性和可溶性为特征的特别稳定且可溶的抗体构架。可将这些构架用于，例如针对抗原特异性的第二套基于酵母的筛选系统。在这种情况下，可随机选择排列特别稳定且可溶的抗体的CDR,并根据最佳可能的抗原识别筛选所得抗体。此外，也可将具有与所选抗原的强结合亲和力的抗体的已知抗体CDR移植到所述特别稳定且可溶的构架上。还可任选通过诱变所选CDR和/或构架，在"质量控制系统，，中选择改进的克隆(WO0148017,AufderMauretal.2004)，即通过对一个或多个选定CDR和/或构架进行定点诱变或随机诱变来突变所述scFv抗体，并在同样条件或更严谨的条件下选择稳定且可溶得抗体，来进一步改进所述抗体。可在酵母质量控制系统中进行体内选择。术语"构架残基"涉及抗原结合多肽单元的氨基酸残基或抗原结合多肽模块的相应残基，所述残基贡献于折叠拓朴学，即贡献于所述单元(或模块)的折叠，或贡献于与相邻单元(或模块)的相互作用。此类贡献可为与单元(或模块)中其他残基的相互作用，或是对多肽主链构象造成的影响，如在a-螺旋或p-折叠、或形成线性多肽或环的氨基酸片断中发现的。术语"靶相互作用残基"指所述单元的氨基酸残基或所述模块的相应氨基酸残基，所述残基贡献于与靶物质的相互作用。此类贡献可为与靶物质的直接相互作用，或是对其他直接相互作用残基的影响，例如通过稳定多肽的所述单元(或模块)的构象，以使或增强所述直接相互作用残基与所述靶的相互作用。可通过分析由上文提到的物理化学方法获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域技术人员熟知的已知且相关结构信息加以比较，来鉴定此类构架和靶相互作用残基。此类构架还可被称为支架，因为它们提供了对更多样的靶相互作用残基或CDR的呈递的支持。可将CDR或靼相互作用残基移植进合适的构架，例如，本领域公知的备选支架，其包括但不限于CTLA-4、淀粉酶抑肽、纤连蛋白(FN3)、新制癌菌素、CBM4-2、脂质运载蛋白、T-细胞受体、蛋白A结构域(蛋白Z)、Im9、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、设计的TPR蛋白、锌指、pVIII、鸟胰腺多肽、GCN4、WW结构域、Src同源性结构域3(SH3)、Src同源性结构域2(SH2)、PDZ结构域、TEM-1卩-内酰胺酶、GFP、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指、CI-2、BPT1APPI、HPSTI、ecotin、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防御素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素1)562、Ldl受体结构域A、"晶状体蛋白、泛素、转移和C型凝集素样结构域(见Binzetal.(2005Oct)NatBiotech23(10):1257-68),或可被移植进合适的源于免疫球蛋白的抗原结合多肽，它们是本领域公知的，其包括但不限于VhH结构域、V-NAR结构域、Vh结构域、Fab、scFv、Bis-scFv、CamelIG、IfNAR、IgG、Fab2、Fab3、微型抗体(minibodies)、双特异抗体(diabodies)、三特异抗体(trabodies)和四特异抗体(tetrabodies)(参见例如Holliger，P.andHudson,P.(2005)，Nat.Biotechnol.23(9),pp.1126-1136)。本发明的抗体优选还具有下述特征中的一种或多种-其在还原条件下(如在酵母相互作用测定中测量时)稳定，其中，与所述scFv融合的选择性标记蛋白的活性与所述scFv在细胞内环境中的高稳定性和可溶性相关。有对所述酵母相互作用测定(所谓的"质量控制")的详细描述(AufderMauretal.(2001);AufderMauretal.，2004;将参考文献整体并入本文)。画其在20。C画40。C(优选在37°C)于PBS中能稳定至少1个月，优选至少2个月，最优选至少6个月，-其在生理条件下保持为单体，國其在环境温度下在PBS中以>约1mg/ml的浓度可溶，优选以>约4mg/ml，更优选以>约10mg/ml，再更优选以>约25mg/ml，最优选以>约50mg/ml的浓度可溶，曙其在盐酸胍滴定中表现出至少1.5M的穿过中点(midpoint)，优选至少1.75M，更优选至少1.9M,最优选至少2M的穿过中点，即可抵抗变性。术语抗体在本发明的范围内使用时指能结合选定抗原的scFv抗体或抗体片段。因此，本发明的scFv抗体可为包含通过短接头肽(例如包含1-4个序列GGGGS的重复的接头，优选(GGGGS)4肽(SEQIDNO:16)，更优选序列GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS(SEQIDNO:17)的接头或Alfthanetal.(1995)ProteinEng.8:725-731中公开的接30头)相连的VL和VH结构域的完整scFv,或简单地为VL或VH结构域，所述结构域具有针对选定抗原的足够结合能力。VL和VH的连接可有两种方向，VL-接头-VH或VH-接头-VL。本发明一方面提供了能在磷酸盐緩冲盐水(PBS)中稳定至少1个月，优选至少2个月的抗体。优选检测所述抗体在生理温度，即37°C下的稳定性。在另一优选的实施方案中，所迷抗体能在PBS中于4'C下保存时或在冻干之后于室温下稳定至少6个月。可例如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后进行标准染色程序(例如考马斯染色或银染)，并比较全长条带与标准蛋白的染色强度分析标准量的所述抗体来检测稳定性。此外，检查降解产物的缺失。降解的蛋白会形成电泳条带拖尾，或甚至由于降解产物太短而看不到，这种情况下，仅全长蛋白条带强度损失表示降解。通常情况下，在对颜色和/或清晰度进行视觉观察时，或通过UV光散射或通过尺寸排阻层析观察时，如果没有聚集、沉淀和/或变性的迹象，则可假定抗体是物理稳定的。以贮藏一定时间之后的活性看的稳定性也是本发明抗体的另一重要特征。这可通过比较贮藏前后的抗体效力加以确定，例如，通过使用ELISA在体外靶结合测定或在体内细胞活性测定(其中，测量抗体的抑制效力)确定。本发明另一方面提供了在生理条件下是且保持为单体的抗体(可例如通过凝胶电泳来判断的)。单体状态是能穿透上皮屏障的抗体的重要特征。本发明再一方面提供了在PBS中于环境温度下以大于约1mg/ml的浓度可溶的抗体，优选以大于约4mg/ml,最优选以约10mg/ml的浓度可溶的抗体。可使用PEG3000通过PEG沉淀，或通过自身相互作用层析(SIC)来测定经纯化的抗体的溶解度。本发明又一方面提供了下述抗体，其在盐酸胍滴定中表现出至少约1.5M的穿过中点，优选至少约1.75M，更优选至少约1.9M，最优选至少约2M的穿过中点。这是对从解折叠抗性的意义上说的稳定性的量度，其中，加入盐酸胍诱导的解折叠/变性之后进行荧光或圆二色光镨分析。在本发明再一方面，具有上述生物物理特征中一种或多种的抗体的结构特征在于轻链可变区域(VL)的构架与选自SEQIDNO:1(Kl型)、SEQIDNO:2(k1型)、SEQIDNO:3(k3型)或SEQIDNO:4(XI型)、SEQIDNO:5(k3型)、SEQIDNO:6(U型)或SEQIDNO:7(X3型)的VL构架具有至少85%的相似性，优选至少约95%相似性，最优选至少约98%同一性；且/或重链可变区域(VH)的构架与选自SEQIDNO:8(H3型)、SEQIDNO:9(H3型)、SEQIDNO:10(Hlb型)或SEQIDNO:11(H3型)的VH构架具有至少85%的相似性，优选至少约95%相似性，最优选至少约98%同一性。在一个优选实施方案中，使用SEQIDNO:2的VL同源体与SEQIDNO:8的VH同源体的组合、SEQIDNO:4的VL同源体与SEQIDNO:10的VH同源体的組合或上文提到的VL序列中任何一条的同源体与SEQIDNO:9的VH同源体的组合。更优选与SEQIDNO:7相似性>卯％，再更优选>95%的抗体。最优选序列为SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:8的抗体。还应当理解，只要保持着靶结合特异性，本发明包括公开的VL序列中任何一条与公开的VH序列中任何一条的组合。两条序列间的相似性百分数是对蛋白序列相关程度的量度。两条序列间相似性的程度可基于序列同一性和/或保守性百分数。保守性指在氨基酸序列上特定位置的改变，但保留原有残基的物理化学性质。一般，通过序列比对来测定序列间的相似性。通过l吏用可网络获取的BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchTools;见Altschul,S,F.，Gish，W.，Miller,W.，Myers,E.W.&Lipman，DJ.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool."J.MolBiol.215:403-410)来测定本文提到的相似性。BLAST蛋白检索可用XBLAST程序(分数=50，字长=3)来进行，以获得与本发明的蛋白分子相似的氨基酸序列。就比较目的而言，为获得带缺口的比对，可按照Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述，32使用GappedBLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。两条序列间的同一性百分数是序列共享的相同位置的数量的函数，其中要考虑到缺口的数量、每个缺口的长度(为了对两条序列的最优比较而需要引入的)。对序列的比较和两条序列间同一性百分数的测定可使用本领域技术人员公知的数学算法来完成。可使用GCG软件包中的GAP程序来测定两条核苷酸序列间的同一性百分数，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重及1、2、3、4、5或6的长度^又重。还可使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法(其已被并入ALIGN程序(版本2.0))来测定两条核苷酸或氨基酸序列间的同一性百分数，其中使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。此外，可使用Needle-man和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法(已被并入GCG软件包中的GAP程序)来测定两条氨基酸序列间的同一性百分数，其中使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵及16、14、12、10、8、6或4的缺口冲又重及l、2、3、4、5或6的长度权重。另一方面，本发明的抗体被化学修饰。化学修饰可改变抗体的性质，例如稳定性、可溶性、抗体结合特异性或亲和性、体内细胞毒性半衰期及组织穿透能力。化学修饰是技术人员公知的。对本发明抗体的优选化学修饰是PEG化。在另一优选方面，通过小于约100nM，优选小于约10nM，最优选小于约1nM的解离常数Kd来表征本发明的抗体的亲和性。通过表面等离子共振(BiaCore)或ELISA来测定结合参数，例如抗体与其关联抗原的亲和性。这些方法是本领域公知的。与本发明的抗体结合的抗原优选是TNFa(肿瘤坏死因子a)。TNFa也被称为恶病质素(cachectin)，其是天然存在的哺乳动物细胞因子，其由多种细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)响应内毒素或其他刺激而产生。TNFa是炎性、免疫和病理生理反应的主要介导因素(Grell，M.，etal.(1995)Cell,83:793-802)。大量病症都与TNFa水平升高相关，它们中很多有显著的医药重要性。TNFoi已显示在多种人类疾病中被上调，所述疾病包括慢性疾病，例如风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(包括Crohn's症和溃疡性结肠炎)、败血症、充血性心力衰竭、支气管哞喘和多发性硬化。TNFa还被称为前炎性细胞因子。但其还涉及一些局部表现的病症，例如眼病，例如，黄斑变性、葡萄膜炎、青光眼、白内障、视网膜炎、干眼综合征、巩膜炎、结膜炎和角膜炎。本发明的抗体特别适用于治疗此类疾病，因为其可局部(locally)和局部(topically)施用，例如通过眼药水用于眼病。本发明还提供了编码本发明抗体的DNA序列及含有所述DNA序列的克隆载体或表达载体。此外，还提供了经所述DNA序列转化的合适的宿主细胞。其可为原核或真核细胞，尤其是大肠杆菌(五.co")、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。可使用重组遗传学领域的常规技术来产生本发明的抗体。在已知多肽序列的情况下，可通过基因合成来产生编码它们的cDNA。此外，提供了用于产生本发明抗体的方法，所述方法包括在使所述抗体合成的条件下培养经编码所述抗体的DNA转化的宿主细胞，及从所述培养物中回收所述分子。所述方法优选提供了从大肠杆菌包涵体或从大肠杆菌周质(如果所用的scFv构建体包涵指导多肽进入周质的信号序列)纯化的scFv抗体。本发明另一方面是本发明提供的抗体作为诊断工具(优选用于体外诊断)和/或作为药物的用途。在任何TNFa相关病况的范畴中特别优选该用途。待用抗TNFascFv或其片段治疗的疾病优选是与TNFa过量表达相关的疾病。如果TNFa的过量表达导致异常的细胞功能，则能结合并从而中和过量TNFa的抗体就是治疗此类疾病的理想药物(如果所述抗体能到达TNFa过量的位置的话)。如果该位置在细胞内，则所述抗体必需要能进入所述细胞。如果该位置是细胞外的，则所述抗体必需能够到达组织中的细胞外基质，即，其必需穿过組织的最外围细胞层(其通常是上皮细胞层)。在本发明的另一实施方案中，34所述抗体能穿透内皮。IV.药物组合物和药物施用A.组合物和施用在大多数情况下，会将本发明的抗体用于药物组合物中，所述药物组合物包含至少一种其他化合物。优选将其与可药用载体、稀释剂或赋形剂组合。所述赋形剂可选自氮酮、苯扎氯铵(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Brij78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯國聚氧丙烯1800、癸酸钠、辛酸、西吡氯铵、氯己定、胆酸盐、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、DMSO、十径溴铵、脱氧胆酸盐、石危酸葡聚糖、EDTA、EDETATE二钠、乙醇、褐霉酸盐、甘胆酸盐、十二烷基石危酸盐、L-a-溶血磷脂酰胆碱、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、鬼苷、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、牛碌胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、紧密连接开口肽(openingpeptides)和肽衍生物、紧密连接开口蛋白(openingproteins)和蛋白衍生物。所述赋形剂优选选自苯扎氯铵、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和氯己定。还可使用癸酸盐。此类物质可作为穿透增强剂发挥作用。在大多数情况下，将包含本发明抗体的药物組合物局部应用而非全身应用。本发明的抗体特别适合于局部应用，因为scFv形式较小，并且其构架具有能使其穿透上皮组织屏障的物理化学特征。局部应用是在相对有限的区域内的应用，例如其是眼、鼻腔、口腔、肠道、皮肤、口腔粘膜和泌尿生殖道、关节和关节间隙、脑、脊推等，其中体积相对小的足够浓缩的抗体的应用就是有效的。另一方面，局部应用是在机体部分的表面上的应用。施用本发明的药物组合物的优选形式是局部应用；但其他形式包括吸入，例如，如果抗体是要穿透肺上皮的话。可使用吸入器或喷雾器及包含气雾剂的制剂实现经肺递送。对于局部应用而言，优选的位置是眼。本发明的抗体特别适合穿透角膜，其主要由三层组织层，即，上皮、间质和内皮构成。因此，所述抗体可用于治疗很多眼病。35B.药物递送系统用于本发明的局部眼部药物递送系统的非限制性例子包括穿透增强剂、角膜胶原膜(collagenshield)、眼部离子渗透、微颗粒或纳米颗粒、眼部插入物、粘膜粘附聚合物、原位胶凝系统、树枝状聚合物、脂乳液和眼部插入物(见Sultana,etal.(2007)FutureDrugs,2(2)，309-323(2007).i.)i.穿透增强剂本发明的药物组合物可包括穿透增强剂。穿透增强剂的例子是本领域公知的，其包括氮酮⑧、苯扎氯铵(BzCl)、BL-7、BL-9、Brij35、Bdj78、Brij98、Brij99、聚氧乙烯-聚氧丙烯1800、癸酸钠、辛酸、西吡氯铵、氯己定、胆酸盐、蓖麻油、玉米油、聚氧乙烯蓖麻油、环糊精、DMSO、十烃溴铵、脱氧胆酸盐、硫酸葡聚糖、EDTA、EDETATE二钠、乙醇、褐霉酸盐、甘胆酸盐、十二烷基硫酸盐、L--溶血磷脂酰胆碱、醋甲唑胺、N-十二烷基肌氨酸、NMP、油酸、Pz-肽、磷脂、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、皂苷、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、牛磺胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐(见Sultana，etal.(2007)FutureDrugs,2(2)，309-323(2007))。在另一实施方案中，穿透增强剂是癸酸钠。再一个实施方案中，穿透增强剂包括胶体系统、聚丙烯酸酯和生物粘附性聚合物。还见U.S.S.N.60/—，_(代理人案巻号No.ES5-016-1,标题为"ImprovedpenetrationEnhancersfortheDeliveryofTherapeuticProteins",提交于2007年7月10日)。ii.角膜胶原膜还可用角膜胶原膜来施用本发明的抗体。在一些实施方案中，可使用解离时间为12、24和72小时的胶原膜。在其他实施方案中，在加替沙星(gatifloxacin)和/或莫西沙星(moxifloxacin)溶液中预先浸泡胶原膜。iii.眼部离子渗透还可通过眼部离子渗透来递送本发明的抗体。在一个实施方案中，可通过跨角膜的离子渗透将抗体递送至眼前节。在另一实施方案中，可通过跨巩膜的离子渗透将高且持续浓度的本发明抗体递送至玻璃体和视网膜。以所需持续时间进行离子渗透。在一些实施方案中，应用离子渗透约l-约4分钟。在其他实施方案中，应用离子渗透少于l分钟。在另一实施方案中，应用离子渗透超过4分钟。iv.微颗粒和纳米颗粒还可用微颗粒或纳米颗粒递送系统来递送本发明的抗体。在一些实施方案中，微颗粒是微胶嚢。在其他实施方案中，微颗粒是微球。再一些实施方案中，微颗粒包含可被侵蚀的、可生物降解的、不可被侵蚀的聚合物或离子交换树脂。在另一实施方案中，微颗粒递送系统是BetopticS⑧，其含有0.25%的倍他洛尔(betaxolol)。也可使用颗粒小于1nm的纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒是纳米胶嚢。在另一实施方案中，纳米颗粒是纳米球。在一个实施方案中，纳米颗粒包含聚丙烯氰基丙烯酸酯(PACA)。在另一实施方案中，纳米颗粒包舍聚4-己内酯。在某些实施方案中，納米颗粒包含固体脂类纳米颗粒，其中含有2.5%的托普霉素及磷酸十六酯。在另一实施方案中，纳米颗粒包含EudragitRS100或EudragitRL100,且任选还包含氯克罗曼(cloricromene)。在其他实施方案中，纳米颗粒包括装载氟比洛芬钠(flurbiprofen,FB)的丙烯酸酯聚合物纳米悬浮液。v.眼部插入物还可使用眼部插入物来施用本发明的抗体。在一些实施方案中，眼部插入物是不可溶的、可溶的或可被生物侵蚀的插入物。不可溶的插入物包括扩散系统、渗透系统和亲水性接触式镜片。可溶插入物可由天然、合成或半合成的聚合物组成。可被生物侵蚀的插入物可由可被生物侵蚀的聚合物组成。vi.粘膜粘附聚合物本发明的药物组合物可包括粘膜粘附聚合物。粘膜粘附聚合物的例子是本领域公知的，其包括壳聚糖(CS)、Ch-HCL和N-羧甲基壳聚糖(CMCh)、N-三甲基壳聚糖(TMC)聚合物、装载毛果芸香碱的CS/Carbopol、聚丙烯酸(PAA)、多糖、木葡聚糖、罗望子种多糖(TSP)和巯基化聚合物或巯聚物(thiomer)。vii.原位胶凝系统本发明的药物组合物可包含原位胶凝系统。原位胶凝系统的例子是本领域公知的，且包括pH介导的原位胶凝系统、温度介导的原位胶凝系统和离子介导的原位胶凝系统。pH介导的原位胶凝系统可包括，例如，聚合物，例如，邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)和Carbopol。温度介导的原位胶凝系统可包括，例如，普罗尼克、tetraonic和乙基羟乙基纤维素。原位胶凝系统还可包括Gelrite(去乙酰化结冷胶(DCG))、藻酸盐(例如，藻酸盐-聚(L-赖氨酸))、马来酸噻吗洛尔(timololmaleate)、眼用溶液(例如TimoptolXE和LizmonTG)及它们的组合。viii.树枝状聚合物本发明的药物组合物可包括树枝状聚合物。树枝状聚合物的例子是本领域公知的，其包括TM聚酰胺(PAMAM)。C.制剂在另一实施方案中，制剂可为緩慢、延长或定时释放制剂、载体制剂(例如微球、微胶嚢、脂质体等)，它们是本领域技术人员已知的。上述任何递送系统都可局部、眼内、结膜下施用，或通过植入施用，使试剂在一段时间内持续释放。制剂可为介载体的形式，例如微胶嚢或大胶囊，或生物相容聚合物的基质，例如聚己内酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚酸酐、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氨基酸、聚环氧乙烷、末尾是丙烯酸的聚环氧乙烷(acrylicterminatedpolyethyleneoxide)、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯腈、聚膦腈、聚原酸酯、乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)及其他聚合物,例如U.S.Pat.Nos.6,667,371、6,613,355、6，596，296、6,413,536、5，968，543、4,079,038、4,093,709、4,131,648、4，138，344、4，180,646、4,304,767、4,946,931(将它们通过引用整体明确并入本文)公开的那些，或可被配制为微球或脂质体的脂类。可局部施用微小的或大的制剂，或通过针头施用，或可被植入。延迟或延38经包被或未包被的胶嚢、脂类或聚合物类化合物、单片层或多片层结构，及上述这些的组合等)。微球、微胶嚢、脂质体等的配制和装载及它们的眼部植入都是本领域技术人员已知的标准技术，例如，使用丙氧鸟苷持续释放植入体，以治疗巨细胞病毒视网膜炎，这是VitreoretinalSurgicalTechniques,Peymanetal"Eds.(MartinDunitzLondon2001，chapter45);HandbookofPharmaceuticalControlledReleaseTechnology,Wise,Ed.(MarcelDekker，NewYork2000)公开的，将其相关章节通过引用整体并入本文。例如，可经由睫状环插入，将持续释放的眼内植入体植入玻璃体腔内。眼内注射可进入到玻璃体(玻璃体内)或结膜下面(结膜下)或眼后(眼球后)或特农嚢下面(特农下)，并且可为储存形式(d印otform)。可通过应用到眼睛外表面的接触式镜片来施用所述组合物，将所述组合物掺入到镜片材料中(例如，在制造时，或含在镜片溶液中)。可经由植入眼内的眼内镜片(IOL)来施用所述组合物。可植入的镜片包括在白内障手术后用于代替患者病眼的任何IOL,其包括但不限于BauschandLomb(RochesterN.Y.)、Alcon(FortWorthTex.)、AUergan(IrvineCalif)和AdvancedMedicalOptics(SantaAnaCalif.)制造的那些。还见Degim，ITandCelebi，N.(2007),CurrentPharmaceuticalDesign,13，99-117。当将镜片植入到镜片囊中时，所述组合物向眼睛提供所需作用。适于植入体(镜片及其他类型)和接触式镜片施用的浓度可变化，这是本领域技术人员知道的。例如，植入体可装载有高含量的试剂，但被配制或调控为使以处于上述范围内的所需浓度持续释放(例如，持续释放制剂)。已发现，用多至1mg/ml的范围内的scFv正常获得的抗体浓度并不能很有效地穿透上皮，除非添加额外的穿透增强剂(WO0040262)。本发明提供了高度可溶的抗体，使可制备包含更高浓度(即，大于约2mg/ml，优选大于约5mg/ml，最优选大于约10mg/ml)的所述抗体的药物组合物，并将其用于对相应抗原相关疾病的有效治疗。因此，本发明提供了治疗抗原相关疾病的方法，其中所述抗体向抗原-抗体相互作用位点的递送需要穿透包含紧密连接的组织，尤其是上皮和/或内皮。上皮是由细胞的层构成的组织，其衬于生物体的外侧(皮肤)和内侧(例如肠)。上皮还包括衬于口腔和体腔内的粘膜膜(包含死的鳞状上皮细胞)及衬于肺、胃肠道和生殖和泌尿道内的上皮细胞。内皮是薄的、平的细胞的层，其衬于血管和器官的内表面。在脉管系统中其形成内腔中的循环血液和血管壁其余部分之间的界面。内皮细胞衬于整个循环系统，从心脏到最小的毛细血管。在小血管和毛细血管中，内皮细胞通常是仅存在的细胞类型。内皮细胞还控制物质进出血流。在一些器官中，存在高度分化的内皮细胞，执行专门的"过滤，，功能。此类独特的内皮结构包括肾小球和血脑屏障。内皮组织是上皮组织的专门类型。在本发明的一个优选实施方案中，可实现对角膜的穿透。角膜上皮覆盖在角膜前面，其由数层细胞构成，这使抗体的穿透进一步更难。本发明的抗体优选能穿透整个角膜。用于治疗葡萄膜炎的理想药物应当具备四个关键特征l)提供迅速的针对急性症状的作用启动。2)显示与标准局部皮质类固醇相当的效果。3)显示与标准局部皮质类固醇相比更好的安全性。4)与标准皮质类固醇或标准单克隆抗体相比，具有有利的药代动力学性质，以使局部应用至角膜，及用于玻璃体内注射。局部应用的TNFa抑制剂(包含足够的药代动力学性质)可满足所有这些方面。抗TNFa的scFv抗体ESBA105能够很好地穿透进入眼前部，组合其高的TNFa中和活性，最终产生眼内浓度，这非常适合治疗前葡萄膜炎的疗效。考虑到在患病的眼中发现的TNFa水平为15pg/ml，而在前部测量到的ESBA105的浓度高达40,000ng/ml(见图7),在眼的玻璃体部分测量到高达125ng/ml(见图8)，我们推断ESBA105不仅适于治疗前葡萄膜炎，其还适用于治疗不同类型的全葡萄膜炎，例如，眼部贝切特病。本发明因此提供了通过局部应用到眼来治疗眼部病症的方法，尤其是用于治疗任何类型的葡萄膜炎、40贝切特病、视网膜炎、干眼综合征、青光眼、Sj6gren综合征、糖尿病(包括糖尿病性神经病)、巩膜炎、结膜炎和角膜炎。优选通过眼药水施用、眼骨或通过储存设备(例如接触式镜片)来进行。在本发明的另一优选的实施方案中，抗体应当穿透肠的上皮。在肺治疗中，应当使用吸入，以携带抗体，从而在肺的上皮处应用本发明的抗体。在本发明还一方面，抗体被用作为诊断工具。本发明的序列如下SEQIDNO:1k1型的VLSSLESGVPSRPSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATyYCQQYKSYWTFGQGTKLTVLGSEQIDNO:2k1型的VLGSILQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTI(VDIKRSEQIDNO:3k3型的VLKVEIKRSEQIDNO:4k3型的VLEIYLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDIKRSEQIDNO:5XI型的VLTKLTVLGSEQIDNO:63型的VLTKVEKRSEQIDNO:7人3型的VLLPVLTQPPSVSVAPGQ丁ARJSCGGNNIETISVHWYQQKPGQAPVLVVSDDLTVLGSEQIDNO:8Hlb型的VHGTYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:9H3型的VHSAISGSGGSTYYADSVKGRFnSRDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLRFLEWLPDAFDrWGQGTLVTVSSSEQIDNO:10H3型的VHAVISNDGRIEHYADAVRGRFnSRDNSQNTVFLQMNSLRSDDTAJLYYCAREIGATGYLD丽GQGTLVTVSSSEQIDNO:11H3型的VHSAISGSGGSTYYADSVKGRFnSRDNSKNTLYLQ廳SLRAEDTAVYYCAKDAGIAVAGTCFDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:12TB-ASAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLE画GWINTYTGEPTYADKFKDRPTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:13ESBA105DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTEHfGMNWVRQAPGKGLE窗GWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLE丁SASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:14TB画WTYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGTKLEIKJRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGK1GLK窗GWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQIHKLKNEDTATYFCARERGDAMDYWGQGTSVrvSSSEQIDNO:15scFvLucentisSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTUISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQ画SLRAEDTAVYYCAKYPYYYTSSHWYFDVWGQGTLVTVSSSEQIDNO:16接头GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNO:17接头GGGGSGGGGSGGGGSSGGGSSEQIDNO:18ESBA105-QC15.2PIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWyQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGRGLE丽GWINTYTGEPTYADKPKDRITFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCAilERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:19ESBA105-H—F68ADrVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCfASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWIN丁YTGEPTYADKFKDRATFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQIDNO:20TB-H—F68V_F70LSAPNRYTGVPSRPSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLE窗GWINTYTGEPTYADKFKDRVTLSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQG丁LVTVSSSEQIDNO:21TB-H一F70L43D麵TQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLE丽GW1NTYTGEPTYADKFKDRJPTLSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCAKERGDAMDYWGQGTLVTVSS实施例除非另有说明，实施例中都使用下述材料和方法。材料和方法除非另有说明，，本发明的实践通常使用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是例如免疫球蛋白技术)和动物饲养的传统技术。参见例如，Sambrook,FritschandManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);AntibodyEngineeringProtocols(MethodsinMolecularBiology),510，Paul,S.,HumanaPr(1996);AntibodyEngineering:APracticalApproach(PracticalApproachSeries,169)，McCafferty,Ed"LrlPr(1996);Antibodies:ALaboratoryManual,Harlowetal，C.S.H丄.Press,Pub.(1999);CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal，JohnWiley&Sons(1992)。实施例1:产生scFv通过作为包涵体表达接着进行重新折叠及层析步骤来产生ScFv抗体。产生三条单链抗体。这包括两个传统的scFv,推测其不满足良好可溶(尤其是稳定和单体)的标准。其中之一是TB-wt(SEQIDNO:14)，其是通过连接鼠抗TNFa单克隆抗体Di62的天然VL和VH序列而构建的(Doringetal，，1994)。另一个是lucentis-scFv,其是通过连接VEGF特异性Fab片段ranibizumab的VL和VH序列而构建的(SEQIDNO:15)。ESBA105是scFv，其携带Di62的CDR，并且其表现出针对TNFa的纳摩尔范围内的Kd值。通过使用所谓的质量控制系统选出的scFv构架来优化ESBA105的可溶性、稳定性和单44体行为(AufderMauretal"2004)。ESBA105的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。图1显示了重新折叠步骤后制备性凝胶过滤中ESBA105(A)、TB-wt(B)和lucentis-scFv(C)的洗脱图。虽然ESBA105的图主要由高达300mAU(吸光度的相对单位)的一个尖锐峰构成，但在TB-wt和lucentis-scFv的图中可看到若干宽的峰，最高分别是16和55mAU。这表明TB-wt和lueentis-scFV的包涵体质量和/爲重新折叠过程相比ESBA105低效得多。以下详细描述了ESBA105的生产过程。构建表达ESBA105的质粒pGMP002:将ESBA105编码序列连接进pET-24d(+)(Novagen,目录号69752-3)的NcoI-HindIII位点。随后，通过T4聚合酶反应补平由Bpul1021和Notl消化产生的粘末端之后，通过平末端连接除去所得构建体的Bpull021-Notl片段，产生pGMP003。通过直接从pET-24d(+)除去Bpull021-Notl产生pGMP002。在大肠杆菌中表达ESBA105:为表达ESBA105,用表达质粒pGMP002来转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。从单个菌落制备甘油贮备培养物，在M9培养基(Sambrooket.al，MolecularCloning,AlaboratoryManual)中培养,其中含有1%的葡萄糖、1ml/1的痕量溶液(WangandLee，BiotechnolBioeng58:325-328)和50pg/ml的卡那霉素。细胞在37。C被培养过夜，加入甘油至20%，将1ml的等份试样作为甘油贮备物贮藏于-80。C。为进行第一次预培养，用1ml甘油贮备物接种50ml的合成限定培养基(Korzet.al"J.Biotechnol.1995,39:59-65),其中含有1%葡萄糖、1ml/l痕量溶液和50pg/ml的卡那霉素。在37。C和200rpm下于带挡板摇瓶中过夜培养预培养物。用第一预培养物接种250ml相同培养基的第二预培养物，再在37。C培养三个小时。生物反应器培养在5l生物反应器(BioFlo110，NewBrunswickScientific)中进行，其中含有初始体积为31的与用于预培养相同的合成培养基。培养温度被设置为37。C。通过加入25%氨水和1M磷酸将培养物pH控制为7.0。通过以41/分钟的总通气速率改变纯氧百分比来将溶解的氧水平保持在高于20%的空气饱和度水平上。用第二预培养物来接种生物反应器，以分批模式进行操作，可高达10-12的OD柳。然后以0.15h"的速率用含有10g/1MgS04'H20和5ml/1痕量溶液的5'0%葡萄糖溶液来开始指数葡萄糖补料。16小时后，通过加入IPTG至1mM来诱导蛋白表达，指数补料持续3小时。然后通过在4,600rpm离心1小时来收获细胞。包涵体制备为制备包涵体，将1kg湿的细胞糊重新悬浮于51TBS緩冲液(10mMTris，150mMNaCl，pH7.3)中。加入1g固体溶菌酶，温育细胞悬浮液30-60分钟。为^f吏细胞破裂，以1000bar使悬浮液经历两次高压均质机(NiroSoavi,Panda2K)。在4600rpm下离心经破裂的细胞l小时，将所得包涵体重新悬浮于含有0.5%LDAO(N-，N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物，Fluka)的21TBS緩冲液中。重复洗包涵体，直到在洗涤上清液中检测不到显著的残留蛋白。最后，用不含LDAO的TBS緩冲液对包涵体洗两次。ESBA105的重新折叠将包涵体溶解于10倍体积的溶解緩冲液(含有6M的盐酸胍、100mMTris、1mMEDTA和20mM的DTT,pH为8.0)中，在室温下过夜温育。然后通过1:50稀释进重新折叠緩冲液来重新折叠溶解的蛋白，所述緩冲液含有3M尿素、100mMTris和半胱氨酸和胱氨酸各2mM，pH为8.5。在室温下持续进行重新折叠24小时。重新折叠之后，通过深度过滤除去沉淀物，将重新折叠溶液浓缩至初始体积的50%。然后针对4倍体积的PBS緩冲液(50mM磷酸钠、150mM46NaCl，pH6.5)来透析经浓缩的重新折叠溶液，并将其进一步浓缩至约1mg/mi的蛋白浓度。通过层析来纯化ESBA105在两个层析步骤中纯化ESBA105:凝胶过滤和阳离子交换层析。所有层析步骤都通过AKTA纯化系统(GEHealthcare)来进行。为进行制备性凝胶过滤层析，使用SephadexS7526/60柱(GEHealthcare)，其中用PBS緩沖液(50mM磷酸钠、150mMNaCl，pH6.5)作为层析緩冲液。收集的ESBA105级分以约185ml的保留体积作为单个峰被洗脱出来。用FractogelEMDS(V(M)(Merck)作为柱树脂，用于第二层析步骤。用5倍柱体积的平衡緩冲液(50mM乙酸钠，pH5.5)来平衡树脂。用50mM乙酸钠(pH5.5)，对来自凝胶过滤的ESBA105峰级分进行10倍稀释，然后以5ml/分钟的流速将其上样到柱上。上样之后，用5倍柱体积的平衡緩冲液洗柱。为洗脱ESBA105，在60分钟内以5ml/分钟使用线性梯度(0-35%的洗脱緩冲液(50mM乙酸钠、500mMNaCl，pH5.5))。收集洗脱后最突出的峰，其被鉴定为ESBA105。最后再针对PBS(50mM磷酸钠、150mMNaCl，pH6.5)来透析收集到的ESBA105级分，将其贮藏于-80。C。实施例2:对scFv的生物物理分析为研究其"类药性"，对ESBA105及其一些衍生物进行生物物理分析。分析涉及测定(1)溶解度参数(PEG沉淀和822值；B22值是对蛋白自身相互作用的量度，其在蛋白晶体生长、溶解和聚集中是重要的，见Valenteetal"BiophysJ.2005Dec;89(6):4211-8.Epub2005S印30)、(2)pl值、(3)对热变性和离液变性的测量及(4)对单体级分较之寡聚级分的定量。1-3项的结果概括于表1中，其还包括分别通过L919和KYM-1测定法测定的相对效力值。表l.一些ESBA105衍生物的数据概括<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>实施例3:scFV在胆藏期间的稳定性scFv随着时间的稳定性是药物领域的重要特征。图4显示了对ESBA105scFv(道1-6)和QC15.2scFv(泳道7-12)的分析，它们是在不同温度(-80。C:泳道l、3、5、7、9和11,或40。C:泳道2、4、6、8、10和12)和浓度(20mg/ml:泳道l、2、7和8;10mg/ml:泳道3、4、9和10;1mg/ml:泳道5、6、11和12)下贮藏2周后通过SDS-PAGE分离并用考马斯来染色的。所述抗体在整个温度范围和所有被测浓度下保持稳定，并未发现有降解或聚集的征兆。在一定时间上稳定的抗体还应当保留其完全的活性。因此，我们在L929测定中针对其活性对在37。C或-80。C贮藏八周后的ESBA105进行了检测。结果列于图5中，未见两个温度间有差异。实施例4:ESBA105离体穿透进全兔眼在离体设置下的不同条件下，检测ESBA105穿透进全兔眼不同区室的量。为进行这些系列实验，将兔眼放到在其表面有凹陷的温育检测板上。凹陷处含有ESBA105检测溶液，将兔眼放到检测板上，使角膜与检测溶液相接触，在37。C温育4小时后，分析不同眼区室内的ESBA105含量。为进行该分析，用注射器从感兴趣的区室移出探针(见图6)，并通过ELISA来测定探针的ESBA105浓度。用上文所述实验设置来评估下述条件检测浓度1、2、5和10mg/ml的ESBA105。还在存在0.5%的癸酸时检测1mg/ml的浓度。之前Thieletal.(Clin.Exp.Immunol.2002Apr;128(1):67-74)已报道0.5%的癸酸能对穿透过角膜有增强作用。当存在0.5%癸酸的情况下施用1mg/ml时，我们测量到在眼前部ESBA105的浓度为约40Hg/ml，这与无癸酸时施用10mg/ml后测量到的浓度大致相等(图7)。令人感兴趣的是，当在玻璃体液中对这两种施用模式的结果进行比较时，含癸酸的情况下施用1mg/ml测量到约40ng/ml，而不含癸酸的情况下施用10mg/ml约为125ng/ml(图8)。在无癸酸时，两个区室中测量到的浓度表现出对于应用的1、2、5和10mg/ml的明显依赖性(图8)。用封闭緩沖液(PBS中的5%低脂乳粉，pH7.4)对眼温育检测板于4。C下进行过夜预温育。第二天用PBS洗板，之后通过在37。C温育30分钟来进行干燥。向经干燥板的每个孔中装入125pl待测溶液，以仅使角膜与待测溶液相接触的方式向孔中放入分离的兔眼。在37。C和100%湿度下温育4小时后，用PBS来洗眼3小时。用25G的针头(用于眼前房)和22G的针头(用于玻璃体)来进行穿刺抽液。如下通过ELISA来测定探针中ESBA105的浓度用台式离心机以13000rpm在室温下离心探针5分钟。在含有0.5%低脂乳粉的TBST(补充有0.005%Tween的TBS)(下文中被称为稀释溶液)中对来自前房的探针进行1:10、1:100和1:1000的稀释，对来自玻璃体的探针进行1:5的稀释，用于EUSA检测。于4。C用0.5ng/ml人TNFa对ELISA96孔板(NuncMaxisorb;49目录号442404)进行过夜包覆。第二天用TBST在室温下洗三次板，再将其与每孔300nl封闭緩冲液(TBST中5%的低脂乳粉)在室温于摇床(500-600rpm)上一起温育60分钟。封闭步骤之后，用TBST洗板三次，之后向每个孔中加入50nl稀释的探针，在室温下于摇床(500-600rpm)上对板进行90分钟的温育。该温育步骤后，用TBST洗板三次，之后向每个孔中加入50nl二抗(AKA3A生物素化的)的1:10000溶液。生物素化的AKA3A是新近生物素化(根据标准生物素化方法)的抗ESBA105的兔多克隆抗体。在室温下于摇床(500-600rpm)上温育90分钟后，用TBST洗板三次，之后加入50pl偶联了抗生蛋白链菌素的辣根过氧化物酶(抗生蛋白链菌素-聚HRP40，1mg/ml;SDT;#SP40C)的1:2000稀释液(在稀释溶液中稀释的)。在摇床(500-600rpm)上于室温温育60分钟后，用TBST洗板三次，用ddH20洗板两次。向每个孔中加入50piBMBluePOD底物(RocheDiagnostics,目录号1484281)来检测辣根过氧化物酶(HRP)活性。于室温下避光温育6-12分钟后，通过向每个孔中加入50nl1MHC1来终止HPR反应。通过在TECANGenios读数仪中于450nm进行分光光度测量来定量HPR反应。最后通过与平行产生的标准曲线对比来确定探针的ESBA105浓度。实施例5:ESBA105穿透Caco-2细胞单层(monolyers)将人结肠腺癌(Caco-2)细胞接种到24转化孔(transwell)板的可透过支持物上，在5%C02的气氛下于37。C培养21天，以使形成紧密单层。进行穿透测定之前，在每个孔中测量跨上皮的电阻，以验证单层的完整性。然后用盐溶液(HBSS)对Caco-2单层洗三次，向转化孔的靠上区室加入含有1nMESBA105(含或不含癸酸盐)的混合物，或仅加入测定培养基作为对照。确定时间点后，收集靠下区室中的内含物，用新鲜测定培养基进行替换。随后通过定量ELISA来分析收集的样品，以测定穿透Caco-2上皮单层的ESBA105的量(图9)。实施例6:穿透小鼠空肠对动物实施安乐死后立即切下约5cm的小鼠空肠，将其与经氧饱和的ringer-krebs緩沖液一起温育，并用ringer-krebs緩冲液冲洗三次。将3.5cm的一段与医用缝线相连，装入200mcl抗体混合物，其中含有1mg/ml的每种抗体形式(因福利美和ESBA105)。在翻转嚢区室末梢约lcm加入第二连接，以确保区室的密封性。将翻转嚢放到含有10ml经氧饱和的ringer-krebs緩冲液的玻璃烧杯中，使仅第一连接接触緩冲液。向该受体区室加入蛋白酶抑制剂，以防止抗体降解。为测定穿透肠组织的每种抗体的量，在确定的时间点后从受体区室取200mcl探针，随后通过定量ELISA进行分析。实施例7:局部使用可溶的抗原结合多肽在兔眼中体内研究局部应用可溶抗原结合多肽ESBA105的药效学和药代动力学。制备四种不同制剂。第一制剂(被称为"B15")包含处于0.15M磷酸盐緩沖液(pH6)中的9.6mg/mlESBA105。第二制剂(被称为"B16")包含处于0.15M磷酸钠緩冲液(pH6)中的10.3mg/mlESBA105和0.01%(w/v)氯己定。第一对照(被称为"B15-0")包含0.15M磷酸盐緩沖液(pH6)。第二对照(被称为"B16-0")包含处于0.15M磷酸钠緩冲液(pH6)中的0.01%(w/v)氯己定。所有制剂都在使用前灭菌并贮藏于4°C。如本文所用，"OTT"表示没有处理。为研究ESBA105在眼中的药效学，每种制剂使用6只兔子。检测兔双眼中的制剂。将2只兔子(4只目艮)用于不含抗体片段的每种制剂，还有两只兔子(4只眼)被用作为首次实验对照。该研究使用共18只兔子。在六天的过程中，予眼局部施用制剂。每天在7时、10时、13时、17时和20时对兔子进行5次处理。处死当天，在7时和10时对兔子进行两次处理，并在最后一次应用后1小时时处死兔子。51在第一天、第三天和第六天对眼进行评估。每种制剂用两只兔子来收集针对每个时间的药代动力学数据。第一天和第三天取房水样品和血清样品。第六天取房水样品和血清样品，并将兔眼切成各組织，以研究抗体片段在不同眼组织中的分布。该研究的结果在图lla-lld中图示。进行其他研究来研究ESBA105的可溶性、药效学和药代动力学。结果记录于图12-16。如可从这些图中可见的，ESBA105已表现出能在兔和猪中穿透角膜组织层。ESBA105在玻璃体中蓄积，并且具有约25小时的局部半衰期。ESBA105在前房中的局部半衰期显著低于玻璃体的。在局部治疗中的全身暴露非常低，例如，最高的局部浓度的约2%。此外，基于兔局部实验，可以每天少至局部5滴就达到治疗性的药物水平(对TNF而言约16000倍)。因此，TNF抑制性的scFv抗体片段的局部应用可成为位于眼中较靠后部分(玻璃体和视网膜)的疾病的有效疗法。实施例8:大鼠急性单发性关节炎中的剂量应答为研究剂量应答，如图17所示施用ESBA105。作为比较，如图17所示施用类克⑧(因福利美)。为进行此实验，将TNFa与三种不同剂量的ESBA105(156jtg、45ng或11ng)或因福利美一起施用。作为对照，使用PBS或仅TNF(10ngi.a.)或仅scFv。结果示于图17中。实施例9:体内局部应用为测定局部施用的一天期间最大的全身应答和局部药物水平，在10小时期间每20分钟施用l滴。通过ELISA测量房水、玻璃体和血清中的药物水平。于PBS中将ESBA105被配制10mg/ml(pH6.5)。对于每滴而言，向瞳孔顶部应用30mcl,然后挤压眼皮以除去多余的液体。结果示于图18和表2中。表2:显示了在实验期间(如图18A图例所示)在指定区室中测量到的最大ESBA105浓度(Onax)。百分数值显示了较之总应用剂量(累积剂量)的Cmax百分比。Cmax累积总剂量玻璃体4.0ng/ml(6.6E-5%)9mg房水5.3ng/nil(1.2E-5%)9mg血清14.2ng/ml(0.3%)9mg实施例10:局部应用可溶抗原结合多肽为测定慢性局部低频次处理期间的最大全身暴露和局部药物水平，向两只兔子(4只目艮)1天应用5次，每次1滴，至6天。对于每滴而言，在下眼囊(eyesac)中应用30mcl的ESBA105(药物主要呈递给巩膜)，全部30mcl保留在眼表面上。第2天、第3天和第6天的第二滴后对眼进行评估。通过ELISA在房水、玻璃体、神经视网膜、脉络膜和血清中测量药物水平。该研究的结果在图19a-图19e中图示。表3概括了在指定区室施用第6个第6天后发现的scFvESBA105的中位浓度(以ng/ml表示)。表3:施用第6个第6天后发现的scFvESBA105的中位浓度房水玻璃体神经视网膜脉络膜血清第6天后的scFv中位浓度(ng/ml)100350~300~100<1在前述说明书的描述下，本发明的多种改变和替代性实施方案对于本领域技术人员来说将是明显的。因此，本说明书应当仅被解释为阐述用，其是用于向本领域技术人员教导用于开展本发明的最佳模式。53结构的细节可相当大地改变，而不偏离本发明的宗旨，对所附权利要求范围内的所有改变的排他性使用是约定保留的。本发明意欲仅被限制为所附权利要求和适用法律条款所要求的程度。本申请引用的所有文献和类似的材料，包括专利、专利申请、文章、书籍、条约、论文和网页(无论此类文献和类似材料的形式如何)都通过引用整体明确引入本文。在并入的文献和类似材料中一份或多份与本申请不同或矛盾的情况下(包括定义的术语、术语使用、描述的技术等)，以本申请为准。本文使用的章节标题仅作组织用，其不应被解释为以任何方式限制描述的主题。虽然本发明是结合多个实施方案和实施例来描述的，但并不表示本发明的教导就限于此类实施方案或实施例。相反，本发明包括多种替代形式、改变和等同物，这将是本领域技术人员能够知道的。权利要求不应被理解为受限于所描述的顺序或元件，除非声明过这样的效果。应当理解，可不偏离所附权利要求的范围，来进行形式和细节上的多种改变。因此，本申请要求保护落入下文的权利要求的宗旨和范围内的所有实施方案及其等同物。54参考文献Alberts,B.，Johnson,A.，Lewis,J.，Roberts,K.，andWalter,P.(2002).MolecularBiologyoftheCell,4thed.Alfthanetal"(1995).Propertiesofasingle-chainantibodycontainingdifferentlinkerpeptides.ProteinEng.8:725-731.Altschul,S.F.，Gish，W.,Miller,W,,Myers,E.W.&Lipman，DJ,(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool."J.Mol.Biol.215:403-410.AufderMaur，A.，Escher，D.，andBarberis,A.(2001).Antigen-independentselectionofstableintracellularsingle-chainantibodies.FEBSLett508,407-412.AufderMaur，A.，Tissot，K.，andBarberis,A.(2004).Antigen-independentselectionofintracellularstableantibodyframeworks.Methods34，215-224.AufderMaur，A.，etal"Directinvivoscreeningofintrabodylibrariesconstructedonahighlystablesingle-chainframework.JBiolChem，277(47》p.45075-85,2002.BenitezDelCastillo,JM.etal.(2004)Long-termtreatmentofrefractoryposterioruveitiswithanti-TNFa(infliximab).Eye,Sept24,e-pubaheadofprint.Binzetal.(2005Oct)NatBiotech23(10):1257-68Bird,RE,Hardman，K.D.，Jacobson，J.W.,Johnson,S.，Kaufman,B.M.，Lee，S.M.，Lee，T.，Pope,S.H.,Riordan，G.S.，andWhitlow,M.(1988).Single-chainantigen-bindingproteins.Science242，423-426.BonfioliandOrefice(2005).Behcet'sdisease.SeminOphthalmol20(3)，199-206.Boydetal,(2001》Immunopathologyofthenon-infectiousposteriorandintermediateuveitides.SurvOphthalmol46，209-233.Chothia，C，andLesk,A.M,(1987),Canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins,JMolBiol196，901-917.Chothia,C，Novotny，J,，Bruccoleri，R，，andKarplus，M,(1985),Domainassociationinimmunoglobulinmolecules.Thepackingofvariabledomains*JMolBiol186，651-663,Degim，LTandCelebi，N.(2007)，Controlleddeliveryofpeptidesandproteins，CurrentPharmaceuticalDesign,13，99-117Dick，AD.etal,(1997)Immunosuppressivetherapyforchronicuveitis:optimisingtherapywithsteroidsandcylosporinA.Br.J.Ophtalmol,81,1107-1112Direskeneli(2001》Behcet'sdisease:infectiousaetiology,newautoantigens,andHLA-B51.AnnRheumDis60，996-1002.Doring，E.StiglerR，GrutzG，vonBaehrR，andSchneider-MergenerJ.(1994)，IdentificationandcharacterizationofaTNFalphaantagonistderivedfromamonoclonalantibody.MolImmunol.31,'1059-67.El隱Shabrawi，Y，andHermannJ,(2002)Anti-tumornecrosisfactor-alphatherapywithinfliximabasanalternativetocorticosteroid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0的组合物，其中所述抗原结合多肽保持稳定至少8周。12.权利要求10的组合物，其中所述抗原结合多肽在4。C保持稳定至少6周。13.以上权利要求中任一项的组合物，其中所迷抗原结合多肽具有本文公开的任何附图中实验显示的药效学或药代动力学特征。14.抗原结合多肽，其中所述多肽针对靶抗原的结合亲和力为至少10E-6M或更小的kD，并且所述多肽足够可溶到能穿过上皮的紧密连接。15.权利要求14的多肽，其中所述多肽满足下述标准中的一条或多条a)所述多肽在生理条件下保持为单体形式-b)所述多肽足够可溶到能在短于约8小时，尤其是4小时或更短时间内穿过上皮的紧密连接。c)所述多肽具有对应于能在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的抗原结合多肽的穿过动力学的1/2Vmax值。16.权利要求14或15的多肽，其足够可溶到能穿过上皮的紧密连接，因此适合用于治疗，其中，溶解度是在标准Caco-2上皮细胞单层测定中测量的，和/或通过标准的细胞内单杂交或双杂交溶解度测定来预测的，和/或是在标准小鼠空肠透过性测定中测量的。17.权利要求14或15的多肽，根据标准PEG沉淀测定或自身相互作用层析(SIC)测定预测到其足够可溶到能穿过上皮的紧密连接，因此适合用于治疗。18.鉴定下述抗原结合多肽的方法，所述多肽具有对应于能在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的抗原结合多肽的穿过动力学的1/2Vmax值，所述方法包括(i)在具有可诱导的报告基因系统的宿主细胞中，细胞内表达候选抗原结合多肽，其中在存在具有所述穿过动力学的抗原结合多肽时，所述报告基因系统产生可被记录的信号；(ii)及针对可记录的信号来筛选所述细胞，其中所述信号的存在将候选多肽鉴定为具有所述穿过动力学的抗原结合多肽。19.通过权利要求18的方法鉴定出的抗原结合多肽。20.用于实施权利要求18的方法的试剂盒。21.治疗具有眼部病况的患者的方法，所述方法通过施用治疗有效量的本权利要求中任一项的抗原结合多肽来实现治疗。22.权利要求21的方法，其中所述病况是葡萄膜炎。23.权利要求22的方法，其中所述病况是年龄相关的黄斑变性。24.抗原结合多肽，其包含具有至少一个抗原结合基序的多肽区域，所述基序侧翼有至少一个支架区域，且其中所述多肽具有足以在短于约8小时内穿过上皮的紧密连接的穿过动力学。25.权利要求24的多肽；其中所述多肽包含被两个支架区域所夹(flankedby)的一个抗原结合基序；被三个支架区域隔夹(flankedby)的两个抗原结合基序；被四个支架区域隔夹的三个抗原结合基序；或被八个支架区域隔夹的六个抗原结合基序，其中在第四和第五支架区域之间具有居间接头区域。26.权利要求24或25的多肽，其中所迷抗原结合基序是CDR，且所述支架区域是免疫球蛋白构架区域。27.权利要求26的多肽，其中所述多肽包含三个CDR和四个居间构架区域或六个CDR和八个构架区域和居间接头区域。28.权利要求14-17、19、24-27中任一项的抗原结合多肽，其中所述多肽由下式表示Y;或Z;或Y-L-Z;或Z-L-Y;其中Y是[F1-CDR1画F2-CDR2誦F3-CDR3F4，Z是[F5腸CDR1画F6-CDR2-F7画CDR3F8;其中，Y的构架区域(Fl-F4)源自一种或多种人轻链构架；Z的构架区域(F5-F6)源自一种或多种人轻链构架；Y的CDR(CDR1-CDR3)源自能结合靶抗原的一种或多种供体CDR;Z的CDR(CDR4-CDR6)源自能结合靶抗原的一种或多种供体CDR;并且，L是柔性多肽接头。29.权利要求28的多肽，其中Y和Z由本文公开的序列中的任何序列或其共有序列来表示。30.组合物，其包含权利要求28-29中任一项的抗原结合多肽，所述组合物^皮配制为达到至少100ng/ml或更高的眼内浓度。31.权利要求30的組合物，其被配制为用于局部施用以得到100ng/ml或更高的眼内浓度，这基于本文公开的细胞或动物模型系统。32.权利要求30的组合物，被配制为在高浓度下保持可溶。33.权利要求30-32的组合物，被配制为用于局部施用至眼，且能在无穿透增强剂的情况下穿过角膜进入眼内空间。34.使用本权利要求中任一项的多肽来治疗、预防或诊断眼部疾病或病症的方法。35.抗体，其包含下述中的至少一种(1)轻链可变结构域(VL)构架，其与选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的VL构架具有至少约85。/。的相似性；及(2)重链可变结构域(VH)构架，其与选自SEQIDNO:8、9、10和11的VH构架具有至少约85%的相似性。36.权利要求35的抗体，其中所述轻链可变结构域(VL)构架与SEQIDNO:2具有至少约85%的相似性，且重链可变结构域(VH)构架与SEQIDNO:8具有至少约85%的相似性。37.权利要求35的抗体，包含与SEQIDNO:4具有至少约85%的相似性的轻链可变结构域(VL)构架和与SEQIDNO:10具有至少约85%的相似性的重链可变结构域(VH)构架。38.权利要求35-36中任一项的抗体，其包含与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8，或SEQIDNO:7和SEQIDNO:8至少约95%的相似性。39.权利要求35-38中任一项的抗体，其针对其抗原的亲和力特征在于解离常数KD小于约100nM。40.权利要求35-39中任一项的抗体，其具有对人TNFa的特异性。41.以上权利要求中任一项的抗体，其经过化学修饰。42.编码权利要求35-40中任一项的抗体的经分离的多核苷酸分子。43.包含权利要求42的经分离的多核苷酸分子的克隆或表达栽体。44.经权利要求43的表达载体转化的合适的宿主细胞。45.权利要求43的宿主细胞，其是原核或真核细胞，尤其是大肠杆菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。46.生产权利要求35-41中任一项的抗体或抗体衍生物的方法，包括在使所述抗体合成的条件下培养权利要求44或45的宿主细胞，及从所述培养物中回收所述抗体分子。47.权利要求35-41中任一项的抗体或抗体衍生物，作为药物。48.包含权利要求35-41中任一项的抗体的药物组合物。49.权利要求48的药物组合物，还包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。50.权利要求49的药物组合物，其中所述赋形剂选自苯扎氯铵、-土温20、"土温40、p土温60、p土温80和氯己定。51.权利要求48-50中任一项的药物组合物，用于局部施用，尤其是作为用于局部施用的组合物。52.权利要求48-51中任一项的药物组合物，其中所述抗体以>2mg/ml的浓度存在。53.治疗抗原相关疾病的方法，其中，权利要求35-41中任一项的抗体向抗原-抗体相互作用位点的递送需要穿透包含紧密连接的组织。54.权利要求35-41中任一项的抗体作为药物或用于诊断的用途。55.鉴定能与抗原特异性结合的scFv抗体的方法，所述方法包括下述步骤(i)从可溶且稳定的抗体构架库中选出最匹配于以特定结合特异性抗所述抗原的非人抗体构架的可溶且稳定的构架，(ii)向所述可溶且稳定的构架提供特异性结合所述抗原的CDRs，或将所述非人抗体的构架朝向所述可溶且稳定的构架的序列进行突变，以产生scFv抗体，(iii)检测所产生抗体的可溶性和稳定性，并检测所产生抗体的抗原结合性，及(iv)选出可溶、稳定且特异性结合所述抗原的seFV。56.权利要求55的方法，还在步骤(ii)和(iii)之间包括下迷-通过对一个或多个选定CDR和/或构架进行定点或随机诱变，来突变所述scFv抗体。57.权利要求56的方法，其中所述选择在酵母系统中进行。58.权利要求56-57中任一项的方法，其在PBS中于37。C下稳定至少l个月，优选至少2个月。59.权利要求56-57中任一项的方法，其在生理条件下保持为单体。60.以上权利要求中任一项的方法，其中所述抗体满足下述标准中的一条或多条a)在环境温度下在PBS中以>1mg/ml的浓度可溶；b)在盐酸胍滴定中表现出至少1.5M的穿过中点。c)在PBS中以>1mg/ml的浓度在生理条件下保持为单体。61.包含抗原结合多肽的组合物，其中所述多肽足够可溶到能穿过完整角膜，且其中所述组合物的pH小于8。62.包含可溶抗原结合多肽的组合物，其中所述抗原结合多肽能在短于约8小时内穿过完整角膜的一层或多层。63.抗原结合多肽，其足够可溶到能穿过上皮的紧密连接，因此适合用于治疗，其中所述溶解度是在标准Caco-2上皮细胞单层测定中测量的，和/或通过标准的细胞内单杂交或双杂交溶解度测定来预测的，和/或是在标准小鼠空肠透过性测定中测量的。64.抗原结合多肽，其足够可溶到能穿过上皮的紧密连接，这是通过标准的PEG沉淀测定或自身相互作用层析(SIC)测定来预测的，因此适合用于治疗。65.包含抗原结合多肽的组合物，其被配制为用于局部施用至眼，且能在无穿透增强剂的情况下穿过角膜并进入眼内空间。全文摘要特异性结合选定抗原且可通过以下方法获得的scFv抗体，所述方法包括(i)从可溶且稳定的抗体构架库中选出最匹配于以特定结合特异性抗所述抗原的非人抗体构架的可溶且稳定的构架，(ii)向所述可溶且稳定的构架提供特异性结合所述抗原的CDRs，或将所述非人抗体的构架朝向所述可溶且稳定的构架的序列进行突变，以产生scFv抗体，(iii)检测所产生抗体的可溶性和稳定性，并检测所产生抗体的抗原结合性，及(iv)选出可溶、稳定且特异性结合所述抗原的scFV。还提供了包含所述scFv抗体的药物组合物、治疗和诊断与可被所述抗体特异性结合的抗原过量表达相关的疾病的方法。文档编号A61P19/02GK101505794SQ200780031471公开日2009年8月12日申请日期2007年7月10日优先权日2006年7月10日发明者A·奥弗德毛尔,A·巴伯利斯,D·厄里什,P·李奇特兰申请人:艾斯巴技术股份公司