专利名称：一氧化碳释放分子在制备早期治疗脓毒症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及一氧化碳释放分子的新用途，具体的说，涉及一种早 期应用一氧化碳释放分子，治疗脓毒症的方法。
背景技术：
脓毒症是严重创伤、休克及感染后常见的并发症，进一步发展可导致脓
毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，即便在基础与临床医学研究及 重症监护手段高度发展的现代，临床治疗仍然收效甚微，死亡率居高不下。 研究表明，严重脓毒症后重要脏器功能衰竭，特别是多脏器功能衰竭的死 亡率很高。多脏器功能衰竭一旦发生，现有治疗措施很难使之逆转，因此 预防或减轻脓毒症早期的脏器损害尤显重要。脓毒症后早期肝脏功能的改 变与肝脏的炎症反应程度密切相关，伤后早期能否有效控制炎症反应，预 防SIRS的发生至关重要。
另外，严重创伤早期即可导致肺组织内白细胞大量激活，产生过量的 炎症介质而引起肺损伤。研究证实脓毒症后肺脏微血管通透性明显增高， 中性粒细胞在肺组织中的浸润明显增加。当中性粒细胞到达组织细胞周围 后可通过释放氧自由基、胶原酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、蛋白水解酶 及脂类代谢产物等造成微血管通透性的增高和组织细胞的损伤。预防脓毒 症后早期肺组织白细胞扣留和过度活化，较少氧化代谢产物和大量炎性物 质、蛋白酶等毒性物质的释放是防治局部组织损伤和SIRS发生的关键途径。 治疗方法的改进，抗生素的更新，如清除或拮抗内毒素治疗、保护肝脏网 状内皮系统的吞噬和清除功能、供给肝细胞支链氨基酸，保持良好的肝肠血液循环、杀菌性通透性增强蛋白质(BPI)、抗内毒素抗血清或抗体、拮抗 细胞因子的治疗等，但脓毒症休克的病死率并无明显下降。由于脓毒症的 病理过程极其复杂，只有致力于阐明其确切的病理生理机制，寻找新的、 有效的治疗靶点，才有希望逐步解决目前临床脓毒症防治的重重困难。业
已证明，内源性CO对SIRS或sepsis时炎症介质和细胞因子的释放具有有 效的抑止作用，从而可有效保护细胞、维持器官功能。作为体内一种重要的 化学气体信使，CO能与可溶性鸟苷酸环化酶结合，并将其激活，使GTP变 成cGMP。升高的cGMP再刺激依赖cGMP的蛋白激酶、磷酸酶或通过调 节离子通道，从而介导一系列生物学变化。在动物实验中发现吸入低浓度 CO后，血管内皮细胞和小肠内皮细胞内sGC/cGMP途径被激活，引起早期 抗凋亡分子Bcl-2上调，凋亡前信号Bax下调。我们的早期研究也发现CO 在血管内皮细胞和胰岛细胞缺氧复氧过程中也是通过激活sGC/cGMP途径 发挥抗凋亡作用。而外源性一氧化碳干预SIRS或Sepsis的研究较少，主 要是由于外源性CO的给予方式及浓度控制比较困难，不利于长期观察实验 结果。
夕卜源'性一氧"f七碳禾畢方夂分子(Carbon monoxide-releasing molecules, CORMs)是近年来新合成的一种一氧化碳复合物，该一氧化碳复合物的制 备方法和理化性能参数，在Motterlini R等所著文献(Curr. Pharm. 2003;9: 2525 - 39)中有详细的报道，该一氧化碳复合物通常可用于制备缓释的一 氧化碳。
如能够将所述的一氧化碳释放分子用于早期治疗脓毒症，将具有十分 重要临床意义。 发明内容本发明的目的是提供一氧化碳释放分子CORM-2在制备早期治疗脓毒
症药物中的应用，以满足临床应用的需要。
发明人经过大量的细胞和动物试验发现，将所述的一氧化碳释放分子 溶解在溶剂中，然后将其置于细胞培养液或生物体内，中可以持续性释放
CO，故可作为一种外源性CO供体，并采用细胞LPS刺激的炎症模型和小 鼠盲肠结扎和穿孔(CLP)脓毒症模型，进行早期干预，即细胞刺激或动物 伤后即刻开始使用的方法，进行试验，发现一氧化碳释放分子可以作为早 期抑制脓毒症的药物。
可以通过静脉给药，将所述的一氧化碳释放分子CORM-2施加于需要 治疗的脓毒症动物，剂量一般8mg/kg体重/天。
本发明还涉及一种治疗脓毒症药物的药物，其特征在于，包括治疗有 效量的一氧化碳释放分子和溶剂。
优选的，所述的溶剂选自DMSO。
采用所述的一氧化碳释放分子CORM-2抑制脓毒症，其浓度控制相对 容易且正确，长期使用时追加方便，能够满足临床应用的需要。
图1为CORM-2抑制细胞氧化应激反应；
图2为CORM-2抑制细胞NO产物；
图3为CORM-2抑制细胞表面粘附分子的表达；
图4为CORM-2抑制脓毒症小鼠肝脏内皮细胞粘附分子的表达；
图5为CORM-2抑制脓毒症小鼠肝脏MPO活性；
图6为CORM-2抑制脓毒症小鼠肝脏内皮细胞对白细胞的粘附；
图7为CORM-2抑制脓毒症小鼠肺脏MPO活性；图8为CORM-2抑制脓毒症小鼠肺泡灌洗液TNF-的表达； 图9为CORM-2抑制脓毒症小鼠肺泡灌洗液IL-1的表达 图10为CORM-2抑制脓毒症小鼠肺脏内皮细胞粘附分子的表达； 图11为CORM-2抑制脓毒症小鼠肺脏内皮细胞对白细胞的粘附。
具体实施例方式
实施例1
1.通过测定血液中的一氧化碳血红蛋白(COHb)可判断一氧化碳(CO)与Hb 的结合程度。采用SteinaAB等(J Mol Cell Cardiol 38:127-34, 2005)文 献规定的方法，进行测定，动物CORM-2使用后COHb的检测结果(见 表l)。
表1 动物CORM-2使用后COHb的检测结果
COHb (%)
CORM-2
(mg/kg bw)Oh6h12h24h48h
100.40.60.40.2
400.93.44.82.7
804.55.65.83.7
1208.612.712.47.5
16012.814.513.48.8
2、本动物实验研究中CORM-2的剂量即选用8mg/kgbw。
实施例2
将一氧化碳释放分子溶解在DMSO溶剂中，采用如下的方法，进行试验
(1) 细胞实验中，CORM-2的终浓度为10 M、 50 M 、 100 M 的溶液；动物实验中，CORM-2的剂量为8mg/kgbw;
(2) 不同工作浓度的CORM-2对LPS诱导的HUVEC细胞氧化应
激(DHR 123)和NO产物(DAF-FM)的影响；
(3) 不同工作浓度的CORM-2对LPS诱导的HUVEC细胞粘附分
子ICAM-1表达的影响；
试验方法
细胞采用人脐带内皮细胞(第3-8代)，LPS (终浓度10 g/ml)刺激
4h后收集细胞；
核蛋白与胞浆蛋白的提取组织标本于液氮中研磨，随后置于300 1 缓冲液E(10mmol/LHEPES (pH7.9)， 10mmol/LKCl， 1.5mmol/L MgC12, l%NP-40， 0.5mmol/LDTT， 0.5 mmol/L PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin,5。/。甘油)中冰浴匀浆，将匀浆液移至EP管中，4"下3,000g离心 10min，吸取上清为胞浆蛋白，-8(TC保存。将沉淀再溶于300 1缓冲液A + (去除P/oNP-40的BufferA)中，振荡混匀，3,000g 4。C离心10min，弃上 清，将沉淀溶于60 1缓冲液Ec(20mmol/LHEPES(PH7.9)， 420 mmol/L NaCl, 1Ommol/LKC1， 1.5mmol/L MgC12, l%NP-40， 0. 5mmol/LDTT， 0.5 mmol/L PMSF, 10 g/ml aprotinin， 10 g/ml leupeptin ,25%甘油)中，冰浴 30min后14，000g离心20min，留取上清-80。C保存。
蛋白印迹(Western blotting):每组取等量蛋白(IO g)进行电泳，再 将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳转移到硝酸纤维(SG)膜上依次加入相应一抗(大鼠抗小鼠ICAM-1,稀释度为1: 1000)、 二抗(辣根过氧化物酶
标记的兔抗大鼠IgG，稀释度1: 2500)及化学发光剂(Enhanced Chemiluminescence试剂盒，ECL)，暗室中曝光于x光片，胶片经全自动洗 片机处理，蛋白带用图象分析系统分析。
统计学处理数据用均数i标准差表示，均数的比较采用t检验。P0.05 为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS6.02统计软件。
结果如下
细胞氧化应激(DHR123)(图1)禾卩NO产物(图2)被CORM-2抑 止，抑止作用呈剂量依赖性。上述研究不但了解了 CORM-2对脓毒症时细 胞氧化应激的影响，也了解了 CORM-2能抑制内皮细胞表面粘附分子的表 达(图3)，减少白细胞的粘附，从而大致探明CORM-2在抑制脓毒症时的
抗炎作用机制。
实施例3
CORM-2对脓毒症小鼠肝脏炎症反应的抑制作用。 试验方法
(1)动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6 — 8周龄，体重18土2克，于普通实验室饲养(商品 化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成五组Sham组(n =9) ， Sham+CORM-2组(n=9) ， CLP组(n二9) ， CLP加CORM-2组 (n二9)及CLP+DMSO组(n=9) 。 CLP组小鼠异氟烷吸入麻醉下，行盲 肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克；CLP加CORM-2 组小鼠CLP后尾静脉注射CORM-2(8mg/kg)。所有动物伤后24小时用异氟垸过度吸入致死后收集标本。 (2)检测指标
肝组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测取肝组织约100mg，力[]0.5% HTAB 2ml制备匀浆，反复冻融3次并超声粉碎10s共3次，4tM0,000g 离心30min，取上清0.1ml加反应液2.9ml，保持温度于25。C，立即在分光 光度计460nm波长下进行2min的扫描，记录第30s和第90s的光密度差值， 以此lmin内吸光度的变化代表酶活力的改变。
△A460/min
MPO活力单位(U/g):-
11.3 x所加组织量g / L反应液 核蛋白与胞浆蛋白的提取组织标本于液氮中研磨，随后置于300 1缓 冲液E(10mmol/LHEPES (pH7.9) ， 1Ommol/LKC1， 1.5mmol/L MgC12, l%NP-40， 0.5mmol/L DTT， 0.5 mmol/L PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin,5。/。甘油)中冰浴匀浆，将匀浆液移至EP管中，4。C下S，000g离心 10min，吸取上清为胞浆蛋白，-S(TC保存。将沉淀再溶于300 1缓冲液A + (去除l。/。NP-40的Buffer A)中，振荡混匀，3，000g 4。C离心10min，弃上 清，将沉淀溶于60 1缓冲液Ec(20mmol/LHEPES(PH7.9)， 420 mmol/L NaCl, 1Ommol/LKC1， 1.5mmol/L MgC12, l%NP-40, 0. 5mmol/L DTT， 0.5 mmol/L PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin ,25%甘油)中，冰浴 30min后14,000g离心20min，留取上清-80。C保存。
蛋白印迹(Western blotting):每组取等量蛋白(ip g)进行电泳，再 将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳转移到硝酸纤维(SG)膜上依次加入相应一抗(大鼠抗小鼠ICAM-1， VCAM-1抗体，稀释度分别为l: 1000和1: 500) 、 二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG，稀释度1: 2500)及 化学发光剂(Enhanced Chemiluminescence试剂盒，ECL)，暗室中曝光 于x光片，胶片经全自动洗片机处理，蛋白带用图象分析系统分析。
白细胞粘附试验(Adhesion):肝窦内皮细胞(Sinusoidal endothelial cells, SECs)的分离参照Braet等方法。采用小鼠后肢骨髓常规分离多形核白细 胞(PMNs) 。 PMNs重悬于PBS中进行放射性同位素标记，5x107细胞/ml 用50|aCiNa51CrO4/ml在37°C孵育60分钟。洗涤去除剩余同位素后，将 标记的PMN (5xl05/ L)加入血清刺激4h后的肝窦内皮细胞，孵育30分 钟，收集细胞裂解液、上清液及洗涤液，液闪仪同位素计数，计算粘附的 PMN百分比
PMN粘附率(％)=细胞裂解液同位素/(细胞裂解液同位素+洗涤液同位素 +上清液同位素)><100。
统计学处理数据用均数士标准差表示，均数的比较采用t检验。P0.05 为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS6.02统计软件。
结果如下
CORM-2对CLP后小鼠肝组织ICAM-1、 VCAM-1蛋白表达的影响
图4示CLP24h后肝组织ICAM-l、VCAM-l蛋白表达明显增高^P0.05)，
应用CORM-2后脏器的ICAM-1、 VCAM-1蛋白表达与CLP组相比明显下
降，差异有显著意义^P0.05)
CORM-2对CLP后小鼠肝组织MPO活性的影响 图5示正常肝
组织MPO活性较低，CLP24h后肝组织MPO活性明显增高(*P<0.05)，应用CORM-2后脏器的MPO活性与CLP组相比明显下降，差异有显著意 义(*P<0.05)
白细胞粘附试验(Adhesion):图6示常规分离肝窦内皮细胞(SECs) 和小鼠后肢骨髓PMNs。 PMNs重悬于PBS中进行放射性同位素标记，5x107 细胞/ml用50)iCiNa51CrO4/ml在37。C孵育60分钟。用CLP小鼠血清刺激 肝窦内皮细胞4小时后，肝窦内皮细胞对白细胞的粘附明显增强PP0.05)， 应用CORM-2处理的CLP小鼠血清刺激肝窦内皮细胞4小时后，对白细胞的 粘附作用较未处理组明显下降，差异有显著意义(*P<0.05)。
实施例4
CORM-2对脓毒症小鼠肺组织炎症反应的抑制作用
试验方法
(1) 动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6 —8周龄，体重18士2克，于普通实验室饲养(商品 化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成五组Sham组(n =9) ， Sham + CORM陽2组(n=9) ， CLP组(n = 9) , CLP力口CO固-2组 (n=9)及CLP+DMSO组(n=9) 。 CLP组小鼠异氟烷吸入麻醉下，行盲 肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克；CLP加CORM-2 组小鼠CLP后尾静脉注射CORM-2(8mg/kg)。所有动物伤后24小时用异氟烷 过度吸入致死后收集标本。
(2) 检测指标
肺组织中髓过氧化物酶(MPO)活性检测取肺组织约100mg，加0.5% HTAB 2ml制备匀浆，反复冻融3次并超声粉碎10s共3次，4'C40，000g离心30min，取上清0.1ml加反应液2.9ml，保持温度于25。C，立即在分光 光度计460nm波长下进行2min的扫描，记录第30s和第90s的光密度差值， 以此lmin内吸光度的变化代表酶活力的改变。
AA460/min
MPO活力单位(U/g):-
11.3 x所加组织量g/L反应液
肺泡灌洗液TNF-k和IL-1卩的测定肺泡灌洗术(BAL)采用文献报 道方法.肺泡灌洗液保存于4。C ， TNF《和IL-1P的测定采用酶链免疫吸 附法(enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA).月巿泡灌洗液使用前 经0.22-mm滤器过滤。
核蛋白与胞浆蛋白的提取组织标本于液氮中研磨，随后置于300 1 缓冲液E [10mM HEPES (hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,羟乙基 哌嗪乙磺酸pH7.9)， 10mmol/L KCl， 1.5mM MgC12， l%NP-40， 0.5mM DTT (dithiothreitol， 二硫苏糖醇)，0.5 mM PMSF (phenylmethyl sulfonylfluoride，苯 甲基磺酰氟化物)，10 g/ml aprotinin (抑酞酶)，10 g/ml leupeptin (亮肽 素)，5%甘油]中冰浴匀浆，将匀桨液移至EP管中，4"下3,000g离心10min， 吸取上清为胞浆蛋白，-80。C保存。将沉淀再溶于300 1缓冲液E+ (去除 P/。NP-40的缓冲液E)中，振荡混匀，3,000g4。C离心10min，弃上清，将 沉淀溶于60 1缓冲液Ec[20mMHEPES(PH7.9)， 420 mM NaCl, 10mM KC1， 1.5mM MgC12, l%NP-40, 0.5 mM DTT， 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin ,25%甘油]中，冰浴30min后14，000g离心
1220min，留取上清-8(TC保存。
蛋白印迹(Western blotting):每组取等量蛋白(1Q g)进行电泳， 再将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳转移到硝酸纤维(SG)膜上依次加入 相应一抗(大鼠抗小鼠ICAM-1抗体，稀释度为1: 1000) 、 二抗(辣根过 氧化物酶标记的兔抗大鼠IgG，稀释度1: 2500)及化学发光剂(Enhanced Chemiluminescence试剂盒，ECL)，暗室中曝光于x光片，胶片经全自动 洗片机处理，蛋白带用图象分析系统分析。
白细胞粘附试验(Adhesion):常规分离肺内皮细胞(Mice Lung Endothelial Cell, MLEC)和小鼠后肢骨髓PMNs。 PMNs重悬于PBS中进行放 射性同位素标记，5x107细胞/ml用50pCiNa51CrO4/ml在37。C孵育60 分钟。洗涤去除剩余同位素后，将标记的PMN(5xl05/ L)加入血清剌激4h 后的肺内皮细胞，孵育30分钟，计算粘附的PMN百分比 PMN粘附率(％)=细胞裂解液同位素/(细胞裂解液同位素+洗漆液同位素 +上清液同位素)\100。
统计学处理数据用均数±标准差表示，均数的比较采用t检验。P0.05 为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS6.02统计软件。
结果如下
CORM-2对CLP后小鼠肺组织MPO活性的影响图7示正常肺组织 MPO活性较低，CLP24h后肺组织MPO活性明显增高(*P<0.05)，应用 CORM-2后脏器的MPO活性与CLP组相比明显下降，差异有显著意义 (*P<0.05)
CORM-2对CLP后小鼠肺泡灌洗液细胞因子水平的影响肺泡灌洗术(Bronchoalveolar lavage, BAL)采用文献报道方法，肺泡灌洗液保存于 4°C ，TNF-K (图8)和IL-1 (图9)的测定采用酶链免疫吸附法(ELISA)。 肺泡灌洗液使用前经0.22-mm滤器过滤。结果显示，CLP24小时后小鼠肺 泡灌洗液细胞因子(TNF-oc和IL-1P)水平均较正常明显提高(P0.05)，应 用CORM-2后与CLP组相比则明显下降，差异有显著意义(P<0.05)。
CORM-2对CLP后小鼠肺组织ICAM-1表达水平的影响图10示CLP 24h后肺组织ICAM-l蛋白表达明显增高(*P<0.05)，应用CORM-2后脏 器的ICAM-1蛋白表达与CLP组相比明显下降，差异有显著意义^P0.05)。
白细胞粘附试验(Adhesion):图ll示常规分离肺内皮细胞(MLEC) 和小鼠后肢骨髓PMNs。 PMNs重悬于PBS中进行放射性同位素标记，5x107 细胞/ml用50pCiNa51CrO4/ml在37。C孵育60分钟。用CLP小鼠血清刺激 肺内皮细胞4小时后，肺内皮细胞对白细胞的粘附明显增强(*P<0.05)，应 用CORM-2处理的CLP小鼠血清刺激肺内皮细胞4小时后，对白细胞的粘附 作用较未处理组明显下降，差异有显著意义(*P<0.05)
权利要求
1.一氧化碳释放分子CORM-2在制备早期治疗脓毒症药物中的应用。
2. 根据权利要求l所述的应用，其特征在于，通过静脉途径，将所述 的一氧化碳释放分子CORM-2施加于需要治疗的脓毒症个体。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，剂量为8mg/公斤体重/天。
4. 一种治疗脓毒症药物的药物，其特征在于，包括治疗有效量的一氧 化碳释放分子CORM-2和溶剂。
5. 根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所说的溶剂选自DMSO。
6. 根据权利要求4所述的药物，其特征在于，细胞研究的浓度为lOpM、 50 iaM或100 laM。
全文摘要
本发明公开了一氧化碳释放分子在制备早期治疗脓毒症药物中的应用。本发明人经过大量的细胞和动物试验发现，将所说的一氧化碳释放分子溶解在DMSO溶剂中，然后将其置于细胞培养液或生物体内，可以持续性释放CO，故可作为一种外源性CO供体，并采用细胞LPS刺激的炎症模型和小鼠CLP脓毒症模型，进行早期干预，进行试验，发现一氧化碳释放分子可以作为早期抑制脓毒症的药物。采用所述的一氧化碳释放分子抑制脓毒症，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便。能够满足临床应用的需要。
文档编号A61P31/00GK101590228SQ20081003804
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者刘东明, 孙炳伟, 曦 陈 申请人:江苏大学附属医院