专利名称：：针对lct中毒的药物的制作方法针对LCT中毒的药物本发明涉及用于预防或减轻大梭菌细胞毒素(LCTs)，特别是艰难梭菌毒素A和B(TcdA和TcdB)、索氏梭菌致命毒素(TcsL)及诺维氏梭菌a毒素(Tcna)中毒的药物。艰难梭菌(Clostridiumdifficile)是严格厌氧生长、产生孢子的革兰氏阳性菌，于70年代末才被鉴定为与抗生素相关的腹泻和假膜性结肠炎的病原体。从90年代起艰难梭菌被认为是发展中国家最重要的医院病菌。作为愈加广泛地使用广谦抗生素的后果，尤其是对于住院治疗的患者，艰难梭菌感染的发病率进一步持续上升。与艰难梭菌相关的疾病是由艰难梭菌所产生的外毒素毒素A(TcdA)和B(TcdB)引起的。存在显示不同毒性和毒素产生的不同菌抹。大约所有菌林的四分之一不产生毒素。产生毒素的菌株几乎总是产生这两种毒素。TcdA是肠毒素，其通过对肠细胞的细胞毒性损害提高小肠粘膜上皮的渗透性并由此引起腹泻。TcdB是细胞毒素，其干扰电解质输送并引起小肠脱水及功能紊乱。TcdA和TcdB属于所谓的大梭菌细胞毒素(LCTs)，分别由具有3个功能结构域的肽链组成，即负责毒素与宿主细胞膜缀合的C端结构域，负责穿越细胞膜的转运的疏水的中间结构域，和具有糖基转移酶功能和介导分子毒性活性的N端结构域。尽管毒素被摄入宿主细胞的过程还未完全弄清，但被认作事实的是，毒素在与宿主细胞受体缀合后通过胞吞作用进入宿主细胞，N端催化结构域被切离且被转运至宿主细胞胞浆内以发挥其毒性。在胞浆内催化结构域将Rho-亚族(Rho,Rac和Cdc42)的GTP酶特异地糖基化(所述Rho-亚族本身参与大量信号传导级联)，并以这种方式阻断相关的信号传导过程，从而最终导致细胞骨架的解聚和细胞死亡。迄今为止，现有技术的出发点在于，TcdA和TcdB和其它"大梭5菌细胞毒素"LCT的毒素肽链上的N-端催化结构域的切离，被一种细胞蛋白酶催化(Rupnik等人，2005和Pfeiffer等人，2003)。但是却不能提供相应的证据。然而在本发明以之为根据的研究过程中，令人惊奇地发现，TcdA和TcdB的裂解是自催化的过程，该过程由磷酸肌醇(IP)启动，因此艰难梭菌毒素除了它的糖基转移酶的催化功能之外，还具有用于自我裂解和自催化性裂解的蛋白酶功能。该蛋白酶功能被鉴定为天门冬氨酸蛋白酶。鉴定为蛋白酶催化中心的蛋白区域是，涉及根据序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的TcdB的氨基酸位置从AS1653至AS1678的氨基酸序列。表征天门冬氨酸蛋白酶的DXG基序(Rao等人)处于氨基酸位置1665。鉴定为磷酸肌醇结合位点的蛋白区域是，涉及根据序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的TcdB蛋白的氨基酸位置从AS1517至AS2142的氨基酸序列。该氨基酸序列展现肌苷-5-单磷酸-脱氢酶(IMPDH)基序，该基序由两个区域构成，即AS1517-AS1593和AS1918-AS2142，它们通过325个氨基酸长的无序列同源性的蛋白质片段分隔开。为了治疗艰难梭菌感染的患者，首先要尽可能停用所述引发性抗生素。进一步的治疗仅仅针对症状进行。在较长持续的或者严重的病程情形下，以及如果出于其它原因不可能停用所述引发性抗生素，则施用甲硝唑或者万古霉素用于治疗。常用的抗生素治疗的缺点是多方面的。在此尤其重要的是，因为用抗生素治疗另一种感染状况而引起的疾病，无法用抗生素治疗有效治愈。其背景是以下事实，艰难梭菌在健康人的肠腔内只相对很少地出现，并且相对于正常的肠菌丛不能够发展。如果正常的肠菌丛经抗生素治疗而破坏，艰难梭菌能得以发展并有效地安顿于小肠。针对抗艰难梭菌的抗生素治疗再度导致肠菌丛的破坏并由此在因果上还阻止健康肠菌丛的产生。这也解释了抗生素治疗结束后所观察到的緩解(Remissionen)的高数目。常用的抗生素治疗的额外缺点是，近期多重抗药性的艰难梭菌属种越来越多地出现。从而威胁到，使目前用于艰难梭菌诱发的疾病的唯一疗法失效，并且因艰难梭菌疾病而死亡的数目上升。另外，用于治疗艰难梭菌感染所必须的抗生素是非常昂贵的，且通常只有在有理由的情况下作为保留抗生素使用。因而存在对药物的迫切需求，该药物适用于特定地防治(预防、清除、緩解)艰难梭菌感染，而不存在梭菌或其它细菌发展耐药性的风险，并且不会损害相关患者的自然菌丛-特别是肠菌群。本发明的任务是提供这样的药物。所述任务的解决方案在于提供文端所提及的类型的药物，其特征在于，包含至少一种效应剂作为活性物质，所述效应剂为LCTs(大梭菌细胞毒素)自催化性蛋白酶活性抑制剂或激活剂，所述LCTs特别是艰难梭菌毒素A(TcdA)和/或艰难梭菌毒素B(TcdB)，和/或索氏梭菌致死毒素(TcsL)和/或诺氏梭菌oc毒素(Tenoc)。下文中，作为LCTs自催化性蛋白酶活性的效应剂，描述的既是LCTs自催化性蛋白酶的激活剂，又是LCTs自催化性蛋白酶的抑制剂。如果所述活性物质或效应剂是抑制剂，则其抗毒性作用基于抑制完整毒素(特别是TcdB或TcdA或TcsL或Tcnot)的蛋白酶活性，并由此阻止细胞毒素的具有糖基转移酶功能的有效片段(在TcdB和TcdA的情形下是63kDa片段)的切除。适合的抑制剂是抑制毒素的蛋白酶活性的化学物质。在上下文的阐述中，术语"化学物质，，既表示无机化合物也表示有机化合物、离子和肽或蛋白。优选的抑制剂是那些不可逆地抑制蛋白酶活性的化学物质。对此的实例是物质EPNP(1，2-环氧基-3-(对-硝基苯氧基)-丙烷)。该物质在蛋白酶催化中心与天冬氨酸残基不可逆反应并抑制所述蛋白水解作用。其它蛋白酶抑制剂是本领域技术人员已知的或可以由他们用已知的方法轻易鉴定的(计算机模拟、高通量筛选)。例如可以合成肽以实施高通量篩选，该肽的氨基酸序列对应于LCTs的蛋白酶裂解位点的序列。通过这些肽链，例如运用本领域技术人员已知的方法与染料AMC(7-氨基，4-甲基-香豆素)的偶合可以产生探针。为实施"高通量篩选"将已标记的探针与毒素和候选物质放置一起。如果探针被裂解，则产生荧光光谱的变化。本领域技术人员用通常的方法轻易捕获该变化。试剂(Ansatze),其中观察到焚光光镨没有变化的即包含潜在的蛋白酶抑制剂。还示例性地描述了另一种方法用于鉴定影响LCTs自催化性蛋白酶活性的活性的物质。对此可以使用例如与染料连接的全毒素或者合适的毒素片段，所述染料的荧光在未裂解的毒素或者毒素片段中是淬灭的。通过毒素或毒素片段的自催化性裂解取消了淬灭性效应。该荧光光镨的变化，如所述，易于捕获。特别合适的抑制剂，即具有抑制作用的效应剂是化学物质，特别是蛋白质且其中尤其是抗体，通过与所述蛋白酶活性中心相互反应抑制LCTs的自催化性蛋白酶活性。在本发明的上下文中，术语"相互反应"意指在LCT与化学物质(特别是蛋白质)之间的任何类型的相互作用，并特别是包括共价键如双硫键和非共价键如范德华力、疏水或静电的相互作用以及氢桥键。在此优选蛋白质且其中尤其是抗体，其与分别根据TcdB-氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)从AS1500至AS1800，优选AS1653至AS1678的TcdB-蛋白质区域，和尤其与1665位置处的DXG基序，或者与TcdA、TcsL或Tcnot的与此等同的或同源的蛋白区域相互作用。这些等同的/同源的蛋白区域，在TcdA的情况下，涉及根据TcdA-氨基酸序列号P16154(SwissProt/TrEMBL)位于AS1662位置处具有DXG基序的从AS1651至AS1675的氨基酸序列截段，在TcsL的情况下，涉及根据TcsL-氨基酸序列号Q46342(SwissProt/TrEMBL)位于AS1666位置处具有DXG基序的从AS1654至AS1679的氨基酸序列截段，在Tcna的情况下，涉及根据Tcna-氨基酸序列号(546149(SwissProt/TrEMBL)从AS1641至AS1665的氨基酸序列截段。其它适宜的抑制剂(具有抑制作用的效应剂)是化学物质，特别是蛋白质且其中尤其是抗体，其通过抑制磷酸肌醇与毒素的相互作用来抑制LCTs的自催化性蛋白酶活性。通过阻止IP键，阻止毒素的溶蛋白性裂解。在此优选蛋白质且其中尤其是抗体，其与分别根据TcdB-氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)从AS1400至AS2300，优选AS1517至AS2142，和尤其AS1517至AS1593或AS1918至AS2142的TcdB蛋白区域，或者与TcdA、TcsL或Tenct的与此等同的或同源的蛋白区域相互作用。同样好的是也可以产生抗体和其它蛋白，其不直接与磷酸肌醇结合(特别是前述蛋白区域)相互作用，而是靶向相邻区域并空间阻碍IP鍵并由此阻止毒素的溶蛋白性裂解。此外可以产生不直接与LCTs的蛋白酶作用的DXG基序相互作用，而是通过与相邻蛋白质片段结合阻止溶蛋白性裂解的抗体和其它蛋白。适宜的抑制剂(具有抑制作用的效应剂)此外呈现出磷酸肌醇(IP)且特别是六磷酸肌醇(IP6)的类似结构，该类似结构可以具有LCT(特别是TcdA和/或TcdB、和/或TcsL和/或Tena)的反应结合位点而非磷酸肌醇且特别是六磷酸肌醇的反应结合位点，但是不具有IP或IP6的引发剂功能(Initiator-Funktion)。该类似结构由此是激动剂IP(特别是IP6)的拮抗剂，并展现出与LCT(特别是TcdA和/或TcdB、和/或TcsL和/或Tcncc)的蛋白酶活性的竟争抑制作用。适宜的结构类似物是本领域技术人员已知的，或可应用本领域技术人员常用的测试方式(例如对此是先前已经描述过的)轻易鉴定。适宜的抑制剂此外是磷酸肌醇的抑制物质(同义词磷酸肌醇抑制物质或磷酸肌醇抑制剂)，即这样的抑制物质，其如此结合或改性磷酸肌醇且特别是六磷酸肌醇，从而抑制它们引发LCT(特别是TcdA和/或TcdB和/或TcsL和/或Tcnot)的蛋白酶活性的能力。这样的物质的实例为二价离子如Ca2+，其与IP6形成不溶的配合物。类似的物质是本领域技术人员已知的，或可应用本领域技术人员常用的测试方式(例如对此是先前已经描述过的)轻易鉴定。9其它适宜的抑制剂(具有抑制作用的效应剂)是抑制在患者(哺乳动物，特别是人类)的肠腔中或患者(哺乳动物，特别是人类)的体细胞内的礴酸肌醇的形成，或者破坏已存在的磷酸肌醇的化学物质，从而阻止LCT在穿透入细胞质的情形下的溶蛋白性裂解。优选这样的物质的实例是锂、VPA(丙戊酸)或CBZ(卡马西平)。适宜的激活剂，即具有激活作用的效应剂，是激活毒素蛋白酶活性的化学物质。激活剂的抗毒作用基于，毒素与宿主细胞如此结合，以致被裂解的片段能够到达细胞内(胞浆)之前，引发完整毒素(特别是TcdB或TcdA或TcsL或Tenot)的蛋白酶活性。所述激活剂因而在宿主细胞外起到裂解具有糖基转移酶功能的细胞毒的有效片段(在TcdB和TcdA中为63kDa-片段)的作用。所述细胞毒的有效片段不能再进入到达细胞内并在那里发挥其细胞毒作用。特别适宜的激活剂(具有激活作用的效应剂)是被分离的(以区别于胞浆内的)磷酸肌醇(IP)，优选六磷酸肌醇(IP6)。具有这种活性物质的药物具有下列优点，存在于患者肠内的LCT(特别是TcdB和/或TcdA和/或TcsL和/或Tcnot)，即在其能与肠细胞或其它体细胞结合并发挥毒性之前，通过药物导入的IP已经在肠中促使裂解。同样良好地适宜作为激活剂(具有激活功能的效应剂)的物质，其类似IP6地促进LCT(特别是TcdA和/或TcdB和/或TcsL和/或Tena)的自催化性蛋白酶活性。这样的物质是本领域技术人员已知的，或可用本领域技术人员已知的方式轻易鉴定。对此还适宜的是前述的"高通量试验"的改进的变化方案。其中使毒素与潜在的激活物质一起提供并依据时间过程研究荧光光谱中的变化。在短时间内呈现强烈变化的检测物(Ansatze)包含适宜的激活剂(具有激活功能的效应剂)。根据本发明，LCT的蛋白酶功能的催化中心也可以用作靶向施用的抗原(接种物质)以产生对抗毒素的免疫。本发明的主题因此还有用于避免或减轻LCT(-大梭菌细胞毒素)中毒的药物，其特征在于，适宜作为疫苗用于施用，并且具有TcdB和/或TcdA和/或TcsL和/或Tcnot的催化中心的完整氨基酸序列或其作为抗原性活性物质的片段。所述抗原性活性物质优选选自下组的蛋白质片段-TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的位于1665位置处的DXG基序-TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1653至AS1678-TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1500至AS1800-TcdA氨基酸序列号P16154(SwissProt/TrEMBL)的位于1662位置处的DXG基序-TcdA氨基酸序列号P16154(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1651至AS1675-TcsL氨基酸序列号Q46342(SwissProt/TrEMBL)的位于1666位置处的DXG基序-TcsL氨基酸序列号Q46342(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1654至AS1679-Tcna氨基酸序列号Q46149(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1641至AS1665。以下依据实施例和附图进一步阐述本发明。显示图1:TcdB1M63(270kDa)全毒素被裂解为在SDS-PAGE中的易位/配位体结构域(207kDa)和N端催化结构域(63kDa)，其实施采用a:Cy3标记的TcdB簡3和猪脾细胞提取物的混合物(实施例U);b:Cy3标记的TcdB腦3和不含蛋白质的猪脾细胞提取物的混合物(实施例IB);c:Cy3标记的TcdB腦3和磷酸肌醇的混合物；d:无标记的TcdB，3和磷酸肌醇的混合物；e:无标记(借助亲和色谱法纯化)的TcdB腦3和磷酸肌醇的混合物;a-e分别在室温下温育1小时图2:TcdB,和/或IP6的混合物的SDS-PAGE，该毒素用或没有用EPNP预处理；泳道1:用EPNP预处理后且无IP6的TcdB腦3，在63kDa区域没有可检验的条带；泳道2:用EPNP预处理后且与IP6温育后的TcdB腦3，仅微弱地显示出典型的63kDa条带；泳道3:没有用EPNP预处理且与IP6温育后的TcdB，"在63kDa的分子量区域可识别明显清晰的条带；泳道4:没有用EPNP预处理且无IP6的TcdB，"在63kDa区域没有可检验的条带。图3:天然TcdB蛋白(a)和经EPNP修饰的TcdB蛋白(b)的胰蛋白酶消化后的ESI-LCMSMS-分析。MS-SurveyScan(大图)和裂解谱(插入部分)。的。如在Ausubel等人(2003)中所描述。实施例1:TcdB自催化性蛋白酶活性的证明参考菌林VPI10463的艰难梭菌毒素B(WOkDa)，下文中简称为TcdB簡"将首先用Cy3进行荧光标记。为此将200-400PgTcdB腦3(tgcB丽ICS，Mainz,德国)用染料Cy3依据制造商(Amersham，Bioscience)的说明进行标记，其通过将毒素与在二甲基甲酰胺中溶解的染料一起在4。C下温育1小时的方式。未结合的染料随即借助尺寸排阻色谱法(SizeExclusionChromatographie-SEC)去除，其中10mM的Tris-HClpH8.5溶液用作为洗脱緩冲液。染料与经Cy3标记的TcdB腦3之间的摩尔比为0.8-1.6。将经标记的TcdB腦3等分并于-80。C下储存以备进一步使用。(A)用于实施现有技术中已知的"体外裂解分析(In-vitro-cleavageassay)，，(对此特另'J参见Rupnik等人(2005);该公开文献的内容明确在此引用)将融化至室温的等份的经Cy3标记的TcdB自3在室温下与猪脾细胞提取物温育1小时。这种猪脾细胞提取物将如下制备将新鲜获得的猪脾收纳于磷酸緩沖液(PBS)中并破碎成单细胞混悬液。通过加入低盐緩冲液(LowSaltBuffer)-即150mMNH4C1、1mMKHC03，0.1mMEDTA,pH7.6-，将存在的红细胞胞溶并由此去除。随即将脾细胞用lOmM的Tris-HClpH8.5洗涤两次，并立即于-80匸深冻。就所希望的细胞提取物而言，视需要将一等份这种深冻的脾细胞在一等份10mM的Tris-HClpH8.5中融化并混悬，并且将该混悬液随即经受超声波处理。将所获得的溶胞产物在200000xg和4t:下离心1小时，并将上清液用于待进行的试验。为了分离和验证在温育过程中产生的TcdB片段，在温育阶段结束时将经Cy3标记的TcdB觸3和猪脾细胞提取物的混合物进行SDS-PAGE。该SDS-PAGE的结果显示于图la中获得了预期的这两条艰难梭菌毒素B(在此为TcdB1M63)的已知的且特征性的63kDa片段和2O7kDa片段。未混合有脾细胞提取物的TcdB腦3等份用作为阴性对照(参见附图1"-，，)。(B)在平行实验中，将(A)中所描述的脾细胞提取物在与经Cy3标记的TcdB,3温育之前纯化脱除蛋白质。出于此目的，将一等份根据(A)制备的猪脾细胞提取物在紧随超声波处理后进行6次苯酚-氯仿提取，其如以下步骤进行将猪脾细胞提取物与苯酚-氯仿-异戊醇(25/24/1)以体积比例1:1混合。将该混合物在1，700xg和4匸下离心10分钟。将含水的最上层倾倒入新的离心管并且将离心和倾倒再重复5次。为了将苯酚的最后残留也去除掉，随即进行氯仿提取法。13以体积比例1:30(30),1:IOO(100)或1:300(300)用10mM的Tris-HClpH8.5稀释，并如在(A)中所描述的与融化至室温的经Cy3标记的TcdB腦3等份混合，并在室温下温育1小时。为了分离和验证在温育过程中产生的TcdB片段，在温育阶段结束时将该混合物进行SDS-PAGE。该SDS-PAGE的结果将借助GelDocEQSystemImageReader(BIO-RAD慕尼黑，德国)使之可见并显示于图lb中在所有测试物中荻得这两条TcdB，3的特征性的63kDa片段和207kDa片段。这说明，脾细胞提取物的含水且无蛋白质的级份始终具有将TcdBm63裂解为它的这两条特征性部分片段的特性。在另一组平行实验中，将(A)中所描述的脾细胞提取物在其如(A)中所述与经Cy3标记的TcdB簡3温育和进行SDS-PAGE之前，加热(96'C，30分钟)处理。该SDS-PAGE的结果同样显示于图lb中再次获得这两条TcdBm"的特征性的63kDa片段和207kDa片段。结果表明，经过热诱导的脾细胞提取物仍具有将TcdB腦3裂解为它的两条特征性部分片段的特性。(C)在另一实验系列中将经Cy3标记的TcdB腦3和未标记的TcdB腦3单独(即，没有与脾细胞提取物混合)与不同的磷酸肌醇在室温下温育1小时并将各自的混合物随即进行SDS-PAGE。该研究的结果在表1和图lc-e中显示。它提供了令人惊奇的核心证据，即TcdB簡3的溶蛋白性裂解可单独由化学物质如IP引发，且在这种溶蛋白性裂解的情形下由此涉及毒素蛋白的自催化过程。由表1所示，一系列的磷酸肌醇可以引发TcdB腦3的自催化性裂解。六磷酸肌醇(IP6)在所测试的肌醇中导致最强的裂解活性，这说明IPs具有最高的引发活性(参见图lc-e)。结构类似物或其它具有引发剂活性的磷酸肌醇相关物质，是本领域技术人员已知或可以用已知方法(如，计算机4莫拟)轻易获得的。例如也可以使用上文所描述的"高通量分析"。在与TcdB,3的温育实验中，对不同浓度IP6的测试显示(参见图14lc和Id)，IP浓度为10幽(图1C)足够用于裂解经荧光标记的毒素B，而用于裂解未标记的(且在SDS-PAGE中通过锌染色(ZincStainandDestainKit,Biorad，Hercules,USA)才使之可见)毒素B，更低的IP浓度直至1MM(图Id)就够了。类似实验也用LCTs中的TcdA腦3、索氏梭菌的TcsL、和Tcnot进行。其表明，磷酸肌醇对LCT家族的所有被研究的毒素的自催化性裂解起激活性作用。(D)为了排除，在实验中使用的来自艰难梭菌的培养基上清液的纯化的TcdB，3被蛋白酶污染，用特别纯化的TcdBw"进行对照实验。TcdB簡3的这种纯化借助亲和色谦法在单克隆抗体2CV(DSMACC2321)的使用下如下进行将7mg的TcdB特异性单克隆抗体2CV(经G蛋白纯化的无血清杂交瘤培养基上清液)偶合到HiTrapNHSSepharose柱上(商购可得自GEHealthcare,Freiburg,FRG)。根据制造商的说明进行偶合和洗脱。用约4mg的TcdB脳3注入所述完备的柱并用50mM的Tris/HCl，pH7.0;125mMNaCl三次洗涤将未结合的蛋白质去除。所述洗脱在一个步骤中用0.1M的三乙醇胺-HClpHll进行。将毒素洗脱为具有浓度为450-185Pg/mg的3个4ml的级份。经洗脱的毒素立即用1M的Tris/HCl,pH7.5以1/10的体积比中和，其经此得以确保，即在洗脱开始之前，所述中和溶液就已经是被预置于级份的承接小管中的。随即通过SDS-PAGE和随后的锌染色证明所述污染性蛋白不存在(参见图le"-，，)。对照试验由如此纯化的未标记的TcdB,3与IP6的温育和随后的SDS-PAGE和借助锌染色毒素和毒素片段的验证组成。该试验的结果显示于图le中并显示全毒素完全裂解为这两种已知的片段63kDa和207kDa。实施例2:通过与蛋白酶抑制剂的温育而灭活TcdB腦3将TcdB,3如实施例1(D)中所述借助亲和色谱法在单克隆抗体2CV的使用下纯化，并随后或者(i)与蛋白酶抑制剂EPNP(10mM的1，2-环氧基-3-(对-硝基苯氧基)-丙烷)或者(ii)-作为对照-与緩冲液(50mMHEPES，1MNaCl，1mMEDTA，pH8.0)在室温下预处理6G分钟。随即类似实施例1(A)进行体外裂解分析。测试物各涉及IOW的体积，且包含各50-100ng未标记的TcdB1(M63，100MMIP6和10mMTris-HClPH8.5。将这些测试物在紧接着温育(室温下l小时)之后进行SDS-PAGE(10%)，随即借助锌染色使毒素和毒素片段可见。图2显示这些实验的结果TcdB，3单独与IP6进行温育后(泳道3)在63kDa的分子量区域显示明显清晰的条带。如果将毒素事先用EPNP预处理后(泳道2),典型的63kDa条带仅微弱地显示。该发现说明，通过添加EPNP几乎完全抑制了TcdB廳3的蛋白水解活性(蛋白酶活性)。此外，用EPNP预处理的毒素将根据Moos等人(2000)的CHO试验测试其残余活性(细胞毒作用)。CHO试验将如下进行将CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)播种于96孔的微量滴定板中(5000细胞/孔)并在标准条件下(5%C02，37°C，用2mM的L-谷氨酰胺补充DMEMF12，5%FCS)温育16小时。随即向细胞中加入在生长培养基中逐级稀释后的毒素。测试10°至10—8之间的稀释级。将细胞在标准条件下温育3小时。随即通过拍摄孔的多个代表性截面并且计数展开的(ausgestreckt)、以及变圆的细胞的方式，用显微镜测定变圆(abgerundet)的细胞的份额(参见Moos等人，MethEnzymol.2000，325:114-125。在此明确引用该出版物的内容)。该CHO试验的结果表明，所述经EPNP预处理的TcdB腦3相比未经处理的TcdB簡3具有明显较弱的细胞毒活性(见表2)。因为EPNP的抑制作用已知基于，EPNP与催化性天冬氨酸残基发生共价的相互作用并经此导致蛋白酶的不可逆的灭活(Salto等人1994)，上述实验的结果表明，TcdB,3的活性抑制基于毒素分子的蛋白酶活性的抑制。在此所描述实验用EPNP证明，TcdB腦3和其它LCT的毒性作用通过用适宜的蛋白酶抑制剂的预处理而明显降低。EPNP表现为LCT类的共价抑制剂的模式物质(Mode11stubstanz)。知的或由他们用已知方法，例如用已经描述的"高通量分析"获得。10463实施例3:通过用IP6细胞外激活蛋白酶活性，从而使TcdB的细胞毒作用灭活将TcdB腦3如实施例1(C)所述与100MMIP6温育。紧接着温育之后，通过将测试物经Microcon-小管(Mi11ipore，孔尺寸为100kD)提纯的方式，将通过蛋白酶活性切下的小的、毒素蛋白的63kDa片段分离。这种TcdB腦3的63kDa片段随即在实施例2中所描述的根据Moos等人(2000)的CHO试验以研究细胞的变圆。其中向细胞中加入未稀释和不同稀释级的蛋白质。该实验表明，具有TcdBw"的糖基转移酶功能的63kDa片段，在所给定的条件下，不能单独引起细胞毒作用。在稀释和未稀释的情况下都不能观察到细胞变圆(因Rho亚族的特异性GTPase的糖基化而引起信号转导过程阻断，并从而引起细胞骨架解聚)。该发现，即所述借助自催化产生的毒素片段是细胞外失活的，证明了Pfeifer等人(2003)和Rupnik等人U005)的结果，其显示，已切离的TcdB10463的催化性结构域不能进入真核细胞并因而在细胞培养基中失活。(而在该工作中明显排除LCT的自催化活性[Pfeiffer等人，2003]，或推断通过细胞蛋白酶激活LCTs[Rupnik等人，2005]，所述与本发明相关地获得的试验结果第一次表明，N-末端的毒素片段自催化切离。)TcdB,3和其它LCTs的毒性作用可以因此通过在毒素进入细胞前诱导毒素的溶蛋白性裂解而抑制。实施例4:TcdB蛋白酶活性中心的证明将经EPNP灭活(参见实施例2)和未经处理的TcdB10463借助SDS-凝胶分离并用锌染色显示。随即切割相应于蛋白质的条带并破碎成小块。将其脱色并干燥，随即在2mMDTT中还原并用20mM乙酰胺碘烷基化。在洗涤和重新干燥凝胶片段后，将其用胰蛋白酶在37。C下过夜消化。所获得的肽键随即通过HPLC分离(NanoAcquity高效液相色语法，Waters,Milford，USA)。为此将样品加载到在2%的流动相B緩冲液(于乙腈中的0.1%的蚁酸)中的反相柱上(NanoEase，BEHC18(75x10cm),Waters,Milford，USA)。流动相A緩沖液包含于水中的0.1%的蚁酸。随即将所述片段通过梯度为3-40%的流动相B緩冲液(90分钟，300nl/min)从该柱中洗脱。将经洗脱的片段随即进行质傳研究。为此使用Waters公司的Q-TofPremier质语仪。该仪器用[Glu-1]-纤维蛋白原肽溶液(500fmol/pl于300nl/min)通过NanoLockSpay-Quelle(Waters)的参考喷雾剂(Referenz—Sprayer)校准。<吏用MassLnyx4.1软件(Waters)用于结果的分析。结果的分析表明，未处理的TcdB与经EPNP处理的毒素仅在一个典型片段有区别(附图3)。该片段包括根据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的TcdB蛋白的氨基酸AS1653至AS1678，其具有于位置1665处的天冬氨酸蛋白酶特征性DXG基序。TcdB催化中心的氨基酸序列AS1653至AS1678与毒素TcdA，TcsL和Tcnoc的对应的催化中心和蛋白区域的对比显示，该区域是高度保守的(参见表3)。本领域技术人员因此可以用已知方法产生抗体或其它蛋白，其特异性地与毒素的蛋白酶结构域的活性中心相互作用，并由此例如阻止LCTs的自催化性裂解。同样好的是也可产生不直接阻断活性中心而是靶向相邻区域并由此空间阻碍毒素的自催化溶蛋白裂解的抗体或蛋白。实施例5:由于经灭活的TcdB的免疫作用通过抗体抑制TcdB作用为了诱导出对抗TcdB细胞毒效应的保护，制备以下TcdB制剂并18在家兔中用于免疫制剂A:用甲醛灭活的TcdB制剂B:用EPNP灭活的TcdB(参见实施例2)制剂C:TcdB片段AS1601至AS1716(DSG基序)制剂D:TcdB片段AS1508至AS1601(肌苷结合性基序的一部分)制剂E:TcdB片段AS1508至AS2157(DSG基序和全部肌苷结合性基序)用本领域技术人员已知的方法在质粒pET-19(Novagen)中表达TcdB片段并通过缀附的His-Tag进行纯化。随即将His-Tag借助肠激酶消化而切除。蛋白纯度将在SDS凝胶中检验(数据未展示)。为进行免疫，首先用抗原将家兔进行基础免疫并随后进行多次强化免疫。最终由家兔血液中获得多克隆的抗血清。为检验多克隆抗血清的中和作用，首先将TcdB用多克隆抗血清预处理(稀释级1:100)并在室温下温育1小时。随即依据CHO试验如在实施例2中所述检测抗血清的中和作用。血清的中和作用的标准是，使细胞免受TcdB的细胞毒作用的保护有多长时间。用制剂A免疫的家兔只显示微量的抗体滴度(参见表4)，而且该家兔的血清不起中和作用。该发现符合本领域技术人员已知于用甲醛处理的LCT的免疫实验的结果。用制剂B免疫的动物，虽然形成明显的滴度(可稀释至1:1500)，然而该抗血清在CHO试验中也不显示中和作用(表4)。用制剂C至E免疫的家兔，同样显示抗体滴度，而且它们的多克隆血清在CHO试验中显示出明显的中和作用(表4)。通过用制剂E免疫产生的多克隆血清，在此显示出最强的中和性特性。通过用制剂C和D分开免疫而产生的血清，显示出相对较低的中和作用。用含有部分肌醇结合性区域的D片段的成功免疫证明，LCT的该截段涉及对于激活毒素重要的区域。IP6在该毒素截段的结合导致自催化性蛋白酶活性的激活，并由此导致LCT的激活。涉及DSG基序的区域的中和作用证明，乾向蛋白酶活性中心的抗体能够抑制蛋白水解活性。用这样的抗体还能够在体内形成对LCT的毒性效应的保护。在用制剂E进行免疫的情形下只是将所述成功的制剂C和D的这两种片段一起使用。用这两种TcdB片段的成功免疫基于，在动物体内诱导了抗体，其既靶向蛋白酶活性中心，又是结合磷酸肌醇结合性区域的这样的抗体。抗血清的作用由此基于，第一次能够诱导针对性地阻止毒素激活的特异性抗体。毒素的自催化性裂解对于LCT在其宿主细胞中的自然摄入是重要的，因为只有这样所述N末端，作为真正的毒性活性的介导性片段才能释放入宿主细胞。在天冬氨酸蛋白酶和磷酸肌醇结合位点的DSG基序的环境下，特异性抗体的结合阻止了毒素的自催化性裂解。由此在患者中可通过使用对LCT的自催化性裂解必要的毒素片段，达到针对LCT的有效免疫。文献A咖bel,F.M.etal,:"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(2003),JohnWileyandSons,Inc.Rupniketal.(2005)"CharacterizationofthecleavagesiteandftinctionofresultingcleavagefragmentsafterlimitedproteolysisofCVoWcA'"/wd砂d/etoxinB(TcdB)byhostcells."M歸i'o/151，199-208.Moosal.(2000)"PurificationandevaluationoflargeClostridia!cytotoxinsthatinhibitsmallGTPasesofRhoandRassubfamilies"MethEnzymol.325:114-125.Pfeiferetal,(2003)"CelluiarUptakeofClostridiumdifficiletoxinsB"丄Biol.Chem.278:44535-41.Raoetal.(1998)"Molecularandbiotechnologicalaspectsofmicrobialproteases"Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:597-635.Saltoetal.(1994)"InvitrocharacterizationofnonpeptideirreversibleinhibitorsofHIVproteases",J.Biol.Chem.269:10691-8.Tang(1971)"Specificandirreversibleinactivationofpepsinbysubstrate-HkeEpoxides",J.Biol.Chem.246:4510-17.21表1:在加入给定的磷酸肌醇下的TcdB,3的自催化性裂解。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表2:与TcdB腦3孵化后的CHO-细胞的细胞变圆(以％)-经EPNP或者未经EPNP-预处理稀释3小时后变圆的细胞(以％)TcdB-10463TcdB-10463+EPNPIO一3100%100%10"100%100%10-5100%50%10—6100%10%l(T10%<5%l(T8>5%<5%表3:TcdB的蛋白酶功能的催化中心的氨基酸序列AS1653至AS1678与毒素TcdA、TcsL和Tcnoc相对应的催化中心和蛋白质区域的比较毒素同族序列范围TcdB-104631653-Q丽IVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQ-1678TcdA-104631649-RNVVVEPIYNPDTGEDISTSL-DFSY-1675TcsL1654-QNLIVEPSYHLDDSGNISSTVINFSQ-1679丁cna1638-CNVIVSGSNKLNSEGDLADT-IDVLD-1663表4:与用多克隆抗血清预处理的TcdB温育后CHO-细胞的细胞变圆的开始时间(以h计)_制剂抗体滴度在…之后开始细胞变圆A1:1001.5hB1:15003hC1:75012-15hD1:5009-12hE1:1000>24h2权利要求1.用于预防或减轻LCT(＝大梭菌细胞毒素)中毒的药物，其特征在于，作为活性物质，含有至少一种效应剂，即LCT(大梭菌细胞毒素)的蛋白酶活性的抑制剂或激活剂。2.根据权利要求l的药物，其特征在于，所述活性物质是效应剂，即艰难梭菌毒素A(TcdA)和/或艰难梭菌毒素B(TcdB)和/或索氏梭菌致死毒素(TcsL)和/或诺氏梭菌a毒素(Tcnoc)的蛋白酶活性的抑制剂或激活剂。3.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是1，2-环氧-3-(对-硝基苯氧基)-丙烷(EPNP)。4.根据权利要求3的药物，其特征在于，所述激活剂是磷酸肌醇，特别是肌醇六磷酸(IP6)。5.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述效应剂是磷酸肌醇的竟争抑制性结构类似物，特别是与肌醇六磷酸(IP6)竟争。6.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述激活剂是类似IP6地促进LCT的(自催化性)蛋白酶活性，特别是促进TcdA和/或TcdB和/或TcsL和/或Tcncc的(自催化性)蛋白酶活性的物质。7.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述效应剂是适用于降低哺乳动物，特别是人类的肠腔内的磷酸肌醇浓度的化学物质。8.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述效应剂是适用于降低哺乳动物细胞内，特别是人类细胞内的磷酸肌醇浓度的化学物质o9.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与蛋白酶活性中心相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体，该活性中心根据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)在AS1500至AS1800的TcdB蛋白区域中。10.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1653至AS1678的TcdB蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。11.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的位于TcdB蛋白的氨基酸位置AS1665处的DXG基序相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。12.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcdA氨基酸序列号P16154(SwissProt/TrEMBL)的AS1651至AS1675的TcdA蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。13.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcdA氨基酸序列号P16154(SwissProt/TrEMBL)的位于TcdA蛋白的氨基酸位置AS1662处的DXG基序相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。14.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcsL氨基酸序列号Q46342(SwissProt/TrEMBL)的AS1654至AS1679的TcsL蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。15.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcsL氨基酸序列号Q46342(SwissProt/TrEMBL)的位于TcsL蛋白的氨基酸位置AS1666处的DXG基序相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。16.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据Tcnot氨基酸序列号Q46149(SwissProt/TrEMBL)的AS1641至AS1665的Tcnoc蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。17.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1400至AS2300的TcdB蛋白区域，或者与与此等同或同源的TcdA或TcsL或Tcnot的蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。18.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与根据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1517至AS2142的TcdB蛋白区域，或者与与此等同或同源的TcdA或TcsL或Tena的蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。19.根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与才艮据TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1517至AS1593或者AS1918至AS2142的TcdB蛋白区域，或者是与此等同或同源的TcdA或TcsL或Tenet的蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。20.用于预防或减轻大梭菌细胞毒素(LCT)中毒的药物，其特征在于，该药物(1)是适用于作为疫苗施用的，且(2)作为抗原性活性物质-(a)含有TcdB氨基酸序列号P18177(SwissProt/TrEMBL)的那些TcdB蛋白片段，至少包括位置1665上的DXG基序，优选氨基酸位置AS1653至AS1678的氨基酸序列，特别优选氨基酸位置AS1500至AS1800的氨基酸序列，-和/或(b)含有TcdA氨基酸序列号P16154(SwissProt/TrEMBL)的那些TcdA蛋白片段，至少包括1662位置处的DXG基序，优选氨基酸位置AS1651至AS1675的氨基酸序列，-和/或(c)含有TcsL氨基酸序列号Q46342(SwissProt/TrEMBL)的那些TcsL蛋白片段，至少包括1666位置处的DXG基序，优选氨基酸位置AS1654至AS1679的氨基酸序列，-和/或(d)含有Tcnoc氨基酸序列号Q46149(SwissProt/TrEMBL)的那些Tcnoc蛋白片段，至少包括氨基酸位置AS1641至AS1665的氨基酸序列。全文摘要用于预防或减轻大梭菌细胞毒素(LCT)中毒的药物，特别是艰难梭菌毒素A和B(TcdA和TcdB)，其特征在于，作为活性物质，至少含有一种效应剂，即LCT(大梭菌细胞毒素)自催化性蛋白酶活性的抑制剂或激活剂。文档编号A61K31/661GK101516359SQ200780035763公开日2009年8月26日申请日期2007年5月26日优先权日2006年8月2日发明者C·冯埃歇尔斯特雷伯,H·希尔德,J·雷尼克,M·鲁普尼克,S·藤泽申请人:美因茨约翰内斯古藤贝格大学