专利名称：：垂盆草醇提物的医药应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中草药提取物的医药应用，尤其涉及一种垂盆草醇提物的医药应用。
背景技术：
：垂盆草(SedumsarmentosumBunge)又名卧茎景天、鼠牙半枝、瓜子草、佛指甲、石指甲、入药始载于《百草镜》。系景天科多年生肉质草木植物。垂盆草是历版《中国药典》收载的常用中药之一。垂盆草是一种重要的药用植物资源，在夏、秋二季采收，除去杂质，其新鲜或干燥全草入药，具有清热解毒、利尿消肿、排脓生肌之效，用于湿热黄疽，丹毒溃疡，小便不利，痈肿疮疡，急、慢性肝炎的治疗，并且具有较好的保肝护肝、免疫抑制、雌激素作用、血管紧张素转化酶抑制作用及抑菌等功效[潘金火，中国药业，16:365—366(2002);KimWH,etal.JNutrSciVitaminol,50:100-105(2004);OhH，etal.BiolPharmBull.，27:2035-2037(2004)]，是具有广阔前景的药用植物。民间用垂盆草治疗急性肝炎有特殊功效，单味垂盆草一般服用15天即可治愈，在治疗时表现的作用是退黄、降酶，肝肿改善，肝区隐痛消失，小便转为正常。据有关文献报道，垂盆草能有效抑制炎性渗出，减少肝细胞损伤，明显降低谷丙氨酸转氨酶(ALT)，降酶作用迅速而持久[郭佳等，上海医药杂志，11:47(1991)]，这与史书记载的该药有"清热解毒、消肿"之效完全吻合。垂盆草的主要成分为垂盆草苷、甾醇类物质、黄酮类物质、某些糖类物质及生物碱类物质等(何爱民等，中草药，28:517—522(1997);何爱民等，中国药科大学学报，28:271—274(1997);HeAimin,etal.Phytochemistry,49:2607-2610(1998)]。研究表明，黄酮类化合物通过清除超氧阴离子和羟自由基抑制脂质过氧化的起始，是清除氧自由基的关键结构，是促进疲劳恢复，增加机体运动能力的有效成分。垂盆草在临床上已广泛应用于治疗咽喉肿痛、热淋水火烫伤、蛇虫咬伤及各种急慢性活动性肝炎，但对于垂盆草醇提物抗肿瘤活性及其作用机制的研究尚未见报道。
发明内容发明目的本发明的目的在于提供垂盆草醇提物的新的医药应用。技术方案本发明的垂盆草醇提物按如下方法制备得到将垂盆草干草用95%乙醇提取23次，乙醇用量为10毫升/(克干草*次)，合并提取液，浓縮，提取物浓缩液采用石油醚萃取去除脂类，石油醚用量为2毫升/克干草，挥去石油醚，再用甲醇溶解，甲醇用量为0.2毫升/克干草，减压蒸干。通过上述制备方法制得的垂盆草提取物中总黄酮含量为430%，甾醇含量为3.520%，垂盆草苷含量为0.410%，三萜类0.210%。垂盆草醇提物对肝癌细胞HepG2增殖的影响实验表明，200pg/ml垂盆草醇提物在作用24小时后即对肝癌细胞有显著的抑制作用，而在作用72小时后各剂量组醇提物均对肝癌细胞有非常显著的抑制作用。说明垂盆草醇提物对肝癌细胞生长有明显的抑制作用，且有一定的剂量依赖关系。流式细胞术分析显示，垂盆草醇提物可使肝癌细胞阻滞于静止(G0/G1)期，从而抑制了细胞的分裂增殖，具有显著的抗肿瘤活性。通过考察免疫细胞化学检测垂盆草醇提物对HepG2VEGF和c-myc的表达的影响，发现垂盆草醇提物可显著抑制二者的表达，尤其对VEGF有非常显著的抑制作用。由此说明，垂盆草醇提物对肝癌细胞有抑制作用。此外，通过考察RT-PCR法检测垂盆草醇提物对HepG2VEGF和c-myc的mRNA水平的影响，发现醇提物可显著抑制VEGF、c-myc的mRNA水平，进一步证实垂盆草醇提物对肝癌细胞有抑制作用。综上研究，垂盆草醇提物可用于制备抗肝癌药物。有益效果本发明对垂盆草醇提物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。垂盆草醇提物具有显著的抑制肝癌细胞增殖的作用，调节细胞周期，从RNA和蛋白水平抑制肿瘤相关基因表达，可作为抗肝癌药物。图1为垂盆草醇提物作用HepG2细胞48h后对其细胞周期的影响。A为药物终浓度为0pg/ml时HepG2的细胞周期分布；B为药物终浓度为50pg/ml时H印G2细胞周期变化；C为药物终浓度为100ng/ml时HepG2细胞周期变化；D为药物终浓度为200^g/ml时HepG2细胞周期变化。随药物浓度增大，细胞阻滞于静止期的数量逐渐增多。图2为垂盆草醇提物对HepG2细胞VEGF、c-myc表达的影响。A、B、C、D、E分别为药终浓度O，25，50，100，200^g/ml时VEGF的表达；F、G、H、I、J分别为药终浓度O，25，50，100，200吗/ml时c-myc的表达。随药物浓度增大，VEGF、c-myc表达量逐渐下降。图3为垂盆草乙醇提物对HepG2细胞的VEGF和c-myc的mRNA水平影响的电泳分析图。随药物浓度增大，VEGF和c-mycmRNA水平显著下调。具体实施方式实施例l:垂盆草醇提物的制备垂盆草千草500g，于95n/。的乙醇5000mL中浸泡5天，纱布过滤，收集药液。重复2次，合并药液，离心取上清，所得上清液经减压蒸发挥去溶剂，用石油醚1000mL萃取去除脂类，挥去石油醚，再用100mL甲醇溶解，减压蒸干、干燥得醇提物。实施例2:醇提物对肝癌细胞增殖的抑制作用醇提物经DMSO溶解并用RPMI1640培养基稀释，使DMSO终浓度为0.1%，经无菌滤器除菌备用。人肝癌细胞株HepG2用含10X小牛血清的RPMI1640培养液置于37°C、5。/。C02培养箱中培养。将肿瘤细胞培养至对数生长期，调整细胞浓度为口104个/ml，接种于96孔板，lOO^d/孔，4小时贴壁后，加入醇提物使终浓度分别为25,50,100,200lig/ml的，另设阴性对照组(RPMI1640培养基)和0.1%DMSO溶剂对照组，每组设6个平行孔，继续培养24、48、72小时，MTT法检测增殖结果。各剂量组对HepG2的作用结果见表l。结果显示，200jag/ml醇提物在作用24小时后即对肝癌细胞有显著的抑制作用，而在作用72小时后各剂量组醇提物均对肝癌细胞有非常显著的抑制作用。说明垂盆草醇提物对肝癌细胞生长有明显的抑制作用，且有一定的剂量依赖关系。表1垂盆草醇提物对肝癌细胞HepG2增殖的影响(pg/ml)24h48h72h一50.3397±0.0308~0.5167±0.03560.8394±0.0261250.3138±0.02570.5108±0.03150.7455±0.0208***500.3104±0.00870.5080±0.01700.6823±0.0256***1000.3010±0.00380.4976±0.03120.6764士0.0609"5152000.2978±0.0205*0.4458±0.0452*0.6738±0.0368****p<0.05,***p<0.001,与对照组相比较实施例3:流式细胞术检测细胞周期分别收集对照组和醇提物各剂量作用48h后的HepG2细胞lxl06个，PI染色，用流式细胞术进行细胞周期分析，结果见附图l。流式细胞术分析显示，醇提物可使肝癌细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制了它的增殖活性。实施例4:免疫细胞化学检测肿瘤相关蛋白表达取对数生长期的HepG2细胞，以5xl(^个/ml细胞浓度接种到放有盖玻片的六孔板中，4h贴壁后将药物以不同浓度加入其中。培养48h后取出盖玻片。PBS清洗标本2次，80%丙醇4°<:固定，染色步骤严格按SABC，DAB试剂盒说明书操作。检领!lVEGF和c-Myc蛋白表达。同时设对照组。染色结果以细胞浆或核膜出现棕黄色髙出背景的细胞为阳性细胞。未经醇提物作用的对照组VEGF(图2，A)和c-myc(图2，F)有很强的阳性表达。在25，50，100和200ng/ml醇提物作用48小时后肝癌细胞的VEGF表达水平依浓度递增呈非常显著下降(图2，B，C，D，E);c-myc表达也有明显的下降(图2，G，H，I，J)。计算每组的阳性细胞率。分析结果见表2。醇提物可显著抑制二者的表达。由此说明，垂盆草醇提物对肝癌细胞肿瘤相关基因的表达有显著的抑制作用。表2垂盆草醇提物对HepG2VEGF和c一myc蛋白表达水平的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*p<0.05，***p<0.001,与对照组相较实施例5:RT-PCR检测VEGF、c-myc的mRNA水平的改变实验组和对照组HepG2细胞分别用Biozol试剂提取RNA，依照提取试剂盒步骤操作后得到白色沉淀，加入in/。。DEPC水3(^l至RNA完全溶解。紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度。取各组总RNA各2昭分别进行逆转录合成cDNA，以P-actin为内标进行半定量RT-PCR。先在94。C预变性5min，然后分别为94。C变性30s，58。C退火40s，72。C延伸30s，共30个循环，最后72'C延伸7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析结果。醇提物对肝癌细胞VEGF、c-myc表达强度的影响见表3和图3。醇提物可显著抑制VEGF、c-myc的mRNA水平。进一步证实垂盆草醇提物对肝癌细胞有抑制作用。表3垂盆草醇提物对HepG2VEGF和c-myc的mRNA转录水平的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种垂盆草醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的垂盆草醇提物按如下方法制备得到将垂盆草干草用95%乙醇提取23次，乙醇用量为10毫升/(克干草*次)，合并提取液，浓縮，提取物浓縮液采用石油醚萃取去除脂类，石油醚用量为2毫升/克干草，挥去石油醚，再用甲醇溶解，甲醇用量为0.2毫升/克干草，减压蒸干。3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于垂盆草醇提物在抑制肝癌细胞的增殖中的应用。4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于垂盆草醇提物在肝癌细胞阻滞于静止期，抑制细胞的分裂增殖中的应用。5、根据权利要求1所述的应用，其特征在于垂盆草醇提物在降低肿瘤相关基因的VEGF和c-myc的蛋白表达水平，从蛋白质水平抑制肝癌细胞增殖中的应用。6、根据权利要求1所述的应用，其特征在于垂盆草醇提物在降低肿瘤相关基因的VEGF和c-myc的mRNA水平，从转录水平抑制肝癌细胞的增殖中的应用。全文摘要本发明涉及垂盆草醇提物的新用途，即在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明对垂盆草醇提物发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。垂盆草醇提物具有显著的抑制肝癌细胞的增殖，调控细胞周期，从RNA和蛋白水平抑制肿瘤相关基因表达，可用于制备抗肿瘤药物。文档编号A61K36/41GK101229214SQ200810019200公开日2008年7月30日申请日期2008年1月16日优先权日2008年1月16日发明者煜孙,张伟云,曹丽丽,沈文斌,邱水晴,陈维霞,鹃黄,黄丹丹申请人:南京大学