专利名称：小柴胡汤减毒配伍组方的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药领域，更具体地涉及一种新的小柴胡汤减毒配伍组方。
背景技术：
小柴胡汤出自《伤寒论》，由柴胡、黄芩、人参、半夏、炙甘草、生姜、大枣七味药组成，是和解少阳的代表方剂，在临床内科上应用非常广泛，常用小柴胡汤加减治疗消化系统、循环系统、呼吸系统、泌尿系统、神经系统疾病与精神病[1]。
近年有关小柴胡汤的肝脏毒副作用受到越来越多的关注。国外Itoh等[陈达民.草药小柴胡汤引起的肝损害.国外医学消化系统疾病分册1996;16(l):61-65]报道40例服用小柴胡汤患者，有9例在服用过程中转氨酶升高及出现黄疸，肝组织活检证实为急性肝损害，停药后肝功能恢复正常，其中4例再次服药后又出现肝损伤，表明小柴胡汤能诱发急性肝炎，其机制可能与柴胡或黄芩的原药材的毒性有关。据报道[金航.日本汉方药制剂副作用分析.国外医学屮医中药分册1997;19(3):62-66][甘典辉,邓嫦.部分中草药致药物性肝损害的报道综述[J].广西中医药，2004,6:5-7]，将小柴胡汤作为抗肝损伤的药物长期广泛的用于慢性肝病病人，结果在平均2个月的潜伏期后引起急性肝炎，组织学检查显示肝小叶中央性坏死、微囊泡状的脂肪样病变和纤维化，在两个活检肝组织中有胆汁淤积的表现[3,4]。也有学者报道[顾文君,刘春红,沈锡中.草药的肝毒性[J].世界临床药物,2003,24:217-226.]小柴胡汤及其类似方提取剂的不良反应，其中多例为肝功能损害(小柴胡汤5例，小柴胡合柴朴汤、小柴胡加桔梗石膏汤各l例)。
鉴于目前对小柴胡汤中各单味药材的研究多集中在化学成分分析和药理研究方面，对各味单药的毒理研究鲜见报道，未见其致毒成分及致毒机理的研究。同时鉴于目前临床上小柴胡汤出现的肝脏毒副作用，因此，本领域需要开发新的减毒的小柴胡汤配伍组方，在保证小柴胡汤原有功效的基础上，大大降低其肝脏毒性。
发明内容
本发明对小柴胡汤组方的肝毒性进行了确认，并明确了该组方中导致肝毒性的药材。
本发明的目的就是提供一种新的小柴胡汤减毒配伍组方。
在本发明中，提供了一种小柴胡汤配伍组方，该组方包含的药材及其重量比例如下， 柴胡2.143份，黄苳1.107份，人参1.107份，半夏2.107份，生姜1.107份，甘草0.893 份，大枣1.536份
在另一优选例中，所述的组方对肝脏的毒性减弱。
图l MTT法检测不同制法小柴胡汤对人肝癌细胞株活性的影响 图2MTT法检测不同配伍减方水煎液对人肝癌细胞株活性的影响
具体实施例方式
实施例l.不同配伍组方小柴胡汤的人肝细胞毒性体外检测 1.材料与仪器
1.1药物和试剂柴胡、制半夏、炎甘草、大枣购自上海康桥中药饮片有限公司； 黄芩购自上海德华国药制品有限公司；人参购自上海信德中药公司饮片厂；生姜购于 市场；对乙酰氨基酚、三苯氧胺和四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；RPMI 1640 培养基和小牛血清购自Gibco公司；青霉素和链霉素购自华北制药有限公司；二甲亚 砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2细胞株人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国科学院上海细胞资源中心，正常 人肝细胞由瑞德肝脏疾病研究所(上海)提供。
.1.3仪器超净工作台(苏净集团)，二氧化碳培养箱(Thermo Forma),倒置 显微镜(重庆光电仪器总公司)，酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司)，超声波清 洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。
1.4药材水煎液和超声萃取液的制备
1.4.1小柴胡汤原方水煎液(《伤寒论》张仲景方)精密称取柴胡4.286g,黄芩 3.214g，人参2.143g，制半夏3.214g，炙甘草1.786g，生姜3.214g，大枣2.143g，加10 倍量水200ml，浸润过夜；加热沸腾，小火微沸煎lh，收集煎液，4层纱布过滤，得滤 液；剩余药渣加8倍量水160ml，同前述提取方法得滤液；合并滤液，单层滤纸过滤，加热浓縮至20ml，分别经0.45^im和0.22pm的微孔滤膜滤过。
1.4.2六味减方水煎液六味(无柴胡)、六味(无黄芩)、六味(无半夏)、 六味(无人参)、六味(无甘草)、六味(无生姜)、六味(无大枣)7种水煎液， 药材量及制法同1.4.1。
1.4.3两味减方水煎液黄芩分别与柴胡、半夏、人参、甘草、生姜、大枣合煎， 共6种水煎液，药材量及制法同1.4.1。
1.4.4单味药材水煎液柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣7种水煎液， 药材量及制法同1.4.1。
1.4.5原方超声萃取液精密称取1.4.1药材量，力n5倍量水100ml，浸润过夜；超 声30min， 4层纱布过滤，单层滤纸过滤，加热浓縮至20ml，分别经0.45nm和0.22imi 的微孔滤膜滤过。
1.4.6柴胡超声萃取液药材量及制法同1.4.5。
1.4.7黄芩超声萃取液药材量及制法同1.4.5。
1.4.8黄芩+柴胡超声萃取液药材量及制法同1.4.5。
2.方法与结果
2.1药物溶液所有实验药物在96孔细胞培养板中终浓度分别为5、 10、 20、 30、 40mg.mr1 (相当于原方药材浓度)；阳性对照为对乙酰氨基酚(八八？)(511111101丄-1);阴 性对照为PBS (磷酸盐缓冲液)。
2.2细胞活性检测方法采用RPMI 1640培养基(含10%小牛血清、100U'mr1 青霉素、100吗'ml"链霉素)，将浓度5xl04'ml"的人肝癌细胞接种于96孔板，每孔 200^11，于37X:， 5。/。C02培养箱中培养过夜。弃去板上各孔内原有液体，分别加入含 有相应浓度药物的细胞培养液，每药物每浓度4个复孔，于37'C, 5。/。C02培养箱中培 养。24h后，加MTT (5mg'mr1) 20pl/孔。37°C， 5% C02培养箱中温孵4h后，弃板上 各孔内原有液体，加DMSO 200nl/孔以溶解甲臜(formazan)沉淀。室温置30min后，用 酶标仪在570nm波长下测定各孔光密度值(OD)。计算细胞活性细胞活性(cell viability, %)=实验组光密度值/对照组光密度值xlOOe/。。
2.3统计处理采用方差齐性检验和t检验。方差齐性检验的检验水准01=0.1， t 检验的检验水准a-0.05。
2.4结果
2.4.1小柴胡汤原方水煎液对人肝癌细胞株生长有显著抑制，小柴胡汤原方水煎液的20、 30、 40mg'mrt浓度组的细胞相对活性分别为66.3。/。、 50.1%和35.1% (图l， 表l);
2.4.2原方和柴胡超声萃取液无显著抑制，黄芩、黄芩+柴胡超声萃取液有显著 抑制(图l，表l);
2.4.3六味减方水煎液中，不含黄芩的水煎液无显著抑制，其他6种含有黄芩的 水煎液均有显著抑制(图2，表2);
2.4.4单味药水煎液中，仅黄吝有显著抑制，其他6种单味药均无显著抑制作用 (图2，表2)
2.4.5两味减方水煎液中，仅黄芩+半夏合煎液无显著抑制，其他5种均有显著抑 制作用，其中黄芩+柴胡的抑制作用最强，其各浓度组的细胞相对活性均低于黄芩、 柴胡分别单独作用时的细胞相对活性，提示柴胡可能与黄芩协同作用并增强黄芩的毒 性(图2，表2)。
表l MTT法检测小柴胡汤原方、柴胡、黄芩、黄苓+柴胡超声萃取液 作用于人肝癌细胞株的570nm光密度值(OD值)(x±s,n=4)
药物OD(阴性对照)OD(5mg'mr1)OD(10tng'mr1)
小柴胡汤原方超声0.882±0.0410.898±0.0320.928±0.069
柴胡超声1.363±0.0791.385±0.1141.396±0.246
黄芩超声1.039±0.0790.997幼.2610.712±0.277
黄芩+柴胡超声1.431±0.1331.405±0.1010.987±0.043**
对乙酰氨基酚 (5mmol.L-1)0.946±0.0630.194±0.079**
药物OD(20mg'mr1)OD(30mg.ml匿1)OD(40mg.mr1)
小柴胡汤原方超声O厕士O.llO0.908±0.0650.828±0.044
柴胡超声1,483±0.0971.512±0.1761.768±0.438
黄芩超声0.409±0細**0.381±0.030**0.390幼.033**
黄芩+柴胡超声0.530±0.062**0.410土0.075"0.413±0.221**
对乙酰氨基酚 C5imno1.1/1)0.194±0.079**
注*P<0.05，** PO.01
6表2 MTT法检测小柴胡汤原方、六味减方、两味减方及各单味药材水煎液 作用于人肝癌细胞株的570nm光密度值(OD值)(x±s, n=4)
药物OD(阴性对照)OD(5mg-mr1)OD(10mg.mr1)
小柴胡汤原方水煎0.833±0.0450.870±0.0400.820±0.042
六味(无柴胡)水煎1.196±0.0541.283±0.0971.075±0.153
六味(无黄芩)水煎、1.201±0.1331.345±0.1141.595±0.101
六味(无半夏)水煎1.255±0.0491.003±0.029**0.937±0.104*
六味(无人参)水煎1.199±0.0451.144±0.1181.171±0.261
六味(无甘草)水煎1.090±0.0350.994±0.1100.746±0.147*
六味(无生姜)水煎0.835±0.0990.774±0.3000.711±0.095
六味(无大枣)水煎1.102±0.0491.012±0.1410.712±0.091**
柴胡'水煎0.963±0.0721.002±0.0491.104±0.120
黄苓水煎1.025±0.0510.608土0.060"0.384±0.071**
半夏水煎0.931±0.0261.144±0.088*1.144±0.071**
人参水煎1.016±0.0540.980±0.0970.948±0.035
甘草水煎0.894±0.0131.177±0.166*1.077±0.087*
生姜水煎'1.375±0.3921.205±0.0971.053±0.031
大枣水煎1.332±0.1631.346±0.1601.274±0.200
黄芩+柴胡水煎0.981±0.0980.610±0.087**0.316±0細**
黄芩+半夏水煎0.939±0.0461.001±0.0350.972±0.053
黄吝+人参水煎0.939±0.0460.346±0.089 **0.260±0.011 **
黄芩+甘草水煎0.939±0馬0.272±0.024 **0.281±0.023 **
黄芩+生姜水煎0.939±0.0460.402±0.027 **0.222±0.008 **
黄芩+大枣水煎0.939±0.0460.344±0.082 **0.254±0駕**
对乙酰氨基酚(5mM)0.946±0扁0.194±0.079**药物OD(20mg'mr1)OD(30mg.m1-1)OD(40mg'mr
小柴胡汤原方水煎0.552±0.157*0.418士0.126"0.292±0.050**
六味(无柴胡)水煎0.914±0.3020.469±0駕"0.280±0.082**
六味(无黄芩)水煎1.412±0.1461.316±0.173**1.401±0.207**
六味(无半夏)水煎0.431±0.039**0.267±0,075**0.227士0.019"
六味(无人参)水煎0.499±0.041**0.314士0.0821^0.250±0.064**
六味(无甘草)水煎0.319±0.068**0.233土0.020"0.233±0.023**
六味(无生姜)水煎0.408±0.046**0.267±0.049**0.266±0.039**
六味(无大枣)水煎0.280±0.075**0.206±0.011**0.226±0.020**
柴胡水煎1.043±0.0681.12U0.1221.061±0.111
黄芩水煎0.285±0.127**0.238±0.035**0.253±0.018**
半夏水煎1.152±0.1471.142±0.051**1.219±0.193
人参水煎0.953±0.0851.003±0.0590.929±0.032*
甘草水煎'1.202±0.159*1.106±0.073**0.930±0.100
生姜水煎1.085±0.1581.020±0.0280.984±0.169
大枣水煎1.334±0.1581.407±0.1571.536±0.080
黄芩+柴胡水煎0.174±0.021**0.177±0駕**0.178±0.017**
黄芩+半夏水煎0.卯7±0.1120駕±0.1780.879±0.083
黄芩+人参水煎0.300±0.013 **0.343±0.012 **0.364±0.010 **
黄芩+甘草水煎0.314±0.032 **0.374±0駕**0.328土0.026 **
黄芩+生姜水煎0.234±0.0160.256±0細**0.288±0.027 **
黄芩+大枣水煎0.287±0.0180.320±0.011 **0.346±0.023 **
对乙酰氨基酚(5mM)0.194±0.079**
注*P<0.05， ** PO.01
实施例2.重新配伍组方的小柴胡汤的人肝细胞毒性体外检测
重新配伍的组方中减少了肝毒性药材黄芩的比例，增加了半夏的比例，新的组 放中各药材的组成比例如下柴胡2.143份，黄芩1.107份，人参U07份，半夏2.107份，生姜1.107份，甘草0.893 份，大枣1.536份。
采用实施例1中的方法进行MTT法检测重新配伍的小柴胡汤水煎液对人肝细胞株的 作用，结果显示重新配伍的小柴胡汤较《伤寒论》张仲景原方小柴胡汤的毒性大大减弱， 同时保持了小柴胡汤原有的疗效。
权利要求
1.一种小柴胡汤配伍组方，其特征在于，包含的药材及其重量比例如下，柴胡2.143份，黄芩1.107份，人参1.107份，半夏2.107份，生姜1.107份，甘草0.893份，大枣1.536份
2. 如权利要求l所述的小柴胡汤配伍组方,其特征在于，该组方对肝脏的毒性减弱。
全文摘要
本发明提供了一种新的小柴胡汤减毒配伍组方，该组方减少了肝毒性药材黄芩的比例，增加了半夏的比例，该组方具体包含柴胡2.143份，黄芩1.107份，人参1.107份，半夏2.107份，生姜1.107份，甘草0.893份，大枣1.536份。重新配伍的小柴胡汤较《伤寒论》张仲景原方小柴胡汤的肝毒性大大减弱，同时保持了小柴胡汤原有的疗效。
文档编号A61K36/9068GK101670077SQ20081004378
公开日2010年3月17日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者萌 戈, 谢天培 申请人:上海天甲生物医药有限公司