专利名称：：麦冬多糖mdg-1在制备治疗糖尿病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及麦冬多糖MDG-1新的医药用途。
背景技术：
：养阴类中药具有生津润燥、滋阴养液等功效，以治疗阴虚证为主，它们的毒性一般较小，作用比较温和，以滋补作用为主，对提高人体免疫力，防病治病具有重要的意义。随着人们对多糖药理作用的认识，多糖的研究也愈来愈受到重视，具有养阴作用的中药常含有大量的多糖，它们的生理活性作用分别体现在免疫调节作用、抗肿瘤作用、降血糖、降血脂作用、抗氧化、抗衰老、保肝作用、抗病毒作用、抗疲劳、耐缺氧、抗纤维化、抗溃疡作用等各方面。中国专利CN1445244A于2003年10月1日公开的麦冬多糖MDG-1是分子量为5000的P-D-果聚糖，以2—1连接的呋喃型果糖为主，平均每2.8个主链基上有一个/^//(2—6),2T//(2—分支，且该多糖的还原端可能与a-D-Glc相连。麦冬多糖MDG-1抗心肌缺血作用显著，是一种具有药用价值的活性多糖。麦冬多糖MDG-1可以使缺血再灌的心脏收縮幅度和冠脉流量较快地恢复，并可抑制心率加快，还可降低缺血后血浆中乳酸脱氢酶的释放。说明麦冬多糖MDG-1对缺血再灌的心肌细胞具有保护作用。(郑琴、冯怡、徐德生等麦冬多糖MDG-l对鼠实验性心肌缺血的保护作用，中国中西医结合杂志，2007，27(12):1116)。文献中尚未见麦冬多糖MDG-1治疗糖尿病及作用机理的报道
发明内容本发明所要解决的技术问题在于开发麦冬多糖MDG-1的新用途，提供麦冬多糖MDG-1在制备治疗糖尿病药物中应用。本发明中的麦冬多糖MDG-1是从麦冬总多糖中分离获得的。中国专利CN1445244A于2003年10月1日公开了麦冬多糖MDG-1的制备方法。本发明通过动物实验发现麦冬多糖MDG-1对于高脂高糖饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射造成的实验性糖尿病大鼠模型(DM大鼠)，经口服给药9周后，MDG-l组(37mg/kg)饮食、饮水及尿量与模型组相比明显减少，同时在实验终末期，MDG-1组血糖与模型组相比明显降低。综合说明，MDG-1组能够改善匿大鼠的多食、多饮及多尿症状，具有一定的降血糖作用。本发明通过血管生成抗体芯片实验发现麦冬多糖MDG-1能使FGF-p，FGF-a上调，这些结果说明MDG-1可能是通过S1P/Akt/ERK信号通路，稳定细胞膜，促进新生血管的生成，从而改善缺血心肌的血液和能量供给，达到治疗心肌缺血的作用；在实验中还发现麦冬多糖MDG-1能使L印tin，TNFa下调，而L印tin，TNFot同糖尿病发生发展过程相关，提示了麦冬多糖MDG-1可能通过抑制L印tin和TNFa通路，起到治疗糖尿病的作用。本发明中，麦冬多糖MDG-1最好以片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或其他适合于口服的固体或液体药物的形式存在于一个摄入单位中，而每个摄入单位麦冬多糖MDG-1的含量最好为0.03—0.3g，且每个摄入单位中麦冬多糖MDG-1的重量百分比最好为6-60%，余量为药用辅料或附加剂。图1是麦冬多糖MDG-150mg/ml组血管生成抗体芯片实验结果。图2是麦冬多糖MDG-1lmg/ml组血管生成抗体芯片实验结果。具体实施例方式有关本发明前述及其它技术内容、特点与功效，在以下较佳实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。实施例l(麦冬多糖MDG-1降血糖实验研究)1、糖尿病大鼠模型的建立清洁级$SD大鼠60只，体重(90士10)g，随机进行分组，其中10只作为正常对照组，给予普通标准饲料喂养，其余50只予高糖高脂饮食，5周后将高脂高糖词料喂饲的动物，给予腹腔注射P/。STZ(40mg/kg)造模，正常对照组给予等容量溶媒，72小时后，空腹血糖>16.7腿01/1，尿糖在+++以上作为糖尿病造模成功大鼠，将DM大鼠根据血糖及尿糖随机分为4组，分别为模型组(N=10)，MDG低剂量(37mg/kg)治疗组(N二9)，MDG高剂量(75mg/kg)治疗组(N=10)，二甲双胍组(N二10，20mg/kg)。各组按上述药物剂量灌胃，正常对照组给予以等量的生理盐水，匿大鼠继续喂养高脂高糖饲料，空白组饲养个普通词料，治疗9周。2、观测指标治疗后的第3周、第6周、第9周代谢笼收集24h尿液，同时检测24小时饮食、饮水、尿量、尿糖。体重每周测一次。给药9周后，禁食12h，次日以25y。乌拉坦麻醉大鼠，腹主动脉收集血标本，测空腹血清血糖、糖化血红蛋白(均为常规生化方法)。3、指标测定血糖测定禁食8小时后，尾静脉取血，用葡萄糖氧化酶法测定，用血糖饮食、饮水、尿量的测定采用代谢笼，分别于第3周、第6周、第9周测定大鼠的饮食、饮水和收集24h尿液，观察其变化。每周称量大鼠的体重，观察其变化。用药9周后，禁食8小时后麻醉，腹主动脉取血，用生化分析仪测定血糖，用罗氏ModularP800全自动生化分析仪测定糖化血红蛋白。4、统计方法实验数据数据用x士s表示，用SPSS13.O统计软件进行统计，采用单因素方差分析。5、实验结果5.l.造模情况50只高脂高糖饲料喂养的大鼠词养5周后，然后按照40mg/kg的剂量腹腔注射l。/。的STZ后，血糖〉16.7，尿糖+++或以上纳入DM造模成功大鼠,共有39只，按照血糖、尿糖及体重随机进行分组，包括模型组(n=10)、MDG-l低剂量组(37mg/kg，n=9)、MDG-1高剂量组(75mg/kg，n=10)、二甲双胍组(n=10)。各濕组血糖与正常对照组比较有显著性差异(p〈0.01)。见表l。表1.注射1%STZ后各组血糖的变化正常对照组模型组MDG低剂量组MDG高剂量组二甲双胍血糖4.2±0.218.9±2.3"20.0±3.1"19.8±2.9"19.3±3.1"AP<0.05，"P〈0.01vscontrolgroup5.2.各组大鼠治疗期间饮食变化在给药后的第3周、第6周、第9周，与正常对照组相比，各DM组饮食有显著增加(P〈0.01);与模型组相比，MDG-1低剂量组饮食在给药后的6周、9周均有显著降低(P〈0.05)，而MDG-1高剂量组差异无统计学意义(p〉0.05)。_表2,造模后各组饮食的变化(单位g/24小时)_空白组模型组MDG低剂量组MDG高剂量组二甲双胍组3周30.6±0.539.3±3.7**39.5±2.041.7±5.439.4±6.56周25.5±1.643.7±i.3甜38.1±0.5"42.1±3.141.9±4.9"9周26.8±0.445.6±1.0**37.8±2.9"41.1±6.237.1±4,8"P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;"<0.05，"P<0.01vsmodelgro卯5.3.各组大鼠治疗期间饮水变化在治疗后的第3周、第6周、第9周，与正常对照组相比，各DM组饮水显著增加(P〈0.01);与模型组相比，各治疗组组饮水显著降低(P<0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05,P<0.01vscontrolgroup;AP<0.05,"P〈0.01vsmodelgroup5.4.各组大鼠治疗期间尿量的变化在治疗后的第3周、第6周、第9周，与正常对照组相比，各DM组饮食明显增加，有显著性差异(P〈0.01)，见表2。与模型组尿量相比，MDG-1低剂量组明显减少，有显著差异(P<0.05)，而MDG-l高剂量组6、9周尿量差异无显著意义(p〉0.05)。_表4.造模后各组尿量的变化(单位ml)_空白组模型组MG低剂量组MG高剂量组二甲双胍组3周21.3±7.433.2±14.5#6周14.5±4.640.7±20.489周16.4±5.137.2±6.0##將》P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;*P<0.05,"P<0.01vsmodelgroup15.2±6.4**20.8±9.6*24.7±12.125.8±10.0A38.5±14.49.8±3.6A17.3±6.5A36.2±1.712.4±5.5.5.各组大鼠给体重的变化造模后，DM组开始给药，正常对照组给予同等量的生理盐水，在整个给药期间与空白对照组相比，各DM组体重出现明显的减少见表2。与模型组相比，各治疗组体重无明显变化(p〉0.05)。表5.造模后各组体重在不同时间段的情况(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05,P<0.01vscontrolgroup;<0.05，"P<0.01vsmodelgroup5.6.给药9周大鼠血糖及糖化血红蛋白影响与正常对照组比较，模型组血糖、糖化血红蛋白显著升高(P〈0.01);与模型组相比，MDG-l低剂量血糖显著降低(P<0.05)糖化血红蛋白有所下降，但无统计学差异(p>0.05)结果见表6。表6.实验终末期各组血糖、糖化血红蛋白的变化(单位mniol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;*P<0.05，"P<0.01vsmodelgroup6、实验结论高脂高糖饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射是实验性糖尿病大鼠常用造模方法。通过高热量饲料喂养，在此基础上给予一定剂量STZ破坏部分胰岛e细胞，引起大鼠高血糖状态。在此次实验中，先给予SD大鼠5周的高脂高糖饲料喂养，然后腹腔注射40mg/kg的1%STZ,与正常对照组相比，各DM组大鼠血糖、尿糖明显升高(P〈0.0D，同时表现出明显的"三多一少"症状，饮食、饮水、尿量明显增多，体重减轻。经给药9周后，MDG-1低剂量组(37mg/kg)饮食、饮水及尿量与模型组相比明显减少，同时在实验终末期，MD-1G低剂量组(37mg/kg)血糖与模型组相比明显降低。综合说明，MDG-1低剂量组能够改善DM大鼠的多食、多饮及多尿症状，具有一定的降血糖作用。实施例2(麦冬多糖MDG-1对血管生成抗体芯片实验的影响)1、细胞培养和加药取对数生长期HMEC-1细胞，放置于6孔板中，放置37"C二氧化碳培养箱中培养，待细胞数达到106个时，换无血清MCDB131培养液培养24h，然后加入用无血清MCDB131培养液配制的麦冬多糖MDG-1培养液。共两组，其中一组加药组(lmg/ml或50mg/ml)，另一组为空白对照组。加药后分别于18h时提取蛋白。2、蛋白样品制备每瓶细胞加lml4。C预冷的PBS。平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。100jil裂解液加0.5filPMSF(100mM)禾卩lpl抑制剂，摇匀置于冰上。每瓶细胞加IOOW裂解液，于冰上裂解30min后，4°C下14000rpm离心15min。3、蛋白含量的测定取样品1.5ml至离心管中，每管加入4"C储存的工作液lml。空白对照组加入20pl水，样品组加入5W样品和15W水。采用分光光度法，以空白对照组为空白对照，测定595nm下样品组吸光度。测定数值用y-0.7174x+0.0954计算，所得y值乘4即为蛋白浓度。4、免疫反应将AngiogenesisAntibodyArray膜放入8孑L板中，力口入3ml1XBlockingBuffer,确保膜蛋白面向上，室温孵化lh。移去1XBlockingBuffer,用4mlIXWashBufferII洗膜两次，弃去多余液体。力口500nl样品于膜的蛋白面，室温孵化l2h。倾去样品液，用4mllXWashBufferI在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用4ml1XWashBufferII在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用滤纸吸去残留液。取出膜，用滤纸吸去残留液，装入新孔中，将Biotin-ConjugatedAnti-AngiogenesisMix用lXWashBufferII稀释至适当浓度加入孔中。室温下孵育2h后，用4mllXWashBufferI在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用4mlIXWashBufferII在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用滤纸吸去残留液。同上方法准备lXStr印avidin-HRPConjugate稀释液并与膜接触，室温下孵育lh后，用4ml1XWashBufferI在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用4mllXWashBufferII在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。用滤纸吸去残留液。5、化学发光，显影，定影将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合后加在膜的蛋白面上，使其与混合液充分接触；5min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中，将lx显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X—光片，用切纸刀剪裁适当大小；打开X-光片夹，把X—光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。6、凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。7、实验结果麦冬多糖MDG-150mg/ml组见图1。麦冬多糖MDG-1lmg/ml组见图2。抗体芯片位点数据见图3。结果分析见表2.1。如图2所示，lmg/ml麦冬多糖MDG-1能使FGF-(3上调，使Leptin，TNFa，HGF下调。如图1所示，50mg/ml麦冬多糖MDG-l能使IFNy，IL-12,FGF-P上调，使Leptin，TNFoc，HGF下调。表2.1抗体芯片位点数据<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8、实验结论血管生成抗体芯片实验结果表明MDG-1能使Leptin，TNFa下调，由于Leptin，TNFa同糖尿病及其并发症的发成发展过程密切相关，所以麦冬多糖MDG-1抑制Leptin和TNFa的作用有利于治疗糖尿病以及减少糖尿病并发症，其治疗糖尿病的作用可能同抑制Leptin和TNFa通路相关。实施例3(麦冬多糖MDG-1片的制备)麦冬多糖MDG-110克；辅料HPMC、十八烷醇、硬脂酸镁，共40克；制备将主药及HPMC、十八垸醇充分混合均匀，过IOO目筛，加粘合剂制成软材，过16目筛制粒，4(TC干燥，整粒。加硬脂酸镁作润滑剂，混合后压片，共制100片，每片0.5克，即可。本实施例制得的麦冬多糖MDG-1片，每片为一个摄入单位，每个摄入单位中含麦冬多糖MDG-10.1克，重量百分含量为20%。实施例4(麦冬多糖MDG-1胶囊的制备)取麦冬多糖MDG-115克；辅料淀粉、糊精、碳酸钙等共45克；制备:将主药及辅料充分混合均匀，装胶囊，共制100粒，每粒0.5克，即可。本实施例制得的麦冬多糖MDG-1胶囊，每1粒为一个摄入单位，每个摄入单位中含麦冬多糖MDG-10.15克，重量百分含量为30%。实施例5(麦冬多糖MDG-1颗粒剂的制备)麦冬多糖MDG-1IO克；辅料淀粉、糊精、糖粉等，共90克；将主药及辅料充分混合均匀，用适当浓度的乙醇适量制软材，制粒，干燥，整粒，分装，每包2克，共制50包，即可。本实施例制得的麦冬多糖MDG-1颗粒，每包为一个摄入单位，每个摄入单位中含麦冬多糖MDG-10.2克，重量百分含量为10%。实施例6(麦冬多糖MDG-1口服液的制备)取麦冬多糖MDG-1500克，加适量水溶解，过滤，加入适量甜味剂及防腐剂溶解后，加水至1000ml，分装，每瓶10ml，即可。本实施例制得的麦冬多糖MDG-1口服液，每瓶为一个摄入单位，每个摄入单位中含麦冬多糖MDG-15.0克，体积百分含量为50%。权利要求1、麦冬多糖MDG-1在制备治疗糖尿病的药物中的应用。2、权利要求l的用途，其特征是，麦冬多糖MDG-1以片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或其他适合于口服的固体或液体药物的形式存在于一个摄入单位中。3、权利要求2的用途，其特征是，每个摄入单位含有麦冬多糖MDG-10.03—0.3g。4、权利要求2或3的用途，其特征是，每个摄入单位中麦冬多糖MDG-1的重量百分比为6-60%,余量为药用辅料或附加剂。全文摘要本发明涉及麦冬多糖MDG-1在制备治疗糖尿病的药物中的应用。麦冬多糖MDG-1能够改善DM大鼠的多食、多饮及多尿症状，且具有一定的降血糖作用，其作用机制可能涉及通过抑制Leptin和TNFα通路，起到治疗糖尿病的作用。文档编号A61P3/10GK101564399SQ200810043279公开日2009年10月28日申请日期2008年4月23日优先权日2008年4月23日发明者怡冯,徐德生,晓林,岚沈申请人:上海中医药大学