专利名称：：一种知母提取物及其作为治疗2型糖尿病药物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及糖尿病药物领域，具体涉及一种用于治疗糖尿病的知母提取物。知母(RhizomaAnemarrhenae)为百合禾斗植物(Anemarriienaasphodeloides)的干燥根茎，其性味苦寒，有清热泻火、生津润燥的功效，是一常用的苦寒清热药。现代研究表明，知母中含有的知母皂苷(timosaponin)、芒果苷(chimonin，mangiferin)及其葡糖苷和知母多糖(anemaran)从不同机制降低血糖，可用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病。知母皂苷可通过恢复胰岛3细胞功能，增强外周组织对胰岛素的敏感性，抑制a-葡萄糖苷酶活性三种途径实现对血糖水平的控制。知母多糖能降低正常小鼠及由四氧嘧啶型小鼠的血糖指标。知母多糖的降血糖作用与其增加肝糖元合成、减少肝糖元分解、增加骨骼肌对葡萄糖摄取等因素有关。此外,醛糖还原酶(AR)在糖性白内障的发病中起着关键作用，还与糖尿病引起的角膜、视神经及外周神经的病变有关。知母多糖可作为醛糖还原酶(AR)抑制剂，缓解糖尿病的并发症状。芒果苷及芒果苷-7-O-3-糖苷对正常小鼠血糖无影响，但可降低KK-Ay小鼠血糖并且有降低血清胰岛素水平的趋势，其降糖机制可能是降低胰岛素抵抗性。并且芒果苷在2型糖尿病中，对高脂血症有益且可作为抗凝血药用于心肌梗死的治疗。
发明内容本发明的目的在于提供一种对2型糖尿病具有治疗作用的知母提取物。本发明的另一个目的在于提供上述知母提取物在制备治疗或预防2型糖尿病药物中的应用。本发明的知母提取物，由如下方法制备而成(1)知母粉碎后，用612倍体积10%90%乙醇溶液提取13次，每次l3h，放冷后过滤，合并滤液，浓縮得稠膏l;(10%90%乙醇溶液是指体积百分数，下述的乙醇溶液均是指体积百分数)(2)取稠膏l，以612倍体积水溶解，上大孔树脂柱，以35个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；以40%80%乙醇溶液洗脱48个柱体积，洗脱液浓縮至无醇，过滤，将沉淀干燥粉碎，得提取物l，即为知母提取物。为了提高提取效率，在上述知母提取物制备方法中，可将醇提取后的残渣进一步用水提取，具体步骤如下所示(l)知母粉碎后，用612倍体积10%90%乙醇溶液提取13次，每次13h，放冷后过滤，合并滤液，浓縮得稠膏1;过滤后残渣加612倍体积水提取13次，每次l3h，趁热过滤，合并滤液，浓縮得稠膏2;(2)取稠膏l，以612倍体积水溶解，上大孔树脂柱，以35个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；以40%80%乙醇溶液洗脱48个柱体积，洗脱液浓縮至无醇，过滤，将沉淀干燥粉碎，得提取物l;(3)取稠膏2，加1020倍体积水溶解，超滤，取截留液，浓縮干燥，得提取物2;所述超滤是采用超滤膜装置及截留分子量10000300000的超滤膜进行超滤；(4)合并提取物l、2，即得知母提取物。上述制备方法得到的知母提取物1，主要含有皂苷类和双苯吡酮两类成分，且含量大于50%。知母提取物2，主要含有知母多糖类成分，且含量大于50%。本发明所述的知母提取物主要含有以下三类成分中的至少二类，此三类成分包括知母皂苷AI、知母皂苷AII、知母皂苷AIII、知母皂苷AIV、知母皂苷BI、知母皂苷BII、知母皂苷BIII等皂苷类，知母多糖A、B、C、D等多糖类及芒果苷和芒果苷-7-O-P-糖苷等双苯吡酮类，且这些有效成分总含量在50%与100%之间。本发明的知母提取物可制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型的药物，用来治疗或预防糖尿病及其并发症。经动物实验证实，该知母提取物具有抑制小肠上皮a-葡萄糖苷酶的活性，增加靶细胞胰岛素受体数目，改善靶细胞对胰岛素敏感性，减轻胰岛素抵抗，促进胰岛素分泌和降低血糖等功效。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明的知母提取物通过保护、修复胰岛内分泌细胞而增加血清胰岛素浓度，并增加肝糖元含量，竞争性地抑制小肠上皮a-葡萄糖苷酶的活性，从而延缓肠道对糖的吸收，起到降糖的作用；通过增加耙细胞胰岛素受体数目，改善靶细胞对胰岛素敏感性，从而减轻胰岛素抵抗；并且对白内障、高血脂和心血管方面的糖尿病并发症有防治作用，因此可制备成治疗或预防2型糖尿病及其并发症的药物，具有很大的医药价值和经济效益。图1为知母提取物对a-葡萄糖苷酶活性影响的曲线图。具体实施方式实施例l制备知母降糖片(1)将知母药材粉碎，用8倍体积量的80%乙醇提取2次，每次lh，放冷后过滤，合并滤液，浓縮得稠膏l。(2)取稠膏1，用8倍体积量水溶解，上大孔树脂柱，以5个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液。以50%乙醇溶液洗脱8个柱体积，洗脱液浓縮至无醇，静置，析出沉淀，过滤，将沉淀千燥粉碎，得提取物l，即知母提取物。(3)称取250g上述知母提取物，加入250g硫酸钙、10g交联聚维酮混匀。以适量80%乙醇作润湿剂制成软材，以14目筛制粒，于6(TC温度下干燥后过12目筛整粒，加入10g交联聚维酮及3g硬脂酸镁混匀后，制成1000片。实施例2制备知母降糖片(1)将知母药材粉碎，以8倍体积量80%乙醇提取2次，每次lh，放冷后过滤，合并滤液，浓縮得稠膏l;过滤后残渣加8倍体积量水提取2次，每次l，趁热过滤，合并滤液，浓縮得稠膏2。(2)取稠膏l，以8倍体积量水溶解，上大孔树脂柱，以5个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液。以50%乙醇洗脱8个柱体积，洗脱液浓縮至无醇，静置，析出沉淀，过滤，将沉淀干燥粉碎，得提取物l。(3)取稠膏2，加20倍体积量水溶解，应用超滤膜装置及截留分子量300000的超滤膜进行过滤，取截留液，浓縮干燥，得提取物2。(4)合并提取物1和提取物2，即得知母提取物。(5)称取250g上述知母提取物，加入250g硫酸钙、10g交联聚维酮混匀。以适量80%乙醇作润湿剂制成软材，以14目筛制粒，于6(TC温度下干燥后过12目筛整粒，加入10g交联聚维酮及3g硬脂酸镁混匀后，制成1000片。实施例3制备知母降糖胶囊(1)将知母药材粉碎，以10倍体积量80%乙醇提取2次，每次lh，放冷后过滤，合并滤液，浓縮得稠膏1;过滤后残渣加10倍体积量水提取2次，每次l，趁热过滤，合并滤液，浓缩得稠膏2。(2)取稠膏1，以8倍体积量水完全溶解，上处理好的大孔树脂柱。以3个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液。以60%乙醇洗脱6个柱体积，洗脱液浓縮至无醇，静置，析出沉淀，过滤，将沉淀干燥粉碎，得提取物1。(3)取稠膏2，加10倍体积量水溶解，应用超滤膜装置及截留分子量100000的超滤膜进行过滤后，取截留液，浓縮干燥，得提取物2。(4)合并提取物1和提取物2，即得知母提取物。(5)称取250g上述知母提取物，加入250g硫酸钙、10g交联聚维酮混匀。以适量80%乙醇作润湿剂制成软材，以14目筛制粒，于6(TC温度下干燥后过12目筛整粒，填入空胶囊中，即得。实施例4知母提取物对葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，格列苯脲(山西三晋药业有限公司，批号20021016)，葡萄糖注射液(江西东亚药业有限责任公司，批号2003092732)，血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司，批号991514)。2、方法取健康小鼠80只，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型组、格列苯脲组、知母提取物低、中、高剂量组(分别为50，100，150mg/kg)。连续灌胃给药7d，正常对照组和模型组给予等剂量生理盐水，格列苯脲组罐胃50mg/kg。末次给药前禁食3h，给药后30min腹腔注射葡萄糖注射液，剂量为2g/kg，造成高血糖模型，30min后眼眶取血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值，结果见表l。表l知母提取物对葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影响组别剂量(mg/Kg)血糖(mmol/L)正常对照组-5.30±0.94*模型对照组-11.81±1.03知母提取物组507.65±1.77**1007.32±2.87**1506.61±1.11**格列苯脲组508.91±2.84*注与模型对照组比较，*P<0.01,**P<0.001。实施例5知母提取物对葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，格列苯脲(山西三晋药业有限公司，批号20021016)，葡萄糖注射液(江西东亚药业有限责任公司，批号2003092732)，血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司，批号991514)。2、方法取健康小鼠80只，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型组、格列苯脲组、知母提取物低、中、高剂量组(分别为50，100，150mg/kg)。连续灌胃给药7d，正常对照组和模型组给予等剂量生理盐水，格列苯脲组罐胃50mg/kg。末次给药前禁食3h，给药后30min腹腔注射葡萄糖注射液，剂量为2g/kg，造成高血糖模型，30min后眼眶取血，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值，结果见表2。表2知母提取物对葡萄糖所致高血糖小鼠血糖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与模型对照组比较，*P<0.01,**P<0.001。实施例6知母提取物对链尿佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，优降糖(天津力生制药厂生产，批号990203)，链尿佐菌素(Sigma公司生产)，血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司，批号991516)。2、方法取健康雄性小鼠80只，随机选取10只作为正常对照组，其余70只禁食12h，按50mg/kg体重的剂量腹腔注射链尿佐菌素，正常对照组注射柠檬酸缓冲液，于造模后l周测定空腹血糖值，筛选血糖值超过Bmmol/L的小鼠为实验模型鼠。将50只糖尿病实验模型鼠随机分为糖尿病模型组，优降糖(灌胃20mg/kg)，知母提取物低、中、高剂量组(分别为50，IOO，150mg/kg)。正常对照组和糖尿病模型组灌胃生理盐水，连续给药3周。末次给药后禁食12h，眼眶取血，测血糖变化值，结果见表3。表3知母提取物对链尿佐菌素所致糖尿病小鼠的血糖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注与模型对照组比较，*P<0.01,**P<0.05。实施例7知母提取物对四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，优降糖(天津力生制药厂生产，批号990203)，四氧嘧啶(Sigma公司生产)，血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司，批号991514)。2、方法雄性昆明种小鼠80只，实验前禁食12小时，随机选取10只作为正常对照组，其余尾静脉注入四氧嘧啶90mg/Kg，72小时后侧血糖值，选其中50只血糖值〉13mmol/L者作为糖尿病小鼠。糖尿病小鼠随机分为知母提取物高、中、低三个剂量组(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)。模型对照组，优降糖阳性对照组(20mg/Kg)，使各组的血糖值均数之间无显著性差异，每组10只。各组每天灌胃给药或生理盐水，连续21天，于末次给药后1小时从小鼠眼眶取血，葡萄糖氧化酶法测血糖值，结果见表4。由表4可知，给药组血糖与模型对照组相比显著降低(PO.Ol)，且血糖下降与知母提取物呈剂量依赖性。表4知母提取物对四氧嘧啶诱发糖尿病小鼠的血糖影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注与正常对照组比较，厶APO.01;与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。实施例8知母提取物对四氧嘧啶糖尿病小鼠的肝糖元含量的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，优降糖(天津力生制药厂生产，批号990203)，四氧嘧啶(Sigma公司生产)。2、方法雄性昆明种小鼠80只，实验前禁食12小时，随机选取10只作为正常对照组，其余尾静脉注入四氧嘧啶90mg/Kg，72小时后侧血糖值，选其中50只血糖值〉13.8mmol/L者作为糖尿病小鼠。糖尿病小鼠随机分为知母提取物高、中、低三个剂量组(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)。模型对照组，优降糖阳性对照组(20mg/Kg)，使各组的血糖值均数之间无显著性差异，每组10只。各组每天灌胃给药或生理盐水，连续21天，于末次给药1小时后断髓处死，按硫酸-蒽酮法，测定肝糖元含量，结果如表5所示表5知母提取物对四氧啼啶糖尿病小鼠的肝糖元含量的影响组别剂量(mg/Kg)肝糖元含量(mg/g)正常对照组-38.21±1.65模型对照组-18.67土1.47AA5021.28±2.28*知母提取物组10023.37±4.18**15027.49±4.24**优降糖组2026.67±4.75**注与正常对照组比较，AAP〈0.01;与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。实施例9知母总提取物对四氧嘧啶糖尿病小鼠的血胰岛素和胰岛组织形态学的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，四氧嘧啶(Sigma公司生产)，蒽酮试剂(上海五联化工厂，批号9806)。2、方法雄性昆明种小鼠60只，实验前禁食12小时，随机选取10只作为正常对照组，其余尾静脉注入四氧嘧啶90mg/Kg，72小时后侧血糖值，选其中30只血糖值》3.8mmol/L者作为糖尿病小鼠。糖尿病小鼠随机分为知母提取物高低两个剂量组(50mg/Kg，150mg/Kg)及模型对照组，每组10只。各组每天灌胃给药或生理盐水，连续21天，于末次给药1小时后断髓处死，分别随机从各组中取3只小鼠胰腺尾部组织，使用Gormori醛复红和H.E染色方法，观察胰岛组织。观察结果见表5。可见知母提取物对被四氧嘧啶破坏的胰岛分泌细胞有一定的修复作用，并增加了胰岛e细胞的分泌颗粒。结果见表6:表6胰岛组织的形态学变化组别Gormori醛复红染色H.E染色<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>知母提取e细胞的分泌颗粒增多，但颗粒稀e细胞形态结构较模型物组低剂疏，排列不均匀组有所改善，核仁较大且量组较少知母提取e细胞的分泌颗粒增多，颗粒浓密，e细胞形态结构接近正物组高剂核仁清晰且较大常，胞浆均匀，无空泡，量组仍有肿胀现象实施例10知母提取物对a-葡萄糖苷酶的活性的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，阿卡波糖(德国拜耳医药保健有限公司，批号101H6)，4-硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Merck公司)a-D-葡萄糖苷酶(Fluka公司)。2、方法将知母提取物和阿卡波糖溶于DMSO缓冲液，并稀释为不同浓度(10-400mg/ml)的药液，与2U/ml葡萄糖苷酶10ul混匀，于37。C温育15min，加入lO血nol/LPNPG90P1，于37。C温育15min，在410nm波长下测定A值，以上反应在96孔板上完成，反应总体积为200"1。每个供试品同时做3复孔，取平均值，并重复3次实验。阿卡波糖作为本法的阳性对照，同时设定空白对照和阴性对照。计算酶活性的抑制率:抑制率气A阴性对照-A供试品)/(A阴性对照-八空白对照)*100%。以浓度(mg/ml)的对数做横坐标，抑制率做纵坐标作图，结果如图l所示。实施例ll知母提取物对正常小鼠血糖的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司，批号991518)。2、方法正常小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组正常对照组，灌胃生理盐水；高、中、低剂量组(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)分别灌胃知母提取物，l次/d，连续用药3周。末次给药3h后眼眶取血，葡萄糖氧化酶法测血糖值，结果如表7所示，知母提取物低、中、高剂量组均能使血糖降低，表7知母提取物对正常小鼠血糖的影响组别剂量(mg/Kg)血糖浓度(mmol/L)正常对照组-9.57±1.75508.08±3.34*知母提取物组1007.95±2.37*1507.14±3.64**注与正常对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。实施例12知母提取物对正常小鼠糖耐量的影响1、材料知母提取物(按实施例2制备)，阿卡波糖(德国拜耳医药保健有限公司，批号101176)，昆明种小鼠(广东药学院药理教研室提供)，血糖测定试剂盒(保定长城临床试剂公司，批号991516)。2、方法取健康成年雄性小鼠50只，禁食2小时，随机分成5组正常对照组、阿卡波糖组和知母提取物的高中低三个剂量组(50mg/Kg，100mg/Kg，150mg/Kg)，每组10只，使各组的血糖无显著性差异。各给予相应剂量一次后，以10kg/kg剂量淀粉灌胃，给淀粉3小时后，眼眶采血侧空腹血糖。结果如表8所示表8知母提取物对正常小鼠血糖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注与正常对照组比较，*P<0.01，**P<0.05。权利要求1.一种知母提取物，其特征在于由如下方法制备而成(1)知母粉碎后，用6～12倍体积10％～90％乙醇溶液提取1～3次，每次1～3h，放冷后过滤，合并滤液，浓缩得稠膏1；(2)取稠膏1，以6～12倍体积水溶解，上大孔树脂柱，以3～5个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；以40％～80％乙醇溶液洗脱4～8个柱体积，洗脱液浓缩至无醇，过滤，将沉淀干燥粉碎，得提取物1，即为知母提取物。2.如权利要求1所述的知母提取物，其特征在于由如下方法制备而成(1)知母粉碎后，用612倍体积10%90%乙醇溶液提取13次，每次l3h，放冷后过滤，合并滤液，浓縮得稠膏l;过滤后残渣加612倍体积水提取13次，每次13h，趁热过滤，合并滤液，浓缩得稠膏2;(2)取稠膏1，以612倍体积水溶解，上大孔树脂柱，以35个柱体积蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；以40%80%乙醇溶液洗脱48个柱体积，洗脱液浓縮至无醇，过滤，将沉淀干燥粉碎，得提取物1;(3)取稠膏2，加1020倍体积水溶解，超滤，取截留液，浓縮干燥，得提取物2;(4)合并提取物l、2，即得知母提取物。3.如权利要求2所述的知母提取物，其特征在于步骤(3)中所述的超滤是采用超滤膜装置及截留分子量10000300000的超滤膜进行超滤。4.权利要求1所述知母提取物在制备治疗或预防2型糖尿病药物中的应用。全文摘要本发明公开一种知母提取物及其作为治疗2型糖尿病药物的应用。本发明是将知母药材用水和含水乙醇提取后，用膜分离技术、大孔吸附树脂分离，精制知母提取物。本发明的知母提取物的主要活性为知母皂苷类、知母多糖类和双苯吡酮类中的三类或任意两类，且主要活性成分的总含量高达50％以上。本发明的知母提取物经药理实验证明可作为治疗或预防2型糖尿病及其并发症的药物，具有很大的医药价值和经济效益。文档编号A61K36/8964GK101229316SQ20081002620公开日2008年7月30日申请日期2008年1月31日优先权日2008年1月31日发明者冯毅凡,妍吴,青孟,石忠峰,郭晓玲申请人:广东药学院