专利名称：抗癌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗癌剂，尤其涉及含有轮烷化合物作为有效成分的抗癌剂。
背景技术：
与30年前相比，日本的平均寿命延长了 10岁以上，开发出大量脑卒中、 心脏病(以往多发的死亡原因)的治疗药被认为是其重要原因之一。但随着 作为死亡原因的脑卒中、心脏病的减少，癌症(恶性赘生物)导致的死亡逐 年增加。现今，居于第一位的死亡原因是癌症，因此现在很多研究者在进行 抗癌剂的研究。
由于多数抗癌剂是被癌细胞摄入后才开始发挥作用，为了使受体介导的 摄入容易，以往认为分子量小且结构稳定的药物是有效的。 专利文献l:日本专利第3741706号说明书
非专利文献l:高田十志和，木原伸浩，古庄义雄，"0夕一口、乂夕 卜化合物O合成K上3于/材料C0機能設計(基于互锁化合物合成的纳米材
料的功能设计)"，高分子，2001年，50[11]， p.770 773
非专利文献2:古庄义雄，木原伸浩，高田十志和，"7 y :y匕°乂夕、、二 上3口夕年廿y、求y 口夕年廿y(D合成-新LV、高分子合成法^考乏3 -(基于滑动的轮烷、巨轮烷的合成——新高分子合成方法的思考)"，高分子 加工，2001年，50[3]， p.114 120
非专利文献3:木原伸浩，高田十志和，"水素結合^基。、〈一y夕一 口、乂夕卜化合物O合成-口夕年廿y、力亍于y合成O最近O進歩-(基于氢 键的互锁化合物合成——轮烷、索烃合成的最新进展)"，有機合成化学協会 誌，2001年，59[3], p.206~218
发明内容
然而，易于由受体介导摄入的抗癌剂也多易于从细胞排出，于是存在很 难存留于癌细胞内的问题。而且，由于曾排出抗癌剂的癌细胞对该抗癌剂具有抗药性，存在相同抗癌剂失效的问题。
此外，易于由受体介导摄入的抗癌剂也易于被正常细胞摄入，存在很难 用于局部治疗、易产生副作用的问题。
鉴于以上问题，为了开发出不易由癌细胞排出的新的抗癌剂，本发明者
潜心进行了反复研究，结果成功地开发了含有索烃(力亍于y， catenane)作为 有效成分的抗癌剂(参考专利文献1 )。具有抗癌作用的索烃是被称为酰胺型 [2]索烃的化合物的一种，其具有下述结构非共价结合的2个分子环呈链状连接。
认为像索烃这样部分未通过共价键结合的高分子新型化合物，由于分子 量比较大且分子易变形， 一旦被细胞摄入就不易被排出。而且，这样的高分 子新型化合物本来就不易被吸收入细胞内。因此，将其局部用于癌细胞时， 不仅可使其对正常细胞的作用降至极小，而且^可有效抑制癌细胞的增殖。
作为这样的高分子新型化合物，除了索烃外，已知的还有被称为轮烷 (Rotaxane)的化合物(参考非专利文献1 3 )。在专利文献1中，本发明者 预言了轮烷的抗癌作用，为了证实该预言，进行了潜心研究。
的^t癌剂。
为了寻找具有抗癌作用的轮烷化合物，本发明者进行了反复研究。结果 确定部分轮烷具有抗癌作用。
也就是说，本发明的抗癌剂含有化学式(I)所示的轮烷化合物作为有 效成分。<formula>formula see original document page 4</formula>
该轮烷化合物是被正式称为[2][双(2- (3,5-二曱基苯基羰氧基)乙基) 铵三氟曱磺酸盐]-[二苯并_24-冠-8]轮烷([2][bis(2-(3,5-dimethylphenylcarbonyloxy)ethyl)ammonium
trifluoromethanesulfonate]-[dibenzo-24-crown-8] rotaxane)的化合物,分子量为 819。该轮烷化合物对热比较稳定，可溶于有机溶剂且不溶于水。
如上述化学式(I)所示，该轮烷化合物由两端结合有较大分子的棒状 部分、和环状部分(冠醚)这两部分构成，所述棒状部分插入环状部分中。 环状部分由于处于插入有棒状部分的状态，因此可以以棒状部分为轴移动。 但由于在棒状部分的两端结合有较大的分子，其成为挡块，使环状部分无法 由棒状部分脱离。
这样，虽然具有棒状部分和环状部分连接的结构，但该棒状部分和环状 部分并不通过共价键结合。因此，分子的形状易发生变化，虽然受体介导的 摄入变得较为困难，但若将其导入癌细胞内，则可抑制癌细胞的增殖。
为了将该轮烷化合物导入癌细胞内，优选在癌细胞的细胞膜上开孔，由 该孔导入细胞内。作为在细胞膜上开孔的方法，可以使用电穿孔法。使用电 穿孔法可局部导入上述轮烷化合物，因此，可被正常细胞摄入的量降至极低， 其结果，可减轻副作用等患者的负担。
目前，经本发明者确认具有抗癌作用的轮烷化合物仅为上述化学式所示 的轮烷化合物。但从轮烷化合物全体所具有的很难被摄入细胞内且一旦被摄 入便很难排出的特征考虑，本发明者预测除上述化学式所示轮烷化合物外， 还存在其它具有抗癌作用的轮烷化合物。
这样，本发明可提供不易从癌细胞排出且适于局部治疗的抗癌剂。
图1为表示样品A0 A5的评价结果的图。 图2为表示样品B0 B4的评价结果的图。 图3为表示样品C0 C2的评价结果的图。 图4为表示样品D0 D2的评价结果的图。 图5为表示与现有抗癌剂比较结果的表。
发明的
具体实施例方式
以下，就本发明的优选实施方式进行详细说明。
本发明的抗癌剂含有上述化学式(I)所示的轮烷化合物作为有效成该轮烷化合物的合成方法没有特别限制，可用滑动法(7 y 、;/ t。y夕、'法)合成。 由于这样得到的轮烷化合物可溶解于二曱基亚砜(DMSO)等溶剂，因 而该溶液可作为抗癌剂使用。溶液中轮烷的浓度没有特别限制，优选为10nM (纳摩尔浓度)以上，特别优选为100nM以上。这是因为虽然溶液中轮烷 的浓度小于lOnM也具有在一定程度上延緩癌细胞增殖的效果，但溶液中轮 烷的浓度为10nM以上时，表现出明确的延缓增殖效果。此外，溶液中轮烷 的浓度为100nM以上时，对癌细胞的抑制效果明显，随着时间的延长，可 j吏癌细力包减少。
构成该轮烷化合物的"棒状部分"和"环状部分"不通过共价键结合。于 是，轮烷化合物的形状易发生变化，受体介导的摄入较为困难。因此，向癌 细胞内导入该轮烷化合物时，优选用电穿孔法在癌细胞的细胞膜上开孔。停 止施加电压时，经电穿孔在细胞膜上形成的孔穴迅速被修复。优选电穿孔时 的电压波形为DC脉冲，脉冲电压为10 40V,脉沖宽度为10毫秒(msec)左 右，脉冲周期为3秒(sec)左右，施加约10次脉冲。
于是，如果通过电穿孔法等使该轮烷化合物被摄入癌细胞内，则癌细胞 不易将其排出，因此，不仅可长时间发挥作用，而且很难表现出对该轮烷化
合物的抗药性。 实施例
下面，就本发明的实施例进行说明。
在验证轮烷化合物的抗癌作用前，对溶剂浓度和电穿孔条件进行设定。 关于溶剂浓度的设定，由于作为溶剂使用的DMSO作为自由基清除剂对癌 细胞发挥作用，因此有必要在能够实质上忽略DMSO的自由基清除作用的 状态下进行验证。另外，关于电穿孔条件的设定，若电穿孔时施加的电压过 高，则致使细胞损伤，因此有必要在能够实质上忽略电穿孔对癌细胞的影响 的状态下进行验证。
卩容剂浓度的设定]
首先，准备小鼠恶性黑素瘤细胞系(B16)，将其播种于96孔的微板上， 使孔内细胞数分别为约5000个。然后，向各孔中分别添加DMSO'使其总 量为100pL。对于样品A0 A5，添加的DMSO的浓度分别按照表1进行设定。[表l]
样品名DMSO的浓度
样品AO0%
样品Al0.1%
样品A20.2%
样品A30.3%
样品A40.4%
样品A50.5%
随后，将这些样品A0 A5中含有的细胞系在C02孵育器中培养24小时。 设定C02孵育器的温度为37.0°C, C02浓度为5.0%。然后，向各样品中添 加细胞增殖试验试剂(生化学工业抹式会社制，商品名"Tetra Color One") lO(iL,在C02孵育器中反应2小时。随后，通过用微板读取器(Bio-Rad公 司制)测定在波长450nm处的吸光度(对照波长600nm),测定了细胞系 的存活率。分别在与细胞增殖试验试剂反应后24小时、48小时以及72小时 的时间点测定存活率。
测定结果如图1所示。如图1所示，可以确认溶剂DMSO浓度增大时， 自由基清除作用明显，可抑制癌细胞的增殖。因此，将DMSO的浓度决定 为对癌细胞影响最小的0.1% (样品Al)。于是，以下实验中的DMSO浓度 均固定为0.1%。
向具有一对电极的多个钵(BTX公司制，商品名"ECM399")中加入约 5000个恶性黑素瘤细胞系(B16)和DMSO(0.P/。)，使其总量分别为600fiL。 随后，在各钵的电极上施加DC脉沖，进行了电穿孔操作。对于样品B0 B4， 分别按照表2设定脉沖电压。各样品脉冲的施加次数均为10次，脉冲宽度 为约10毫秒，脉冲周期为约3秒。
7[表2]
样品名电压
样品BO0V
样品Bl10V
样品B220V
样品B330V
样品B4術
随后，将这些样品B0 B4中含有的细胞系在与上述"溶剂浓度的设定，， 相同的条件下进行培养，使之与细胞增殖试验试剂反应。然后分别测定24 小时后、48小时后以及72小时后细胞系的存活率。
测定结果如图2所示。如图2所示，样品B3得到与未进行电穿孔的样 品BO基本相同的结果。因此，将电穿孔时的施加电压定为对癌细胞影响最 小的30V。于是，以下实验中电穿孔时的施加电压均固定为30V。 _
样品名浓度
样品COOnM
样品Cl10 nM
样品C2100 nM
随后，将这些样品C0 C2中含有的细胞系在与上述"溶剂浓度的设定" 相同的条件下进行培养，使之与细胞增殖试验试剂反应。然后分别测定0小 时后、24小时后、48小时后以及72小时后细胞系的存活率。
测定结果如图3所示。如图3所示，轮烷化合物的浓度越高，培养后的
8细胞数越少，由此可以确认式(I)所示轮烷化合物具有延迟癌细胞的增殖 的效果。轮烷化合物的详细作用机制尚不明确，但可以认为轮烷化合物并非 时间依赖性而是浓度依赖性地抑制细胞的增殖，不依赖于细胞周期。 [抗癌作用的验证2 (进行电穿孔)]
向具有一对电极的多个钵中加入约5000个恶性黑素瘤细胞系(B16)、 DMSO (0.1%)和式(I)所示轮烷化合物，使其总量分别为600(LiL。随后， 在各钵的电极上施加30V的DC脉沖10次，进行电穿孔操作。对于样品 D0 D2，添加的轮烷化合物的浓度分别按照表4进行设定。 [表4]
样品名浓度
样品DOOnM
样品Dl10 nM
样品D2100 nM
随后，将这些样品D0 D2中含有的细胞系在与上述"溶剂浓度的设定" 相同的条件下进行培养，使之与细胞增殖试验试剂反应。然后分别测定0小 时后、24小时后、48小时后以及72小时后细胞系的存活率。
测定结果如图4所示。如图4所示，进行电穿孔时对癌细胞增殖的抑制 效果更为明显。尤其是在轮烷化合物浓度为100nM的样品D2中，可以确认 随着时间的推移，癌细胞减少。这样，确认通过使轮烷化合物浓度为100nM 以上、且进行电穿孔，可以得到显著的癌细胞增殖抑制效果。
此外，时间或浓度结果表明，在抗癌剂的分类方面，其以高浓度在短时 间内发挥作用。
关于凋亡(Apoptosis)抗性基因Bel-2的mRNA的表达、凋亡促进性基因 Bax以及Bad的mRNA的表达、以及细胞死亡相关基因(細胞死O実行遺伝 子)Caspase-3的mRNA的表达，以作为普通蛋白的(3-肌动蛋白为基础进行研 究，与现有抗癌剂5-FU进行比较。各mRNA的表达是在提取总RNA后， 通过PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)进行，经琼脂糖凝胶 电泳后，进行焚光测定，求得与未使用抗癌剂的样品(对照)的荧光比。
结果如图5所示。如图5所示，在轮烷化合物和5-FU中，所得荧光比大致相同。但很明显的是轮烷化合物的用量为5-FU的十分之一以下，其 抗肺瘤作用强于现有抗癌剂。基于以上结果，认为式(I)所示轮烷化合物 作为抗癌剂是有用的。 工业实用性
可以认为本发明作为抗癌剂是有用的。
权利要求
1. 一种抗癌剂，其含有下述化学式(I)所示的轮烷化合物作为有效成分[化学式1]
2. 根据权利要求1所述的抗癌剂，其中，所述轮烷化合物溶解于溶液 中，并且所述轮烷化合物在所述溶液中的浓度为10nM以上。
3. 根据权利要求2所述的抗癌剂，其中，所述轮烷化合物溶解于溶液 中，并且所述轮烷化合物在所述溶液中的浓度为lOOnM以上。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的抗癌剂，其中，通过电穿孔法将 所述轮烷化合物导入细胞内。
全文摘要
提供不易由癌细胞排出且适于对癌细胞进行局部治疗的新的抗癌剂。本发明的抗癌剂含有化学式(I)所示的轮烷化合物作为有效成分。该轮烷化合物由两端结合有较大的分子的棒状部分、和被该棒状部分插入的环状部分(冠醚)这两个部分构成。由于在棒状部分的两端结合有较大的分子，其成为挡块，使环状部分无法由棒状部分脱离。该棒状部分和环状部分并不通过共价键结合。因此，分子的形状易发生变化，受体介导的摄入变得较为困难，但一旦将其导入癌细胞内，则可抑制癌细胞的增殖。
文档编号A61K31/357GK101522188SQ200780038299
公开日2009年9月2日 申请日期2007年10月10日 优先权日2006年10月14日
发明者小野信文 申请人:万斯有限公司