一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法

专利名称：一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种预防家禽传染病的疫苗制备方法，具体地讲涉及一种禽流 感四联灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
联苗是指不同种微生物或其代谢产物组成的疫苗，联苗可简化接种程序， 减少接种动物应激反应的次数，此外对于产蛋鸡，尤其是种鸡应尽可能避免或 减少在产蛋期间做免疫接种，而鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽
流感(H9亚型)四联灭活疫苗(简称禽流感四联灭活疫苗)主要是在开产前使 用，使用剂量与单苗相当，但其效力与单苗相同，具有使用简便、接种程序简 单等优点，减少疫苗的免疫次数，避免家禽产生不必要的应激，达到事半功倍的 效果。
一般情况下，要制作联苗，就必须浓縮抗原，浓縮技术成为近年来研究联 苗的热点技术，主要的方法有超速离心法、中空纤维法、超滤浓縮法。

发明内容
为了克服现有技术不足，本发明公开了一种禽流感四联灭活疫苗的制备方 法，通过本发明制成了禽流感四联灭活疫苗可以有效预防鸡新城疫、传染性支 气管炎、H9亚型禽流感和减蛋综合征的发生，同时也可以大大降低人们的劳动 强度，降低畜禽死亡率，减少养殖户的损失，造福人类。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案
所述一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其制备方法步骤如下-
①、生产用毒种的制备将NDVLaSota株毒种用灭菌生理盐水作10—4稀释，将IBV M^株毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释；将NDV La Sota株毒种和IBV M 株毒种分别接种9 10日龄SPF鸡胚上，置37'C继续孵育，收获鸡胚液；将AIV HL株毒种用灭菌生理盐水作10—3稀释后，接种9 10日龄SPF鸡胚，置37'C继 续孵育，收获鸡胚液；将EDSV AV127病毒毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释后接 种10 11日龄易感鸭胚，置37'C继续孵育，收获鸭胚液；
② 、制苗用病毒液的制备将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作 l(T稀释，将IBV M"株生产毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释，将NDV La Sota 株毒种和IBV M"株毒种同时接种9 10日龄SPF同一鸡胚上，置37'C继续孵育， 收获鸡胚液；将AIV HL株生产毒种用灭菌生理盐水作10—3稀释后，接种9 10 日龄SPF鸡胚，置37'C继续孵育，收获鸡胚液；将EDSVAV127病毒生产毒种用 灭菌生理盐水作10—2稀释后接种10 11日龄易感鸭胚，置37'C继续孵育，收获 鸭胚液；将NDVLaSota株、IBVM^株、AIVHL株病毒液作3. 5倍浓縮，将EDSV AV127株病毒液作4倍浓縮浓縮后分别灭活；
③ 、灭活疫苗的制备
取灭活的浓縮3. 5倍NDV La Sota株、IBV M"株、AIV HL株病毒液和浓縮 4倍的EDSV AV127株病毒液按1: 1: 1: 1.5的比例混合，取混合后的病毒液 97 99份(体积份)，加入吐温-80 1 3份(体积份)，混合制成水相；取白油 96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2 (体积份)份制成油相；
、将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1:1.5 2.5， 一起乳化， 即制得禽流感四联灭活疫苗，分装，贴签,装箱、入库。
本发明所采用的灭活是指，IBV M41病毒液创新采用低温灭活，2 8'C经 120 145小时，并将浓縮后的NDV La Sota 、 AIV HL株和EDS AV127株病毒液， 分别加入0.05 0. 15%甲醛溶液，经35 38。C灭活12 17小时，可彻底灭活病毒，并不影响其免疫原性。
本发明所采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘，实验证明含油相和水相乳化 剂的疫苗比仅含油相的疫苗免疫效果好，可使抗原充分混合均匀，不易分层， 在37'C条件下更稳定，黏度也低。
本发明采用了纤维膜超滤浓縮法，可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度达4 倍以上，纤维膜超滤浓縮装置，设有二级孔径不同的纤维滤柱， 一级滤柱的纤 维可滤除部分细菌和杂质，二级超滤株的中空纤维可截留病毒粒子。
本发明所采用的NDV La Sota、 IBV M41、 AIV HL株和EDS AV127株均购自
中国兽医药品监察所。
由于釆用了如上所述的技术方案，本发明具有如下积极效果
1、 本发明采用纤维膜超滤浓縮法，可提高免疫抗原在疫苗终产品的浓度， 可是使效价达大幅提高。由于采用低温灭活，即可彻底灭活又不影响免疫原性。
2、 本发明使用佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原 性，与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应 答，或者改变机体免疫应答类型。实验证明含油相和水相乳化剂的疫苗比仅含 油相的疫苗免疫效果好，可使抗原充分混合均匀，不易分层。在37"C条件下更稳 定，黏度也低。
3、 本发明在生产工艺中独创的将NDV和IBV病毒同时接种同一鸡胚的方法 比起两种毒珠液分别接种鸡胚，节省了鸡胚的使用数量，减少了疫苗生产的操作 步骤,避免了毒种污染机会，而且省去了疫苗制作中的浓縮环节，可节省时间，提 高效率。本公司技术人员经过大量试验最终找到了四种病毒之间最佳的配合比
例，并解决了四种病毒之间的互相干扰问题。可使一次接种代替的四次接种，使 其效力与单苗相当，具有使用简便、接种程序简单等优点。
具体实施例方式
实施例1: 一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其制备方法步骤如下
① 、生产用毒种的制备将NDV La Sota株毒种用灭菌生理盐水作10—4稀释， 将IBV M"株毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释，将AIV HL株毒种用灭菌生理盐水 作10"稀释后，分别接种9 10日龄SPF鸡胚，置37'C继续孵育，收获鸡胚液; 将EDSVAV127病毒毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释后接种10 11日龄易感鸭胚: 置37'C继续孵育，收获鸭胚液；
② 、制苗用病毒液的制备将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作 10—4稀释，将IBV M"株生产毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释，将NDV La Sota 株毒种和IBVM^株毒种同时接种9 10日龄SPF同一鸡胚上，置37'C继续孵育， 收获鸡胚液；将AIV HL株生产毒种用灭菌生理盐水作10—3稀释后，接种9 10 曰龄SPF鸡胚，置37'C继续孵育，收获鸡胚液；将EDS AV127病毒生产毒种用 灭菌生理盐水作10—2稀释后接种10 11日龄易感鸭胚，置37'C继续孵育，收获 鸭胚液；将NDVLaSota株、IBVM^株、AIV HL株病毒液作3. 5倍浓縮，将EDS V AV127株病毒液作4倍浓縮；浓縮后分别灭活；对IBV M41病毒液创新采用 0. 1%的甲醛溶液4度144小时灭活，并将浓缩后的NDV La Sota 、 AIV HL株和 EDSV AV127株病毒液，分别采用0. 1%的甲醛溶液37度16小时灭活。
③ 、灭活疫苗的制备
取灭活的浓縮3. 5倍NDV La Sota株、IBV M"株、AIV HL株病毒液和浓缩 4倍的EDS AV127株病毒液按1: 1: 1: L5的比例混合，取混合后的病毒液97 份(体积份)，加入吐温-80 3份(体积份)，混合制成水相；取白油96份(体 积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2 (体积份)份制成油相；
、将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1:1.5， 一起乳化，即制得禽用四联灭活疫苗，分装，贴签，装箱、入库。
实施例2: —种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其制备方法步骤如下 其制备步骤①、步骤②同实施例1制备步骤①、步骤②；步骤③、④改为 ③、灭活疫苗的制备
取灭活的浓縮3. 5倍NDV La Sota株、IBV Mu株、AIV HL株病毒液和浓縮 4倍的EDS AV127株病毒液按1: 1: 1: 1.5的比例混合，取混合后的病毒液98 份(体积份)，加入吐温-80 2份(体积份)，混合制成水相；取白油96份(体 积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2 (体积份)份制成油相；
、将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1:2.0， 一起乳化，即制得 禽用四联灭活疫苗，分装，贴签，装箱、入库。
实施例3: —种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其制备方法步骤如下 其制备步骤①、步骤②同实施例1制备步骤①、步骤②；步骤③、④改为 ③、灭活疫苗的制备
取灭活的浓縮3.5倍NDV La Sota株、IBV M"株、AIV HL株病毒液和浓縮 4倍的EDS AV127株病毒液按1: 1: 1: 1.5的比例混合，取混合后的病毒液99 份(体积份)，加入吐温-80 l份(体积份)，混合制成水相；取白油96份(体 积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2 (体积份)份制成油相；
、将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1:2.5， 一起乳化，即制得 禽用四联灭活疫苗，分装，贴签，装箱、入库。
权利要求
1、一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其特征是其制备方法步骤如下①、生产用毒种的制备将NDV La Sota株毒种用灭菌生理盐水作10-4稀释，将IBV M41株毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释，将AIV HL株毒种用灭菌生理盐水作10-3稀释后，分别接种9～10日龄SPF鸡胚，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将EDSV AV127株毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释后接种10～11日龄易感鸭胚，置37℃继续孵育，收获鸭胚液；②、制苗用病毒液的制备将NDV La Sota株生产毒种用灭菌生理盐水作10-4稀释，将IBV M41株生产毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释，将NDV La Sota株毒种和IBV M41株毒种同时接种9～10日龄SPF同一鸡胚上，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将AIV HL株生产毒种用灭菌生理盐水作10-3稀释后，接种9～10日龄SPF鸡胚，置37℃继续孵育，收获鸡胚液；将EDSV AV127病毒生产毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释后接种10～11日龄易感鸭胚，置37℃继续孵育，收获鸭胚液；将NDV La Sota株、IBV M41株、AIV HL株病毒液作3.5倍浓缩，将EDSVAV127株病毒液作4倍浓缩；浓缩后分别灭活；③、灭活疫苗的制备取灭活的浓缩3.5倍NDV La Sota株、IBV M41株、AIV HL株病毒液和浓缩4倍的EDSV AV127株病毒液按1∶1∶1∶1.5的比例混合，取混合后的病毒液97～99份(体积份)，加入吐温-801～3份(体积份)，混合制成水相；取白油96份(体积份)、司本-80 4份(体积份)、硬脂酸铝2(体积份)份制成油相；④、将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1∶1.5～2.5，一起乳化，即制得禽用四联灭活疫苗，分装，贴签，装箱、入库。
全文摘要
一种禽流感四联灭活疫苗的制备方法，其制备方法步骤如下①生产用毒种的制备②制苗用病毒液的制备③灭活疫苗的制备取灭活的浓缩3.5倍NDV La Sota株、IBV M₄₁株、AIV HL株病毒液和浓缩4倍的EDSV AV127株病毒液按1∶1∶1∶1.5的比例混合，取混合后的病毒液97～99份，加入吐温-80 1～3份，混合制成水相；取白油96份、司本-80 4份、硬脂酸铝2制成油相；④将水相与油相混合，水相与油相混合之比为1∶1.5～2.5，一起乳化，即制得禽用四联灭活疫苗，该疫苗具有免疫效果好，工艺简单，经济效益高等优点。
文档编号A61K39/295GK101607083SQ20081005004
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月18日 优先权日2008年6月18日
发明者乔荣岑, 习向锋, 刘守川, 孙进忠, 晋春霞, 荣骏弓, 闵亚杰 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司