脊柱髓核植入物的制作方法

专利名称：：脊柱髓核植入物的制作方法脊柱髓核植入物描述本发明涉及用于治疗稚间盘的脊柱髓核植入物和因此特别地涉及CD-RAP蛋白的用途。推间盘(IVD)的退变是牵涉机械、遗传和生物因素的多因素过程。尽管病理生理学机制仍然不清楚，但已对所产生的推间盘的结构和功能的变化进行了详尽的描述。与关节软骨不同，IVD由不同的组织组成。健康的IVD是包含由纤维性纤维环(annulusfibrosus)(AF)围绕的果冻样髓核(NP)的良好包覆的无血管器官，其提供推骨之间的可动性和緩冲。髓核位于各推间盘的中央并且由软骨细胞组成，所述软骨细胞在成人中产生包含高百分比的蛋白聚糖(PG)和II型胶原的细胞外基质。髓核由纤维环围绕，所述纤维环由高度组织的、在同心性骨板(concentriclamellae)中定向的定向排列的胶原纤维和细胞外基质组成。内纤维环比外纤维环厚并且具有缺少片层结构的纤维软骨基质(fibrocartilaginousmatrix)。薄的不同区i或(过〉度区(transitionzone)(TZ))将内纤维环与髓核分开。在衰老过程中，髓核的蛋白聚糖含量的减少导致减少的水合作用和退变的迹象，包括推间盘高度的减少和脊柱外围结构上载荷的增加。在生物学水平上，其反映髓核细胞的正常合成代谢和分解代谢功能之间的不平衡。在退变性推间盘疾病(DDD)的一些病例中，IVD的逐渐退变由机械不稳定性引发。髓核上增加的载荷和压力使细胞或侵入的巨噬细胞产生更大量的细胞因子或毒性量的金属蛋白酶(MMP)。随着DDD的发展，毒性水平的细胞因子和固P降解细胞外基质和导致蛋白聚糖的破坏，从而减少持水力，导致髓核脱水。随后，髓核的弹性减少，结果可能产生纤维环的分层，最后发生内裂缝(internalfissure)向外周展开。这些改变引起甚至更大的机械不稳定性和诱导细胞因子产生，这促进了DDD，推间盘开始凸出(推间盘脱出疾病)，最终破裂，导致神经刺激和腰痛。不幸的是，与椎间盘相关的腰痛的大多数现有疗法关注于获得症状緩解而非修复根本的退变过程(degenerativeprocess)。保守性治疗由物理手段、止痛药、肌肉松驰药、非类固醇抗炎药、全身性糖皮质激素的使用、细胞因子拮抗剂的硬膜外注射和注射组成。在疗法的更后期，退变性推间盘的治疗是除去退变的推间盘和在推间盘的任一侧融合相邻的推骨或用合成的推间盘材料替换推间盘。推间盘替换或融合不恢复正常的推间盘高度、生理或机械性质，这很可能在手术部位或相邻的推间盘处导致其他症状。因此，需要抑制或逆转退变背后的细胞平衡失调和恢复推盘生物学功能的其他治疗方法。全世界许多研究者正在寻找修复退变的推间盘(degeneratedintervertebraldisc)的生物学方法。4乜学號冲亥溶解剂(Chemonucleolyticagent)例》口木瓜凝乳蛋白酶在过去一直用作治疗脱出的IVD(herniatedIVD)的方法。疼痛的减轻与降解PG(从而减少推间盘内压力和减轻受累神经根的压迫)的能力相关。然而，相关的并发症例如过敏反应、神经损伤和感染减少了木瓜凝乳蛋白酶的用途。更近以来，软骨素酶ABC(C-ABC)被建议用作化学髓核溶解术的备选，因为其缺少蛋白酶活性并且具有更窄的底物谙。尽管软骨基质的再生在使用C-ABC治疗后比使用木瓜凝乳蛋白酶更早发生，但推间盘高度和PG含量没有充分恢复，给IVD留下改变的最适度以下的生物化学性质，从而加速事件的退变性级联反应(Takegami等人，2005;Masuda等人，2004;Masuda和An，2004)。WO2005/000283和其中的参考文献描述了治疗退变性推间盘疾病的方法，包括将拮抗剂例如MMP的高亲和力拮抗剂、高特异性细胞因子拮抗剂、高特异性p38激酶抑制剂、抗炎药、环化素(cycline)化合物、抗增殖剂或抗凋亡剂注射入患病的推间盘。这些化合物据认为通过促炎细胞因子、固P的抑制、前列腺素的调控或促炎效应的减少来抑制DDD中的分解代谢过程或抑制软骨细胞增殖或凋亡，但未描述合成代谢活性。WO2006/086105描述了使用转录因子抑制剂治疗和/或逆转稚间盘的病症的方法，所述抑制剂靶向转录因子例如NF-kB、E2F、GATA-3和STAT。WO2006/031376描述了治疗退变性推间盘疾病的方法，包括将抗氧化剂单独地或与另外的治疗剂例如血纤蛋白、透明质酸、干细胞、骨髓或生长因子一起施用入推间盘。在其他研究中，已将外源生长因子如转化生长因子0-I(TGF-P1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、生长和分化因子-5(GDF-5)以及成骨蛋白(0P-1)施用至推间盘内细胞或进行推间盘内注射以刺激蛋白聚糖和胶原的合成，从而减慢或逆转IVD的退变(Levicoff等人，2005;Sobajima等人，2004;Takegami等人，2005;Kawakami等人，2005)。然而，这些生长因子具有相当的非特异性，具有诱导成骨基因的风险，从而可诱导不希望的骨形成。该生长因子技术的应用的另一个限制是外源生长因子的相对短的生物学半衰期，这使得在它们递送后只能够产生短暂的生物学效应。因此，本发明的目的是提供改善或恢复推盘(vertebraldisc)的生物机械性质和/或抑制影响推盘的疾病的进一步发展的脊柱髓核植入物。本发明的另一个目的是提供包含能够逆转影响推盘的疾病过程、恢复推盘的性质或抑制疾病的进一步发展的软骨分化和维持因子的髓核植入物。本发明的另一个目的是通过在牺牲IVD内的分解代谢过程的情况下刺激合成代谢过程来改变软骨动态平衡以提供用于治疗慢性病况例如DDD的新方法。本发明的另一个目的是提供包含用于治疗稚盘的局部退变的软骨分化和维持因子的髓核植入物，其中软骨分化和维持因子为患者提供治愈、减緩疾病发展和/或改善患者健康的更好的机会。另一个目的是提供脊柱髓核植入物以增加IVD组织中的推间盘高6度和蛋白聚糖含量。本发明的另一个目的是提供髓核植入物，所述植入物包含用于在人中提供，除了软骨维持外，特定细胞因子的作用的压制和抑制以治疗慢性病况例如DDD的软骨分化和维持因子。本发明的另一个目的是提供可通过微创法(minimalinvasiveprocedure)或内窥镜才直入或注射的脊柱髓核才直入物。本发明的另一个目的是提供髓核植入物递送系统，所述递送系统能够提供治疗剂的更长水平或持续控制释放，从而确保所述治疗剂在退变的IVD的部位可^f吏用更长的时间范围(timeframe)。本发明的另一个目的是提供脊柱髓核植入物，所述植入物是能够提供更长水平的治疗剂的递送系统。为实现本发明的目的，提供包含作为非抗体或非受体分子的软骨分化和维持因子的脊柱髓核植入物或配制剂。所述植入物特别地是经推间盘可注射的或可植入的(injectableorimplantabletransdiscally)。为了清楚起见，非抗体是指软骨分化和维持因子不是抗体例如抗TNFcc的单克隆抗体、多克隆抗体或嵌合抗体。受体分子是指具有抗促炎细胞因子例如TNFa的高特异性的受体分子、其截短形式或其功能等同物。本发明者已开发了许多通过对病理脊柱病症(例如DDD)施用有效量的功能性生物分子来治疗病理脊柱病症例如退变性推间盘疾病的方法。根据本发明，一个实施方案包括治疗推间盘的方法，其中优选通过一次或重复注射经推间盘施用治疗有效量的软骨分化和维持因子。在一个实施方案中，软骨分化和维持因子选自能够刺激IVD细胞的分化和维持同时抑制不希望的骨形成的高度软骨特异性蛋白例如CD-RAP或其活性片段。这样的软骨分化和维持因子如CD-RAP抑制细胞因子和MMP的活性和/或减少此类细胞因子和醒P的表达，同时刺激导致退变组织例如纤维软骨的部分或完全恢复的合成代谢过程，从而能够逆转或终止疾病过程。因此，软骨分化和维持因子的注射帮助阻止退变性推间盘的7衰老过程。因此，本发明使得能够在较早的阶段治疗退变性推间盘，从而阻止细胞外基质的降解。此外，软骨分化和维持因子减轻或阻止软骨降解以及保持或改善IVD的结构和功能，优选没有不希望的骨形成。本发明的另一个实施方案涉及软骨决定和维持因子在制备用于治疗需要该治疗的哺乳动物的脊柱病症的药物组合物中的用途。在优选实施方案中，脊柱病症是特发性腰痛、推间盘脱出、推间盘内破裂或裂缝的稚间盘、神经根病、推管狭窄、脱出的髓核-诱导的坐骨神经痛、坐骨神经痛、特发性脊柱侧凸或脊髓病。本发明的另一个方面包括脊柱核(spinalnucleus)才直入物或配制剂(其包含作为非抗体或非受体分子的软骨分化和维持因子，优选其中植入物或制剂是经推间盘可注射的或可植入的)在制备用于治疗需要该治疗的哺乳动物的脊柱病症的药物组合物中的用途。为了本发明的目的，术语"脊柱髓核植入物"是指将被施用至推间盘，特别地施用入推间盘的髓核(NP)的装置或制剂。优选，可通过AF将植入物直接施用入推间盘或将其直接置于推间盘的NP内。可通过针或微创法的其他方法将其注射入推间盘。其还指脊柱髓核植入物是可注射入髓核、推间盘内间隙(intradiscalspace)或推间隙的药物制剂。植入物可以是包含软骨分化和维持因子的固体，例如海绵或固体载体。优选，植入物是允许其容易施用的液体。植入物例如可以是包含软骨分化和维持因子(任选与其他药物、配制助剂(formulationaid)或载体一起)的液体。在使用更大大小的载体材料的情况下，推间盘的部分或完全去除可以是优选的。为了本发明的目的，术语"经推间盘施用(transdiscaladministration)"包括但不限于脊柱髓核植入物至推间盘内，特别地至推间盘的NP内的注射，所述推间盘包括完整的推间盘、不同阶段的退变的推间盘、脱出的推间盘(herniateddisc)、破裂的推间盘(ruptureddisc)、分层的推间盘(delaminateddisc)或裂缝的推间盘(fissureddisc)。如果待注射的体积可能对NP造成压力，可在注射或施用用于脊柱的植入物之前去除至少部分NP。在一些情况下，去除的材料的体积为大约待施用的体积±20%的量。术语经推间盘施用还包括脊柱髓核植入物至退变的或完整的推间盘(如上面对于NP所描述的)的AF内的注射。在使用更大大小的载体材料的情况下，在施用脊柱髓核植入物之前，部分或完全去除推间盘可能是必需的。其还包括将植入物提供入位于外部的但与相邻推体的AF壁或终板(endplate)紧密相邻的位置，这可以避免AF的穿刺，从而避免推间盘上的潜在负荷。术语"退变性推间盘疾病(DDD)"是特征部分在于髓核的蛋白聚糖和水含量的逐渐丧失的慢性过程，其可表现在多种病症例如特发性腰痛、推间盘脱出、推间盘内破裂或裂缝的推间盘、神经根病、推管狭窄、脱出的髓核-诱导的坐骨神经痛、坐骨神经痛、特发性脊柱侧凸和/或脊髓病中。推间盘退变级别可通过手术前MRI的分析来分级。术语"软骨分化和维持因子"是指一种或多种软骨分化因子，所述因子可具有促有丝分裂能力，但特征在于它们增加和/或保持细胞的软骨细胞特异性表型(例如合成代谢活性)而无不希望的骨形成的能力。软骨细胞特异性特征是例如聚集蛋白聚糖(aggrecan)、II型胶原、S0X-9和蛋白聚糖的产生。软骨形成形态发生素(Chondrogenicmorphogen)可将推间盘细胞的去分化或纤维变性表型逆转至与更年轻的和正常成人的推间盘的推间盘髓核细胞(discnucleuscell)相当的纤维软骨细胞表型。其还可对推间盘的纤维环细胞(annuluscell)和/或终板细胞具有合成代谢作用。软骨分化和维持因子优选是分泌分子，从而可以以自分泌、旁分泌或内分泌的形式潜在地起作用。根据本发明的"间充质干细胞(MSC)"是作为未定型的间充质祖细胞存在于许多成熟骨骼组织中的原始细胞或静止细胞群体。MSC是可变化的(flexible)并且具有向几种成熟组织类型包括软骨、骨、脂肪和其他组织(取决于提供给这些静止细胞的环境和生物学信号)分化的能力。MSC可从许多自体来源包括骨髓、血液、肌肉组织和脂肪获得，所述自体来源可经收获来分离这些细胞而无显著的供体部位发病率或免疫原性潜力。MSC可以是NP细胞或AF细胞、软骨细胞或可如AF或NP细胞那样起作用的或可以分化成细胞或建立功能性NP和/或AF的其他活细胞的前体细胞。本文中所使用的"治疗或医治"是指与病症或疾病相关的症状的减轻、症状的进一步发展或恶化的停止、疾病或病症的防治或预防。本发明基于这样的发现，即软骨分化和维持因子例如MIA(黑素瘤抑制活性因子)家族的成员如CD-RAP可通过合成代谢作用(例如脊柱中的纤维软骨的再生或恢复)影响或改变脊柱病症，同时阻止或抑制脊柱推间盘内的分解代谢退变过程(例如细胞外基质的退变)。软骨分化和维持因子对脊柱病症的这样的效应是令人吃惊的，因为推间盘(IVD)的软骨与其他普通软骨相当不同。与称为透明软骨的关节软骨相反，IVD的软骨由其为特殊类型的软骨的纤维软骨组成。特别地，IVD的AF被认为是纤维软骨性的并且主要由高度定向的胶原纤维组成的片层组成。NP包含更高含量的随机定向的II型胶原，和更高浓度的蛋白聚糖。AF的细胞已显示沿着片层的占优势的胶原纤维方向定向排列。最里面的AF和NP区域的细胞更圆并且累积更多的II型和VI型胶原以及蛋白聚糖。在纤维软骨和其他类型软骨例如关节/透明软骨之间存在显著的物理和化学差异(W02005/091960和其中的参考文献)。例如，纤维软骨的不同在于在其主要存在于纤维环中的基质中具有许多I型胶原。来自纤维软骨例如IVD软骨的II型胶原比来自关节软骨的II型胶原具有显著更高水平的羟基化和糖基化并且聚集蛋白聚糖具有更多的取代。这些翻译后修饰影响纤维软骨胶原和IVD的结构和物理功能。纤维软骨IVD的出生前分化(Antenataldifferentiation)也与滑膜关节中的关节软骨的出生前分化不同。IVD具有复杂的发育史并且包含脊索来源的细胞，所述脊索来源的细胞在关节软骨中不具有等同物。在本发明之前，未曾显示本发明的软骨分化和维持因子例如CD-RAP具有在体外或体内阻止纤维软骨或纤维软骨细胞退变的生物学效应。本发明的软骨分化和维持因子诱导和维持IVD中的软骨合成代谢(例如蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的合成)，同时退变和软骨分解代谢(包括基质的分解、异常蛋白聚糖和胶原的合成)的发病机理部分或完全被阻止、抑制或甚至逆转。异常推间盘退变、增加的凋亡和减少的基质分子合成至少部分由细胞因子例如IL-1介导，所述细胞因子显示将軟骨细胞从合成代谢转换至分解代谢，包括分子和形态学水平上的软骨分解。由本发明介导的细胞因子和腦P(已知其参与推间盘退变)的活性的抑制和/或此类细胞因子和匪P的表达的减少有助于正常推间盘基质的再合成并且影响椎间盘细胞功能。因此，软骨分化和维持因子的注射帮助阻止或逆转退变性推间盘的老化或退变过程。因此，本发明使得能够在较早阶段治疗退变性稚间盘，从而阻止细胞外基质的降解和保持IVD的结构和功能。优选，本发明的软骨分化和维持因子是非抗体和非受体分子。这表示根据本发明使用的因子既不是抗体分子也不是受体分子。软骨分化和维持因子优选是非转录因子(例如，不是S0X-9)或优选是细胞外蛋白质。更优选，软骨分化和维持因子不选自转化生长因子P(TGF-P例如TGF-p1)-、骨形态发生(BMP)-和胰岛素样生长因子(IGF)-家族蛋白(例如IGF-l)。BMP蛋白由Wozney等人(Wozney和Rosen，1998)描述并且包括例如BMP-2、BMP-7以及生长和分化因子例如GDF-5、GDF-6和GDF-7。优选，软骨分化和维持因子是软骨形成形态发生素，更优选是这样的软骨形成形态发生素，其为具有软骨再生(合成代谢因子)和维持的合成代谢活性的蛋白质(优选软骨特异性蛋白)。合成代谢因子，与诱导髓核区域降解的分解代谢因子例如金属蛋白酶、凋亡因子、白细胞介素、前列腺素、蛋白质水解和降解酶、氧自由基、一氧化氮和纤连蛋白片段相反，在推盘内增加细胞的软骨细胞特异性表型。优选，软骨形成形态发生素是优选对于软骨组织是特异性的控制软骨形成和维持同时又避免或抑制骨形成的软骨决定因子(cartilagedeterminationfactor)。在一个实施方案中，软骨分化因子具有小于80kDa，优选S30kDa,更优选S15kDa,最优选10至15kDa的分子量。根据本发明使用的软骨分化和维持因子特别地是诱导细胞外基质蛋白例如蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和/或胶原的合成的因子。另夕卜，优选，所述因子导致细胞因子和醒P的量减少。在一个实施方案中，软骨分化和维持因子选自具有SH3-结构域或具有采用SH3-样结构域折叠的结构域的蛋白质例如CD-RAP。SH3-结构域或SH3-样结构域描述于例如Stoll等人(Stoll等人，2001b)中并且可通过用Kelley等人(Kelley等人，2000)中/>布的3D-PSSMWeb服务器预测SH3-折叠来确定。SH3-结构域(也称为Src同源结构域)是在许多细胞内蛋白中发现的蛋白质分子。到目前为止，还未描述过SH3-结构域蛋白质用于治疗脊柱病症。在另一个实施方案中，软骨分化和维持因子是可特异性结合纤连蛋白、纤连蛋白片段和/或富含脯氨酸的序列的蛋白质，如例如文献(Stoll等人，2001a;Horaandberg和Hui，1996;Homandberg等人，1997)中所述。在一个实施方案中，软骨分化和维持因子包含纤连蛋白或整联蛋白结合结构域。软骨分化和维持因子与细胞外蛋白例如纤连蛋白或纤连蛋白片段以及整联蛋白的结合可以例如通过ELISA来确定。可将纤连蛋白、其片段或整联蛋白涂铺在塑料表面上并且暴露于软骨分化和维持因子。结合的量可通过过氧化物酶偶联的抗软骨分化和维持因子单克隆抗体来测定。整联蛋白结合还可如Bauer等人(通过引用合并入本文)所述来测定。优选，软骨分化和维持因子选自a)包含或具有CD-RAP的成熟序列(SeqIDNo.1)的软骨细胞蛋白和其功能性片段或变体，b)与CD-RAP的C端4个半胱氨酸骨架(SeqIDNo1的氨基酸12至107)具有至少63%、优选80%、更优选90%的氨基酸序列同源性的蛋白质，或c)具有本文中定义的通式序歹'Kgenericsequence)1至3(SeqIDNo.122、3和4)中的任一个的蛋白质。具有与CD-RAP相同的生物学功能的功能性片段优选具有SeqIDNo1中所示的序列的至少20,特别地至少40和更优选至少50，最优选80个连续氨基酸的长度。优选，功能性片段包含SeqIDNo.1的位点1至50、1至70、1至80、20至80、20至107的氨基酸。成熟的CD-RAP序列(SeqIDNo.1)GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLT1HRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGD丫YGDLAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTDKWDFYCQ通式序列1(SeqIDNo.02)CX4CX17CX12VXn.13WX7.18FX4VX21CX通式序列2(SeqIDNo.03)KXCXDXECX"DX3PDCX12VX2KLX7-9WXGSX5.13GYFPX3VX18DFXCX通式序列3(SeqIDNo.04)KXCXDX2CX8AX2DX3PDCRFX5GXVX5KLX7WXGSVX12GYFPX22DFXCQ其中各独立出现的"X"代表任何氨基酸，小写的数字表示任何氨基酸的数目。优选，"X"独立地代表天然存在的氨基酸，特别是A、R、N、D、B、C、Q、E、Z、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。特别优选，软骨分化和维持因子是CD-RAP(软骨源性视黄酸敏感蛋白)(也称为MIA(黑色素瘤抑制活性))、OTOR(纤维细胞来源的蛋白、FDP、MIA-样、MIAL)和属于分泌蛋白种类的TANGO130(Bosserhoff等人，2004;Bosserhoff和Buettner，2003;Bosserhoff等人，1997;WO00/12762)。CD-RAP或MIA是作为软骨样分化的高度特异性标记的130个氨基酸的蛋白质(EP0710248，EP1146897,全部通过引用合并入本文)。基因表达在软骨形成开始时至整个软骨发育过程中被激活(Dietz和Sandell，1996;Sakano等人，1999)。在由骨关节炎引起的软骨损伤的情况下，CD-RAP在疾病开始发生时表达水平增加，此时观察到强合成代谢作用，一旦疾病恶化其表达下降(Saito等人，2002)。本文中涉及的蛋白质可在原核或真核宿主细胞中从完整的或截短的基因组DNA或cDNA或从合成的DNA表达。蛋白质可从培养基或内含体分离和/或再折叠，从而形成生物学活性组合物。关于CD-RAP的重組蛋白纯化的示例性方案，参见例如EP0710248和Lougheed等人(Lougheed等人，2001)。在Tscheudschilsuren等人和Stoll等人(Tscheudschilsuren等人，2005;Stoll等人，2003)(其公开内容通过引用合并入本文)中描述了如何检测此类分离的蛋白质的活性(例如软骨形成)的详细描述。软骨诱导的生物测定法描述于EP1146897的实施例2至5中，其通过引用合并入本文。实施例5描述了用于软骨诱导的小鼠异位植入测定法。可选地，软骨诱导和维持可在部分或完全厚度的关节软骨修复模型中进行测定。在本发明的一个实施方案中，脊柱髓核植入物还包含一种或多种另外的活性剂，优选抗分解代谢剂(anticatabolic)(例如TIMP-1和TIMP-2)、促有丝分裂剂(例如IGF-1、PDGF、EGF、FGF)、骨形态发生蛋白例如GDF-5、BMP拮抗剂例如头蛋白或脊索发生素和/或细胞内调节剂(例如LMP-1、S0X-9)或其組合。抗分解代谢剂的加入还例如通过抑制降解酶来增加由软骨分化和维持因子或软骨形成形态发生素介导的基质合成。促有丝分裂分子是这样的生长因子，其增加细胞的有丝分裂速率并且还可能增加PG合成至不同程度(取决于细胞所来源的推间盘的区域)，从而进一步支持软骨分化和维持因子或软骨形成形态发生素的作用。通过将软骨分化和维持因子与细胞内调节剂组合，可在体外实验中实现软骨分化和维持因子和/或PG合成的上调。在另一个实施方案中，脊柱髓核植入物还包含一种或多种抗金属蛋白酶、环化素化合物、细胞因子拮抗剂、TNF抑制剂、IL抑制剂、抗血管生成物质(anti-angiogenicsubstance)、蛋白水解酶的抑制剂、抗炎药物包括英利昔单抗、依那西普(etanercerpt)、阿达木单抗(adalimulab)、奈瑞莫单抗(nerelimo醒b)、来那西普(lenercerpt)等，或其组合。在另一个实施方案中，为了防止稚间盘的长期结构性损伤，将脊柱髓核植入物与化学髓核溶解剂例如C-ABC或US2005/0031666中描述的化学髓核溶解剂一起共施用或在注射或施用所述化学髓核溶解剂后再施用脊柱髓核植入物。优选，脊柱核植入物是经推间盘可注射或可植入的。优选，注射是局部或非全身性注射。经推间盘注射或植入的有利方面是可使用更高浓度的软骨分化和维持因子同时引起最小的全身性毒性。可将软骨分化和维持因子或IVD推间盘修复剂于可接受的溶剂或媒介物例如但不限于生理盐水溶液、无菌水、林格氏液中直接进行植入或注射。优选，将其施用入推间盘内或NP间隙。可通过单次或重复注射，优选通过经皮注射或经由导管经皮进行施用。软骨形成蛋白优选CD-RAP的推间盘内注射将通过刺激推间盘细胞上调蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和/或胶原合成来增加推间盘的高度。因此可通过微创技术来进行临床应用，从而显著地节省费用和与其他方法例如部分间盘切除术(disectomy)或推体融合相比减少并发症的可能性。可以将本发明的脊柱髓核植入物加入至推间盘，还可以去除推间盘的部分并用本发明的植入物替代它。因此，本发明还提供了使用本发明的髓核植入物替代一定量的例如在髓核摘除术(nucleotomy)或部分髓核摘除术中净皮除去的NP或补充由于年龄、损伤等原因而退变的NP。正在退变或已退变的推间盘或其部分可用标准技术，使用激光、刮刀或其他手术器械来去除。正在退变的推间盘可以是完整的推间盘或破裂的推间盘。正在退变的推间盘可被分层，可具有裂缝或可脱出。脊柱髓核植入物可与微创稳定术结合。在其中持续刺激导致不希望的因子例如分解代谢因子产生的晚期推间盘退变(advanceddiscdegeneration)的严重病例中，微创稳定术可进一步支持再生或抑制退变的推间盘的发展。在本发明的一个实施方案中，植入物或配制剂还可包含载体或药或药物递送装置是生物相容的，因为其是无毒的并且在身体内不引起炎症反应。载体可包括基质或支架结构。载体可以是固体、液体、凝胶、糊剂或其他可注射形式。优选，载体包括水凝胶例如WO2005/113032中描述的水凝胶，特别地可注射的水凝胶、硫酸化的透明质酸、高度取代的羧曱基纤维素和其盐、藻酸盐、褐藻酸丙二醇酯(hydroxypropylalginate)、壳聚糖、羟乙基淀粉(hydroxethylstarch)、胶原、明股、reversethermal凝胶(例如PluronicF128)、基于壳聚糖的热敏共聚物(例如chitosan-Pluronic⑧水凝胶)、多孔丝支架、多个微:J求体、脂质体配制剂和羟基磷灰石纤维网。载体是适合IVD细胞的向内生长、增殖和驻留(residence)的细胞的适当底物。栽体可包括聚合物例如Pluronics例如pluronic168，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，例如WO2005/034800中描述的嵌段共聚物。优选，载体包括硫酸软骨素、明胶、乙酰透明质酸和/或透明质酸钠或其混合物，包括三-共聚物例如明胶/软骨素-6-硫酸/乙酰透明质酸三-共聚物。三-共聚物的制备描述于Yang等人(Yang等人，2005)，其完全合并入本文作为参考。载体可包括由富含血小板的血浆组成的血纤蛋白凝胶、与生物可降解明胶水凝胶一起的富含血小板的血浆、血纤蛋白/透明质酸复合物(composite)、封装有因子的明胶水凝胶微球体、可注射的生物可降解的水凝胶复合物(其包含例如聚合物例如寡(聚(乙二醇)延胡索酸酯、聚乳酸(PLA)/聚乙醇酸(PGA)和聚s己内酯(polyepsiloncapronolactone))。优选，载体包括壳聚糖-甘油磷酸酯或原位血凝块或用壳聚糖-甘油磷酸酯溶液稳定的血凝块。在本发明的一个实施方案中，脊柱髓核植入物还包含持续释放装置，例如包括水凝胶、聚阴离子水凝胶、多个微球体、脂质体配制剂和羟基磷灰石纤维网的持续释放装置。持续释放装置特别地使得能够进行受控释放。在一个实施方案中，持续释放装置提供了连续不断的释放，在另一个实施方案中，持续释放装置提供间歇性释放。在一个实施方案中，软骨分化和维持因子封装在脂质体中。脂质体具有优于晶体溶液的有利方面，因为可避免推间盘中的机械刺激，从而除了延长治疗剂的持续时间和减慢在施用部位的清除之外可避免治疗诱导的炎症。用于提高治疗化合物和其他试剂的递送效率的一个方法是在脂质结构例如脂质体中进行封装。脂质体通常包含具有核心(所述核心通常在水性介质中包含化合物)的封闭脂滴。在某些实施方案中，将化合物化学结合至脂质组分或仅将其包含在脂质体的水性内腔中。优选以干燥的脂质体组合物(其可进行重构以产生封装软骨分化和维持因子的脂质体)的形式提供根据本发明的包含软骨分化和维持因子的药物组合物或脊柱髓核植入物。优选，脂质体制剂是干燥的重构媒介物(DRV)，其在水性溶液中重构后，形成封装有软骨分化和维持因子的脂质体。本文中使用的脂质体组合物是例如干燥的颗粒状产物，其在加入水后分散，从而形成包含生物活性成分的多层脂质体配制剂。有利地，通过使用干燥的脂质体来避免活性剂和/或脂质体的稳定性问题例如聚集或氧化。适合用于配制剂的单独地或以混合物形式存在的脂质包括中性或带正电荷的脂质例如胆固醇、磷脂酰胆碱、氢化磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱二油酯(dioleylphosphatidylcholine)、石粦脂酰甘油二油酯(dioleylphosphatidylglycerol)、磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine)、二棕榈酰胆碱(dipamlitoylcholine)、神经节苷脂、神经酰胺、磷脂酰肌醇、磷酸、双十六坑基碌酸酉旨、dimyrylstoylphosphatidylcholine、石更月旨酰胺、二棕榈酰磷月旨酰甘油(dipalraitoylphosphatidylgycerol)和其它相似脂质。优选脂质混合物带电荷。脂质体配制剂通常是至少两种脂质例如胆固醇和磷脂酰胆碱的混合物，更常见三种或更多种脂质的混合物。在另一个实施方案中，将本发明的软骨分化和维持因子PEG化(pegylated)。该经修饰的软骨分化和维持因子具有大于未经修饰的试剂的生物学半衰期，从而可提高试剂用于脊柱病症的医学治疗(medicaltreatment)的功效。PEG化可增加蛋白质的大小、提高稳定性、增加蛋白质的溶解性、减少蛋白质水解和减少给药频率。此外，可减少朝向蛋白质聚集的倾向。PEG化可通过蛋白质上的氨基或巯基与聚乙二醇(PEG)上的化学反应基团(碳酸酯、酯、醛或三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate))之间的稳定的共价键实现。所得的结构可以是线性的或分支的。PEG试剂例如描述于Roberts等人(Roberts等人，2002)中。其他PEG化试剂是但不限于甲氧基聚(乙二醇)(raPEG)、甲基PEOu马来酰亚胺PEG、包含胺反应性、加曱基帽的(methyl-capped)聚环氧乙烷(PEO)的修饰试剂(曱基PEOn-NHS酯，n=4、8、12)。在另一个实施方案中，本发明的脊柱核植入物包含髓核组织或细胞，优选来源于间充质干细胞(MSC)的细胞。在软骨分化和维持因子单独地或与其他形态发生素或生长因子如IGF-l成员或BMP—起存在的情况下，可将从供体组织(例如骨髓基质)分离的MSC或自体干细胞培养在三维的生物可降解的支架材料例如透明质酸、丝、胶原、胶原/乙酰透明质酸支架、水凝胶、壳聚糖、壳聚糖凝胶、可注射的可交联的聚合物制剂、可降解的聚合物凝胶或支架、聚乳酸、明胶/软骨素-6-硫酸/乙酰透明质酸支架、透明质酸的酯或衍生物例如Hyaff11、羟基磷灰石纤维网和血纤蛋白胶中或其上，所述形态发生素或生长因子支持此类细胞分化成髓核-样细胞并且优选在氧张力下刺激PG合成。用于培养的方法例如描述于Honda等人，2000，其通过引用合并入本文(Honda等人，2004)。然后将所得的培养的细胞或新组织，优选，与支架材料一起，移植入或注射入受累堆间盘以达到NP的再生。还可以在单层培养物中例如在体外低氧条件下分离和扩增MSC，如在推间盘的NP区域中发生的一样。进行移植的MSC可用刺激IVD愈合所需的一种或多种软骨分化和维持因子进行转染或可用包含此类软骨分化和维持因子(例如CD-RAP或其活性片段)的软骨形成诱导培养基进行刺激。优选，可通过编码此类软骨分化和维持因子如CD-RAP蛋白或其活性片段的表达载体进行转染。可通过注射例如胰岛素微量注射器(Sakai等人，2005)或另一种施用装置将优选包埋在生物材料例如胶原、去端肽胶原凝胶、藻酸盐、褐藻酸丙二醇酯、羧甲基纤维素或羟乙基淀粉中的已转染的和/或已刺激的MSC或培养的MSC移植入退变性推间盘。细胞密度可以是例如1x104个细胞/1111至1x107个细胞/ml，优选1x1()5个细胞/ml至lx1()6个细胞/ml。还可在软骨分化和维持因子单独或与其他形态发生素或生长因子如TGF-p成员和/或BMP(例如BMP-2)—起存在的情况下将MSC培养在藻酸盐、小丸(pellet)、微团或聚集的细胞培养物中，所述形态发生素或生长因子支持此类细胞分化成NP样细胞。在一个实施方案中，递送系统包含MSC或AF细胞与3-D多孔丝支架。多孔丝支架可来源于从家蚕提取的丝心蛋白。细胞可在未分化软骨细胞。可将MSC或AF细胞直接接种于丝支架或接种于装载有软骨分化和维持因子的丝支架，并且可培养在补充或未补充单独的或与上述其他因子一起的软骨分化和维持因子的培养基中。来自家蚕蚕茧的丝心蛋白支架可以如Sofia等人和Karageorgiou等人(Sofia等人，2001;Karageorgiou和Kaplan,2005)中所述进4亍提取。在一个实施方案中，可用至少一种软骨分化和维持因子的基因离体转染AF、NP或MSC细胞以提供刺激IVD愈合所需的细胞和蛋白质，然后在于例如单层培养物、藻酸盐珠粒或三维生物可降解支架材料中培养或不培养的情况下将其再植入被靶向的宿主组织。例如，以单层的形式接种分离的NP细胞，然后使用转染剂例如FuGene6试剂，用例如包含软骨分化和维持因子的表达载体或病毒基因治疗载体例如腺病毒或腺相关病毒(AAV)进行转染。在数天的培养(例如，7天)后，将细胞传代和封装在藻酸盐中，例如优选大约0.5至2%的藻酸盐中。基因的表达可通过标准方法例如RT-PCR或ELISA来分析。可将藻酸盐珠粒中的此类转染的髓核细胞用于IVD的组织工程和用于退变性推间盘疾病的治疗。其他的基因疗法描述于例如Wells，2004;Paul等人，2003和Sobajima等人，2004中。在一个实施方案中，使用例如编码刺激IVD愈合所需的软骨分化和维持因子的重组猿猴病毒40腺病毒载体或杆状病毒载体暂时永生化细胞例如优选人来源的NF细胞、MSC或自体软骨细胞。在另一个实施方案中，可用携带外源因子例如软骨分化和维持因子的腺病毒载体转染退变性人IVD细胞(例如NP细胞)。然后，随后的步骤是将这些经修饰的细胞注射回患病的IVD。本发明还涉及本发明的软骨分化和维持因子在培养用于制备药物组合物的间充质干细胞中的用途，所述药物组合物用于治疗需要该治疗的哺乳动物特别是人中的脊柱病症。本发明通过附图和实施例进一步说明。图1举例说明了包含CD-RAP的脂质体配制剂在数天中的稳定性(三角形)。按照实施例3测定脂质体配制剂的稳定性。上面的曲线(正方形)显示CD-RAP在37。C下在緩冲液中的稳定性，从而测定蛋白质在这些条件下的稳定性。图2显示在37。C下24小时后50pgCD-RAP在血纤蛋白凝块(fibrinclot)系统中的固定作用。A:Tachotop,14mm的直径，4mm的高度，来自Nycomed;B:猪I型胶原海绵，BiomUp;C:再水化的Hyalofi1l-F。图3举例说明与未加入CD-RAP和BMP-2的阴性对照相比，在用CD-RAP(100ng/ml)刺激后，培养的兔IVD细胞的百分比(％)蛋白聚糖(GAG)诱导(n-3)。实施例实施例1:纤维环穿刺模型在本实施例中，在兔纤维环穿刺模型中，CD-RAP的注射有效地部分恢复推间盘高度。可使用确定的针规通过推间盘的纤维环的穿刺来在青少年期的新西兰白兔(NewZealandWhiteRabbit)中诱导推间盘退变(Singh等人，2005)。在通过向堆间盘的背部区域注射利多卡因提供局部麻醉后，获得侧平面射线照片以测定IVD高度的注射前基线值。然后将兔置于侧伏卧位，并且使用后外侧腹膜后手术(posterolateralretroperitonealapproach)暴露腰IVD。在每一只兔中，4吏用18G针对AF穿刺。在4、8和10周后，动物接受緩沖盐溶液(磷酸精氨酸或PBS)或媒介物脂质体(作为对照)或2.5mg/ml至lOmg/mlCD-RAP(于PBS中)的蛋白质溶液或脂质体封装的CD/RAP(2.5rag/ral)至髓核的注射。然后观察动物8或12周(诱导和治疗期)。临床前结果通过腰脊骨的磁共振成像(MRI)扫描来分析，使用成像软件通过用定制程序测量的放射学观察来监测IVD高度，并计算仰HI(手术后DHI/手术前DHIxlOO)。关于IVD的组织学分析，切片用苏木精伊红和番红0染色。通过使用单因素方差分析法(one-wayanalysisofvariance)(AN0VA)分析组间差异的统计显著性。推间盘退变治疗的可选的緩慢进行性和重现性动物模型是如Sobajima等人(Sobajima等人，2005)中所描述的Lipson和Muir的经典"刺伤模型"。关于刺伤方法，可在新西兰白兔的AF中产生切口。对于每一只兔，将用CD-RAP处理一个推间盘，用盐溶液或媒介物处理另一个推间盘。纤维环针穿刺模型导致推间盘在12周的观察期中变窄。盐溶液处理的推间盘展示推间盘的大面积退变。然而，仰HI显示与注射盐溶液或媒介物的推间盘相比，CD-RAP组具有保持推间盘高度的倾向。组织学分析显示与对照组相比，蛋白聚糖合成和抗退变性变化的保护增力口。实施例2:包含CD/RAP的脂质体的制备为了制备持续的脂质体制剂，将75Gmg磷脂酰胆碱和250mg胆固醇在圆底烧瓶中溶解于20ml乙醇中。在旋转式蒸发器中定量除去溶剂。通过在室温下温和搅拌，使产生的薄脂质膜在10ml水中再水化，从而获得脂质体(10%(w/v)脂质)。通过随后的超声处理制备直径大约100nm的单层嚢泡(SUV)。将300|a1SUV与250julCD-RAP溶液(3mg/ml于420mM/1Arg/P04pH7.5中)混合，然后进行冻干。在即将使用干燥的重构嚢泡之前通过用蒸馏水重构lyocake来产生封装蛋白质的多层脂质体(MLV)。该再水化导致大约50。/。或更大的至MLV(具有大约1.5iLim或更大的平均直径)中的捕获效率而无被捕获的药物的化学变化。实施例3:包含CD-RAP的脂质体配制剂的稳定性本实施例举例说明包含CD-RAP的脂质体配制剂在数天内的稳定性。如下测定脂质体配制剂的稳定性如上所述将120iagCD-RAP封装在300iil脂质体悬浮液中。将IOOjul的等分用300ul双蒸水稀释，然后通过在16000rcf下离心15分钟来对其进行分离。为了测定封装效率，使用标准曲线，通过RP-HPLC定量未封装的CD-RAP。重悬浮和离心步骤的6次重复未显示游离CD-RAP增加。通过在7天的时间内测量通过离心(在16000rcf下进4亍15分钟)分离的上清液中CD-RAP的游离浓度来描述释放。在各时间点上，使用标准曲线通过RP-HPLC测量游离CD-RAP的量。图1中显示的结果显示高于50%的高封装效率(时间第0天)。在随后于37。C下长达7天的观察期中，获得保持大约45%的封装的平台，从而指示重构的包含CD-RAP的脂质体的稳定性。实施例4:固定CD-RAP的植入物本实施例举例说明在基于胶原或透明质酸的支架中的固定CD-RAP的植入物。将50jugCD-RAP配制于125ju120mMKH2P04、150mMKC1、K0H、pH7.5，0.01%Tween80中。使溶液渗入胶原海绵(A:Tachotop⑧(A)，14咖直径，4mm高度，来自Nycomed;(B)猪I型胶原海绵，BiomUp);或与500p1Hyaff凝胶(再水化的Hyalofi1卜F(C)，30mg于0.5ml双蒸水中，3h，5。C)混合以吸附CD-RAP。随后通过冷冻干燥除去水。为了测定吸附至胶原或Hyaff上的CD-RAP的固定动力学，将CD-RAP浸透的样品固定在500ju1牛血纤蛋白凝块(4.9mg血纤蛋白原、0.3U凝血酶于50mM柠檬酸钠、150mM氯化钠、10mM氯化钩，pH6.4中)中，如由Meyenburg等人(Meyenburg等人，2000)所述。然后用2ral接受体培养基(acceptormedium)(磷酸盐緩冲液，0.02%Tween80)完全覆盖凝块。〗吏用标准曲线，通过RP-HPLC在24小时后定量游离CD-RAP的量。图2中显示的结果显示不同生物材料的固定功效的差异，材料A和C显示对重组CD-RAP蛋白的强结合性质。这些结合性质可用于软骨决定和维持因子在缺陷部位例如退变的推间盘中的局部靶向和保留，从而避免CD-RAP的高起始发生并在再生部位提供长期的维持。实施例5:人和动物推间盘细胞的分离本实施例举例说明制备IVD细胞的方法，所述IVD细胞用于分析CD-RAP对细胞外基质组分(其对于软骨细胞的刺激和CD-RAP的合成代谢活性是特异性的)的产生的影响。人推间盘细胞可从通过在患有退变性推间盘疾病的患者的治疗中进行的间盘切除术回收的人推间盘组织分离。样品(髓核或纤维环)用PBS漂洗以除去残留的血液或细胞外基质。在组织切碎后，使用胶原酶溶液(O.5mg/ml于PBS中)在37。C下进行45分钟以从细胞外基质释放细胞，然后可通过离心分离细胞(参见Klagsburn，"MethodsinEnzymology"，第VII巻)。在除去上清液后，将收获的细胞在6孔板上培养于具有或不具有胎牛血清的Eagle最小必需培养基中。来自动物组织的牛IVD细胞通过连续酶促消化来分离。在增湿的大气中于37。C，5%C02下培养细胞(每天更换补充有10%胎牛血清、25lug/ml抗坏血酸、360|ag/mlL-谷氨酰胺和50mg/ml庆大霉素的DMEM/F12培养基)直至它们达到大约80%的汇合。来自动物组织的兔IVD细胞通过连续的酶促消化来分离。在增湿的大气中于37。C,5%c02下在补充有10%FCS、1%青霉素/链霉抗生物素蛋白和50ng/ml抗坏血酸的DMEM培养基中培养细胞直至它们达到大约90%的汇合。此后，将它们传代，再培养另外7天。实施例6:推间盘细胞在藻酸盐珠粒中的培养通过将60jLi11.2%的藻酸盐(于0.15NaCl中)和实施例5中的IVD细胞一起快速递送至102mmo1/L氯化4丐溶液中形成半固体珠粒来形成藻酸盐珠粒。清洗珠粒两次，将其置于具有lml培养基的12孔板中(Aota等人，2005)。所得的藻酸盐珠粒可用于分析在加入或不加入CD-RAP的情况下，纤连蛋白片段(120kDa片段(Chemicon，Cat.No.F1904),来自人血浆的70kDa的纤连蛋白的蛋白水解片段(Sigma，Cat.No.F0287))对蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖表达的影响。实施例7:CD-RAP介导的IVD细胞中聚集蛋白聚糖和蛋白聚糖合成的诱导本实施例举例说明脊柱植入物用于证明CD-MP(当加入至IVD细胞时)在培养期间显著增加IVD细胞的蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表达的用途。在第7天，将实施例5的IVD细胞置于24孔板中以研究蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表达。将细胞在含有O.5"M和0.1iaM的70kDa的纤连蛋白片段(F0297Sigma)的无血清培养基中再培养7天。为了分析CD-RAP对蛋白聚糖合成和聚集蛋白聚糖的表达的影响，在用纤连蛋白培养后2天加入不同浓度的CD-RAP(1、5、10、20ug/ffll)。7天后，通过Lightcycler分析(SybrGreen)分析聚集蛋白聚糖的表达。为了从珠粒释放细胞，将珠粒溶解在含有55mmol/L柠檬酸钠、30imnol/LNa2EDTA、0.15M氯化钠pH6.8的緩冲液中。清洗细胞沉淀并将其重悬浮于裂解緩沖液中以进行RNA提取(Qiagen)。使用RNeasyMiniKit(Qiagen)进^f亍RNA分离。按照Invitrogen的SuperscriptIIRT试剂盒的说明书进行CDNA合成。P-肌动蛋白用作对照。用于扩增的引物如下a)牛p-肌动蛋白引物5'GGAAATCGTCCGTGACATCAA3';AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC3。聚集蛋白聚糖引物是5'AAGAGAGCCAAACAGCCGA3';5'CTGGTAGTCCTGGGCATTGT3'。按照Farndale等人(Farndale等人，1982)中描述的方法，使用二甲基亚甲蓝(DMMB)比色测定法测量蛋白聚糖合成。可使用离心过滤装置(centriconfilter)以5000rev/分钟进^f亍10至20分钟来浓缩培养基。GAG含量可通过将20Hi1浓缩的或稀释的培养基与200ia1DMMB溶液混合，然后测量525-530nm处的光密度来测定。为进行标准化，可使用硫酸软骨素(硫酸软骨素A94%，牛气管，ICN)。计算每微克DNA或细胞数目的所有测量值的平均值。实施例8:兔稚间盘细胞中蛋白聚糖的诱导当按照实施例5分离的兔IVD细胞达到90%汇合时，将细胞置于6孔板中以研究蛋白聚糖合成。将细胞再培养5天。为了分析CD-RAP对蛋白聚糖合成的影响，将培养基改变成1%FCS，并且将BMP-2(100ng/ml)单独地或与CD-RAP(lOOng/ml)—起加入至培养物。5天后，使用实施例7中描述的二甲基亚甲蓝(D画B)比色测定法在细胞培养上清液中测量蛋白聚糖的合成。3个独立实验的GAG刺激的结果总结于图3中。这些数据表明向经BMP-2刺激的IVD细胞中加入CD-RAP在培养的兔IVD细^(中导致GAG增加。么、^TB"尸/!"泰》乂紬日J入本文。尽管已举例说明和描述了优选实施方案，但应当理解，可根据本观.本发明。p①IBPOSSes!S!SAIOJPUOLPS6S}1}.S0p90npuHueE6B4-ul5UOJqy.(卜660.V-S!J」BHu!p①UOJqJj14一MpeJ:3lno9se一一t迈0U54sseelsu一sa一ep54sp仁beu501AOolloqwlBOLSMuo一一SPBJ6apuboa一soaloKI一oL5:B一oossv.(966{.).d*pjhP￡B.v-0-6&qpumtoHanss一iL.loauuoo.sa!nl.jnos着sc！sce0A，6oujis8A一spa著nsfe;4Aieo-lo!CJ*6卜寸-sz.寸>-SCJewed-JC!X山eeeQ,OSNVl60一0￡0_4l>2J24}0C.SWBdU2,sssjdxepus36eHt想0u！uo一ssa!d5spue-uo!一ez.lleoqIBPJOS0￡o』_40,ajnpn4s:sue6v=wd￥E,aosnos-U660TirilapuBSp仁sry-jQSJangr<-2*su5usf>wsle一J91BEO!g.uo一ultsla妄pevtsjpcolpjc-ijaseEbss《x4一/VPBAjoi一q!4u！Bujouel①CJ)v一sc!①IOJd￡6u!lls!一qsJS3.(soos).y-JSU;pngpue->j,v-，pqJssogH83E①qolo迅「-vll/1>qA1!/50Bu一J6elu！puo一JBIP-6ay.{9002).>!.<-Jloq&ssog-S91X02PUOLP』e30〖ls仁0siledE8e:s一leoos一p一sqalisA.si仁一AqEs一一oqeiaatpuery-5l一tplftjrg.o-UOSSJepcv-Tg-jsjet-ro-6」9qplsEOHrs-工-uv-.A-dovpassagedculturedch'oncirocytesinar>ewscaffold:hybrid75:25poly(L-tectide-epsiton-:caprolactone)sponge,JOralMaxiltofacSurg62,1510-1516.Karageorgiou，V.andKaplan,D.(2005),Porosrtyof3DbiomaterialscaHoldsandosteogenesis.Btomaterials26,5474-5491.Kawakami,M.，Ma實sumoto'T.,HasWzume'H,,Ku;r，bayasW，K,，C'hubinskaya,S.,andYoshida'M(2005),Osteogenicprotein-1(osteogenicprotein-1/bonemorphogenet.icp.rotein-7)inhibitsdegenerationartelpain-re，atBdbehavior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