专利名称：：一种预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物抗菌缓释制剂，具体的说涉及一种预防和治疗骨髓炎的溶葡萄球菌酶局部缓释制剂。
背景技术：
：骨髓炎是一种骨科常见但又难以根治的疾病。细菌感染是引发骨髓炎的直接原因，化脓性骨髓炎最常见的致病菌为金黄色葡萄球菌，约占总感染病例的70%左右，其次为溶血性链球菌和铜绿色假单胞菌等。全身应用抗生素是骨髓炎治疗的传统方法。但是骨感染病灶的血液循环相对较差，即使全身应用大剂量抗生素，在病灶局部组织中亦难以达到有效的抗生素浓度。近年来，庆大霉素PMMA珠链局部药物缓释制剂以广泛应用于骨髓炎治疗。然而由于PMMA在体内无法降解，故还需要进行二次手术将植入庆大霉素PMMA珠链取出，这无疑给患者带来二次痛苦和增加医疗费用。同时研究表明，局部高浓度的抗生素会对骨再生和骨愈合过程中的主要作用细胞——成骨细胞产生一定的影响[卢丙仑，冯志华等.体外评价抗生素对人重组骨形成蛋白一2诱骨活性的影响.中国临床康复.2002，6(22):3344-3345]。另外，随着广谱抗生素的广泛应用，细菌耐药率不断升高，这给以抗生素为主要治疗手段的骨髓炎疾病的临床治疗带来巨大的困难和挑战。'溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是一种肽链内切酶。该酶可切断细菌细胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽键桥结构，从而达到迅速溶解并杀死细菌的目的。即使是耐药性金黄色葡萄球菌，MRSA及具有多药抗性的"超级细菌"，溶葡萄球菌其能溶解包括生长静止期的细菌，故不容易诱导产生耐药菌株。申请人于2006年12月6日申请的发明专利"溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎的药物中的应用"(申请号200610119208.0，公开号CN101195027A)已经公开了溶葡萄球菌酶在制备治疗骨髓炎药物中具有很好的应用前景，但由于该发明是将溶葡萄球菌酶直接与磷酸钙骨水泥等药物载体材料进行混合，由于在混合过程中会磷酸钙骨水泥会释放热量，在一定程度上会影响溶葡萄球菌酶等蛋白类物质的生物活性，因此按照该方法制备的制剂的杀菌活性一般只能维持3天左右(CN101195027A说明书第7页第1行的抑菌试验结果)，而且溶葡萄球菌酶等生物蛋白大分子与骨水泥等载体材料直接混合会影响磷酸转骨水泥分子间作用力，进而降低骨水泥固化后的强度，因此在临床应用上还存在一定缺陷。因此寻找一种能有效治疗骨髓炎，并能维持更长时间杀菌活性的局部缓释制剂是本发明需要解决的主要内容。
发明内容本发明需要解决的技术问题之一是公开一种具有较长杀菌活性时间治疗骨髓炎的局部缓释制剂。本发明需要解决的技术问题之二是提供该局部缓释制剂的制备方法。本发明需要解决的另一个技术问题是公开所述的局部缓释制剂的应用。本发明的构思是这样的溶葡萄球菌酶(lysost邵hin)是一种含锌的金属蛋白酶，它能一降解革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖层的甘氨酸肽键，从而裂解金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁，起到彻底杀死细菌的目的，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌的效果非常好。磷酸l丐骨水泥(calciumphosphatecement,CPC)是一种可生物降解的载体材料，也是目前唯一能自固化并能产生骨再生效果的骨修复植入材料。它是一类以各种磷酸钙盐为主要成份，使用时加入调和液，在生理条件下具有自固化能力、降解活性及成骨活性的无机材料。但由于蛋白类药物在储存及固化过程中活性损失大，目前尚未有含蛋白多肽类药物的骨修复植入材料在临床上的应用。聚乳酸类(PLA，PLGA)可生物降解材料是基础的生物医学材料，可作为药物控制释放的载体材料，该类物质降解产物为乳酸和水分子，生物相容性好。这类新的药物剂型国外已有多种产品上市，我国现有控制释放剂型领域还是空白。本发明以溶葡萄球菌酶为杀菌活性成分，通过超临界流体微粒制备技术制得含溶葡萄球菌酶的PLA-PLGA多聚物微球，并将其与磷酸钙骨水泥(CPC)复合，制备出携载溶葡萄球菌酶微球的新型缓释可降解抗菌复合人工骨。本发明的技术方案如下所述及的溶葡萄球菌酶缓释制剂包括溶葡萄球菌酶0.01-lwt%,聚乳酸(PLA)1-20wt%，聚乳酸一羟基乙酸(PLGA)0.5-10wt%，磷酸钙骨水泥(CPC)70-90wt%。其中所述及的溶葡萄球菌酶可采用上海高科联合生物技术员研发有限公司市售的产品。所述及的PLA为分子量为30,000至100，000的DL-或D-多聚乳酸。所述及的PLGA为分子量为30,000至100，000的DL-聚乳酸-聚羟基乙酸聚合物。所述及的磷酸钙骨水泥为a-磷酸三钙和磷酸氢钙，用于骨填充和骨修复，可自固化的磷酸钙骨水泥。所述及的药物制剂的制备方法包括如下步骤(1)、溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球的制备，包括如下步骤a)配制溶液A:按上述比例称取溶葡萄球菌酶，将其溶解于DMSO中；b)按上述比例称取PLA和PLGA，将其溶解于二氯甲垸中，加入溶液A中，得到溶液B;c)将溶液B超临界C(V流体混合，通过超临界反溶剂过程(SAS)技术制备平均粒径小于10微米的含溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球；d)收集溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球。(2)、溶葡萄球菌酶/PLA/PLGA/CPC复合材料制备将a-磷酸三鈣磷酸氢钙溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA载药微球以重量比为12:9:l的比例混匀，形成缓释制剂固相粉末。可使用2y。Na2HP04为液相固化液，将本发明公开的缓释制剂固相粉末与液相固化液在常温下以3g:1ml的比例混和成糊状，注入模具中，放入37°C、100%的湿度环境中，材料固化后脱模制成人工骨块；或将固相粉末与液相固化液在常温下以3g:1ml的比例混和成糊状后填入骨缺损部位，固化后形成具有抗菌作用的可降解性骨水泥。本发明公开的溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球-磷酸钙骨水泥局部缓释制剂具有如下特点1、杀菌效果强。该制剂对革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌，具有很强的杀菌作用。2、药物缓释能力强。使用超临界流体微粒制备技术制得含溶葡球菌酶的含聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)多聚物微球。可通过二种途径调节溶葡萄球菌酶的释放速率(1)由于聚乳酸-羟基乙酸在体内的降解速率大于聚乳酸的降解速率，通过增加聚乳酸-羟基乙酸的比例可增加溶葡萄球菌酶的释放速率；(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物中亲水性羟基乙酸比例高，聚合物降解速率快，因此通过调节乳酸、羟基乙酸在聚合物中的相对含量比例可以调节溶葡萄球菌酶的释放速率，使得溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球药物在体液中的缓释可控制在2周至三个月。3、可降解性。葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球所使用的PLA、PLGA及磷酸韩骨水泥均可在体内降解，材料填充部位可被再生骨组织置换。4、骨水泥固化过程中酶活性损失量小。通过聚乳酸的保护作用，固化过程中总酶活损失低于50/0。5、理化性能好，该制剂的含药微粒平均粒径小于10微米，不降低磷酸钙骨水泥的固化后的强度。6、稳定性强。本品在25'C常温保存6个月，生物活性基本没有改变。7、本发明为局部用药制剂，可直接灭杀给药部位包括耐药性金黄色葡萄球菌在内的敏感性细菌起效快，制剂可在病灶部位缓慢释放溶葡萄球菌酶，有效杀灭引发骨髓炎的多种耐药性致病菌，避免因使用传统抗生素带来的毒副作用及耐药菌的出现，同时具有缓慢吸收和传导成骨的作用，能有效治疗骨感染，修复骨缺损，毒副作用小。图l是溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球的体外缓释曲线图具体实施方式实施例1溶葡萄球菌酶-聚乳酸微球的制备1、溶葡球菌酶溶液配备称取10毫克溶葡球菌酶冻干粉，溶解于10毫升二甲亚砜(DMS0)，配制成lmg/ml的溶葡球菌酶溶液。2、PLA-PLGA有机溶液的配备称取0.4克分子量为30，000-50，000的聚乳酸多聚物，0.1克分子量为30，000-50，000的聚乳酸-聚羟基乙酸(其中乳酸、羟基乙酸比例为75:25)多聚物，溶解于10毫升二氯甲烷，配制成5%PLA-PLGA溶液。3、将596PLA-PLGA溶液逐滴缓慢加入配制好的溶葡球菌酶-DMSO溶液，备用。4、平衡超临界C02流体，过程温度37。C、压力13.5MPa，C02流速为20g/min，通过喷嘴泵入上述配制好的溶葡球菌酶溶液，通过超临界反溶剂法制得溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球。(具体过程参照P.Caliceti等在《JournalofControlledRelease》94(2004)p195-205)。5、经检测溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球平均粒径约为3-15微米。实施例2溶葡球菌酶微球-磷酸钙骨水泥的制备1、称取6克超细a-磷酸三钙粉末、4克超细磷酸氢钙粉末、及l克实施例l所制备的溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA载药微球，混合均匀，形成固相粉末；2、配制2%Na2HP04(pH6.5)液相固化液，将4ml液相固化液与上述制得的固相粉末混和成糊状，注入模具中，放入37°C、100%的湿度环境中，.材料固化后脱模制成人工骨块。取实施例2制得的人工骨块，称量后置于100ml的PBS缓冲溶液(pH7.4)中，密封，4。C恒温恒速(100r，min-l)振荡。分别在三个月内内定时取缓冲液，检测溶葡球菌酶酶活性，计算溶葡球菌酶累积释放百分率。缓释溶葡球菌酶微球的体外释药结果如图l所示该结果显示，溶葡球菌酶在体外释药过程时间长达三个月，释放速度较为稳定，可在给药部位维持稳定长效释放。实施例4溶葡萄球菌酶微球稳定性试验1、将溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球在25'C存放6个月。2、于不同存放时间，称取5mg溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球置于100ml的PBS缓冲溶液(pH7.4)中，密封，4t恒温恒速振荡24小时，通过0.22um滤膜过滤，取100ul缓冲液，检测溶葡球菌酶酶活性，结果如表l所示，溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球在25'C存放6个月后酶活性没有发生变化。表l、溶葡萄球菌酶微球稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例5溶葡萄球菌酶微球-磷酸钙骨水泥对慢性骨髓炎的作用效果1、慢性骨髓炎模型动物的建立家兔右小腿内上侧剪毛，在麻醉下切开皮肤，暴露胫骨干骺端。用16号针头钻开骨髓腔，放出少量骨髓。然后用小干棉球浸沾3X10/ml金黄色葡萄球菌悬液O.3ml.填入骨髓腔内.再从钻洞孔注入5%鱼甘油酸钠0.5ml，缝合切口。通过观察发现，术后1周，局部明显红肿，X光片见软组织阴影，原钻孔边缘骨密度增高，周围局限性骨质疏松。光镜下见骨髓腔内大量炎性细胞浸润，呈弥漫性蜂窝组织炎性改变。2、试验方法1)选择确诊患有慢性骨髓炎的家兔供试验用，根据治疗顺序，将其随机分为"溶葡萄球菌酶"组和对照组。手术取出棉球，待用。2)试验组将a-磷酸三钙粉末、磷酸氢钙粉末、及溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA载药微球按比例混合均匀，用液相固化液将其混和成糊状，用针头注入取出棉球后的空腔中，缝合伤口。3)对照组将a-磷酸三钙粉末、磷酸氢钙粉末及PLA-PLGA空白微球按比例混合均匀，用液相固化液将其混和成糊状，用针头注入取出棉球后的空腔中，缝合伤口。3、组织学观察治疗术后8周，无菌条件下切取右胫骨上段约，并纵剖为两部分。取其一半纵剖标本，修整后用100g/L中性甲醛固定，混合脱钙液脱钙，石蜡包埋，常规切片，染色。于光镜下观察骨缺损修复及骨髓炎治疗情况。4、细菌学检査将纵剖的另一半标本，在无菌条件下称重、剪碎、匀浆，接种于琼脂培养基，37°下培养24小时，测量并计算平均每克标本中的金葡球菌数。5、治疗效果判定标准有效局部保持较正常外观形状，骨皮质缺损区完全骨性修复，塑形较好;其剖面未发现明显骨质增生、破坏，髓腔内骨髓形成良好，无炎性组织。无效胫骨近端外观不同程度变形、膨大且残留皮质骨缺损;其剖面见皮质骨不同程度增生、破坏，髓腔被炎性组织充填。与治疗前比较无明显变化。6、组织学试验结果表2溶葡球菌酶组与对照剂组治疗效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从表2可以看出，,用溶葡萄球菌酶微球-磷酸钙骨水泥治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的骨髓炎疗效显著，与对照组相比，治愈率前者比后者提高83个百分点，经卡方检验，差异显著(P〈0.05)。7、细菌学检测结果术后8周，试验组和对照组每克标本细菌平均计数分别为0CFU/g、3.12X109CFU/g。因各组细菌计数结果为几何级分布，经方差齐性检验，发现方差不齐，进行对数转换后，行方差分析，组间差异有非常显著性意义(P〈0.001)。8、综上所述，溶葡萄球菌酶微球-磷酸钙骨水泥具有良好的骨传导和骨诱导作用，还有非常强的抗感染能力，能修复严重污染的兔胫骨骨缺损,而且能有效杀灭感染部位金黄色葡萄球菌，彻底治愈骨髓炎。权利要求1.一种预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂，其特征在于，组分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶0.01-1％，聚乳酸(PLA)1-20％，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)0.5-10％，磷酸钙骨水泥(CPC)70-90％。2.根据权利要求1所述的预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂，其特征在于，所述的聚乳酸(PLA)为分子量为30，OOO—IOO，OOO的DL-或D-多聚乳酸。3.根据权利要求1所述的预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂，其特征在于，所述及的聚乳酸一羟基乙酸(PLGA)为分子量为30，OOO—IOO，000的DL-聚乳酸-聚羟基乙酸聚合物。4.根据权利要求1所述的预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂，其特征在于，所述及的磷酸钙骨水泥(CPC)为a-磷酸三钙和磷酸氢^。5.根据权利要求1-4任一所述的预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球的制备首先配制溶液A:按上述比例称取溶葡萄球菌酶，将其溶解于DMSO中；然后按上述比例称取PLA和PLGA，将其溶解于二氯甲烷中，加入溶液A中，得到溶液B;将溶液B与超临界C02流体混合，通过超临界反溶剂过程(SAS)技术制备平均粒径小于10微米的含溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球；收集溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球；(2)溶葡萄球菌酶/PLA/PLGA/CPC复合材料制备将a-磷酸三钙磷酸氢钙溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA载药微球以重量比为12:9:l的比例混匀，形成缓释制剂固相粉末。6.根据权利要求1-4任一所述的预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂的应用，其特征在于，使用2%化2朋04为液相固化液，将缓释制剂固相粉末与液相固化液在常温下以3g:1ml的比例混和成糊状，注入模具中，材料固化后脱模制成人工骨块；或将缓释制剂固相粉末与液相固化液在常温下以3g:1ml的比例混和成糊状后填入骨缺损部位，固化后形成具有抗菌作用的可降解性骨水泥。全文摘要本发明公开了一种预防和治疗骨髓炎的局部缓释制剂及其制备方法和应用。该制剂的组分及重量百分含量包括溶葡萄球菌酶0.01-1％，聚乳酸(PLA)1-20％，聚乳酸—羟基乙酸(PLGA)0.5-10％，磷酸钙骨水泥(CPC)70-90％。该制剂以溶葡萄球菌酶为杀菌活性成分，通过超临界流体微粒制备技术制得含溶葡萄球菌酶的PLA-PLGA多聚物微球，并将其与磷酸钙骨水泥(CPC)复合，制备出携载溶葡萄球菌酶微球的新型缓释可降解抗菌复合人工骨。该制剂的理化性能好、杀菌效果强，在体外释药过程时间长达三个月，释放速度稳定，可在给药部位维持稳定长效释放。文档编号A61K38/43GK101618209SQ200810043578公开日2010年1月6日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者莉李,黄青山申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司