专利名称：包含合成佐剂的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物和疫苗组合物领域。更具体地，本文描述的实施 方案涉及药物和疫苗组合物，以及相关的预防和治疗方法，其中所述 组合物包括p比喃葡萄糖脂佐剂(glucopyranosyl lipid adjuvant, GLA)。
相关领域描述
高级生物体的免疫系统被表征为区分外源物质(或"非己，，物质)和 亲近的或"自身"组分，这使得外源物质引发免疫反应而"自身"组分被
其中在体液反应中由称为浆细胞的分化的B淋巴细胞产生抗原特异性 抗体，在细胞介导的反应中不同类型的T淋巴细胞作用通过多种机制 清除抗原。例如，能识别特异性抗原的CD4+辅助T细胞可以通过释 放诸如细胞因子的可溶性的介质募集免疫系统的其它细胞来作出反应 以参与免疫反应。同样，也 能"i只另'J 4争异'1"生#凡原的CD8+纟田月包毒T纟田月包 可以通过结合到携带抗原的细胞或颗粒并破坏或损伤所述细胞或颗粒 来作出反应。通常为诱导宿主理想的免疫反应，提供根据多种不同制 剂的某些疫苗，这在免疫学领域是已知的。
病毒、细菌或某些真核病原体的热灭活的或者活的减毒的传染性病原 体进行免疫；用能够指导遗传物质表达的无毒力转染原进行免疫，其 中所述遗传物质编码免疫反应所针对的一种或多种抗原；以及用包含来自特定病原体的分离的免疫原(诸如蛋白)的亚单位疫苗进行免疫，
以产生针对所述病原体的免疫。(参见，例如，Liu, 1998iVafMreMeAcMe 4(5 suppl.):515.)对于某些抗原，可有一种或多种类型的理想免疫，这 些方法中没有一种对所述免疫特别有效，包括疫苗的开发，所述疫苗 在免疫学上保护宿主抗人免疫缺陷病毒或其它传染性病原体、癌症、 自体免疫疾病或其它临床病症中是有效的。
长期认为肠细菌脂多糖(LPS)是免疫系统的有效刺激物，尽管它在 佐剂中的使用已经由于其毒性效应被缩减。LPS的无毒衍生物，单磷 酰月旨质 A (MPL)已被 Ribi 等(1986， Immunology and lmmunopharmacology of Bacterial Endotoxins (纟田菌内毒素的免疫学禾口 免疫药物学)，Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)描述，所述单磷酰脂质 A是通过从葡糖胺的还原端移除核心糖基团和磷酸产生的。
MPL的另一种去毒形式是从二糖骨架的3-位去除酰基链后得到， 其被称为3-0-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。它可以通过GB 2122204B中教导的方法来纯化和制备，GB 2122204B参考文献也/>开 了双磷酰脂质A和其3-0-脱酰基变体的制备。例如，已经以具有直径 小于0.2/mi的小粒度的乳剂的形式制备了 3D-MPL，且其制备方法在 WO 94/21292中被公开。包含单磷脂酰脂质A和表面活性剂的水制剂 已在WO9843670A2中被描述。
可以从细菌来源中纯化和加工欲被配制在佐剂组合物中的细菌脂 多糖来源的佐剂，或可选择地，它们可以是合成的。例如，在Ribi等， 1986(上述)中描述了纯化的单磷酰脂质A,在GB 2220211和U.S. Pat, No. 4,912,094中描述了衍生自沙门氏菌属(&/附0"^/"平)的3-0-脱酰 基单磷酰脂质A或3-0-脱酰基双磷酰脂质A。 3D-MPL和(S(l-6)二糖 葡糖胺以及其它纯化的和合成的脂多糖已被描述(WO 98/01139; U.S. Pat. No. 6,005,099和EP 0 729 473 Bl , Hilgers et al.， 1986 /杠 j〃erg_y /mwtmo/" 79(4):392陽6; Hilgers et at" 1987， /mmimo《ogy, 60(1); 141-6;和EP 0 549 074 Bl)。 3D-MPL和来自智利急荚树(gw/〃q/a Sa; o加n'a Mo/^a)树皮的皂香佐剂的组合物在EP 0 761 231 B中被描 述。WO 95/17210公开了佐剂乳化系统，其基于与免疫刺激物QS21
10配制的鲨烯、O!-生育酚和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(TWEENTM-80),
任选地包括3D-MPL。尽管这种组合物易得到，但使用来自天然产物 的佐剂伴随着高生产成本、批次之间的不一致、大规模生产的困难， 以及杂质在任何给定的制剂的组合构成中存在的不确定性。
很明显，对改良的疫苗存在需要，特别是对有益地包含高纯度、 化学定义的佐剂组分的疫苗存在需要，所述疫苗显示了不同批次之间 的 一 致性，可以被以工业规模有效制备而不引入不必要的或结构不确 定的污染物。本发明提供了用于这种疫苗的组合物和方法，并提供了 其它相关的优势。
发明简述
本发明在其几个实施方案中涉及组合物和方法，所述组合物和方 法有利地使用了合成吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)作为佐剂和疫苗组分。 依照本文描述的本发明的一个实施方案，提供了包含抗原和吡喃葡萄 糖脂佐剂CGLA)的疫苗组合物。
在另一个实施方案中，提供了包含(a)抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂 (GLA)和钟样受体(toll-like receptor, TLR)激动剂的疫苗组合物，其中在 某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利 什曼虫(丄e/Wmam'a)同源体以及至少 一种丙肝抗原。在另一个实施方案 中，提供了包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和选自皂苷和皂苷类 似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提供了 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和载体的疫苗组合物，所述载体 包含油和ISCOMATRIXTM的至少一种。在另一个实施方案中，提供了 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及下述的一种或多种的疫苗组 合物(i)至少一种辅佐剂，(ii)至少一种TLR激动剂，(iii)至少一种咪 唑并喹啉(imidazoquinoline)免疫反应调节剂，以及(iv)至少 一种双茎环 免疫调节剂(dSLIM)。在某些另外的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在 时选自明矾、植物石威和去垢剂，其中所述植物石威选自番茄素，且所述 去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85 (Span 85)和硬脂酰酪氨酸(Stearyl tyrosine); (ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、 聚1:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LelF) 的利什曼虫同源体以及至少 一种丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并喹啉免 疫反应调节剂当存在时选自雷西莫特(resiquimod) (R848)、咪喹莫特 (imiquimod)禾口噶德莫特(gardiquimod)。在另一个实施方案中，4是供了 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)、以及辅佐剂和药学上可接受载 体中至少一种的疫苗组合物，其中所述辅佐剂选自细胞因子、去垢 剂和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，且所述药学上可接受的载体包 含选自如下的载体磷酸钓、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体、 新体(novasome)、非离子表面活性剂嚢泡(noisome)和微粒。在特别的 实施方案中，其中使用了脂质体或类似的载体，GLA位于脂质体的层 状结构，或被包裹。在另一个特别的实施方案中，其中使用了微粒， 所述微粒是基于或包含聚合物脂肪脂质(fat lipids)的 一种。
在某些另外的实施方案中，细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-a和IFN々，嵌段聚合物或生物可降解聚合物选自普流罗 尼克L121 (PluronicL121)、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C, 去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。
在另一个实施方案中，提供了包含至一种重组表达构建体和吡喃 葡萄糖脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编 码抗原的核酸序列的启动子。在一个实施方案中，所述重组表达构建 体存在于病毒载体，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病 毒、1|>相关病毒、疱渗病毒、十曼病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒 中。
依照上述所有实施方案中的某些，GLA没有3'-脱-0-酰化。依照 上述所有实施方案中的某些，GLA包含(i)双葡糖胺骨架，其具有通过 非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣 之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii)连接于非 还原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个的 脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基， 其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包
12含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中 一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯
键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。
依照包括TLR激动剂的上述所有实施方案中的某些，TLR激动剂 能够通过与选自TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9中的至少一种TLR相互作用来递送生物信号。在某些 另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚1:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利 什曼虫同源体以及至少一种丙肝抗原。在特别的实施方案中，其中使 用了 TLR-7和/或TLR-8激动剂，TLR-7和/或TLR-8激动剂祐:i秀陷于 嚢泡中。
依照上述所有实施方案中的某些，GLA具有下式
其中R1、 R3、 115和R6是Cn-C2o烃基；且R2和R4是C12-C20烃基。 依照上述所有实施方案中的某些，疫苗组合物能够在宿主体内引 发免疫反应。在某些另外的实施方案中，免疫反应是对抗原特异的。 依照上述所有实施方案中的某些，所述抗原能够在宿主体内引发免疫 反应，所述免疫反应选自体液反应和细胞介导的反应。依照上述所有 实施方案中的某些，疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫反 应，所述反应选自Th1-型T淋巴细胞反应、Th2-型T淋巴细胞反应、 细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应、抗体反应、细胞因子反应、淋巴因子 反应、趋化因子反应以及炎症反应。依照上述所有实施方案中的某些， 疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫反应，所述反应选自(a)一种或多种细胞因子的产生，其中所述细胞因子选自干扰素-7
(IFN-力、肺瘤坏死因子-a (TNF-a); (b)—种或多种白介素的产生，其 中所述白介素选自IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL陽IO、 IL-12、 IL-13、 IL隱16、 IL-18和IL陽23; (c)一种或多种趋化因子的产生，其中 所述趋化因子选自MIP-la、 MIP-1/3、 RANTES、 CCL4和CCL5;以 及(d)选自记忆性T细胞反应、记忆性B细胞反应、效应T细胞反应、 细胞毒T细胞反应以及效应B细胞反应的淋巴细胞反应。
依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自选自细菌、病毒和真 菌的至少一种传染性病原体。
在某些另外的实施方案中，细菌是放线细菌(Actinobacterium)，且 仍在某些另外的实施方案中，所述放线细菌是分支杆菌 (mycobacterium)。在某些其它相关的实施方案中，所述分支杆菌选自 肺结核分支杆菌(M. ^Z^n^/os/s)和麻风分支杆菌(M. /印rae)。在某些其 它的实施方案中，所述细菌选自沙门氏菌OSfl/mowe〃a)、、淋J求菌 (A^^en'fl)、螺力走体(5orre/!'a)、 衣原体(C/i/flmy^a)和博德特氏菌
在某些其它相关的实施方案中，病毒选自单纯疱渗病毒、人类免 疫缺陷病毒(HIV)、 猫免疫缺陷病毒(FIV)、 巨细月包病毒 (cytomegalovirus)、 7jc痘-带状疱渗病毒(Varicella Zoster Virus)、肝炎病 毒、爱泼斯坦-巴尔氏病毒(Epstein Barr Virus, EBV)、呼吸道合胞病毒、 人乳头瘤病毒(HPV)和巨细胞病毒。依照上述所有实施方案中的某些， 抗原来自人类免疫缺陷病毒，其在某些另外的实施方案中选自HIV-1 和HIV-2。
在某些其它相关的实施方案中，真菌选自曲霉菌(As/ ergz7/w)、芽 生菌(5/aWomyc&s1)、王求孑包菌(Cocc/^'o^/es)牙口月申孑包子菌(尸we"moc;AS"s)。 在某些其它相关的实施方案中，所述真菌是酵母，其在某些另外相关 的实施方案是假丝酵母(OwAWfl)，其中仍在某些另外的实施方案中， 假丝酵母选自白色念珠菌(C.a化z'cfl"力、光滑念珠菌(Cg/Wrato)、克柔 念珠菌(C.A:n^e")、 葡萄牙念珠菌(C. /ww7am'ae)、 热带念珠菌 (6*.加/>/(:<2//力、近平滑念珠菌(C./ ara戸7c^z-力。依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自寄生虫，所述寄生虫 在某些另外的实施方案中是原生动物，其在某些另外的实施方案中是
疟原虫(尸/^moAwm)，其仍在某些另外的实施方案中选自恶性症原虫(尸. /a/cZ/ fln/m)、间日症原虫(尸Wva;c)、三日症原虫ma/fln力e)和卵圆痴 原虫(尸力va/e)。在某些其它实施方案中，寄生虫选自棘阿米巴 (Jca"//zamoe6a0、溶组织内阿米巴(五"tomoe6a /^to/_y"ca)、管圓线虫 (y^g/c^&owgj/iw)、 曼氏血吸虫(Sc/n'Wosoma mawsom'/) 、 i矣及血吸虫 (5"c力z、toso附fl Aaemato6/w附)、日本血吸虫(Sc/n'Wosoma ya/ om'cw附)、湄 公河血吸虫(ScA^toso附a weA:owg0、 隐孑包子虫(C>7/>toy/7onWww)、 钩口 线虫(v4wcy/oWoma)、溶组织内阿米巴(五wtomoe6a /n'Wo(y"cfl)、结肠内阿 米巴(五wtowoe6a co")、迪斯帕内阿米巴(五wtomoeZ7a fifopflr)、 p合特曼 内阿米巴(五"to附oe6a Aa/^wawm')、 波氏内阿米巴(五wtomoe6fl; o/ech)、 班氏吴策线虫(WwcAeren'a 6a"CTq/H)、贾第虫(G^W&)、利什曼虫 (Z^、/ wam'a)、虫需形 <主肠蛲虫(五WeroZ^W51 ve/7m'cw/an、)、人虫回虫(^scan's /wm6n'co/cfes)、 毛首鞭形线虫(7Wc/mWs fn'c/mn'a)、 美洲板口线虫 (jVecator amen'ca"m力、十二才旨肠钩虫(y4wc_y/asto/wa 6 wocfewa/e)、 马来丝 虫(5n/g7'(2 ma/a少z〕、》走盘尾丝虫(O cZzocen:a vo/viz/w)、 麦i也那龙纟戋虫 (Z)racawct//1^ mec /wew57's)、》走毛线虫(7WcA/we〃a 5^>"/^)、 粪类圆线虫 (;SYrowgy/oW&s Wercora/^)、 中华后睾吸虫57'we似/"、 并殖 吸虫'属(尸aragowz'mws sp)、 肝片形p及虫(Fascz'o/fl /^/ a"cfl)、 姜片吸虫 (尸flsa'o/a magwa)、 大片吸虫(Fasdo/a g7'gawZ/ca)、 牛肉i"条虫 sagi"a/a)和猪肉纟条虫(Zlaem'a so/Zmw)。
依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自至少一种癌细胞。在 某些另外的实施方案中，所述癌细胞源自原发性实体肿瘤，且在某些 其它另外的实施方案中，所述癌细胞源自为转移性或继发性实体肿瘤 的癌，以及在某些其它的实施方案中，所述癌细胞源自为循环肿瘤或 腹水肿瘤的癌。在某些相关的实施方案中，所述癌细胞源自选自下述 的癌宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、 脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉 瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、
15尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、 磷状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、 乳头状腺癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管肺癌(bronchogenic carcinoma )、 肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌和 肾母细胞瘤(Wilms，tumor)。在某些其它相关的实施方案中，癌细胞源 自选自下述的癌睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、 神经胶质瘤、星细胞瘤、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、颅咽管瘤、 室管膜瘤(ependymoma)、卡〉果体瘤、血管母细胞瘤(hemangioblastoma)、 听神经瘤、少突胶质细胞瘤(oliodendroglioma)、脑膜瘤、黑素瘤、成 神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦 尔登其斤净争4仑巨王求蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)禾口重链 病。
依照上述所有实施方案中的某些，抗原来自与自身免疫疾病相关 的至少一个抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫 学上交叉反应。在某些另外的实施方案中，与自身免疫疾病相关的抗 原决定部位、生物分子、细月包或组织选自snRNP (当所述自身免疫疾 病是系统性红斑狼疮时)，曱状腺球蛋白、促曱状腺素受体和曱状腺上 皮细胞中的至少一种(当所述自身免疫疾病是曱状腺机能亢进(Graves， disease)时)，血小板(当所述自身免疫疾病是血小板减少性紫癜时)，天 疱渗4元原、桥库立芯#唐蛋白-3 (desmoglein-3)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)、 包斑蛋白(envoplakin)和大疱性类天疱疮抗原1中的至少一种(当所述 自身免疫疾病是天疱疮时)，髓磷脂碱性蛋白(当所述自身免疫疾病是 多发性硬化时)，胰岛j3细胞(当所述自身免疫疾病是1型糖尿病时)以 及乙酰胆碱受体(当所述自身免疫疾病是重症肌无力(myasthenia gravis) 时)。
在另 一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫反应的药物组合物， 其包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。 在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫反应的药物组合物，其 包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体或赋形 剂。在另一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫反应的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)、钟样受体(TLR)激动剂以及药 学上可接受的载体或赋形剂。在另外的实施方案中，TLR激动剂选自 脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长 和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体以及至少 一种丙肝抗原。在另 一个实施方案中，提供了诱导或增强免疫反应的药物组合物，其包含 抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)、选自皂苷和皂苷类似物的至少一种 辅佐剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，提 供了诱导或增强免疫反应的药物组合物，其包含抗原、吡喃葡萄糖脂 佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体，所述载体包含油和 ISCOMATRIXTM中的至少一种。在另一个实施方案中，提供了诱导或 增强免疫反应的药物组合物，其包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖脂佐剂 (GLA)， (c)下述中的一种或多种(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR 激动剂、(iii)至少 一种咪唑并喹啉免疫反应调节剂和(iv)至少 一种双茎 环免疫调节剂(dSLIM)，以及(d)药学上可接受的载体或赋形剂。在某 些另外的实施方案中，(i)辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂， 其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司 盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、 聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF) 的利什曼虫同源体和至少 一种丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并p奎啉免疫 反应调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。
在另 一 个实施方案中，提供了诱导或增强免疫反应的药物组合物， 其包含抗原、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及至少一种辅佐剂和药学上 可接受的载体，其中所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物 可降解的聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自 磷酸钩、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在 某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流 罗尼克⑧L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C,且所述去垢 剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含至少一种重组表达构建体、吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体或赋 形剂，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。 在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体，该 构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱渗 病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。
依照上述药物组合物的某些另外的实施方案，抗原和GLA彼此接 触；而依照上述药物组合物的某些其它另外的实施方案，抗原和GLA 彼此并不接触。在某些另外的实施方案中，其中所述抗原和GLA彼此 不接触，它们存在与分离的容器内。在其它实施方案中，提供了诱导 或增强免疫反应的药物组合物，其包含含有抗原和第 一 药学上可接受 的载体或赋形剂的第 一结合物；以及含有吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和 第二药学上可接受的载体或赋形剂的第二结合物，其中所述抗原和
GLA彼此并不接触。在另外的实施方案中，所述抗原和GLA存在于 分离的容器内。在某些相关的实施方案中，所述第一药学上可接受的 载体或赋形剂不同于所述第二药学上可接受的载体或赋形剂。在其它 相关的实施方案中，所述第一药学上可接受的载体或赋形剂与所述第 二药学上可接受的载体或赋形剂并无不同。
在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体传染性疾病的方法， 所述个体具有或疑似有患传染性疾病的危险，所述方法包括给予所述 个体包含(a)抗原和(b)吡喃糖脂佐剂(GL.A)的疫苗组合物，其中所述抗 原来自至少一种与所述传染性疾病相关的传染性病原体，或与其在免 疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述传染性疾病。在另一个实施 方案中，提供了治疗或预防个体传染性疾病的方法，所述个体具有或 疑似有患传染性疾病的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原、(b) 吡喃糖脂佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物，其中所 述抗原来自至少一种与所述传染性疾病相关的传染性病原体，或与其 在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述传染性疾病。在另外的 实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼原 虫同源体以及至少一种丙肝抗原。在另一个实施方案中，提供了治疗
18和预防个体传染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患传染性疾病 的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡糖脂佐剂 (GLA)和(c)选自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物， 其中所述抗原来自与传染性疾病相关的至少一种传染性病原体，或者 与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述传染性疾病。在另 一个实施方案中，提供了治疗或预防个体传染性疾病的方法，所述个 体具有或疑似有患传染性疾病的危险，所述方法包括给予个体包含(a) 抗原、(b)吡喃葡糖脂佐剂(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIXtm中的 至少一种的载体的疫苗组合物，其中所述抗原来自与传染性疾病相关 的至少一种传染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治 疗或预防所述传染性疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防 个体中传染性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患传染性疾病的危 险，所述方法包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b) 吡喃葡糖脂佐剂(GLA),以及(c)下述中的一种或多种(i)至少一种辅 佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫反应调 节剂和(iv)至少 一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，其中所述抗原来自与 传染性疾病相关的至少一种传染性病原体，或者与其在免疫学上交叉 反应，并由此治疗或预防所述传染性疾病。在某些另外的实施方案中， (i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物磁< 是番茄素，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂 酰酪氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利 什曼虫同源体和至少 一种丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并查啉免疫反应 调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。
在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体传染性疾病的方法， 所述个体具有或疑似有患传染性疾病的危险，所述方法包括给予所述 个体包含(a)抗原、(b)吡喃糖脂佐剂(GLA)和(c)辅佐剂和药学上可接受 的载体中的至少一种的疫苗组合物，其中所述辅佐剂选自细胞因子、 嵌段共聚物或生物可降解聚合物和去垢剂，且所述药学上可接受的载 体包括选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体和微粒的载体，其中所述抗原来自与所述传染性疾病相关的至少 一种传染性病 原体或与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述传染性疾病。
在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 NF-a和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流 罗尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C，并且所述去垢 剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。
在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体传染性疾病的方法， 所述个体具有或疑似有患所述转染性疾病的危险，所述方法包括给予 所述个体包含(a)至少一种重组表达栽体和(b)p比喃葡萄糖脂佐剂(GLA) 的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的 启动子，其中所述抗原来自与所述传染性疾病相关的至少一种传染性 病原体，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述传染 性疾病。在另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体， 其在某些另外的实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱渗病 毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒。依照与上述方法相关的 某些实施方案，所述抗原来自选自细菌、病毒和真菌的至少一种传染 性病原体。
在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方 法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给 予所述个体包含(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的疫苗组合物， 其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生 物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或 预防所述自身免疫疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个 体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危 险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂 (GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自与 自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织， 或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在 某些另外的实施方案中，所述TL R激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I: C 、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体以及至少一种丙肝抗原。在另一个实施方案中，提供了 治疗和预防个体自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身
免疫疾病的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡 萄糖脂佐剂(GLA)和(c)至少 一 种选自皂苷和皂苷类似物的辅佐剂的疫 苗组合物，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决 定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并 由此治疗或预防自身免疫疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或 预防个体中自身免疫疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫 疾病的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐 齐寸(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIXtm中的至少一种的载体的疫苗 组合物，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定 部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由 此治疗或预防自身免疫疾病。在另一个实施方案中，提供了治疗或预 防个体免疫性疾病的方法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的 危险，所述方法包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原， (b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)， (c)下述中的一种或多种(i)至少一种辅 佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并查啉免疫反应调 节剂、(iv)至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，其中所述抗原来自与 自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织， 或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防自身免疫疾病。在 某些另外的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和 去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇 酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂 多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和 起始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体和至少一种丙肝抗原；以及(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反应调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹 莫特和嘎德莫特。
在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方 法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给 予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少一种，其中所 述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物，以及去 垢剂，并且所述药学上可接受的载体包括选自磷酸4丐、水包油型乳剂、 油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体，其中所述抗原来自与自身免 疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者 与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述自身免疫疾病。在 另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNFa和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克 L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C,且所述去祐剂选自急 苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。
在另一个实施方案中，提供了治疗或预防个体自身免疫疾病的方 法，所述个体具有或疑似有患自身免疫疾病的危险，所述方法包括给 予个体包含(a)至少一种重组表达构建体和(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA) 的疫苗组合物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的 启动子，其中所述抗原来自与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定 部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由 此治疗或预防自身免疫疾病。在另外的实施方案中，所述重组表达构 建体存在于病毒载体，该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺 病毒、A泉^目关病毒、疱渗病毒、'f曼病毒、痘病毒和逆4争录酶病毒的病 毒中。、术 、^, 、 、 ,,, 、— ？、 、术
自身免疫疾病选自l型糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化、系统性 红斑狼疮、重症肌无力、克罗恩氏病(Crohn's disease)、曱状腺机能尤 进、血小板减少性紫癜和天疱渗。在上述与治疗或预防自身免疫疾病 相关的的某些其它实施方案中，与自身免疫疾病相关的抗原决定部位、 生物分子、细胞或组织选自snRNP (当所述自身免疫疾病是系统性红 斑狼疮时)，曱状腺球蛋白、促甲状腺素受体和曱状腺上皮细胞中的至 少一种(当所述自身免疫疾病是曱状腺机能亢进时)，血小板(当所述自 身免疫疾病是血小板减少性紫癜时)，天疱渗抗原、桥粒芯糖蛋白-3、 桥粒斑蛋白、包斑蛋白和大疱性类天疱痴抗原1中的至少一种(当所述自身免疫疾病是天疱渗时)，髓磷脂碱性蛋白(当所述自身免疫疾病是 多发性硬化时)，胰岛/3纟W胞(当所述自身免疫疾病是1型糖尿病时)以
及乙酰胆^5威受体(当所述自身免疫疾病是重症M^无力时)。
依照其它实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个
体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体包含(a)抗原和 (b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，其中所述抗原来自与癌症 相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在 免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。依照其它的实施方 案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌 症的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂 佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组合物，其中所述抗原来 自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或 者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。在某些另 外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫 同源体以及至少一种丙肝抗原。依照其它的实施方案，提供了治疗和 预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方 法包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和(c)选自皂 苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物，其中所述抗原来自 与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者 与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。
依照其他的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所述 个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予所述个体包含(a) 抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIXtm中 的至少一种的载体的疫苗组合物，其中所述抗原来自与癌症相关的至 少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上 交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。依照其它的实施方案，提供 了治疗或预防个体癌症的方法，所述个体具有或疑似有患癌症的危险， 所述方法包括给予所述个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b) 吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)，以及(c)下述中的一种或多种(i)至少一种
23辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并p查啉免疫反应 调节剂和(iv)至少 一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)，其中所述抗原来自 与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者 与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌症。在某些另外 的实施方案中，(i)所述辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂， 其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司 盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽 聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子 4a (LeIF)的利什曼虫同源体和至少 一种丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并 喹啉免疫反应调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德 莫特。依照其它的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法，所 述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体疫苗组合
物，所述组合物包含(a)抗原、(b户比喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐 剂和药学上可接受的载体中的至少一种，其中所述辅佐剂选自细胞因 子、嵌段共聚物或生物可降解的聚合物以及去垢剂，并且所述药学上 可接受的载体包括选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质 体以及微粒的载体，其中所述抗原来自与癌症相关的至少 一种抗原决 定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并 由此治疗或预防所述癌症。在另外的实施方案中，所述细胞因子选自 GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNFa和IFN々，所述嵌段共聚物或生 物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG 和聚I:C，且所述去垢剂选自皂芬、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰 酪氨酸。依照其它的实施方案，提供了治疗或预防个体癌症的方法， 所述个体具有或疑似有患癌症的危险，所述方法包括给予个体包含(a) 至少一种重组表达构建体和(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的疫苗组合 物，所述构建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子，其 中所述抗原来自与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细 胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此治疗或预防所述癌 症。在另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体中， 该构建体在某些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、慢病毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。
在上述治疗或预防癌症的方法的某些另外的实施方案中，抗原来 自至少一种癌细胞，所述癌细胞在某些另外的实施方案中源自原发性 实体肺瘤，且其在某些其它另外的实施方案中，源自为转移性或继发 性实体肺瘤的癌，以及在某些其它另外的实施方案中，源自为循环肿 瘤或腹水肺瘤的癌。在某些实施方案中，所述癌细胞源自选自下述的 癌宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂 肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、 淋巴管肉瘤、腹膜假黏液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、 尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、磷状上皮细 胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺 癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、 绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌和肾母细胞瘤。在某些其它的实施
方案中，癌细胞源自选自下述的癌睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、
膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、 室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、 脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。
依照上述治疗或预防传染性疾病或自身免疫疾病或癌症的方法的
任一种的某些另外实施方案，给药步骤进行一次；而在这些方法的某 些其它另外实施方案中，给药步骤至少进行两次；且在某些其它另外 的实施方案中，给药步骤至少进行三次；在某些其它另外的实施方案 中，给药步骤进行四次或更多次。依照上述治疗或预防传染性疾病或
自身免疫疾病或癌症的方法中的任一种的某些另外的实施方案，在给 药步骤前，个体用引发剂预处理，所述引发剂选自细菌提取物、活病 毒疫苗、包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子的至少 一种 重组表达构建体和包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子的 病毒载体。在另外的实施方案中，所述细菌提取物来自卡介菌(Bacillus Calmet-Guerin, BCG)。
在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特
25异性免疫反应的方法，其包括给予个体包含(a)抗原和(b)他喃葡萄糖脂 佐剂(GLA)的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提供了引发或增强 个体体内期望的抗原特异性免疫反应的方法，其包括给予个体包含(a) 抗原、(b)卩比喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和(c)钟样受体(TLR)激动剂的疫苗组 合物。在某些另外的实施方案中，TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、 聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF) 的利什曼虫同源体以及至少一种丙肝抗原。在另一个实施方案中，提 供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫反应的方法，其包括 给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和(c)选自皂苷和皂 苷类似物的至少一种辅佐剂的疫苗组合物。在另一个实施方案中，提 供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫反应的方法，其包括 给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)包含油和 ISCOMATRIXtm中的至少 一种的载体的疫苗組合物。在另 一个实施方 案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫反应的方法， 其包括给予个体疫苗组合物，所述组合物包含(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖 脂佐剂(GLA)以及(c)下述中的一种或多种(i)至少一种辅佐剂、(ii)至 少一种TLR激动剂、(iii)至少一种。米唑并查啉免疫反应调节剂、(iv) 至少一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。在某些另外的实施方案中，所述 辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番 茄素，且所述去垢剂选自皂香、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪 氨酸；(ii)所述TLR激动剂当存在时选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫 同源体和至少 一种丙肝抗原；以及(iii)所述咪唑并喹啉免疫反应调节剂 当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。
在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特 异性免疫反应的方法，其包括给予个体包含(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂 佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可接受的载体中的至少 一种的疫苗 组合物，其中所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解 聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包括选自磷酸钙、 水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-ce 和IFN-7，所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C,且所述去垢剂选自急苦、聚 山梨醇酯80、司盘85和硬脂酖酪氨酸。
在另一个实施方案中，提供了引发或增强个体体内期望的抗原特 异性的免疫反应的方法，其包括给予个体包含(a)至少一种重组表达构 建体和(b户比喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的疫苗组合物，所述构建体包含可 操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的实施方案中， 所述重组表达构建体存在于病毒载体中，该构建体在某些另外实施方 案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、慢病毒、痘病毒和 逆转录酶病毒的病毒中。
在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性反应的方法的某些 实施方案中，GLA没有被3'-脱-0-酰化。在上述引发或增强个体体内 期望的抗原特异性反应的方法的某些其它的实施方案中，GLA包含 (i)双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的l位氨基己醣和还 原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的 还原末端葡糖胺；(ii)连接于非还原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接 于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还 原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基 链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端 葡糖胺的3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接 的十四酰链。在某些相关的另外实施方案中，TLR激动剂当存在时能 够通过与选自TLR-2、 TLR匿3、 TLR誦4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR画7、 TLR-8 和TLR-9的至少一种TLR相互作用来递送生物信号。在某些另外的实 施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、 鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体以 及至少一种丙肝抗原。
在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性反应的方法的某些 另外的实施方案中，GLA具有下式
27其中
R1、 R3、尺5和R6是Cu-C2。烃基；且
R2和R4是C,2-C2。烃基。
在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异性反应的方法的某些 另外的实施方案中，疫苗组合物能够在宿主体内引发免疫反应。在某 些另外的实施方案中，免疫反应对所述抗原是特异的。在上述引发或 增强个体体内期望的抗原特异性反应的方法的某些另外的实施方案 中，所述抗原能够在宿主体内引发免疫反应，所述免疫反应选自体液 反应或细胞介导的反应。在上述引发或增强个体体内期望的抗原特异 性反应的方法的某些另外的实施方案中，疫苗组合物能够在宿主体内 引发至少一种免疫反应，所述反应选自Th1-型T淋巴细胞反应、TH2-型T淋巴细胞反应、细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应、抗体反应、细胞 因子反应、淋巴因子反应、趋化因子反应以及炎症反应。在上述引发 或增强个体体内期望的抗原特异性反应的方法的某些另外的实施方案 中，疫苗组合物能够在宿主体内引发至少一种免疫反应，所述反应选 自(a)—种或多种细胞因子的产生，其中所述细胞因子选自千扰素-7 (IFN-力、肺瘤坏死因子-a(TNF-a); (b)—种或多种白介素的产生，其中 所述白介素选自IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL-IO、 IL-12、 IL陽13、 IL-16、 IL-18和IL-23; (c)—种或多种趋化因子的产生，其中 所述趋化因子选自MIP-la、 MIP-1 /3、 RANTES、 CCL4和CCL5;以
28及(d)选自记忆性T细胞反应、记忆性B细胞反应、效应T细胞反应、 细胞毒T细胞反应以及效应B细胞反应的淋巴细胞反应。
依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包 括将(a)抗原和(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)混合。依照某些其它的实施 方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原、(b)吡喃葡萄 糖脂佐剂(GLA)以及(c)钟样受体(TLR)激动剂混合。在某些其它的实施 方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、 鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LelF)的利什曼虫同源体以 及至少一种丙肝抗原。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组 合物的方法，其包括将(a)抗原、(b)他喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)选 自皂苷和皂苷类似物的至少一种辅佐剂混合。依照某些其它的实施方 案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包括将(a)抗原、(b户比喃葡萄糖 脂佐剂(GLA)以及(c)包含油和ISCOMATRIX 中的至少 一种的载体混 合。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包 括将(a)抗原，(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)下述中的一种或多种 混合(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、(iii)至少一种咪 唑并全啉免疫反应调节剂和(iv)至少 一种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。 在某些另外的实施方案中，(i)辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和去 垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇 酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激动剂当存在时选自脂多糖、 肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因 子4a (LeIF)的利什曼虫同源体和至少一种丙肝抗原；以及(iii)咪唑并 喹啉免疫反应调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德 莫特。依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其 包括将(a)抗原、(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及(c)辅佐剂和药学上可 接受的载体中的至少一种混合，其中所述辅佐剂选自细胞因子、嵌 段共聚物或生物可降解聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的 载体包含选自磷酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微 粒的载体。在某些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-ce和IFN-7，所述嵌,史共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C， 且所述去垢剂选自皂芬、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。
依照某些其它的实施方案，提供了制备疫苗组合物的方法，其包 括将(a)至少一种重组表达构建体和(b)p比喃葡萄糖脂佐剂混合，所述构 建体包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的 实施方案中，所述重组表达构建体存在于病毒载体中，该构建体在某 些另外实施方案中存在于选自腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、慢病 毒、痘病毒和逆转录酶病毒的病毒中。在某些实施方案中，GLA没有 3'-脱-0-酰化。在某些实施方案中，GLA包含(i)双葡糖胺骨架，其 具有通过非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位 氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii) 连接于非还原末端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至 多6个的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的 3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨 基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链， 以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包 含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。在某些实 施方案中，TLR激动剂能够通过与选自TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9的至少一种TLR相互作用来递送生 物信号。在某些另外的实施方案中，所述TLR激动剂选自脂多糖、肽 聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子 4a (LeIF)的利什曼虫同源体以及至少 一种丙肝抗原。
依照上述制备疫苗组合物的方法的某些实施方案，GLA具有下
式
30其巾
R1、 R3、 R5和R6是Cn-C2o烃基；且
R2和R4是C『C2。烃基。
在某些另外的实施方案中，混合步骤包括乳化，且在某些其它另 外的实施方案中，混合步骤包括形成颗粒，所述颗粒在某些另外的实 施方案中包括微粒。在某些其它另外的实施方案中，混合步骤包括形 成沉淀物，所述沉淀物包含全部或部分抗原以及全部或部分GLA。
在某些其它的实施方案中，提供了免疫佐剂药物组合物，其包含 吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及药学上可接受的载体或赋形剂。在某些 其它的实施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及钟样受 体(TLR)激动剂的免疫佐剂组合物。在某些另外的实施方案钟，TLR 激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核 核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体以及至少一种丙肝 抗原。在某些其它的实施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA) 以及选自急苷和急普类似物的至少 一种辅佐剂的免疫佐剂组合物。在 某些其它的实施方案中，提供了免疫佐剂药物组合物，其包含吡喃葡 萄糖脂佐剂(GLA)以及包含油和免疫刺激复合物基质TM (ISCOMATRIXtm)中的至少一种的药学上可接受的载体。在某些其它 的实施方案中，提供了免疫佐剂组合物，其包含(a)吡喃葡萄糖脂佐剂 (GLA)，以及(b)下述中的一种或多种(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一 种TLR激动剂、(iii)至少一种咪唑并喹啉免疫反应调节剂和(iv)至少一 种双茎环免疫调节剂(dSLIM)。
在某些另外的实施方案中，(i)辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱 和去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨 醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii)TLR激动剂当存在时选自脂多 糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起 始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体和至少一种丙肝抗原；以及(iii)咪 唑并喹啉免疫反应调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和 嘎德莫特。在某些其它的实施方案中，提供了包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA) 以及辅佐剂和药学上可接受的载体的至少 一种的免疫佐剂组合物，其
中所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物可降解聚合物以及
去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自磷酸钙、水包油型乳 剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某些另外的实施方案
中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL-2、 IL-7、 IL-12、 TNF-a和IFN-y， 所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼克L121 、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C，且所述去垢剂选自皂苦、聚 山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。
在某些其它实施方案中，提供了改变宿主免疫反应的方法，其包 括给予宿主包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和药学上可接受的载体或 赋形剂的免疫佐剂药物组合物，并由此改变宿主的免疫反应。在某些 其它的实施方案中，提供了改变宿主免疫反应的方法，其包括给予 宿主包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和(b)钟样受体(TLR)激动剂的免疫 佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫反应。在某些另外的实施方案中， TLR激动剂选自脂多糖、肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、 真核核糖体延长和起始因子4a (LeIF)的利什曼虫同源体和至少一种丙 肝抗原。在其它另外的实施方案中，提供了改变宿主免疫反应的方法， 其包括给予宿主包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及选自皂苷和皂苷 类似物的至少 一 种辅佐剂的免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫 反应。在某些其它的实施方案中，提供了改变宿主免疫反应的方法， 其包括给予宿主包含吡喃葡萄糖脂佐剂GLA)以及药学上可接受的 载体的免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫反应，所述载体包含 油和ISCOMATRIXTM中的至少一种。在某些其它的实施方案中，提供 了改变宿主免疫反应的方法，其包括给予宿主免疫佐剂组合物，并 由此改变宿主的免疫反应，所述组合物包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA) 和下述的一种或多种(i)至少一种辅佐剂、(ii)至少一种TLR激动剂、 (iii)至少 一种咪唑并喹啉免疫反应调节剂和(iv)至少 一种双茎环免疫调 节剂(dSLIM)。
在某些其它的实施方案中，辅佐剂当存在时选自明矾、植物碱和
32去垢剂，其中所述植物碱是番茄素，所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；TLR激动剂当存在时选自脂多糖、 肽聚糖、聚I:C、 CpG、 3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因 子4a(LelF)的利什曼虫同源体和至少一种丙肝抗原；以及咪唑并查啉 免疫反应调节剂当存在时选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特。 在某些其它的实施方案中，提供了改变宿主体内免疫反应的方法， 其包括给予宿主免疫佐剂组合物，并由此改变宿主的免疫反应，所述 组合物包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)以及辅佐剂和药学上可接受的载 体的至少一种，其中所述辅佐剂选自细胞因子、嵌段共聚物或生物 可降解聚合物以及去垢剂，并且所述药学上可接受的载体包含选自磷 酸钙、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体以及微粒的载体。在某 些另外的实施方案中，所述细胞因子选自GM-CSF、 IL誦2、 IL隱7、 IL-12、 TNF-ce和IFN-7,所述嵌段共聚物或生物可降解聚合物选自普流罗尼 克L121、 CRL1005、 PLGA、 PLA、 PLG和聚I:C，且所述去垢剂选自 皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸。步骤进行一次、两次、三次、四次或更多次。在上述改变宿主免疫反 应的某些其它另外的实施方案中，改变宿主免疫反应包括诱导或增强 免疫反应。在上述改变宿主免疫反应的某些其它另外的实施方案中， 改变宿主的免疫反应包括下调免疫反应。在上述改变宿主反应的某些 另外的实施方案中，所述方法还包括同时或以任一顺序连续地给予抗 原，所述抗原来自与诱导的或增强的免疫反应所针对的传染性疾病相 关的至少一种传染性病原体，或者与其在免疫学上交叉反应。在某些 另外的此类实施方案中，给予抗原的步骤进行一次、两次、三次、四方案中，所述方法包括同时给予或以任一顺序连续给予抗原，所述抗决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。 在某些另外的此类实施方案中，给予抗原的步骤进行一次、两次、三的实施方案中，所述方法包括同时给予或以任 一 顺序连续给予抗原， 该抗原来自与诱导的或增强的免疫反应所针对的癌症相关的至少 一种 抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反 应。在某些另外的此类实施方案中，给予抗原的步骤进行一次、两次、 三次、四次或更多次。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含在第一容器内的上述免疫佐剂组合物，以及在第二容器内的抗原，其中所述免疫佐剂 组合物不与所述抗原接触。在另一个实施方案中，提供了试剂盒，其包含在第一容器内的上述的免疫佐剂组合物，以及在第二容器内的 包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子的至少 一种重组表达 构建体，其中所述免疫佐剂组合物不与所述重组表达构建体接触。在 刚描述的试剂盒的某些另外的实施方案中，所述抗原来自选自细菌、 病毒、酵母和原生动物中的至少一种传染性病原体。在刚描述的试剂盒的某些其它另外的实施方案中，抗原来自至少一种癌细胞。在刚描 述的试剂盒的某些其它另外的实施方案中，抗原来自与自身免疫疾病 相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在 免疫学上交叉反应。参照下面的详细描述和附图，本发明的这些和其它方面会被容易 地理解。此外，本文提及的、更为详细地描述本发明的某些方面的各 种参考文献都以其整体通过引用的方式并入本文。附图筒述
图1显示了 HPLC数据，表明了 MPL-AF和GLA-AF中的污染物 质的数目和含量。使用安捷伦1100 (Agilent 1100)系统和ESA电雾式 检测器(Corona CAD detector)采集这些层析谱。该方法在Waters Atlantis C18柱上采用曱醇到氯仿梯度来执行。注射液分别包括2.5 的GLA和MPL,以及作为助溶剂的0.27 /xg的合成磷酸胆碱(POPC)。图2显示了表明细胞因子和趋化因子水平的ELISA数据，所述细 胞因子和趋化因子是由Mono Mac 6细胞系的人巨噬细胞(图a-e)以及 PBMC来源的树突状细胞(DC)(图f-h)应答GLA刺激时表达的。细胞以每孑L 1x105个细胞用GSK Biologicals MPL⑧的水制齐寸(MPL-AF)、 GLA的水制剂(GLA-AF)或单独的AF々某介物培养24小时。通过夹心 ELISA测量上清中的MIP陽lb, IP-10, IL-6, IL-23和IL-lb的水平。图3显示了 ELISA数据，表明了使用与GLA-AF或GLA-SE配制 的两种不同剂量的Fluzone疫苗每次免疫后一周(即，在第7天，图A; 以及在第28天，图B)，与单独使用Fluzone相比，在小鼠体内诱导的 抗Fluzone抗体产生的水平。图A和B显示了第 一次(A)或第二次(B) 注射后一周，小鼠的ELISA抗体滴度，所述小鼠在3周时间内被用在 含有GLA-AF、 GLA-SE或没有佐剂的制剂中的20 ml (1.8 /ig)或2 ml (0.18 mg) Fluzone (Flu)疫苗免疫了两次。图C显示了第二次免疫后的 小鼠血清中的中和抗体(HAI)的滴度。图4显示了 ELISA数据，表明了使用单独的或与GLA-SE配制的 SMT抗原进行第三次免疫后一周，在小鼠体内诱导的抗-SMT抗体产 生的水平。在三周时间内用配制在含有GLA(GLA-SE，每次免疫每只 动物20 pg)的稳定乳剂中的SMT抗原(每次免疫每只动物10 ptg)免疫 或者用单独的SMT蛋白注射C57BL/6小鼠三次。每次免疫后一周通 过放血采集血清，通过ELISA检测SMT特异性的IgGl和lgG2c抗体 的血清水平。显示了倒数终点滴度的平均值和标准误。图5显示了 ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA (40, 20, 5 或1 ^g)配制的利什(Leish)-110f抗原进行首次免疫后1周，与盐水对 照相比，在小鼠体内诱导的抗利什-110f抗体产生的水平。在两周时间 内，用利什-110f抗原(每次免疫每只动物10 j^g)免疫或用盐水注射 Balb/c小鼠三次，所述抗原配制于含有40, 20, 5或1 mg的GLA的稳 定乳剂(GLA-SE)中。每次免疫后一周通过放血采集血清，通过ELISA 检测利什-110f特异性IgGl和lgG2a抗体的血清水平。显示了首次免 疫后7天采集的血清的倒数终点滴度的平均值和标准误。图6显示了 ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA配制的利 什-110f抗原进行第三次免疫后l周，与盐水对照相比，在小鼠体内诱 导的抗利什-110flFN-7细胞因子产生的水平。来自Balb/c小鼠的脾细 胞在单独的培养基中，或在含有10 mg/ml的利什-110f或3 mg/ml的伴刀豆球蛋白A(ConA)的培养基中体外培养3天，所述小鼠在两周时 间内被用配制于含有40、 5或1 /ig的MPL的稳定乳剂(MPL-SE)或含 有40、 5或1 Atg的GLA的稳定乳剂(GLA- SE;)内的利什-110f抗原(IO /xg)免疫三次，或用盐水溶液注射。通过ELISA检测了上清中的IFN-g 水平。显示了平均值和标准误。图7显示了 ICS数据，表明了进行第三次免疫后一周在小鼠体内 诱导的产生ID83特异性的IFN-7、 IL-2和TNF细胞因子的CD4+和 CD8+T细胞的频数(frequencies)，所述免疫是使用单独的ID83或由含 有 GLA (GLA画SE) 、 GLA+CpG (GLA/CpG-SE)或 GLA+GDQ (GLA/GDQ-SE)的制剂作为佐剂的ID83进行的。来自C57BL/6小鼠的 脾细胞在含有10mg/mlID83的培养基中体外培养12小时，所述小鼠 在三周的时间内被用与GLA-SE 、 GLA/CpG-SE 、 GLA/嘎德莫特 (GDQ)-SE配制的肺结核分支杆菌ID83融合蛋白(8 pg)免疫三次或者 用盐水注射。通过细胞内染色检测以及通过在BDLSRIIFACS上进行 流式细胞计数测量CD3+CD4+或CD3+CD8+设门T细胞内的IL-2、 TNF和IFN-g的细胞水平。图8，图A显示了ICS数据，表明了使用ML0276抗原进行第三 次免疫后一周，与盐水和空白对照相比，在小鼠体内诱导的产生 ML0276特异性IFN-7细胞因子的CD4+T细胞的频数，所述ML0276 抗原用含有CpG或咪喹莫特(IMQ)的水制剂、或含有GLA的稳定油乳 剂(GLA-SE)、或混合在一起的上述三者配制。来自C57BL/6小鼠的 脾细胞在含有10 mg/ml的ML0276的培养基中体外培养12小时，所 述小鼠在三周时间内被用与CpG、咪喹莫特(IMQ)、 GLA-SE、上述三 者的组合配制的麻风分支杆菌ML0276抗原(10 pg)免疫三次或用盐水 注射。图A显示了通过细胞内染色冲企测以及通过在BD LSRII FACS 上进4亍流式细胞计数测量的CD3+CD4+ T细胞内的IFN-g的细胞水 平。图B显示了作为保护相关的引流淋巴结的细胞性。发明详述本发明在其几个实施方案中提供了疫苗组合物、佐剂组合物以及
包括使用合成的吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的相关方法。GLA提供了合
成免疫佐剂，其优于现有技术的佐剂，且特别优于天然产物佐剂，能
够以基本上均一的形态制备。而且，与天然产物来源的佐剂不同，GLA
其从限定的起始物质以化学方式合成来获得化学定义的产物，具有质 和量的批次之间的一致性，因此GLA提供了包括改良的产品质量控制 的先前未有的益处。令人惊喜地，尽管3-酰基单磷酸脂质A与某些毒 性有关，但是已发现当它的2氨基位含有单酰基链时，该分子保留可 接受的安全谱(safety profile)。此外，这类化合物的合成是简化的，因 为3位特异的脱乙酰作用具有技术挑战。因此，本发明还提供了安全 和易于合成方面的优势。
如本文所描述的，含有GLA的组合物和它们应用的方法在一些实 施方案中包括GLA本身与药学上可接受的载体或赋形剂用于免疫佐 剂活性(包括"辅佐")的用途，其中给予个体GLA可以完全独立于给予 个体一种或多种抗原，和/或在时间上和/或空间上与其分离，所述抗原 是个体免疫反应(例如，抗原特异性反应)的引发或增强所针对的。其 它的实施方案包括GLA在疫苗组合物中的应用，所述組合物也包括一 种或多种由所述疫苗引发或增强的免疫反应所针对的抗原。如本文所 述的，在某些相关的实施方案中，这些疫苗组合物也包括一种或多种 钟样受体(TLR)激动剂和/或一种或多种辅佐剂、咪唑并喹啉免疫反应 调节剂与双茎环免疫调节剂(dSLIM)中的一种或多种。在其它相关的实 施方案中，本文提供的疫苗组合物可以包含GLA和一种或多种重组表 达构建体，每一个构建体都包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的 启动子，所述抗原是个体免疫反应的引发或增强所针对的。
GLA
如上文所提及的，作为以化学方法合成的佐剂，GLA可以以基本 上均一的形态制备，其指就GLA分子而言，至少80%、优选至少85%、 更优选至少卯％、更优选至少95%以及仍更优选至少96%、 97%、 98% 或99%纯化的GLA制剂，该GLA分子包含(i)双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的1位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基 己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii)连接
于非还原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii)至多6个 的脂酰链，其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基， 其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包 含通过酯键与多于12个,灰原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中 一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯 键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。给定的GLA制剂 的纯度测定可以由熟悉适当的分析化学方法学的技术人员容易地完 成，诸如通过气相层析法、液相层析法、质谱法和/或核磁共振分析。 本文所^使用的GLA可以具有下述通用结构式
其中R1、 R3、 R5和R6是Cu-C2o烃基；且仗2和R"是<:12-(320烃基。
GLA可以例如从Avanti Polar Lipids, Inc. (Avanti极性脂质公司) (Alabaster, AL (阿拉巴马)；产品号699800，其中R1、 R3、 115和116是 十一烃基，且112和114是十二烃基)商购。
"烃基"指直链或支链的、无环或环状的、不饱和的或饱和的脂肪 烃，其含有1至20个碳原子，在某些优选的实施方案中，含有11至 20个碳原子。代表性的饱和直链烃基包括曱基、乙基、正-丙基、正-丁基、正-戊基、正-己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、 十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而饱和的 支链烃基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔-丁基、异戊基等。代表性 的饱和环状烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和 的环状烃基包括环戊烯基、环己烯基等。环状烃基在本文也被称为"同素环(homocyclcs)"或"同素环(homocyclic rings)"。不饱和的烃基在相邻 的碳原子之间包含至少一个双键或三键(分别被称为"烯基"或"炔基")。 代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、l-丁烯基、2-丁烯基、 异丁烯基、l-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-l-丁烯基、2-曱基-2-丁烯基、 2,3-二曱基-2-丁烯基等；代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔 基、l-丁炔基、2-丁炔基、l-戊炔基、2-戊炔基、3-曱基-l-丁炔基等。 因此，在本文涉及的某些实施方案中，GLA可以具有上述任一种 结构，且在某些实施方案中，特别涉及GLA可以具有在下述专利申请 的一个或多个中公开的脂质佐剂的任一结构，而在某些其它的实施方 案中，特别涉及GLA可以不具有在下述专利申请的 一个或多个中公开 的脂质佐剂的任一结构U.S. Pat. No. 6，544，518、 EP 1531158、 WO 2001/036433、 WO 97/11708、 WO 95/14026、 U.S. 4,987,237、 JP 63010728、 JP 07055906、 WO 2000/013029、 U.S. 5,530,113 、 U.S. 5,612,476、 U.S. 5,756,718、 U.S. 5,843,918、 WO 96/09310、 U.S. Pub. 2004/161776、 U.S. Pub. No. 2003/170249、 U.S. Pub. No. 2002/176867、 WO 2002/032450 、 WO 2002/028424 、 WO 2002/016560 、 WO 2000/042994、 WO 2000/025815、 WO 2000 018929、 JP 10131046、 WO 93/12778、 EP 324455、 DE 3833319、 U.S. 4,844,894、 U.S. 4,629,722。 依照某些实施方案，GLA没有3'-脱-0-酰化。 抗原
用于本文描述的疫苗组合物和应用GLA的方法的某些实施方案 中的抗原可以是个体内免疫反应的引发或增强所针对的任一靶抗原决 定部位、分子(包括生物分子)、分子复合物(包括含有生物分子的分子 复合物)、亚细胞集群、细胞或组织。通常，术语抗原指所关注的多肽 抗原。然而，如本文所-使用的，抗原也可以指编码所关注的多肽抗原 的重组构建体(例如，表达构建体)。在某些优选的实施方案中，所述 抗原可以是或可以来自与感染、癌症、自身免疫疾病、过敏症、哮喘 症或任何其它的状态(其中，抗原特异性免疫反应的激活是理想的或有 益的)相关的传染性病原体和/或抗原决定部位、生物分子、细胞或组 织，或者与其在免疫学上交叉反应。优选地，在某些实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够引发针 对人类或其它哺乳动物病原体的免疫反应的抗原或抗原成分，所述抗
原或抗原成分可以包括来自病毒的成分，诸如来自HIV-1(如tat， nef， gpl20或gpl60)、人类疱渗病毒(如gD或其衍生物或如来自HSV1或 HSV2的ICP27的即刻早期蛋白)、巨细胞病毒((特别是人类)(如gB或 其衍生物)、轮状病毒(Rotavirus)(包括活力减弱病毒)、爱泼斯坦-巴尔 氏病毒(如gp350或其衍生物)、水痘带状疱渗病毒(诸如gpl, II和IE63) 或者来自诸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、曱 型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及戊型肝炎病毒的肝炎病毒，或者来自 其它的病毒病原体，诸如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白 或其衍生物)、副流感病毒、麻渗病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例 如HPV6, 11， 16， 18等)、虫媒病毒(例如黄热病毒(Yellow Fever Virus)、 登革热病毒(Dengue Virus)、虫皁传月卤炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、日本脑炎病毒或流感病毒(全活或灭活病毒、4姿种在鸡胚或 MDCK细胞内的裂解流感病毒，或完整流感病毒体(如由Gluck, Vaccine, 1992， 10, 915-920所描述的)或者是其纯化的或重组的蛋白， 诸如HA， NP, NA或M蛋白或者其组合)。
在某些其它优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够引发 针对人类或其它哺乳动物病原体的免疫反应的抗原或抗原成分，所述 抗原或抗原成分可以包括来自一种或多种细菌病原体的成分，所述病 原体例如奈瑟菌属某些种(A^^en'fl印p)，包括淋病奈瑟菌(TV. gowo〃/zea)和脑膜炎奈瑟菌(A^ we"/"g"WM)(例如荚膜多糖和其偶联 物、转铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PiIC、黏附素)；化脓链 球菌OS.;^oge"^)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸质)， 无乳链球菌(S. a^z/ac"ae),变异链球菌0. 杜克雷嗜血杆菌(//.
莫拉菌属某些种(Moraxe//a s; p)，包括粘膜炎莫拉菌(Af cato/r/mfe), 也称为粘膜炎布兰汉3求菌(^^3"/^附6//(3 caton7mfe)(例如 高和低分子量的黏附素及透明质酸酶)；博德特菌属某些种C8o^/ete〃a 印/0 ，包括百曰咳博德特菌(5. ; eWM^(例如百曰咳杆菌粘附素、百 日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)，副百日咳博德特菌;^ra; eWM^/s)和支气管败血症博德特菌(及 ZvYmc/n'"〃caJ; 分枝杆菌属某些种(M少coZ)"cten'臓印p )， 包括月申结 核分枝杆菌(例如ESAT6,抗原85A、 -B或-C)、牛型分枝杆菌(M. 6ov&)、麻风分枝杆菌(M./印rae)、鸟分枝杆菌(M. av/"m)、副结核分枝 杆菌(M. /^n^wZ^rciz/ow^)、耻祐分枝杆菌(A/. swegwa"'力；军团病杆菌 属某些种(丄eg/owe〃a 包括嗜肺军团菌(丄.pwewmop/n'/a);埃希氏
菌属某些种C&c/^n'c/n'a ^; )，包括肠毒素性大肠埃希菌(e"tera/o;dc五. co/Z)(例如定居因子、不耐热毒素或其衍生物、耐热毒素或其衍生物)、 肠出血性大肠埃希菌0^ra/^morrag/c co//)、肠致病性大肠埃希菌 O"^ra; fl^oge"z'c五.co//)(例如志贺(Shiga)毒素样毒素或其衍生物)；弧 菌属某些种(7z力ho印/ ),包括霍乱弧菌(7. c力o/era)(例如霍乱毒素或其 衍生物)；志贺菌属某些种(W/ge〃a^; ),包括索氏志贺菌(& ^""&)、 痢疾志贺菌(S.办^w^^e)、弗氏志贺菌0S.y ex"en7);耶尔森菌属某些 种(7^sz'm'a ^; )，包括小肠结肠炎耶尔森菌(J. 6"& <:0//"^)(例如Yop 蛋白)、鼠疫耶尔森菌(j. ; m似)、假结核耶尔森菌(j. 戸ei^/o励emz/os7》；弯曲杆菌属某些种(CV m;^/o6fl"er卿),包括空
肠弯曲杆菌(c. ^m')(例如毒素、翁附素和透明质酸酶)和结肠弯曲杆
菌(C. co/Z);沙门菌属某些种(Sa/mo"e//a ^; ),包括伤寒沙门菌(S. 0^/n〕、副伤寒沙门菌GS.; ara(y; A/)、猪霍乱沙门菌(S. c/ o/era^！^),肠 炎沙门菌OS. e",en'/z'cfe);利斯特菌属某些种(丄Men'a s; ; .),包括单核细 月包增生利斯特菌(丄.mowoc3^ogewe"; 螺杆菌属某些种(Z/e"co6a"er 印; )，包括幽门螺杆菌(/Z.;^/on')(例如尿素酶、过氧化氢酶、空泡素)； 假单胞菌属某些种(i^ewdomo"w w力，包括铜绿假单胞菌(尸. aer"g/wosa); 葡萄球菌属某些种(5Va/ /^/ococc^ 577p.), 包括金黄色葡 萄球菌(S. aw"w)、表皮葡萄球菌OS. e^Ww脂Vfe);肠球菌属某些种 (^V^eracoccM s; / .), 包4舌粪肠王求菌(S./aecafc)、屎肠3求菌(五./aecz.Mm); 梭菌属某些种(C/as^Wwm w; .)，包括破伤风梭菌(C. Wam')(例如破伤 风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C. Zw&"m/m)(例如肉毒菌毒素及其衍 生物)、艰难梭菌(C. ^^"7e)(例如梭菌毒素类A或B及其衍生物)；芽 孢杆菌属某些种C8a"7/ws印; .)，包括炭疽杆菌(B. anthmcis)(例如肉毒菌毒素及其衍生物)；棒杆菌属某些种(a o^eZja"en'wm ^/ .)，包括白 喉棒杆菌(C. A》/^/2en'ae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体属某些 种(5o厅e/Za 包括伯氏疏螺旋体(5. Zwrgafor/en')(例如OspA, OspC,
DbpA, DbpB)、伽氏疏螺力走体(5. ganVn》(例如OspA, OspC, DbpA， DbpB)、阿弗西尼疏螺旋体(5. a/ze/")(例如OspA， OspC， DbpA, DbpB)、 安德森疏螺旋体(及v4w&ao"z7)(例如OspA, OspC, DbpA， DbpB)、赫姆 斯疏螺旋体(5./^wwz7);埃里希体属某些种(五/zWcAz'a^p.),包括马埃 里希体(E. equi)和人类粒细胞埃里希体病(the Human Granulocytic Ehrlichiosis)的々某介；立克次体属某些种(Wd^加'a s/ / )，包括立氏立克 次体(i . n'c^to");衣原体属某些种(CA/am;^'a ^; .)包括沙眼衣原体 (C. fracAowfl似)(例如MOMP,肝素结合蛋白)，肺炎衣原体(C. / "ewmom'ae)(例如MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鵠热衣原体(C. psittaci); 钩端螺旋体属某些种(Z印to印zVa ),包括问号钩端螺旋体(L. interrogans);密螺万炎体属某些种(77^; owema ^p.)， 包括苍白球密螺旋: 体(r. /7a〃zV/^2)(例如罕见的外膜蛋白)，齿垢密螺旋体(T. denticola)、 猪瘌疾密螺旋体(T. hyodysenteriae);或其他细菌病原体。
在某些其它优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂含有能够引发 针对人类或其它哺乳动物病原体的免疫反应的抗原或抗原成分，所述 抗原或抗原成分可以包括来自 一种或多种寄生虫的成分(参见，例如， John, DT. and Petri, W.A., AfarA:e〃 awe Afed/ca/尸anxs"o/ogy-9"
五丄(Markell和Voge的医学寄生虫学-第9版)，2006， WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D,D.， GeorgzVParas"o/ogy/or f^m.wan'fl/w-S"
(Georgis的兽医寄生虫学-第8版)，2002， WB Saunders, Philadelphia),所述寄生虫例如痴原虫属某些种(P/asmoAwm ), 包 括恶性痴原虫(尸./a/cz》wMm);弓形虫属某些种(7b;co/7^wma)，包 括人刚地弓形虫(r.go"A7)(例如SAG2， SAG3, Tg34);内阿米巴属某 些种(五"towoe6a ^ / .),包括溶组织内阿米巴(五./^to/j^'ca);巴贝虫属 某些种(SaZ ew'a s/w.),包括田鼠巴贝虫(及mZcro");锥虫属某些种 (7Vy; 朋asom(2 577/7.), 包括克氏锥虫(r. co/z/); 贾第虫属某些种(GVan^/fl ^; .)，包括蓝氏贾第虫(G. lamblia);利什曼虫某些种，包括硕大利什
42曼虫(丄.m"7》。；月申嚢虫属某些种(尸wei/moc，化印/7.),包4舌卡氏肺嚢虫 CP. can'""); 毛滴虫属某些种(rn'c/zowoww )， 包4舌鞘毛滴虫(r. vag/"afe);或者来自能够感染哺乳动物的蠕虫，诸如(i)线虫感染(包 4舌，^f旦不卩艮于蠕形住肠蛲虫(五w&TOWtw verm/cw/an、)、人虫回虫(^ycan、 /w附6hc(9zW^s)、 毛首l便形纟戋虫(Jh.cAi/n、 Zn.c/mn.(3)、 美洲4反口纟戋虫 (jVeca/owMe〃'ca肌51)、 十二指肠钩虫(v4wcj^/o加麵di/oc ewa/e)、 班氏吴 策纟戋虫(『wcAeren'a Z fl"cro/h〕、 马来丝虫(5n/g/a附a/a力)、^走盘尾丝虫 (OwcAocerca vo/vm/m"、 麦i也刃卩龙纟戋虫(ZVflcawcw/t^ mecfz,wews&)、》走毛 线虫(JWc/^"e〃a s/ /ra"力禾口粪类圓线虫(5Vrawgy/o/6 &s Wercora//"); (ii) 吸虫感染(包4舌，但不限于曼森血吸虫(Sc/n'Woswnfl wa朋om')、埃及血 吸虫(5^/n'Woyoma /wemaZo6z'wm)、 曰本血吸虫(5"c/z&^woma、 湄公河裂体吸虫(Sc/n.Wosoma 、 中华后睾吸虫Aorc/^
w'we mi)、 并殖吸虫属(Pamgom'mw51 s/ )、 肝片形吸虫(Fawc/o/a Ae/ a〃ca)、 姜片吸虫(Fascz.o/a mag"a)、 大片吸虫(Fasc/o/a g7'gwz"ca)); 以及(iii)绦虫感染(包括但不限于牛肉绦虫和猪肉绦虫)。因此某些实施 方案可以涉及包括来自血吸虫属某些种(Sc/n'Wowwm s/^.)或来自酵母 的抗原的疫苗组合物，血吸虫属某些种如曼氏血吸虫、埃及血吸虫和/ 或日本血吸虫，酵母诸如假丝酵母属(Ow^/a^; .),包括白假丝酵母 (C. a/6/ca"";隐球菌属(Co^tococa^ ^; .)，包括新型隐球酵母(C.
对于结核分枝杆菌，其它优选的特异性抗原例如ThRal2、 Tb H9、 TbRa35、 Tb38-1、 Erd 14、 DPV、 MTI、 MSL、 mTTC2和hTCCl (WO 99/51748)。针对结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白及其变体，其中 结核分枝杆菌的至少两种、优选三种多肽融合成较大的蛋白。优选的 融合物包括Ral2-TbH9画Ra35、 Erdl4-DPV-MTI、 DPV画MTI-MSL、 Erdl4DPV-MTI-MSL-mTCC2、 Erdl4-DPV-MTI画MSL、 DPV-MTI-MSL陽 mTCC2、 TbH9隱DPV-MTI (WO 99151748)。
对于衣原体最优选的抗原包含例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)、 ORF3 (EP 366 412)以及推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗制剂的 其它衣原体抗原可以选自在WO 99128475中描述的组。优选的细菌疫苗包含来自包括肺炎链球菌的链球菌属某些种的抗原(例如荚膜多糖
及其偶联物、PsaA、 PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白抗 原肺炎链球菌溶血素(5"c/^m 5kp/i"爿cto， 1989, 67， 1007; Rubins et al.， M/craZ /fl/尸wAoge"ew、卩微兰務放4^理」，25， 337-342),以及其突 变的去毒衍生物(WO 90/06951; WO 99/03884)。其它优选的细菌疫苗 包含来自嗜血菌属(//^附叩/ 7^ ^ p.)的抗原，包括流感嗜血杆菌B型
!'w/Zwewzae (y/ e (例如PRP及其偶联物)，不可分型流感嗜血杆菌， 例如OMP26、高分子量黏附素、P5、 P6、蛋白质D和脂蛋白D，以 及丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(U.S. Pat. No. 5,843，464)或多重拷贝变 体或其融合蛋白。
乙型肝炎表面抗原衍生物在本领域是公知的，其包括在欧洲专利 申请EP-A414 374、 EP-A-0304 578和EP 198474中描述的那些PreSl、 Pars2S表面抗原等。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1 抗原、gpl20，特别是在CHO细胞中表达时。在另外的实施方案中， 本发明的疫苗制剂包含本文上面限定的gD2t。
在本发明优选的实施方案中，含有要求保护的佐剂的疫苗包含的 抗原来自被认为是生殖器疣病因的人类乳头瘤病毒(HPV) (HPV 6或 HPV ll及其它)，以及是宫颈癌病因的HPV病毒(HPV16、 HPV18及 其它)。生殖器疣预防或治疗性疫苗的特别优选形式包含Ll颗粒和壳 粒，以及包含选自HPV6和HPV11蛋白E6、 E7、 L1和L2的一个或 多个抗原的融合蛋白。融合蛋白某些优选的形式包括WO 96/26277中 公开的L2E7，以及GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285)中公开的蛋白 D(l/3)-E7。优选的HPV宫颈感染或癌症的预防性或治疗性疫苗组合 物可以包含HPV 16或18的抗原。例如，Ll或L2抗原单体，或者作 为病毒样颗粒(VLP)共同呈现的Ll或L2抗原，或者在VLP或壳粒结 构内单独呈现的单独的Ll蛋白。这些抗原、病毒样颗粒和壳粒本身 是已知的。参见例如WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792和 W093/02184。
其它早期蛋白可以单独地被包括或者作为诸如E7、 E2或优选例 如F5的融合蛋白；特别优选的实施方案包括包含L1E7融合蛋白的VLP (WO 96/11272)。特别优选的HPV16抗原包含与蛋白D载体融合 的早期蛋白E6或E7以形成来自HPV16的蛋白D-E6或E7融合物， 或其组合；或者包含E6或E7与L2的组合(WO 96/11272)。可选择地， HPV16或18的早期蛋白E6和E7可以呈现为单分子，优选蛋白 D-E6/E7融合物。这类疫苗可任选地包含来自HPV18的E6和E7蛋白 的任一者或两者，优选以蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。本发明的疫苗另外还包含来自其它HPV菌抹 的抗原，优选来自HPV 31或33菌抹。
本发明的疫苗还包含来自导致疟疾的寄生虫的抗原。例如，来自 恶性痴原虫的优选抗原包括RTS，S和TRAP。 RTS是杂交蛋白，包含 恶性痴原虫的环子孢子(CS)蛋白的基本上全部的C-末端部分，后者通 过乙型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸连接于乙型肝炎病毒 表面(S)抗原。其完整结构在国际专利申请号PCT/EP92/02591中公开， 该国际申请公布号为WO 93/10152，要求英国专利第9124390.7号申 请的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，且当它 与来自HBV的S抗原共表达时，它产生了称为RTS，S的混合颗粒。
在以WO 90/01496公布的国际专利申请号PCT/GB89/00895中描 述了TRAP抗原。本发明的优选实施方案是疟疾疫苗，其中抗原制剂 包含RTS,S和TRAP抗原的组合。可能是多级症疾疫苗的组分的候选 物的其它疾原虫抗原是恶性痴原虫MSP1, AMA1 ， MSP3, EBA, GLURP， RAP1, RAP2，钳合蛋白(Sequestrin), PffiMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27125， Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230，以及在疾原虫属某些种中的它们的类似物。
因此，本文公开的某些实施方案涉及来自诸如细菌、病毒或真菌 的至少一种传染型病原体的抗原，所述病原体包括放线细菌，诸如结 核分支杆菌和麻风分支杆菌或另外的分支杆菌；细菌诸如沙门菌属、 奈瑟球菌属、疏螺旋体属、衣原体属或博德特菌属的成员；病毒诸如 单纯疱渗病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、巨 细胞病毒、水痘带状疱渗、肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔氏病毒(EBV)、 呼吸道合胞病毒、人乳头状瘤病毒(HPV)以及巨细胞病毒；HIV诸如
45HIV-1或HIV-2;真菌诸如曲霉菌、芽生菌、球孢菌和肺孢子菌，或 者酵母，包括假丝酵母属，诸如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠 菌、葡萄牙念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌；寄生虫诸如原生动 物，例如症原虫属，包括恶性症原虫、间日症原虫、三日疸原虫和卵 圓症原虫；或者另外的寄生虫，诸如棘阿米巴、溶组织内阿米巴、管 圓线虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、隐孢子虫(Cryptosporidium)、埃及 吸血虫、钩虫线虫、溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴、迪斯帕内阿米 巴、哈特曼内阿米巴、波氏内阿米巴、班氏吴策线虫、贾第虫以及利 什曼虫的一种或多种。
例如，在含GLA的疫苗实施方案中含有来自疏螺旋体属的抗原， 所述抗原可以包括核酸、病原体来源的抗原或抗原制剂、重组产生蛋 白或肽，以及嵌合融合蛋白。 一种这样的抗原是OspA。 OspA借助其 在宿主细胞内的生物合成可以是载脂形式的完全成熟的蛋白 (Lipo-OspA)，或者可选择地可以是非载脂的衍生物。这种非载脂衍生 物包括非载脂NSl-OspA融合蛋白，其具有流感病毒的非结构蛋白 (NS1)的N-末端的前81个氨基酸，以及完整的OspA蛋白，且另一种 MDP-OspA是携带3个附加的N-末端氨基酸的OspA的非载脂形式。
鉴别具有或疑似有患本文所述传染性病原体感染的危险的个体的 组合物和方法在本领域是已知的。
例如，细菌结核分支杆菌导致肺结核(TB)。该细菌通常侵袭肺脏， 但也可以侵袭肾脏、脊柱和脑。如果不能恰当治疗的话，TB疾病可以 是致死性的。当被传染的人打喷嚏或咳嗽时，这种疾病可以在人与人 之间播散。在2003年，美国报道的TB病例超过了 14,000例。
尽管结核通常可以采用长期的抗生素治疗来控制，但这种治疗不 足以预防该疾病的播散并引起了关于抗生素抗性菌抹的潜在选择的担 忧。被传染的个体在一段时间内可以是无症状的，但有传染性。此外， 尽管依从治疗方案是关键的，但患者行为难以监测。 一些患者不能完 成治疗过程，这导致了无效治疗和耐药性的发生(例如美国专利 7,087,713)。
目前，活细菌疫苗是诱导针对肺结核的保护性免疫的最有效的方
46法。用于这 一 目的的最常见的分支杆菌(Mycobacterium)是卡介菌 (Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)，牛型分支杆菌的无毒力抹。然而， BCG的安全性和功效是争议的来源，且有些国家，如美国并不给全民 接种。通常使用皮肤测试来完成诊断，其包括结核菌素PPD (蛋白纯 化的衍生物)的皮内暴露。抗原特异性T细胞反应导致了注射后48、 72小时在注射部位的可测量的硬结，这提示已暴露于分支杆菌抗原。 但是敏感性和特异性一直是该测试的难题，并且接种了 BCG的个体不 能与受感染的患者区分开(例如，美国专利7,087,713)。
尽管巨噬细胞一直作为肺结核杆菌免疫的主要效应器，但T细胞 是所述免疫的优势诱导细胞。T细胞在保护肺结核杆菌感染中的重要 作用在AIDS患者中被示例由于与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染有关 的CD4 T细胞的耗竭，AIDS患者体内通常会出现肺结核分支杆菌。 已表明，分支杆菌反应性CD4 T细胞是干扰素-7(IFN-力强大的产生细 胞，其也已被进一步表明触发小鼠体内巨噬细胞的抗分支杆菌效应。 尽管IFN-7在人体内的作用是不清楚的，但已有研究表明1,25-二羟基 -维生素D3单独地或与IFN-7或肿瘤坏死因子-ca关用激活人巨噬细胞 以抑制肺结核分支杆菌感染。此外，已知IFN-7激活人巨噬细胞以产 生1,25-二羟基-维生素D3。类似地，已表明，IL-12在激发对肺结核 分支杆菌感染的抗性中发挥作用。对肺结核分支杆菌感染的免疫学的 综述,参见Chan and Kaufmann, in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (肺结核发病机理、保护和控制)，Bloom (ed.), ASM Press. Washington, D.C. (1994)。
包括多肽和编码这种多肽的DNA分子的应用，所述多肽含有一种或 多种分支杆菌蛋白的至少一种免疫原部分。含有这种多肽或DNA序 列以及适当的检测试剂的诊断试剂盒可以用于;^测患者和生物样本中 的分支杆菌感染。也提供了针对这种多肽的抗生素。此外，这种化合 物可以配制于疫苗和/或药物组合物中，用于抗分支杆菌感染的免疫。 (美国第6,949,246和6,555,653号专利)。
47二十世纪60年代，在世界上很多地方都消灭了症疾，但这种疾病 仍持续存在，并出现了耐药的新致病抹。疟疾在90多个国家是主要的
公共卫生问题。10例痴疾中有9例出现在撒哈拉以南非洲(sub-Saharan Africa)。超过1/3的世界人口正面临危险，且每年有350至500百万 的人感染症疾。今年有45百万怀孕妇女面临感染症疾的危险。在那些 已经被感染的个体中，每年有超过1百万被感染个体死于可预防的疾 病。那些死亡者中主要是非洲的儿童。
痴疾通常是在人4皮受感染的雌痴蚊(Anopheles mosquito)口丁咬时4专 播。蚊子必须通过汲取已经感染了痴疾的人的血被感染后才能传播症 疾。症疾由寄生虫导致，且该病的临床症状包括发热和流感样不适， 诸如寒战、头痛、月几肉疼痛和疲^f巻。这些症状可以伴有恶心、呕吐和 腹泻。痴疾也可以导致由红细胞的损失引起的贫血和黄疽。 一种类型 的疟疾，恶性痴疾，如果不能及时治疗的话，可能导致肾衰、惊厥、 意识模糊、昏迷和死亡。
个体中症疾的体外诊断方法是已知的，其包括将从个体采集的组 织或生物学流体与分子或多肽组合物接触(在允许体外免疫反应在所 述组合物和存在于组织或生物流体中的抗体之间发生的条件下)，以及 形成的抗原抗体复合物的体外检测(参见，例如，美国专利7,087,231)， 其中所述分子或多肽组合物包括一个或多个多肽序列，其携带由恶性 疰原虫的传染活性导致的蛋白的 一 个或多个T抗原决定部位的全部或 部分。
已经描述了重组恶性痴原虫(3D7) AMA-1胞外区的表达和纯化。 先前的方法已经产生了高纯化的蛋白，其保留了天然分子的折叠和二 碌b键。重组的AMA-1可以用作i貪断试剂以及用于抗体制备，和作为 蛋白单独用于或作为疫苗的一部分用于预防疟疾。(美国专利 7,029,685)
本领域已经描述了编码种属特异性的间日疾原虫痴疾肽抗原的多 核苷酸，所述抗原是分泌入感染后的易感哺乳动物宿主血浆内的蛋白 或蛋白片段，这样产生针对这些抗原的单克隆或多克隆抗体。所述肽 抗原、单克隆抗体和/或多克隆抗体用于诊断疰疾的测定中被利用，以及用于确定是否间日痴原虫是导致感染的种属。(美国专利6,706,872) 也已经报道了种属特异性的间日疟原虫疟疾肽抗原，其是分泌入感染 后的敏感哺乳动物宿主血浆内的蛋白或蛋白片段，这样产生针对这些 抗原的单克隆或多克隆抗体。所述肽抗原、单克隆抗体和/或多克隆抗 体在用于诊断痴疾的测定中被利用，以及被用于确定是否间日痴原虫 是导致感染的种属(参见，例如，美国专利6,231 ，861)。
通过产生高纯度蛋白的方法也已经表达了重组的恶性痴原虫(3D7) AMA-1胞外区，其保留了天然分子的折叠和二辟J建。所述重组的 AMA-1用作i貪断试剂，以及用作疫苗用于抗体产生(美国专利 7,060,276)。同样已知的是重组恶性疾原虫(3D7) MSP-142的表达和纯
化，其保留了天然分子的折叠和二硫键。重组的MSP-l42用作诊断试
剂以及用作疫苗用于抗体产生。(美国专利6,855,322)。
因此根据这些和相关的公开内容，已知检测人类痴疾感染的诊断 方法，以鉴定具有或疑似有患疾疾传染性病原体感染的危险的个体。 具体地，例如，将血液样本与含有3-乙酰基嘧啶腺噤呤二核普酸 (APAD)、底物(例如，乳酸盐或乳酸)以及緩沖液合并。该试剂祐:i殳计 为检测由痴疾寄生虫产生的独特的糖分解酶的存在。已知该酶是寄生 虫乳酸脱氢酶(PLDH)。使用上述试剂，很容易区别PLDH与宿主的 LDH。所述试剂与寄生虫感染的血液样本合并导致了 APAD的还原。 但是APAD不^皮宿主LDH还原。然后可以通过多种技术，包括光谱、 荧光测定、电泳或比色分析来^r测还原的APAD。以上述方式4企测还 原的APAD提供了疾疾感染的阳性指示(例如美国专利5,124,141)。在 另 一种诊断疟疾的方法学中，包含特征性氨基酸序列的多肽源自恶性 痴原虫抗原GLURP，并可在4企测样本中被针对所述多肽或与其反应的 特异性抗体所识别。(美国专利5,231,168)
利什曼病是世界范围内的寄生虫病，在印度次大陆、非洲和拉丁 美洲频繁流行，是世界卫生组织开发疫苗的优先考虑对象。不同疾病 的复合，利什曼寄生虫导致了内脏器官的致命感染以及严重的皮肤病。 利什曼病最具破坏性的形式中的 一种是鼻和嘴的毁容感染。利什曼病 例的数量越来越多，目前在许多地区以难于控制。作为HIV感染的结
49果，利什曼病在一些发达地区也处于上升状态，特别是在南欧。可利 用的药物是有毒性的、昂贵的，并需要长期的每日注射。
利什曼虫是定居于免疫系统的巨噬细胞或白血细胞的原生动物寄 生虫。这种寄生虫通过小的吸血昆虫(沙蝇)的叮咬传播，所述昆虫由 于定居于地球上的广大地区，难以控制。
内脏利什曼病是该病三种表现形式中最危险的。据估计每年发生
约500,000例内脏形式(黑热病(kala-azar)或"致死疾病")的新病例。超 过200百万的人目前处于感染内脏利什曼病的危险中。超过90%的内 脏利什曼病例发生在印度、孟加拉国、苏丹、巴西和尼泊尔。大多数 死亡发生在儿童。患有皮肤形式的那些人通常是永久的毁容。
利什曼虫感染难以i貪断，并且通常涉及组织活4企样本的组织病理 学分析。然而已经开发了几种血清学和免疫学诊断测定。(美国专利 7,008,774; Senaldi et al" (1996) /画画/. M&AoA 193:9 5; Zijlstm, et al., (1997) 7Va"义i . Soc. Tro; . Tl^A i/yg. 91 :671 673; Badaro， et al" (1996) J. Inf. Dis. 173:758 761 ; Choudhary, S., et al.， (1992)丄Com附. ZXs. 24:32 36; Badaro， R., et al.， (1986)爿附.7Vo/ . 35:72 78;
Choudhary, A., et al" (1990) 7>顯.及.Soc. 7Vo; . MW.外g. 84:363 366; 和Reed， S. G.， et al., (1990)爿m.丄7Vo; . MW. /fyg. 43:632 639)。前鞭毛 体释放代谢产物进入培养基以产生条件培养基。这些代谢产物是宿主 免疫原性的。参见Schnur， L. F.， et al., (1972) Isrl. J. Med. Sci. 8:932 942; Sergeiev, V. P., et al" (1969) Med. Parasitol. 38:208 212; El-On， J.， et al" (1979) Exper. Parasitol. 47:254 269;和Bray, R. S., et al" (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605 609; U.S. Pat. No. 6,846,648，美国专利 5,912,166;美国专利5,719,263;美国专利5，411 ,865)。
世界范围内大约有40百万人感染导致AIDS的病毒HIV。每年约 3百万人死于该病，他们中的95%是在发展中国家。每年有接近5百 万的人感染HIV。目前在撒哈拉以南非洲，该病的负担最重，但它正 在向诸如印度、中国和俄罗斯的其它国家快速传播。这种流行病在少 数民族人口中蔓延最快。在美国，从1981年起，已经报道了超过
50950,000例的AIDS。 AIDS袭击处于多产的年纪的人。由于生物学和 社会原因，妇女患HIV/AIDS的危险增加。
AIDS由人类免疫缺陷病毒(HIV)导致，所述病毒杀死和破坏人体 免疫系统的细胞，并且进行性破坏人体对抗感染和某些癌症的能力。 HIV最普遍的传播是通过与受感染的伴侣进行无保护的性交。对这一 问题最有力的解决方案是预防病毒的播散。实现这一目的的一条途径 是制备安全、有效和负担得起的HIV疫苗。在世界范围内，处于HIV 感染高危险中的5个患者中不到1个采取了有效的预防。
诊断HIV感染的方法是已知的，包括通过患者样本的病毒培养、 确定的核酸序列的PCR，以及检测患者血清中抗-HIV抗体的存在的抗 体测试(参见例如，美国专利第6,979,535， 6,544,728， 6,316,183， 6,261 ,762,4,743,540号)。
根据本文公开的某些其它实施方案，疫苗组合物和相关的制剂以 及应用方法可以包括来自癌细胞的抗原，其可以用于癌症的免疫治疗 学治疗。例如，佐剂制剂可以利用肿瘤排斥抗原，诸如前列腺癌、乳 腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑色素瘤癌的排斥抗原。 示例性的癌症或癌细力包来源的抗原包括MAGE 1、 3和MAGE4或其 它MAGE抗原如在WO99/40188中公开的那些、PRAME、 BAGE、 Lage (也被称为NY Eos 1) SAGE和HAGE (WO 99/53061)或GAGE (Robbins and Kawakami， 1996 Cwrm^ Pp/m'cms /mwwwo/ogy 8, pps 628-636; Van den Eynde et al" /w^7z加'owa/ Towma/ o/ C7/m'ca/ cfe i e層rc/ (1997&1998); Correale et al. (1997)， Jo訓a/ o/他"麵/ /"W/M/e 89, p. 293。癌抗原的这些非限定性实例表达于诸如黑 色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌的多种胂瘤类型中。参见，例如美国专 利第6,544,518号。
依照某些本文公开的实施方案，适于与GLA —起使用的其它肺瘤 特异性抗原包括但不限于肿瘤特异性或肿瘤相关性神经节苷脂类，如 GMb和GM3或其与载体蛋白的偶联物；或者在GLA疫苗组合物中使 用的用于引发或增强抗癌症免疫反应的抗原可以是自身肽激素，诸如 用于许多癌症的治疗的全长促性腺激素释放激素(GnRH, WO95/20600)， 一种10个氨基酸长的短肽。在另一个实施方案中，使用 了前列腺抗原，诸如前列腺特异性抗原(PSA)、 PAP、 PSCA(例如， 淑, 95(4) 1735-1740 1998)、 PSMA或在优选的实施方 案中的称为前列腺酶(Prostase)的抗原。(例如，Nelson, et al.，尸rac.胸/. Jc"(i. t/&4(1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al.A^". Sd. 1999. 96， 3114-3119; WO 98/12302; U.S. Pat. No. 5,955,306; WO 98/20117; U.S. Pat. Nos. 5,840,871和5,786,148; WO/004149。从 W098/137418和WO/004149中可知其它的前列腺特异性抗原。另一 种是STEAP (iW^S96 14523 14528 7-12 1999)。
用于本发明的背景下的其它肿瘤相关抗原包括Plu-1 ( /所o/. C7zem 274 (22) 15633 -15645, 1999)、 HASH-1 、 HasH-2、 Cripto (Salomon et al飾m， 199, 21 :61-70， U.S. Pat. No. 5,654， 140)和Criptin (U.S. Pat. No. 5,981,215)。此外与癌症治疗疫苗特别相关的抗原也包括酪氨 酸酶和存活蛋白。
本文7>开的涉及包含癌抗原的含有GLA的疫苗组合物的实施方 案可以用于对抗由肿瘤相关抗原表达表征的任何癌症，诸如 HER-2/neu表达或其它癌症特异性或癌症相关抗原。
诊断具有或疑似有患癌症危险的个体中的癌症可以通过众多本 领域公认的方法学中的任一种来完成，这可以依赖于包括临床表现、 癌症的进展程度、癌症类型或其它因素而变化。癌症诊断学的实例包 括患者样本(例如，血液、皮肤活检、其它组织活检、手术样本等)的 组织病理学检测、组织细胞化学4企测、免疫组织细胞化学^r测和免疫 组织病理学检测，对限定的遗传(例如，核酸)标志物的PCR检测，对 循环中的癌相关抗原或携带所述抗原的细胞的血清学检测，或对限定 的特异性抗体的血清学检测，或者本领域技术人员熟悉的其它方法学。 参见，例如，美国专利第6,734,172; 6,770,445; 6,893,820; 6,979,730; 7,060,802; 7,030,232; 6,933,123; 6,682,901; 6,587,792; 6,512,102; 7,078,180; 7,070,931号；JP5-328975; Waslylyk et al., 1993 211(7):18。
本发明的某些实施方案的疫苗组合物和方法可以用于预防或治疗自身免疫疾病，其包括疾病、状态或病症，其中宿主或个体的免疫 系统不利地介导针对"自身"组织、细胞、生物分子(例如，肽、多肽、
蛋白、糖蛋白、脂蛋白、蛋白脂质、脂质、糖脂、诸如RNA和DNA 的核酸、低聚糖、多聚糖、蛋白聚糖、糖胺聚糖等等，以及个体细胞 和组织的其它分子组分)或抗原决定部位(例如，特异性的免疫限定识 别结构，诸如被抗体可变区互补决定区(CDR)或被T细胞受体CDR识 别的那些)的免疫反应。
其在任一种情形下都针对正常的自组织。哺乳动物的自身免疫疾病通 常分类为两种不同类型中的一种细胞介导的疾病(即T-细胞)或抗体 介导的病症。细胞介导的自身免疫疾病的非限定性实例包括多发性硬 化、风湿性关节炎、桥本曱状腺炎、I型糖尿病(青少年型糖尿病)和自 身免疫性葡萄膜视网膜炎(uvoretinitis)。抗体介导的自身免疫病症包括 但不限于重症肌无力、系统性红斑狼疮(或SLE)、曱状腺机能亢进、 自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性哮喘、 冷球蛋白血症、血栓性血小板减少性紫癜、原发性胆管纤维硬化和恶 性贫血。与系统性红斑狼疮有关的抗原是小核核糖核酸蛋白(snRNP); 与曱状腺机能亢进有关的抗原是促曱状腺激素受体、曱状腺球蛋白和 曱状腺上皮细胞的其它组分(Akamizu et al" 1996; Kellerman et al" 1995; Raju etal., 1997和Texier et al.， 1992);与天疱疮有关的抗原是类 钙粘蛋白(cadherin-like)天疱疮抗原，诸如桥粒芯糖蛋白3和其它黏附 分子(Memar et al" 1996: Stanley, 1995; Plott et al" 1994; and Hashimoto, 1993);以及与血栓性血小板减少性紫癜有关的抗原是血小板抗原。(参 见，例^口，美国专利6,929,796; Gorski et al. (Eds.), (自身
免疫),2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch and Lipsky, P. E. (Eds.) CWrew/ Cowce, z'w y^o/m附wm'^朋d CArow/c /^/7amma"ow (自身免疫和慢性炎症的现代观点)(Cwrr. r印.M/craZ^o/, /mww加/Y微^:參夢和名疾夢的應A观^」)2001, Springer, NY.)
53自身免疫参与80多种不同的疾病，包括1型糖尿病、多发性硬化、 狼疮、风湿性关节炎、硬皮病和曱状腺疾病。对于大多数自身免疫疾
病缺乏有关发病率的有力的量化评估。20世纪90年代末完成的最新 研究表明自身免疫疾病是美国第三位最常见的主要疾病；且最常见的 自身免疫疾病影响了超过8.5百万美国人。该疾病流行的目前估值是 美国人口的5%到8%。大多数自身免疫疾病倾向于侵袭女性。可能获 得自身免疫疾病的女性是男性的2.7倍多。女性更易感自身免疫疾病； 男性看起来比女性具有更高水平的天然杀伤细胞活性。(Jacobsen et al， C7/wz'ca//附mwwo/ogy 7mmwwo/ a/Ao/ogy， 84:223-243， 1997.)
当免疫系统将自身组织错认为异物而启动不恰当的攻击时，就发 生了自身免疫疾病。机体可受到自身免疫疾病不同方式的侵袭，包括， 例如肠道(克罗恩氏疾病)和脑(多发性硬化)。已知自身抗体攻击自身细 胞或自身组织以损伤它们的功能，并由此导致自身免疫疾病，并且已
知在自身免疫疾病真正发生(例如，临床体4i和症状出现)之前就可以 在患者的血清中检测出自身抗体。因此自身抗体的检测可以早期发现 或识别自身免疫疾病的存在或发展为自身免疫疾病的风险。基于这些 发现，已经发现了针对自身抗原的多种自身抗体，并且在临床检验中
已经测量了针对自身抗原的自身抗体(例如，美国专利6,919,210, 6,596,501 ， 7，012，134， 6,919,078),而其它的自身免疫诊断学可能涉及 相关代谢产物的检测(例如,美国专利第4,659,659号)或免疫学活性(例 如，美国专利第 4,614,722和5,147,785, 4,420,558, 5,298,396, 5,162,990， 4,420,461， 4,595,654， 5，846，758， 6,660,487号)。
在某些实施方案中，本发明的组合物特别适用于治疗老人和/或免 疫低下患者，包括肾透析个体、化疗和/或放疗个体、接受移植者等。 这些个体通常显示对疫苗的减弱的免疫反应，因此使用本发明的组合
物能够增强这些个体达到的免疫反应。
在其它实施方案中，用于本发明的组合物中的一种抗原或多种抗 原包括与呼吸系统疾病有关的抗原，诸如由细菌感染(例如，肺炎球菌 感染)导致或加剧的那些疾病，用于预防和治疗诸如慢性阻塞性肺疾病 (COPD)的状态。COPD的生理学定义是在患'隄性支气管炎和/或肺气肿
54部分可逆的呼吸道阻塞(Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121)。 COPD的恶化经常是由细菌(例 如，肺炎球菌)感染引起的(Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336- 63)。 TLR
如本文描述的，本发明的某些实施方案涉及疫苗组合物和免疫佐 剂组合物，包括药物组合物，所述组合物包括一种或多种钟样受体激 动剂(TLR激动剂)。钟样受体(TLR)包括天然免疫系统的细胞表面跨膜 受体，其赋予宿主细胞早期识别多种保守的微生物分子结构的能力， 所述分子结构可以存在于众多传染性病原体内或表面。(例如，Armant et al" 2002 G飾,肠/. 3(8):reviews(综述)3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 272:50; Medzhitov et al" 1997 CW. C|p/w. /画画/. 9:4;
Luster 2002 CWr. O/ /". /mwwwo/. 14:129; Lien et al. 2003 iVa/. /mmimo/. 4:1162; Medzhitov， 2001淑及ev. /画歸/. 1:135; Takeda et al" 2003 j i ev/附麵wo/. 21:335; Takeda et al. 2005 /"Z. 7mmw加/. 17:1 ; Kaisho et al" 2004脸rah /"/e". 6:1388; Datta et al" 2003 /. /画画/. 170:4102)。
诱导TLR-介导的信号转导以促进通过天然免疫系统的免疫反应 的启动可以通过TLR激动剂来实现，所述TLR激动剂与细胞表面的 TLR结合。例如，脂多糖(LPS)可以是通过TLR2或TLR4的TLR激 动剂(Tsan et al., 2004 /.丄ei/A;. 76:514; Tsan et al.， 2004爿m. /.
尸力W/0/. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 WocA: 24:206);聚(月几苷-胞香)(聚I:C)可以是通过TLR3的TLR激动剂(Salem et al., 2006 24:5119); CpG序歹'j(含有未曱基化的胞嘧啶-鸟噤呤或"CpG" 二核苷酸基序的寡聚脱氧核苦酸，例如，CpG 7909, Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et al. M^Ws FzW ~ C/z'w 尸力ar麵co/ 27:193; Vollmer et al.t>w rAmz/ 少 5:673; Vollmer et al., 2004 Jw&'附/cn96. v4gew" CAe附o/力e广48:2314; Deng et al., 2004 / /附mwwo/. 173:5148)可以是通过TLR9的TLR激动 剂(Andaloussi et a.， 2006 G7/fl 54:526; Chen et al" 2006 J. /mmw o/. 177:2373);肽聚糖可以是TLR2和/或TLR6的激动剂(Soboll et al., 2006
55肠/. 7 e戶t/. 75:131 ; Nakao et al., 2005 J. /顯歸/. 174:1566); 3M003 (4-氨基-2-(乙氧甲基)-ce,o:-二曱基-6,7,8,9-四氬-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-l-乙醇水合物，分子量318Da，来自3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN,其 也是相关化合物3M001和3M002的来源；Gorden et al., 2005 /www"o/. 174:1259)可以是TLR7激动剂(Johansen 2005 五xp. j〃erg. 35:1591 )和/或TLR8激动剂(Johansen 2005);鞭毛蛋白可以是 TLR5激动剂(Feuillet et al.， 2006淑腦103:12487); 且丙肝抗原可以作为通过TLR7和/或TLR9的TLR激动剂(Lee et al., 2006尸亂胸.加J. "&4 103:1828; Horsmans et al,， 2005 42:724)。其它的TLR抗原是已知的(例如，Schirmbeck et al., 2003 /wmw"o/. 171:5198),且依照本文描述的某些实施方可以4吏用其它的 TLR抗原。
例如，借助于背景知识(参见,例如,美国专利第6,544,518号申请)， 已知含有未曱基化的CpG 二核苷酸("CpG")的免疫激活型寡核苷酸可 以作为通过全身和粘膜两种途径给药时的佐剂(WO 96/02555, EP 468520, Davis et al.，丄/画歸/， 1998. 160(2):870-876; McCluskie and Davis，丄/mmimo/" 1998， 161(9):4463-6)。 CpG是存在于DNA中的胞嘧 啶一鸟嘌呤二核苷酸基序的缩写。cg基序在免疫激活中的重要作用由
Krieg,Mm^e 374,p546 1995阐明。详细的分析已经表明CG基序必须 是在某一序列背景下，且这些序列在细菌DNA中是常见的，但在脊 推动物DNA中罕见。所述免疫激活序列通常是嘌呤、嘌呤、C、 G、 嘧啶、嘧啶；其中所述二核苦酸CG基序不是甲基化的，^f旦已知其它 未甲基化CpG序列具有免疫激活性，且可以用于本发明的某些实施方 案中。当CpG配制于疫苗中时，它可以在游离的溶液中与游离的抗原 (WO 96/02555; McCluskie and Davis,见上述)一起给药，或与抗原共i介 偶联(PCT公布号WO 98/16247),或者与诸如氬氧化铝的载体配制(例 ^口, Davis et al.见上述，Brazolot画Millan et al., iVocA^Z/JcatiSc/., C/S^， 1998, 95(26), 15553-8)。
用于本发明的佐剂或疫苗的优选寡核苷酸优选包含由至少三个、 更优选至少6个或多个核苷酸分开的两个或多个二核苷酸CpG基序。本发明的寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷 酸中的核苷酸间是二硫代磷酸酯或更优选硫代磷酸键，尽管磷酸二酯 和其它的核苷酸间键都在包括带有混合核苦酸间键合的寡核苷酸的本
发明的范围内。在U.S. Pat. Nos. 5,666,153, 5,278,302和WO95/26204
中描述了产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法。
优选的寡核苷酸的实例具有在下述公开文献中公开的序列；对于 某些本文公开的实施方案，所述序列优选含有硫代磷酸修饰的核苷酸 间键合
CPG 7909: Cooper et al" "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults. (CPG 7909佐剂在抗逆转录病毒治疗的HIV感染的成年人中改善乙型 肝炎病毒疫苗的血清保护).'^4/2)& 2005 Sep 23;19(M):M73-9.
CpG 10101: Bayes et al., "Gateways to clinical trials (临床试验途 径)."M&Ws FzW. .C"w.泡函co/. 2005 Apr;27(3): 193-219.
Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9 (TLR9的免疫激活性CpG 寡聚脱氧核普酸配体的药物开发进展)."Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 May; 5(5): 673-682
可选择的CpG寡核香酸可以包括上文引用的公开文献中描述的优 选序列变体，其不同在于具有无意义(inconsequential)的核苷酸序列置 换、插入、删除和/或添加。本发明的某些实施方案中使用的CpG寡 核苷可以通过本领域已知的任何方法合成(例如EP 468520)。可以利用 自动合成仪方便地合成这些寡核苷酸。所述寡核苷酸通常是脱氧核苷 酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯， 或更优选地是硫代磷酸键，尽管磷酸二酯也在本发明涉及的实施方案 范围内。也涉及包含不同核鲁酸间键合的寡核香酸，例如，混合的硫 代磷酸磷酸二酯。也可以使用稳定寡核芬酸的其它核苦酸间键。
辅佐剂
本文提供的某些实施方案包括疫苗组合物和免疫佐剂组合物，包 括药物组合物，所述组合物除了 GLA,含有至少一种辅佐剂，该辅佐剂指这种组合物中具有不同于GLA的佐剂活性的组分。具有所述佐剂 活性的辅佐剂包括一种成份，其在给予诸如人类(例如人类患者)、非 人类的灵长类、哺乳动物或具有公认的免疫系统的另一种高等真核生
物体的个体时能够改变(即，以统计学上显著的方式增加或降低；以及 在某些优选的实施方案中，增强或增加)免疫反应的能力和寿命。(参 见,如J i口 ， Powell and Newman, "Vaccine design-The Subunit and Adjuvant Approach (疫苗设计-亚单位和佐剂方法)"，1995， Plenum Press, New York)。在本文/>开的某些实施方案中，GLA和期望的抗原，以 及任选地一种或多种辅佐剂可以因此改变，例如引发或增强针对期望 的抗原的免疫反应，所述抗原可以与GLA同时给药，或者可以在时间 和/或空间上(例如，在不同的解剖学部位)分开给药。但某些发明实施 方案并不限制于此，还涉及在不包括指定抗原的组合物中的GLA的给 药，但所述组合物还可以包括一种或多种TLR激动剂、辅佐剂、咪唑 并喹啉免疫反应调节剂以及双茎环免疫调节剂(dSLIM)。
因此如上所述，辅佐剂包括除了 GLA之外具有佐剂作用的成分， 诸如皂苷和皂苷类似物，包括QS21和QS21类似物(参见,例如，U.S. Pat. No. 5,057,540; EP 0 362 279 Bl; WO 95/17210)、明矾、诸如番茄素的 植物碱、诸如(但不限于)皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨 酸的去垢剂、 一种或多种细胞因子(例如，GM-CSF， IL-2， IL-7, IL-12, TNF-a， IFN-力、咪唑并喹啉免疫反应调节剂以及双茎环免疫调节剂 (dSLIM,例如，Weeratna et al., 2005 Faca7ze 23:5263)。
在例如美国专利6,544,518， Lacaille-Dubois， M and Wagner H. (1996 2:363-386)，美国专利第5,057,540号，Kensil, O"
i ev 77^ C釘^ ， 1996， 12 (1-2): 1-55和EP 0 362 279 Bl中 讲述了包括皂苷的去垢剂。包含Quil A部分(皂芬)的称为免疫激活复 合物(ISCOMS)的孩i粒结构是溶血的，且已经用于疫苗的制备中 (Morein, B., EP 0 109 942 Bl)。据报道，这些结构具有佐剂活性(EP 0 109 942 Bl; WO 96/11711)。这些溶血急苦QS21和QS17 (Quil A的 HPLC纯化部分)已经作为有效的系统佐剂;故描述，且在U.S. Pat. No.5,057,540和EP 0 362 279 Bl中公开了它们的制备方法。这些参考
58文献中也描述了 QS7 (Quil-A的非溶血部分)作为系统疫苗的有效佐剂的用途。在Kensil et al. (1991. J. Immunology 146:431-437)中还描述了QS21的用途。QS21和聚山梨醇酯或环式糊精的组合也是已知的(WO99/10008)。在WO 96/33739和WO 96/11711中描述了包含诸如QS21和QS7的QuilA部分的微粒佐剂系统。已经用于系统接种疫苗研究的其它皂苷包括来自诸如丝石竹属(Gypsophila)和肥皂草属(Saponaria)的其它植物品种的那些(Bomford et al.， Kacc/"e, 10(9):572-577, 1992)。
七叶树皂角素(E s cin)是与用于本文公开的实施方案的佐剂组合物中的皂苷有关的另一种去垢剂。七叶树皂角素在默克索引(第12版第3737条目)中被描述为皂苷的混合物，存在于马栗树(horse chestnuttree),欧洲七叶杉于(Jescw/Ms/n》; ocflWawwm」的冲予中。描述了它通过层析和纯化(Fiedler， Arzneimittel- Forsch. 4, 213 (1953)),以及通过离子交换树脂(Erbring et al., U.S. Pat. No. 3，238,190)的分离。七叶树皂角素部分
M， et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8): 1454-1464))。毛地黄皂苷是另一种去垢剂，也在默克索引(第12版，第3204条目)中被描述为皂苷，其来自毛地黄CD/g/tofc/ i^pi^efl)的籽，并依照Gisvoldet al.， 爿m.J5^0c， 1934， 23, 664禾口 Rubenstroth-Bauer，尸Ajas7'o/.CA亂，1955, 301, 621描述的方法被纯化。
用于本文公开的某些实施方案中的其它辅佐剂包括嵌段共聚物或生物可降解聚合物，其涉及本领域相关技术人员熟悉的 一类聚合化合物。可以包括在GLA疫苗组合物内或GLA免疫佐剂内的嵌段共聚物或生物可降解聚合物的实例包括普流罗尼克⑧L121 (BASF Corp.，Mount Olive, NJ;参见，例如，Yeh et al" 1996 PZ 画.版13:1693;美国专利第5,565,209号)、CRL1005 (例如，Triozzi et al., 1997 C"" C證.
3:2355)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚-(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、以及聚I:C。(参见,例如，Powell andNewman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计—亚单^立和佐剂方法)"，1995, Plenum Press, New York)
59某些实施方案涉及包括油的GLA疫苗和GLA免疫佐剂，所述油在某些此类实施方案中可以促进辅佐剂活性，在其它的此类实施方案中可以附加地或选择地提供药学上可接受的载体或赋形剂。已知许多
疫佐剂组合物中。举例来说，此类油的实例包括但不限于角鲨烯、角鲨烷、矿物油、橄榄油、胆固醇和二缩甘露醇单油酸酯。
已知的，并可以作为辅佐剂包括在本发明公开的某些实施方案中。某些优选的咪唑并喹啉免疫反应调节剂包括(作为非限定性实例)雷西莫特(R848)、咪p奎莫特和嘎德莫特(Hemmi et al., 2002 A^. 7mmt/"o/.3:196; Gibson et al" 2002 Ce//. /mw腳/. 218:74; Gorden et al., 2005/mww"o/. 174:1259);这些和其它的咪唑并会啉免疫反应调节剂在适当的条件下，也可以具有本文描述的TLR激动剂活性。其它的免疫反应调节剂是基于核酸的双茎环免疫调节剂(dSLIM)。可以在Schmidt et al.,2006 垂rgy 61:56; Weihrauch et al. 2005 C// C羅w11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals， J. Knablein (Editor).John Wiley & Sons, December 6, 2005.(183至约200页讨论了 dSLIM)中，以及从Mologen AG (Berlin, FRG: [2006年8月18曰在http:〃www,mologen.com/English/ 04.20-dSLIM.shtml的在线4全索]中发现被涉及用于本发明公开的某些实施方案中的dSLIM的具体实例。
如上文所述，与本文所述的GLA —起使用的一种辅佐剂可以是铝辅佐剂，其通常被称为"明矾"。明矾辅佐剂基于下述羟基氧化铝、^畴酸羟铝，或各种专利盐(proprietary salts)。使用明石凡辅佐剂的疫苗可以包括用于破伤风菌抹、HPV、曱型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒的疫苗以及本文描述的其它抗原。铝辅佐剂是有优势的，因为它们具有良好的安全记录、能放大抗体反应、稳定抗原并且用于大规模生产相对简单。(Edelman 2002 Mo/. 21:129-148; Edelman， R. 1980
Rev. /"/ec/.版2:370-383,)
可以与GLA结合用于有效的免疫刺激的其它辅佐剂包括皂普和皂苷类似物，包括QS21以及在本文被称为QS21类似物的产生相似作用的结构相关化合物。QS21已经被公认为是优选的辅佐剂。QS21可以包含来自智利皂笑树(Qi"llaja Saponana Molma)的树皮、经11PLC纯化的非毒性部分。在U.S. Pat, No. 5，057，540中公开了 QS21的制备。(还可参见美国专利第6,936,255, 7,029,678和6,932,972号)
在某些实施方案中，GLA也可以与被称为ISCOMS的"免疫激活复合物"(例如美国专利第6,869,607, 6,846,489， 6,027,732， 4,981,684号)结合，包括皂普来源的ISCOMATRIX ,其可以从例如Iscotec(Stockholm, Sweden)和CSL Ltd. (Parkville， Victoria, Australia)商购。
重组表达构建体
依照本文公开的某些实施方案，GLA疫苗组合物可以含有至少一种重组表达构建体，其包含可操作连接于编码抗原的核酸序列的启动子。在某些另外的实施方案中，所述重组表达构建体存在于诸如腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、慢病毒、痘病毒或逆转录酶病毒载体的病毒载体中。制备和使用这些表达构建体和载体的组合物和方法是本4贞i或已4口的，侈ij々口依照、Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols inMolecular Biology (新编分子生物学实验指南)，2006 John Wiley &Sons, NY，用于本文提供的多肽抗原的表达。通常可以在例如美国专利第6,844,192; 7,037,712; 7,052,904; 7，001，770; 6,106,824; 5,693,531;6,613,892; 6，875，610; 7,067,310; 6,218,186; 6,783,981; 7，052，904;6,783,981; 6,734,172; 6,713,068; 5,795,577和6,770,445号以及别处找到用于某些本发明公开的实施方案中的重组表达构建体的非限定性实例，以及适用于本文提供的多肽抗原表达的教导。
免疫反应
本发明因此提供了在能够启动免疫反应的宿主内改变(即，例如，相对于本领域的技术人员熟悉的适当对照，以统计学上显著的方式增强或降低)免疫反应的组合物。正如本领域的普通技术人员已知的，免疫反应可以是宿主免疫状态的任何积极的改变，其可以包括参与宿主免疫状态的维持和/或调节的一种或多种组织、器官、细胞或分子的结构或功能的任何改变。通常，可以通过多种公知的参数的任一种^^测免疫反应，这些参数包括但不限于体内或体外的下述^r测可溶性免疫球蛋白或抗体的检测；诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介质以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核普和/
或脂质介质的检测；由免疫系统中细胞改变的功能或结构特性确定的
细胞激活状态的变化，例如细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基
因表达或溶细胞行为的专门活性诱导；通过免疫系统的细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)；或者任何其它可以;险测免疫反应存在的标准。
免疫反应通常被认为是，例如，通过宿主免疫系统的细胞和组织在分子和细胞水平上区分自身结构和异已结构，但本发明不应局限于此。例如，免疫反应还可以包括由自身分子、细胞或组织的免疫识别导致的免疫系统状态变化，这可以伴随诸如免疫系统组分的典型调节的许多正常状态，或者可以存在于诸如在自身免疫和退行性疾病中观测到的不适当的自身免疫反应的病理状态。作为另一个实例，除了诱导特定免疫系统活性的上调(诸如抗体和/或细胞因子产生，或者细胞介导的免疫激活)外，免疫反应还可以包括可检测的免疫的抑制、消弱或任何其它的下调，这可以是由选择的抗原、抗原给药途径、特异耐受诱导或其它因素导致的。
可以通过本领域的普通技术人员易于熟悉的许多公知的免疫学测定的任一种来建立由本发明的疫苗诱导的免疫反应的检测。这些测定包括，但不必限于体内或体外的下述检测可溶性抗体的检测；诸如细胞因子、淋巴因子、趋化因子、激素、生长因子等可溶性介质以及其它可溶性小肽、碳水化合物、核苦和/或脂质介质的检测；由免疫系统中细胞改变的功能或结构特性来确定的细胞激活状态的变化，例如细胞增殖、改变的运动性、诸如特异性基因表达或溶细胞行为的专门活性诱导；通过免疫系统的细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或凋亡的启动(程序性细胞死亡)。进行这些和类似测定的操作步4聚是7>#口的，并且可以在<列^口 Lefkovits (/wmwwo/ogy Me/Aofi^ Afawwa/:T7zg C頻/ rg/ze聽've <S<9MrcedooA o/rec/zm々w&s (0^瘦夢才法手H面的戎j谅參,劝，1998;也可参见C群eW尸ratoco/".w/画丽o/柳W建夢豸-绘 /^」；还可参见，例如，Weir, i7aw必ooA: o/ ￡r/ en>ne"M/
62/mmwwo/ogy (^^發^瘦夢手^f」，1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) Se/ecto/ M^Ao^s Ce〃w/ar 7mmwwo/ogy 〈勿應 f瘦夢才法;#逸」，1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green andReed， 1998 Sde"ce 281 :1309和其中引用的参考文件)中找到。
抗原反应性T细胞增殖的检测可以通过多种已知的技术实现。例 如，T细胞增殖可以通过测量DNA合成的速率来^r测，且抗原特异性 可以通过控制暴露于候选的抗原反应性T细胞的刺激物(诸如，例如， 特异性期望的抗原-脉冲抗原呈递细胞或对照抗原-脉冲抗原呈递细月包) 来测定。被刺激增殖的T细胞显示了增加的DNA合成速率。测量DNA 合成速率的经典方式是，例如，通过用含氚的胸腺嘧咬脉沖标记T细 胞培养物，所述含氚的胸腺嘧啶是掺入新合成的DNA的核苷前体。 掺入的含氣胸腺。密啶的量可以用液体闪烁谱仪来测定。检测T细胞增 殖的其它方式包括测量白介素-2 (IL-2)产生的增加、Ca"流出或染料摄 取，诸如3-(4，5-二甲基p塞唑-2-基)-2,5-联苯-四唑。可选择地，可以测 量淋巴因子(诸如干扰素-力的合成，或者可以定量应答特定抗原的T 细胞的相对数目。
例如，可以通过采用诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、平衡透析或包括Western印迹的固相免疫印迹的体外方法学， 测定来自用本发明的疫苗处理的宿主的样本(例如，包含免疫球蛋白的 样本，诸如血清、血浆或血液)来检测抗原特异性抗体的产生。在优选 的实施方案中，ELISA测定还可以包括用靶抗原特异性的固相单克隆 抗体进行靶抗原的抗原捕获固定，例如，以增加该测定的^:感性。例 如，使用商业途径容易得到的方法、装置和试剂(例如Sigma, St. Louis, MO;还参见R&D Systems 2006 Catalog, R&D Systems, Minneapolis, MN),通过酶联免疫吸附测定(ELISA)也可以容易地检测可溶性介质 (例如，细胞因子、趋化因子、淋巴因子、前列腺等)的详细结果。
许多其它的免疫学参数可以使用本领域公知的常规测定来监测。 这些可以包括，例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC) 测定、继发性体外抗体反应、利用已确立的标志物抗原系统进行各种 外周血细胞或淋巴样单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光测定分析、免
63疫组织化学或其它相关的测定。例如，可以在Rose etal. (Eds.), Ma聽a/
5成人1997 American Society of Microbiology, Washington, DC中找到 这些和其它测定。
因此，本发明涉及本文提供的疫苗和佐剂组合物能够引发或增强 宿主的至少一种免疫反应，所述免疫反应选自Th1-型T淋巴细胞反应、 Th2-型T淋巴细胞反应、细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应、抗体反应、 细胞因子反应、淋巴因子反应、趋化因子反应以及炎症反应。在某些 实施方案中，免疫反应可以包含下述中的至少一种 一种或多种细胞 因子的产生，其中所述细胞因子选自千扰素-7(IFN-7)、肿瘤坏死因子 -a (TNF-a); —种或多种白介素的产生，其中所述白介素选自IL-l、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-8、 IL陽IO、 IL-12、 IL-13、 IL-16、 IL-18 和IL-23; —种或多种趋化因子的产生，其中所述趋化因子选自 MIP-lce、 MIP-1 0、 RANTES、 CCL4和CCL5;以及选自记忆性T细 胞反应、记忆性B细胞反应、效应T细胞反应、纟田月包毒T细胞反应以 及效应B细胞反应的淋巴细胞反应。参见，例如WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6,692,752; U.S. 7,084,256; U.S. 6,977,073; U.S. 6,749,856; U.S. 6,733,763; U.S. 6，797，276; U.S. 6,752,995; U.S. 6,057,427; U.S. 6,472,515; U.S. 6,309,847; U.S. 6,969,704; U.S. 6,120,769; U.S. 5,993,800; U.S. 5,595,888; Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6951 ; Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53;Beutler et al., 1986 Nature 320:584; U.S. 6，991 ,791 ; U.S. 6，654，462; U.S. 6,375,944。 药物组合物
药物组合物通常包含GLA (可/人Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL购买；产品号699800),且还可以包含本文提供的与药学上可接受 的载体、赋形剂或稀释剂结合的一种或多种组分，其选自抗原、TLR 激动剂、辅佐剂(任选地包括细胞因子、咪唑并喹啉免疫反应调节剂和 /或dSLIM)和/或重组表达构建体。
因此，在某些方面，本发明涉及GLA"单治疗"，其中如本文所述 的，GLA被配制于基本上没有其它抗原的组合物中，并被给予个体以
64激活免疫反应，例如非特异性免疫反应，由此治疗或预防疾病或其它 状态，诸如生物体导致的感染。在一个实施方案中，例如，本发明的 组合物和方法采用了单磷酰二糖用于激活个体的免疫反应。在另一特 定实施方案中，所述组合物和方法使用脂质A的2-单酰形式来激活个
体的免疫反应。在另一特定实施方案中，GLA采用了喷雾形式，任选 地以试剂盒的形式提供。
GLA可以优选配制于稳定的乳剂中。在一个特定的实施方案中， 例如，提供了在基本上没有其它抗原的稳定乳剂中包含脂质A衍生物 的组合物。在另一个特定的实施方案中，提供了适用于哺乳动物的包 含3-酰基单磷酸脂质A的衍生物的组合物，其中2位氨基具有单酰链， 且该组合物基本上没有其它抗原。
在某些其它实施方案中，药物组合物是包含GLA和抗原的疫苗组 合物，另外还可以包含本文提供的与药学上可接受的载体、赋形剂或 稀释剂结合的一种或多种组分，其选自TLR激动剂、辅佐剂(包括例 如细胞因子、咪唑并壹啉免疫反应调节剂和/或dSLIM)等和/或重组表 达构建体。
示例性的载体在使用的剂量和浓度对受者无毒。对于基于GLA加 核酸的疫苗，或者对于包含GLA和抗原的疫苗，每千克体重给予约 0.01]Ltg至约100 mg，通常是通过皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径或 通过其它途径给予。
优选的剂量是约1 /Ag/kg至约1 mg/kg，特别优选的是约5 /xg/kg 至约200jLig/kg。对本领域的技术人员显而易见的是，给药的数量和频 率依赖于宿主的反应。用于治疗用途的"药学上可接受的载体"是药学 领域7>知的，且在例如Remingtons Pharmaceutical Sciences(雷明顿药 物科学)，Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)中被描述。例 如，可以使用生理学pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐。防腐剂、稳定剂、 染料以及甚至调味剂都可以提供在药物组合物中。例如，苯曱酸钠、 山梨酸和对羟基苯曱酸酯可以作为防腐剂加入。同上在1449。此外， 可以使用抗氧化剂和悬浮剂。同上。"药学上可接受的盐"指本发明的化合物的盐，其来自所述化合物和 有机酸或无机酸(酸加成盐)或者有机或无机碱(碱加成盐)的合并物。本 发明的组合物可以以游离碱或盐的形式使用，两种形式都被认为是在 本发明的范围内。
药物组合物可以是允许该组合物给予患者的任何形式。例如，所 述组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶)的形式。给药的典型途径 包括，但不限于，口部的、表面的、肠胃外的(例如舌下的或经颊的)、 舌下的、直肠的、阴道的以及鼻内的(例如作为喷雾剂)。本文使用的
术语肠胃外的包括电离子导入(例如U.S. 7,033,598; 7,018,345; 6，970，739)、超声波导入(例如，U.S. 4,780,212; 4,767,402; 4,948,587; 5,618,275; 5,656,016; 5,722,397; 6,322,532; 6,018,678)、热的(例如U.S. 5,885,211; 6,685,699)、被动透皮(例如U.S. 3，598,122; 3,598,123; 4,286,592; 4，314,557; 4,379,454; 4,568,343; 5,464,387; UK Pat. Spec. No. 2232892; U.S. 6,871 ,477; 6,974,588; 6,676,961)、微针(例如U.S. 6,908,453; 5,457,041 ; 5,591 ,139; 6，033,928)给药，且还包括皮下注射、 静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵窦内(intmcavernous)、鞘内(intrathecal)、 外耳道内(intrameatal)、尿道内注射或输注方法。在特定的实施方案中， 本文描述的组合物(包括疫苗和药物組合物)通过选自电离子导入、微 气穴(microcavitation)、超声波导入或微针的技术皮内给药。
如此配制药物组合物以使在将该组合物给予患者时，包含其中的 活性成分是生物可利用的。给予患者的组合物釆用 一个或多个剂量单 位的形式，其中，例如，药片可以是单一剂量单位，以气溶胶形式的 本发明的 一种或多种化合物的容器可以有多个剂量单位。
对于口服给药，可以存在赋形剂和/或粘结剂。实例是蔗糖、高岭 土、淀粉糊精、藻酸钠、羧曱基纤维素和乙基纤维素。着色剂和/或调 味剂可以存在。可以使用涂层。
组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬浮剂。 作为两个实例，所述液体可以口服给药或通过注射递送。当意名叉口服 给药时，优选的组合物包含甜味剂、防腐剂、染色/着色剂以及增味剂 的一种或多种。在意欲通过注射给药的组合物中，可以包括表面活性
66剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、緩冲液、稳定剂和等渗剂的 一种或多种。
本文使用的液体药物组合物药物组合物，无论是以溶液、悬浮液 的形式或其它相似的形式，都可以包括下述载体或赋形剂的一种或多 种诸如注射水、盐水溶液、优选生理盐水、林格液、等渗氯化钠的 无菌稀释液，诸如角豊烯、角鲨烷、矿物油、二缩甘露醇单油酸酯、 胆固醇和/或合成的单和二甘油酯的可以作为溶剂或悬浮介质的不挥
发性油，聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它溶剂；诸如苯甲醇或尼泊 金甲酯的抗菌剂；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二 胺四乙酸的螯合剂；诸如乙酸盐、种檬酸盐或磷酸盐的緩沖液以及诸 如氯化钠或葡萄糖的张力调节剂。肠胃外制剂可以装入安瓿、 一次性 注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量瓶内。可注射的药物组合物优 选是无菌的。
在特别的实施方案中，本发明的药物或疫苗组合物包含小于0.2 um的稳定水悬浮液，且进一步包含选自磷脂、脂肪酸、表面活性剂、 去垢剂、皂苷、含氟脂(fluorodatedlipids)等的至少一种组分。
在另一个实施方案中，本发明的组合物以可以雾化的方式配制。 在疫苗或药物组合物中包括诸如递送载体的其它组分也可以是理 想的，所述递送载体包括但不限于铝盐、油包水型乳剂、生物可降解 油载体、水包油型乳剂、生物可降解微胶嚢以及脂质体。在上文也描
括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷酰胺(MDP)、葡聚糖、IL-12、 GM-CSF、 7干扰素和IL-12。
尽管本发明的药物组合物可以使用本领域的技术人员已知的任何 合适的载体，但载体的类型依赖给药方式和是否需要持续释放而变化。 对于肠胃外给药，诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、乙醇、脂 肪、蜡或緩沖液。对于口服给药，可以使用上述载体的任一种或固体 载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、 葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以使用生物可降解的微球体(例如聚乳交 酯(polylactic galactide))作为本发明的药物组合物的载体。例如在美国专利第4，897，268和5,075,109号中公开了合适的生物可降解的微球体。 在这点上，大于约25微米的微球体是优选的。
药物组合物(包括GLA疫苗和GLA免疫佐剂)也可以含有诸如緩 沖液的稀释液，诸如抗坏血酸的抗氧化剂、低分子量(少于约10个残 基)的多肽、蛋白质、氨基酸、包括葡萄糖、蔗糖或糊精的碳水化合物， 诸如EDTA的螯合剂，谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐 水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性的适当的稀释液。优 选地，使用适当的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释液可以将产品配 制成冷冻干产物。
如上文所述，在某些实施方案中，本发明包括能够递送编码期望 的抗原的核酸分子的组合物。这种组合物包括重组病毒载体(例如，逆 转录病毒(参见WO 90/07936, WO 91/02805， WO 93/25234, WO 93/25698和WO 94/03622)、 &泉病毒(参见Berkner,所o&c/ m々i^s 6:616-627, 1988; Li et al.， //謂.G匿77 e广4:403-409， 1993; Vincent et al.，淑.5:130-134， 1993; and Kolls et al" P亂胸/. Jcad. W.
97:215-219, 1994),痘病毒(参见美国专利第4,769,330号；美国专 利第5,017，487号；和WO 89/01973))、络合到聚阳离子分子的重组表 达构建体核酸分子(参见WO 93/03709),以及与脂质体结合的核酸(参 见Wang et al.，尸亂胸/. Jed Sc/.固84:7851 , 1987)。在某些实施 方案中，DNA可以连接到杀死的或灭活的腺病毒(参见Curiel et al.， //wm. Gewe rAer 3:147-154， 1992; Cotton et al., iVoc.爿cad. Sd.
89:6094， l"2)。其它合适的组合物包括DNA-配体(参见Wu et al., C力em. 264:16985-16987, 1989)和脂质-DNA组合物(参见 Feigner et al.，尸rac. Mz". JcaA <Scz'. 84:7413-7417, 1989)。
除了直接的体内操作，也可以采用间接体内(ex vivo)操作，其中将 细胞从宿主取出，修饰并置入相同的宿主动物或另外的宿主动物。显 然，本领域技术人员可以利用上述组合物的任一种将编码抗原的核酸 分子导入间4妻体内环境中的组织细胞。用于病毒的、物理的和化学的 才聂取方法的操作是本领域公知的。因此，本发明用于增强或引发宿主、患者或细胞培养物的免疫反 应。如本文使用的，术语"患者，，指任何温血动物，优选人类。患者可 以罹患传染性疾病、诸如乳腺癌的癌症或自身免疫疾病，或者可以是 正常的(即，没有可检测的疾病和/或感染)。"细胞培养物"是含有免疫 活性细胞或免疫系统的分离的细胞(包括，但不限于，T细胞、巨p盆细 胞、单核细胞、B细胞和树突状细胞)的任何制备物。所述细胞可以通 过本领域普通技术人员公知的多种技术来分离(例如聚蔗糖-泛影葡胺
(Ficoll-hypaque)密度离心)。细胞可以(但不必须)从罹患癌症的患者中 分离出，且可以重新导入治疗后的患者。
在某些实施方案中，意欲肠胃外或口服给药的液体组合物应该含 有一定量的GLA疫苗组合物以达得合适的剂量。通常，该量是组合物 中抗原重量的至少0.01%。当意名爻口服给药时，该量可以在组合物重 量的0.1%至约70%变动。优选的口服组合物含有约4%至约50%的抗 原。优选的组合物和制剂如下制备使肠胃外剂量单位含有0.01%至 1%重量比的活性成分。
药物组合物可以用于表面给药，在这种情况下，载体可以适宜地 包括溶液、乳剂、药膏或凝胶基质。所述基质，例如，可以包括下述 中的一种或多种矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、诸如水 和乙醇的稀释液，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于表面 给药的药物组合物中。如果计划透皮给药，组合物可以包括透皮贴片 或电离子导入装置。表面制剂可以含有来自约0.1%至约10% w/v (每 单位体积的重量)的抗原(例如GLA-抗原疫苗组合物)或GLA (例如免 疫佐剂组合物；GLA可以从Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL处 得到；例如产品号699800)的浓缩物。
意欲直肠给药的组合物，可以采用例如栓剂的形式，其在直肠内 溶化并释放出药物。用于直肠给药的组合物可以含有作为合适的无刺 激赋形剂的油脂性基质。这种基质包括，但不限于，羊毛脂、可可油 和聚乙二醇。在本发明的方法中，疫苗组合物/佐剂可以通过使用插入 物、珠子、延时释放制剂、贴片或快速释放制剂来给药。
69某些实施方案也涉及包含本文描述的GLA疫苗组合物和/或GLA 免疫佐剂组合物的试剂盒，其可以以一种或多种容器提供。在一个实 施方案中，GLA疫苗组合物和/或GLA免疫佐剂组合物的所有组分共 同存在于单个容器内，但本发明的实施方案并不限制于此，还可以涉 及两个或多个容器，其中，例如，GLA免疫佐剂组合物与抗原组分分 离，互不接触。通过非限定的理论，认为在一些情况下，GLA免疫佐 剂组合物的单独给药是有益的，而在另一些情况下，这种给药与抗原 的给药在时间上和/或空间(例如在不同的解剖部位)上分开是有益的， 仍在另 一些情况下，个体的给药是有益地给予本文所述的GLA疫苗组 合物，其包含抗原和GLA，以及任选地，最好还是本文所述的其它组 分。
所述试剂盒实施方案的容器可以是任何合适的容器，器皿、小瓶、 安瓿、管子、杯子、盒子、瓶子、长颈瓶、罐、盘、单孔或多孔器械 的孔、槽、桶等等，或者其它装置，本文公开的组合物可以在其中放 置、储存和/或转运，并易于移走其中的内容物。通常，这种容器可以 由与目的用途相兼容的材料制造，从中可以容易地实现包含的内容物 的回收。这种容器的优选实例包括玻璃和/或塑料密封的或可重新密封 的管子和安瓿，包括具有橡胶隔膜的那些或其他密封的装置，其使用 针和注射器与内容物的回抽兼容。例如，这样的容器可以由玻璃或化 学兼容的塑料或树脂制成，该玻璃或化学兼容的塑料或树脂可以由一 种材料制成，也可以是涂覆由这种材料，该材料允许容器中的物质的 有效回收和/或保护这种物质免受例如诸如紫外线或温度极限的降解 条件的影响，或防止包括微生物污染物的不必要的污染物进入。容器 优选地为无菌的或可灭菌的，并且由可与任何载体、赋形剂、溶剂、 媒介物等兼容的材料制成，这样可被用于悬浮或溶解本文所描述的疫 苗组合物和/或免疫佐剂组合物和/或抗原和/或重组表达构建体等等。
乳剂系统还可以用于配置本发明的组合物。例如，许多单相或多 相乳剂系统已经被描述。已经证明，水包油乳剂佐剂本身作为一种辅 助成分是有用的(EP 0 399 843B)。此外，水包油乳剂和其他活性剂的 合并物作为疫苗佐剂也已经^皮描述(WO 95/17210; WO 98/56414; WO99/12565; WO 99/11241)。已描述了其他油乳剂佐剂，诸如油包水乳剂 (U.S. Pat. No. 5,422,109; EP 0 480 982 B2)和水包油包水乳剂(U.S. Pat. No. 5.424,067; EP 0 480 981 B)。用于本发明的油乳剂佐剂可以是天然 的或合成的，可以是矿物的的或有机的。矿物油和有机油的实例很容 易为本领域的技术人员所理解。
在一个特别的实施方案中，本发明的组合物包含水包油乳剂，其 中GLA掺入油相中。在另一个实施方案中，本发明组合物物包含水包 油乳剂，其中GLA掺入油相中，并存在另外的组分，诸如本文所描述 的辅佐剂、TLR激动剂等。
为了使任何水包油组合物适合对人类的给药，乳剂系统的油相优 选包含一种可代谢油。术语可代谢油的含义为本领域所熟知。可代谢 可以被定义为"能够通过新陈代谢被转化，，(Dorland's illustrated Medical Dictionary (道兰氏图解医学词典)，W. B. Saunders Company, 25th edition (1974))。所述油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成 油，其对受体无害且能够通过新陈代谢被转化。坚果(例如花生油)、 种子和谷物是植物油最通常的来源。合成油也是本发明中的 一部分， 可以包括商用油，例如NEOBEEe及其他。
例如角鲨烯(2,6,10， 15,19,23-六曱基-2,6,10,14,18，22-二十四碳六 烯)，是一种不饱和油，在鲨鱼肝油中大量存在，在橄榄油、麦芽油、 米糠油和发酵粉中含量较少，它是用于本发明的特别优选的油。考虑 到角鲨烯是胆固醇生物合成中的中间物(默克索引，第10版，第8619 条目)，因此它是可代谢的油。特别优选的油乳剂是水包油乳剂，尤其 是水包角鲨烯乳剂。另外，本发明中最优选的油乳剂佐剂包含一种抗 氧化剂，其优选地为a生育酚油(维生素E, EP 0 382 271 Bl)。 WO 95/17210和WO 99/11241公开了任选地与免疫刺激剂QS21和/或 3D-MPL(上文已经讨论过)配制的基于角鲨烯、ce生育酚、吐温⑧80 (TWEEN⑧80)的乳剂佐剂。WO 99/12565公开了通过在油相中加入固 醇，对这些角鲨烯乳剂的改进。另夕卜，甘油三酯，诸如三辛精((327115()06) 可以被加入油相中，以便稳定乳剂(WO 98/56414)。
71存在于稳定的水包油乳剂中的油滴的大小优选直径小于1微米，
可以在基本上30-600nm的范围内，优选直径基本上约30-500 nm，且 最优选直径基本上为150-500 nm，特别是直径约为150 nm，所述直径 是用光子相关光谱法测量的。在这一点上，数目为80%的油滴应在优 选的范围内，数目更优选超过90%和最优选地超过95%的油滴位于限 定的大小范围内。存在于本发明中的油乳剂中的组分的量常规是2% 至10%的诸如角罝烯的油；2%至10%的a生育酚(如果存在时)；以及 0.3%至3%的表面活化剂，诸如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。优选 地，油a生育酚的比例等于或少于1，这样能提供更稳定的乳剂。司 盘85也可以以约1%的水平存在。在某些情况下，本发明中的疫苗另 外含有稳定剂是有益处的。
法包括将油相与如PBS/吐温80⑧溶液的表面活性剂混合，随后用均质 器均质化。例如，包括将混合物通过注射器针头一次、两次或更多次 的方法适合均质化少量的液体。同样地，在微射流均质器(microfluidiser) (M110S微流体仪，最大50个通道，在6帕的最大输入压(约为850帕 的输出压)下作用2分钟时间)中的乳化过程适合制备较小或较大体积 的乳剂。可以通过包括测量产生的乳剂的常规试验来进行这种调整， 直至制备出所需直径的油滴。
下面提供的实施例用于说明而非限制。
实施例
实施例1
GLA水制剂
本实施例描述了含有GLA的佐剂水制剂的制备。该GLA水制剂 (GLA-AF)含有注射水(WFI)、 GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; 产品号 699800)和 1-棕榈酰-2-油酰-胆碱磷酸 (l隱palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphochline, POPC)。 通过卄寻乙醇 和POPC溶液添加到预称重量的GLA中制备所述制剂。将润湿的GLA 超声10分钟以尽可能地分散GLA。然后将GLA在氮气中干燥。干燥
72的GLA和POPC用WFI重新水化以达到恰当的体积。将该溶液在60°C 下超声15-30分钟，直至所有的GLA和POPC都溶解。对于长期的保 存，GLA-AF制剂必须冻干。冻干过程包括将甘油添加到溶液中，直 到达到总体积的2%。然后将溶液置于l-10mL量的小瓶中。随后使小 瓶经历冻干过程，该过程包括冰冻溶液及随后将其置于真空中通过升 华抽走冻结的水份。
实施例2
GLA HPLC分析
本实施例描述了含GLA的佐剂水制剂的HPLC分析。将该制剂生 产出后(参见，上述实施例1),要进行某些放行和稳定性检验以确保产 品质量和重现性。所有的制剂都要使用高效液相层析(HPLC)、动态光 散射(DLS)和视觉检测来进行放行和长期稳定性检验。使用Agilent 1100系统和ESA电雾式冲全测器采集HPLC层析谱。该方法在Waters Atlantis C18柱上采用曱醇到氯仿梯度来执行。注射液分别包括2.5 gg 的GLA(Avanti Polar Lipids, Inc,， Alabaster, AL;产品号699800, GLA-AF)或MPL (GSK Biologicals， Rixensart， Belgium, MPL画AF),和 作为助溶剂的0.27 的合成磷酸胆碱(POPC)。
图1显示了表明MPL-AF和GLA-AF中的污染物质的数目和含量 的HPLC数据。
HPLC谱显示了 GLA-AF比MPL-AF更纯。也就是说，GLA誦AF 中的污染物峰少于MPL-AF佐剂制剂中的污染物峰。较纯的起始产物 对研究者来说益处巨大，因为获得的生物反应来自用于GLA制剂中的 单一的主要组分。
实施例3
GLA油制剂
本实施例描述了 1毫升含有GLA的佐剂油制剂的制备。将 GLA(100微克；Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800) 与溶于25毫摩尔磷酸铵緩沖液(pHN5.1)中的甘油(22.7mg)、磷脂酰胆
73碱或卯磷脂(7.64 mg)、普流罗尼克⑧F-68 (BASF Corp.， Mount Olive, NJ)或类似的嵌段共聚物(0.364 mg)在角鲨烯(34.3mg)中乳化，使用0.5 mgD,L-a-生育酚作为抗氧化剂。在高压下处理该混合物，直至形成不 分散的且具有小于180 nm的平均粒度的乳剂。然后将乳剂无菌过滤至 玻璃单位剂量瓶中并加盖以储存较长时间。该制剂在2-8°C下储存时， 可以使用至少三年。
实施例4
GLA对鼠巨噬细胞和树突状细胞的刺激
本实施例描述了表明GLA的佐剂作用的体外模型。采用标准的组 织培养方法学和试剂。按照供应商的建议，维持鼠J774和RAW267.4 巨喧细月包系的细月包(American Type Culture Collection, Manassas, VA)， 并将其在多孔器皿中以粘附的细胞单层培养。遵循Xiong " a/.(J. Biol. Chem 2004, 279， ppl0776-83)的实验方案，树突状细胞源自骨髓祖细 胞。通过在细胞培养基(含有10%胎牛血清的DMEM)中稀释水性佐剂 制剂获得合成GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号 699800)的多种佐剂浓度，并在收集无细胞培养物上清前，将细胞在含 有5% C02的湿润空气中于37°C维持24小时。使用特异性的夹心 ELISA测定试剂盒(细胞因子试剂盒来自eBiosciences, San Diego， CA, 趋化因子试剂盒来自R&D Systems, Minneapolis, MN)，，換照生产商的 说明书，测定上清液中诸如IL-12、 IL-6和TNF的可溶性鼠细胞因子， 以及诸如RANTES的趋化因子。
GLA-AF在小鼠巨噬细胞系和原代鼠树突状细胞(DC)中诱导剂量 依赖性免疫反应，这由诸如IL-12p40、 IL-6和TNF的细胞因子以及如 RANTES的趋化因子分泌所表征。
实施例5
GLA对人巨噬细胞和树突状细胞的刺激
本实施例描述了表明GLA的佐剂作用的体外模型。使用了标准的 组织培养方法学和试剂。
74按照供应商的建议，维持人Mono Mac 6巨噬细胞系(美国典型培 养物保藏中心，Manassas, VA)的细胞，并将其在多孔板中以粘附的细 胞单层培养。遵循标准的实验方案，树突状细胞源自外周血单核细胞 (PBMC)。通过将水性佐剂制剂稀释于细胞培养基(对于MonoMac 6, 是含有10%的胎牛血清的DMEM;对于DC,是含有10%人血清的 DMEM)中，得到合成GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产 品号699800)或天然产物MPL (GSK Biologicals， Rixensart, Belgium) 的多种佐剂浓度，并在收集无细胞培养物上清之前，将细胞在含有5% C02的湿润空气中于37°C维持24小时。 -使用特异性的夹心ELISA测 定试剂盒(细胞因子试剂盒来自eBiosciences， San Diego, CA，以及趋化 因子试剂盒来自R&D Systems, Minneapolis, MN)，按照生产商的说明 书，测定上清液中诸如IL-1(S、 IL-23和IL-6的可溶性人细胞因子，以 及诸如IP-10 、 RANTES和MIP-1/3的趋化因子。
图2显示了表明细胞因子和趋化因子的水平的ELISA数据，所述 细胞因子和趋化因子是由Mono Mac 6细胞系的巨噬细胞(图a-e)以及 单核细胞来源的树突状细胞(图f-h)应答GLA刺激时表达的。
GLA-AF在人巨噬细胞系Mono Mac 6(图2，图a-e)以及原代DC (图2，图f-h)中诱导了剂量依赖性免疫反应，这由诸如IL-1/3、 IL-6、 IL-23的细胞因子和诸如RANTES 、 IP-10 、 MIP-1 )8的趋化因子的分泌 所表征。对于测试的所有细胞因子和趋化因子，浓度在5-500的 GLA-AF的活性^f氐于MPL-AF。
实施例6
GLA对人血细胞的刺激
本实施例描述了表明GLA的佐剂作用的体外模型。使用了标准的 组织培养方法学和试剂。
用合成 GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号 699800)或天然产物MPL (GSK Biologicals, Rixensart, Belgium)的多
种佐剂浓度培养人全血细胞，所述佐剂浓度是通过将水性佐剂制剂溶 于细胞培养基(含有10%胎牛血清的DMEM)中得到的。在收集无细胞
75培养物上清之前，将血细胞在含有5% C02的湿润空气中于37°C维持 16小时n使用特异性的夹心F,T,TSA测定试剂盒(eBiosciences， San Diego CA)，按照生产商的说明书，测定上清液中可溶性人细胞因子IL-W。 GLA-AF在人全血细胞中诱导了剂量依赖性的免疫反应，这由 IL-1/5细胞因子的分泌所表征。在该测定中，92 nM的GLA在功效方 面等价于57,000 nM的MPL-AF。
实施例7
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GL A在流感疫苗中的佐剂作用的体内模型。 采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免 疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在三周时间内，用人类剂量的1/25 (20 /il)和1/250 (2 /xl)的Fluzone 疫苗(Sanofi-Aventis， Swiftwater， PA)免疫小鼠(每组3只Balb/c动物) 两次，所述疫苗单独使用，或配制于(i)依照上述实施例1使用的操作 步骤的含有GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号 699800;每次免疫每只动物给予20 pg)的水性乳剂("GLA-AF")中，或 者配制于(ii)依照上述实施例3使用的操作步骤的含有GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800;每次免疫每只动物 给予20 jLtg)的稳定乳剂("GLA-SE")中。每次免疫后一周，通过给动物 放血采集血清，并依照发表的方法(同上)通过ELISA检测特异针对 Fluzone的总IgG抗体血清水平。依照发表的方法，通过血凝抑制实验 (HAI)也检测了病毒中和抗体的血清水平。
图3显示了 ELISA数据，表明了使用两种不同剂量的与GLA-AF 或GLA-SE配制的Fluzone疫苗每次免疫后一周(即，在第7天，图A; 以及在第28天，图B),与单独使用Fluzone相比，在小鼠体内诱导的 抗Fluzone抗体产生的水平。显示了每组/时间点中的倒数终点滴度的 平均值和标准误。图3的图C显示了 HAI数据，表明了使用两种不同 剂量的与GLA-AF或GLA-SE配制的Fluzone疫苗进行第二次免疫后
76一周，与单独使用Fluzone相比，在小鼠体内诱导的病毒中和抗体产
生的水平。显示了每组/时间点中的倒数终点滴度的平均值和标准误。
应答Fluzone疫苗的总IgG和中和抗体滴度通过在水制剂或稳定 油制剂中添加GLA而增强。与2 pi剂量Fluzone疫苗一起使用的GLA 的佐剂作用更为显著，诱导的抗原特异性体液反应与单独使用20 pi Fluzone疫苗相似(GLA-AF)或更强(GLA-SE)。这些结果提示通过用含 有GLA的制剂辅佐，降低Fluzone疫苗的剂量，且仍诱导高水平的IgG 和中和抗体滴度是可能的。这在诸如禽流感的世界性传染病的情形下 特别重要。
实施例8
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的 佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周时间内，用单独使用的SMT抗原(每次免疫每只动物给予 10 Mg)或用配制于依照上述实施例3使用的操作步骤的含GLA(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800;每次免疫每只动物 给予20/xg)的稳定乳剂(GLA-SE)中的SMT抗原免疫小鼠(每组三只 C57BL/6动物)三次。第三次免疫后一周，通过给动物放血采集血清， 且依照发表的方法，通过ELISA4企测特异性针对SMT抗原的IgGl和 lgG2c抗体的血清水平。
图4显示了 ELISA数据，表明了单独使用SMT抗原或使用与 GLA-SE配制的SMT抗原第三次免疫后一周，在小鼠体内诱导的抗 -SMT抗体产生的水平。显示了每组的倒数终点滴度的平均值和标准 误。
IgGl或lgG2c抗体同种型分别主要与TH2或TH1反应有关。已 经表明，TH1反应对于抗利什曼虫感染的保护是必需的。单独接种 SMT主要诱导SMT特异性的IgGl抗体。接种SMT+GLA-SE诱导较高的抗体滴度，并将显型逆转到主要是lgG2c抗原特异性的抗体反应， 其与抗该疾病的保护有关。
实施例9
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的 佐剂作用的体内才莫型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在2周时间内，用配制于依照上述实施例3中使用的操作步骤的 含不同量的GLA (Avanti Polar Lipids, Inc.， Alabaster, AL;产品号 699800;每次免疫每只动物给予40, 20, 5或1 jiig)的稳定乳剂(GLA-SE) 中的利什-110f抗原(每次免疫每只动物给予10 Aig)免疫小鼠(每组三只 Balb/c动物)三次。第一次免疫后一周，通过给动物放血采集血清，且 依照发表的方法(同上)，通过ELISA检测特异性针对利什-110f的IgGl 和lgG2a抗体的血清水平。
图5显示了 ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA (40， 20, 5 或l jitg)配制的利什-110f抗原第一次免疫后一周，与盐水对照相比， 在小鼠体内诱导的抗利什-11 Of抗体产生的水平。显示了每组的倒数终 ,#、滴度的平均值和标准误。
利什-11 Of特异性的IgG 1和lgG2a抗体滴度是GLA剂量依赖性的。 在测试的所有GLA的浓度都观测了 TH1相关的IgG2a抗体的优势。
实施例10
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的 佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
78在3周时间内，用盐水或配制于依照上述实施例3中使用的4乘作
步骤的含有GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号 699800;每次免疫每只动物给予20 pg)的稳定乳剂(GLA-SE)中的利什 -lllf抗原(每次免疫每只动物给予10/^g)免疫小鼠(每组三只Balb/c动 物)三次。最后一次免疫后2周，处死小鼠，收集脾脏，依照发表的方 法，通过ELISA分析T细胞依赖性的IFN-7和IL-4细胞因子对体外 抗原刺激的应答。
IL-4或IFN-7细胞因子分别主要与TH2或TH1反应有关。我们和 其它人已经表明TH1反应对于抗利什曼虫感染是必需的。所有的动物 对伴刀豆球蛋白A (—种有效的有丝分裂原)反应良好。接种利什 -lllf+GLA-SE i^导了利什-lllf抗原特异性的细胞反应，而在盐水对 照组没有这种反应。当与伴刀豆球蛋白A比较时，接种利什 -lllf+GLA-SE诱导了远超过IL-4的IFN-7，其是与抗该疾病的保护有 关的TH1:TH2比率或显型。
实施例11
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的 佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在2周时间内，用盐水或配制于稳定乳剂中的利什-110f抗原(每 次免疫每只动物^会予10 gg)免疫小鼠(每组三只Balb/c动物)三次，所 述乳剂含有不同量的(i)依照上述实施例3中使用的操作步骤的GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800;每次免疫每只 动物给予40, 5或1 /ig) (GLA-SE),或者(ii)由生产商供应的乳剂 ("MPL隱SE", GSK Biologicals， Rixensart, Belgium)中的MPL⑧(每次免疫 每只动物给予40, 5或l/xg)。最后一次注射后一周，处死小鼠并收集 脾脏，依照发表的方法(同上)，通过ELISA分析T细胞依赖性的细胞因子对体外抗原刺激的应答。IFN-7细胞因子反应与抗利什曼虫 感染的TH1保护显型有关。
图6显示了 ELISA数据，表明了使用与不同量的GLA配制的利 什-110f抗原进行第三次免疫后l周，与盐水对照相比，在小鼠体内诱
导的抗利什-110f的IFN-7细胞因子产生的水平。显示了每组中的平均 值和标准误。
所有的动物都对伴刀豆球蛋白A (—种细胞活化剂和有丝分裂原) 反应良好。接种利什-110f+GLA-SE以剂量依赖性方式诱导了利什-110f 抗原特异性的细胞因子反应，而在盐水对照组没有观测到这种反应。 在所有测试的浓度下，GLA-SE比MPL-SE更有效，诱导了更高水平 的IFN-7，所述IFN-7是由抗原特异性T细胞分泌的。
总之，将稳定油制剂中的GLA添加到利什曼虫疫苗抗原候选物利 什-110f中主要诱导了与保护性TH1显型有关的抗原特异性的细胞型 (T细胞)免疫反应。此外，GLA-SE在诱导保护相关的细胞因子如IFN， 方面比MPL-SE更有效。
实施例12
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性利什曼虫抗原疫苗中的 佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在2周时间内，用盐水或配制于稳定乳剂中的利什-110f抗原(每 次免疫每只动物给予10 Mg)免疫小鼠(每组三只Balb/c动物)三次，所 述乳剂含有不同量的(i)依照上述实施例3中使用的操作步骤的GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800;每次免疫每只 动物给予20 或5 /ig) (GLA-SE),或者(ii)由生产商供应的乳剂 ("MPL-SE", GSK Biologicals, Rixensart， Belgium)中的MPL⑧(每次免疫 每只动物给予20或5 Mg)。最后一次注射后一周，处死小鼠并收集脾 脏，依照发表的方法(同上)，通过细胞内细胞染色(ICS)和流式细胞术
80分析T细胞依赖性的IFN-7、 IL-2和TNF细胞因子对体外抗原刺激的 应答。这三种细胞因子与抗利什曼虫感染的TH1保护显型有关。
当在单细胞水平分析时，与利什-110f+MPL-SE组相比，在利什 -llOf+GLA-SE组中，表达所有三种细胞因子IFN-7、 IL-2和TNF或 IFN-7和IL-2组合的CD4+ T细胞的频数更高，且在20和5 /xg剂量都 观测到了这一结果。据报道(Seder e a/.)，表达所有三种细胞因子 IFN-7、 IL-2和TNF的CD4+ T细胞的高频数与抗利什曼虫感染的保 护相关。
总之，将稳定油制剂中的GLA添加到利什曼虫疫苗抗原候选物利 什-110f中主要诱导了与保护性TH1显型有关的抗原特异性的细胞型 (T细胞)免疫反应。此外，GLA-SE在诱导保护相关的细胞因子如IFN-7、 IL-2和TNF方面比MPL-SE更有效。
实施例13
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性肺结核分支杆菌抗原疫 苗中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南),Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周时间内，用单独的或配制于依照上述实施例3中使用的操 作步骤的含GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号 699800;每次免疫每只动物给予20 jLig)的稳定乳剂(GLA-SE)中的ID83 抗原(每次免疫每只动物给予8 jug)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物) 三次。第三次免疫后一周，通过给动物放血采集血清，且依照发表的 方法(同上)，通过ELISA4会测特异性针对ID83的IgGl和lgG2c抗体 的血清水平。IgGl或lgG2c抗体同种型分别主要与TH2或TH1反应 有关。已经表明，TH1反应对于抗肺结核分支杆菌感染的保护是必需 的。
单独接种ID83主要诱导抗原特异性的IgGl抗体。相比之下，接 种ID83+ GLA-SE诱导更高的抗体滴度，并将显型逆转到主要是lgG2c
81抗原特异性的抗体反应，其与抗该疾病的保护有关。
实施例14
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性肺结核分支杆菌抗原疫 苗中的佐剂作用的体内it型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周时间内，用单独的或配制于含有GLA(GLA-SE)、 GLA + CpG (CpG1826， Coley Pharmaceuticals, 25 /ig) (GLA/CpG-SE)或GLA+嘎德莫 特(GDQ) (Invivogen, 20 ^g) (GLA/GDQ-SE)的稳定乳剂中的ID83抗原 (每次免疫每只动物给予8 Mg)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次。 最后一次注射后3周，处死小鼠并收集脾脏，依照发表的方法，通过 ICS和流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞依赖性的IFN々、IL-2和 TNF细胞因子对体外ID83抗原刺激的应答。IFN-7、 IL-2和TNF细胞 因子的表达与抗肺结核分支杆菌感染的保护性TH1反应有关。
图7显示了 ICS数据，表明了进行第三次免疫后一周在小鼠体内 诱导的产生ID83特异性的IFN-7、 IL-2和TNF细胞因子的CD4+和 CD8+T细胞的频数，所述免疫是使用单独的ID83或由含有GLA
制剂辅佐的ID83进4亍的。
产生ID83特异性细胞因子的CD4+或CD8+ T细胞的频数在盐水 或单独的ID83疫苗组处于背景水平。产生ID83抗原特异性细胞因子 的T细胞，CD4+和CD8+两者都由ID83+GLA-SE的接种所诱导，且 它们的频tt通过添加如GDQ(TLR7/8)或CpG (TLR9)的另 一种TLR配 体被进一步增加。表达IFN-7 + TNF或IFN-7 + IL-2的T细胞是优势 群。
总之，用GLA-SE辅佐针对肺结核分支杆菌的抗原大大增强了抗 原特异性的细胞反应(T细胞)，如通过表达IFN-7、 IL-2和/或TNF细 胞因子的T细胞的频数所测量的。将GLA-SE与另 一种TLR配体合并进一步增加了产生抗原特异性细胞因子的细胞的频数，所述细胞是与 抗该疾病的保护有关的显型。
实施例15
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性麻风分支杆菌抗原疫苗 中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周时间内，用由水制剂辅佐的ML0276抗原(每次免疫每只动 物给予10 /ig)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次，所述制剂含有 CpG(CpG1826, Coley Pharmaceutical,每次免疫每只动物给予25gg)、或 咪喹莫特(IMQ) (3M Pharma,每次免疫每只动物给予25/xg)或GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800;每次免疫每 只动物给予25/xg，根据上述实施例3中使用的实验操作，GLA-SE)、 所述三者的混合物，或是作为阴性对照的盐水。第二次免疫后3周， 通过给动物放血釆集血清，且依照发表的方法(同上)，通过ELISA检 测特异性针对ML0276的IgG抗体的血清水平。
来自盐水对照组的动物没有显示出ML0276特异性的IgG，且来 自ML0276+CpG和ML0276+IMQ组的动物显示了极低水平的抗原特 异性抗体。相比之下，ML0276+GLA-SE诱导了显著水平的ML0276 特异性的IgG，其在三种佐剂一起使用时可被进一步增强。
总之，这些数据支持GLA-SE和/或GLA-SE与另外的TLR配体 的组合当与抗原ML0276 —起使用时对于诱导抗原特异性抗体的辅佐 作用。
实施例16
含有GLA疫苗的体内应用
本实施例描述了表明GLA在含有特异性麻风分支杆菌抗原疫苗 中的佐剂作用的体内模型。采用了标准的免疫方法学和试剂(Current
83Protocols in Immunology (免疫学实验指南)，Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY)。
在3周时间内，用由水制剂辅佐的ML0276抗原(每次免疫每只动 物给予10 Atg)免疫小鼠(每组三只C57BL/6动物)三次，所述制剂含有 CpG (CpGi826, Coley Pharmaceutical,每次免疫每只动物纟会予25/ig)、或 咪喹莫特(IMQ) (3M Pharma,每次免疫每只动物给予25/xg)或GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL;产品号699800;每次免疫每 只动物给予25Atg，根据上述实施例3中使用的实验操作，GLA-SE)、 所述三者的混合物，或是作为阴性对照的盐水。最后一次注射后3周， 处死小鼠并收集脾脏，依照发表的方法，通过ICS和流式细胞术分析 CD4+ T细胞依赖性的IFN-7细胞因子对体外ML0276抗原刺激的应 答。IFN-7细胞因子的表达与抗麻风分支杆菌感染的保护性TH1反应 有关。
图8的图A显示了 ICS数据，表明了相比于盐水和空白对照，使 用ML0276抗原进行第三次免疫后一周，在小鼠体内诱导的产生 ML0276特异性IFN-7细胞因子的CD4+ T细胞的频数，所述抗原是用 含有CpG或咪喹莫特(IMQ)的水制剂或含有GLA (GLA-SE)的稳定油 乳剂，或混合在一起的所述三者配制的。显示了每组的平均值。图8 的图B显示的数据表明了与盐水和空白对照相比，在用ML0276抗原 免疫的小鼠体内，引流麻风分支杆菌感染部位的淋巴结的细胞性，所 述ML0276抗原用含有CpG、或咪喹莫特(IMQ)的水制剂或含有GLA (GLA-SE)的稳定油乳剂或上述三者的混合物配制。显示了每组的平均 值和标准误。
来自生理盐水对照组的动物没有显示出ML0276特异性的IFN-7 反应，背景频数是阳性细胞的0.04%。来自CpG和IMQ组的动物显 示了产生抗原特异性细胞因子的细胞的频数轻度增加，分别是0.17% 和0.11%。相比之下，当使用GLA-SE作为佐剂时，观测到了 ML0276 特异性的IFN-， CD4+T细胞显著增加的数目(0.66%),当三种佐剂混 合在一起时，频数进一步增加(2.14%)。
随后使小鼠的子集感染麻风分支杆菌，发现小鼠受到ML0276+GLA-SE的保护，这通过与注射了盐水的对照相比，引流感 染部位的淋巴结内的细胞数目降低被测量。接种ML0276+CpG和 ML0276+IMQ与盐水相比，仅诱导了细胞数目的中度降低。
总之，这些数据支持GLA-SE和/或GLA-SE与另外的TLR配体 的组合当与抗原ML0276 —起使用时对于诱导抗原特异性细胞反应的 辅佐作用。
本说明书中引用的和/或列于申请记录表中的上述所有的美国专 利、美国专利申请公布、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和 非专利的公开出版物都以其整体通过引用的方式并入本文。
通过上述，可以理解，尽管本文以示例的目的描述了本发明的具 体实施方案，但在不背离本发明的精神和范畴内可以做出各种变化。 因此，除受所附的权利要求书限制外，本发明不受其它限制。
权利要求
1.疫苗组合物，其包含(a)抗原；和(b)吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)。
2. 如^5L力要求1所述的疫苗组合物，其还包含选自下述的至少一种另外组分(a) 钟样受体(TLR)激动剂；(b) 皂苷或皂苷模拟物；(c) 包含油和ISCOMATRIXTM中的至少 一种的载体；(d) 咪唑并会啉免疫反应调节剂；(e) 双茎环免疫调节剂(dSLIM);(f) 辅佐剂；以及(g) 药学上可接受的载体。
3. 如权利要求2所述的疫苗组合物，其中(i) 所述辅佐剂，当存在时，选自明夙、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸；(ii) 所述TLR激动剂，当存在时，选自脂多糖、肽多糖、聚I:C、 CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LelF)的利什曼虫同源体以及至少一种丙型肝炎抗原；(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反应调节剂，当存在时，选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特；(iv) 所述辅佐剂，当存在时，选自细胞因子、去垢剂和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，以及(v) 所述药学上可接受的载体，当存在时，包含选自磷S^丐、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体和微粒的载体。
4. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述GLA没有被3'-脱-0-酰化。
5. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述GLA是3-酰基单磷酸脂质A的衍生物，其中2-氨基位置包含单酰基链。
6. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述GLA包含(i) 双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的l位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii) 连接于非还原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii) 至多6个脂酰链；其中 一个脂酰链通过酯^:连接于还原末端葡糖胺的3-羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中 一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-鞋基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。
7. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述GLA具有下式其中R2和R'R'、 RR"和I^是CH-C2o烃基；且是Cl2-C20经基。
8. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述抗原包含至少一种多肽抗原或至少一种重组表达构建体，所述重组表达构建体包含可才喿作连接于编码至少 一 种多肽抗原的核酸序列的启动子。
9. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述抗原来自(i)与传染性疾病相关的至少一种传染性病原体，(ii)与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或(iii)与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。
10. 引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括给予个体包含(a)抗原和(b)他喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的组合物，其中所述抗原来自(i)与传染性疾病相关的至少一种传染性病原体，(ii) 与癌症相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或(iii) 与自身免疫疾病相关的至少一种抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应，并由此引发或增强个体体内期望的抗原特异性免疫反应。
11. 如权利要求IO所述的方法，其中所述组合物还包含选自下述的至少一种另外组分(a) 钟样受体(TLR)激动剂；(b) 皂苷或皂苷模拟物；(c) 包含油和ISCOMATRIXtm中的至少 一种的载体；(d) 咪唑并喹啉免疫反应调节剂；(e) 双茎环免疫调节剂(dSLIM);(f) 辅佐剂；以及(g) 药学上可接受的载体。
12. 如权利要求11所述的方法，其中(i)所述辅佐剂，当存在时，选自明讽、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，且所述去垢剂选自皂苷、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸，(ii) 所述TLR激动剂，当存在时，选自脂多糖、肽多糖、聚I:C、 CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LelF)的利什曼虫同源体以及至少一种丙肝抗原，以及(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反应调节剂，当存在时，选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特；(iv) 所述辅佐剂，当存在时，选自细胞因子、去垢剂和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，以及(v) 所述药学上可接受的载体，当存在时，包含选自磷酸钓、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体和微粒的载体。
13. 如权利要求10所述的方法，其中所述GLA没有被3'-脱-O-酰化。
14. 如权利要求10所述的方法，其中所述GLA是3-酰基单磷酸脂质A的衍生物，其中2-氨基位置包含一个酰基链。
15. 如权利要求IO所述的方法，其中所述GLA包含(i) 双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的l位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii) 连接于非还原端葡糖胺的4位氨基己醣的0-磷酰基团；以及(iii) 至多6个的脂酰链；其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺键连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。
16.如权利要求IO所述的方法，其中所述GLA具有下式其中R1、 R3、 R5和R6是Cu-C2o烃基;且R2和R4是d2-C2。烃基。
17.如权利要求10所述的方法，其中所述抗原包含至少一种多肽抗原或至少 一种重组表达构建体，所述重组表达构建体包含可操作连接于编码多肽抗原的核酸序列的启动子。
18.如权利要求IO所述的方法，其中所述抗原来自(i)与传染性疾病相关的至少 一种传染性病原体，(ii)与癌症相关的至少 一个抗原决定部位、生物分子、细胞或组织或(iii)与自身免疫疾病相关的至少一个抗原决定部位、生物分子、细胞或组织，或者与其在免疫学上交叉反应。
19.诱导或增强免疫反应的药物组合物，其包含:(a) 吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA);以及(b) 药学上可接受的载体或赋形剂。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述组合物还包含选自下述的至少一种另外組分(a) 钟样受体(TLR)激动剂；(b) 皂苷；(c) 包含油和ISCOMATRIXtm中的至少 一种的载体；(d) 咪唑并喹啉免疫反应调节剂；(e) 双茎环免疫调节剂(dSLIM);(f) 辅佐剂；以及(g) 药学上可接受的载体。
21. 如权利要求20所述的药物组合物，其中(i) 所述辅佐剂，当存在时，选自明矾、植物碱和去垢剂，其中所述植物碱选自番茄素，且所述去垢剂选自急香、聚山梨醇酯80、司盘85和硬脂酰酪氨酸，(ii) 所述TLR激动剂，当存在时，选自脂多糖、肽多糖、聚I:C、CpG、3M003、鞭毛蛋白、真核核糖体延长和起始因子4a(LelF)的利什曼虫同源体以及至少一种丙肝抗原，以及(iii) 所述咪唑并喹啉免疫反应调节剂，当存在时，选自雷西莫特(R848)、咪喹莫特和嘎德莫特；(iv) 所述辅佐剂，当存在时，选自细胞因子、去垢剂和嵌段共聚物或生物可降解聚合物，以及(v) 所述药学上可接受的载体，当存在时，包含选自磷酸钓、水包油型乳剂、油包水型乳剂、脂质体和微粒的载体。
22. 如权利要求19所述的药物组合物，其中所述GLA包含(i) 双葡糖胺骨架，其具有通过非还原末端葡糖胺的l位氨基己醣和还原末端葡糖胺的6位氨基己醣之间的醚键连接于非还原末端葡糖胺的还原末端葡糖胺；(ii) 连接于非还原端葡糖胺的4位氨基己醣的O-磷酰基团；以及(iii) 至多6个的脂酰链；其中一个脂酰链通过酯键连接于还原末端葡糖胺的3羟基，其中一个脂酰链通过酰胺^t连接于非还原末端葡糖胺的2-氨基，并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链，以及其中一个脂酰链通过酯键连接于非还原末端葡糖胺的3-羟基并包含通过酯键与多于12个碳原子的烷酰基链连接的十四酰链。
23.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述GLA具有下式:<formula>formula see original document page 8</formula>其中R1、 R3、 R5和R6是Cu-C2。烃基；且R2和R4是d2-Qo烃基。<formula>formula see original document page 8</formula>其中R1、 R3、 R5和R6是Cn-C2o烃基；且R2和R4是d2-C20烃基。
24.刺激个体非特异性免疫反应的方法，其包括权利要求19的药物 组合物的给药。
25.试剂盒，其包含(a) 包含吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)和药学上可接受的载体或赋形剂 的组合物；以及(b) 第二容器内的抗原，其中所述免疫组合物不与所述抗原接触。
全文摘要
本发明基于以基本上均一形态提供的合成吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA)的有益免疫学佐剂特性的发现，公开了用于诱导或增强免疫反应的包括疫苗和药物组合物在内的组合物和方法。化学定义的合成GLA提供了包含天然产物佐剂、不同批次之间一致的疫苗组分，没有污染物或活性的波动。也提供了疫苗和药物组合物，其包括GLA以及抗原、钟样受体(TLR)激动剂、辅佐剂和诸如药物载体的载体中的一种或多种。
文档编号A61K39/39GK101516396SQ200780035774
公开日2009年8月26日 申请日期2007年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者史蒂文·G·里德, 达瑞克·卡特 申请人:传染性疾病研究院