专利名称：：人宫颈癌的一种治疗性疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人宫颈癌的一种治疗性疫苗。技术背景人乳头瘤病毒(humanpapilloma-virus，HPV)的持续感染常可引起生殖器疣、宫颈癌、阴茎癌、肛周癌及头颈部癌等发生，其中尤以宫颈癌危害最为突出。目前全球宫颈癌患者己超过1400万，主要集中在发展中国家，且每年新增病例47万余，其中至少一半人死亡，宫颈癌在妇女肿瘤死亡率中高居第二位，已成为困扰社会的重大公共卫生问题(ZurHausenH.Papillomavirusinhumancancers.ProAssocAmPhysicians,1999,111(6):581-587.KoutskyLA,GallowayDA，HolmesKK.Epidemiologyofgenitalhumanpapillomavirusinfection.Epidemiol.Rev.1988，10:122—163.MungerK,BaldwinA，EdwardsKM.MechanismsofHumanPapillomavirus-inducedOncogenesis.JVirol，2004，78(21):11451—11460.GarlandSM.Humanpapillomavirusupdatewithaparticularfocusoncervicaldisease.Pathology,2002,34(3):213-224.)。临床上宫颈癌传统治疗方法疗效不佳，主要表现为中晚期病人化疗有效率一般小于20%，放疗或手术后近4成复发，且预后极差。研究表明，利用最新分子生物学进展，研究生物工程疫苗以提高疗效，是目前在宫颈癌防治上最有希望取得突破的方向之一(JansenKUandShawAR.Humanpapillomavirusvaccinesandpreventionofcervicalcancer.Annu.Rev.Med.2004,55:319—331.AmandaPsyrri*andDanielDiMaioHumanpapillomavirusincervicalandhead-and-neckcancer.NatureclinicalpracticeONCOLOGY2008，5(1):24-31.)。HPV是一种双链DNA病毒，其衣壳蛋白LI与L2表达后能自我装配或形成病毒样颗粒(VLP)，可诱发机体产生特异性中和抗体和有效的周部免疫反应；HPV共有8个早期蛋白，其中E6和E7可分别使抑癌蛋白p53和Rbl失活，导致细胞周期失控、端粒酶激活与细胞永生化，其持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，以之为靶位可引发较强的特异性T细胞反应，E6和E7蛋白在正常人体内不存在，且抗原性、特异性均较强，属较好的疫苗靶位(RodenRB,GrrenstoneHL,KimbauerR,etal.Invitrogenerationandtype-specificneutralizationofahumanpapillomavirustype16virionpseudotype.virology，1996,70(9):5875-5883.PorgadorA.Inductionofantitumorimmunityusingbonemarrow-generateddendriticcells.JI醒unol,1996,156(8):2918-1926.EvansM,BoryiewiczLK,EvansAS，etal.AntigenprocessingdefectsincervicalcarcinomaslimitthepresentationofaCTLepitopefromhumanpapillomavirus16E6.JI譲unol,2001，167(9):5420-5428.BerezutskayaE，BagchiS.ThehumanpapillomavirusE7oncoproteinfunctionallyinteractswiththeS4subunitofthe26Sproteasome.JBiolChem，1997,277(48):30135-30140.)。近10年来HPV疫苗研究非常活跃，国际上已有数个HPV候选疫苗进入临床II或III期试验阶段，不过包括2006年FDA正式批准上市的Gardasil(Merck公司)在内，多为预防性的VLP疫苗，治疗性疫苗研究尚有待加强(Noauthorslisted.Newvacdnepreventscervicalcancer.FDAConsum.2006;40(5):37.)。此外尤其值得、注意的是，大宗流行病学调査显示HPV是由多个型别组成的病毒，缺乏群抗原决定簇，而不同地区HPV感染型别构成比是存在差异的，因此开发多价疫苗才能真正起到防治效果。以宫颈癌为例，国外多以16和18型为主，58型罕见(<2%)，而我国58型感染则非常普遍(约10-30%)，宫颈癌病人中检出率仅次于16型(50%左右)，在南方许多地区甚至与16型几乎持平(ShiW,BuP,LiuJ,etal.Humanpapillomavirustype16E7DNAvaccine:mutationintheopenreadingframeofE7enhancesspecificcytotoxicT-lymphocyteinductionandantitumoractivity.JVirology.l999,73(9):7877-7881.林玉纯，刘宝印，李洁等.人乳头瘤病毒58型的发现及各型在中国宫颈疾患中的分子流行病学研究.医学研究通讯，1996;25(11):21.DaiM,BaoYP,LiN,etal.HumanpapillomavirusinfectioninShanxiProvince,People'sRepublicofChina:apopulation-basedstudy.BrJCancer.2006，95(1):96隱101.ChanPK，LiWH,ChanMY,etal.Highprevalenceofhumanpapillomavirustype58inChinesewomenwithcervicalcancerandprecancerouslesions.JMedVirol,1999，59(2):232-238.)。多价疫苗开发受载体容量及生产成本等限制，而且不常见亚型的保护效果也很难证实，目前国外仍以一价或二价最常见病毒类型疫苗的研究为主，国内对58型感染亦未引起足够重视，迄今国际上进入临床试验阶段的HPV候选疫苗中没有一个是针对58亚型的，这极可能导致相当长时间内进口疫苗在我国不适用，因此，自主开发针对我国国情的HPV疫苗迫在眉睫。目前，治疗性HPV疫苗的研制主要有下列方法(ShreyaKanodia,DianeM.DaSilva,etaLRecentadvancesinstrategiesforimmunotherapyofhumanpapillomavirus-inducedlesionsInt.J.Cancer:2008;122:247-259.)。1、以病毒为载体的疫苗。主要是以痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体，主要优点能引起宿主产生强烈的细胞和体液免疫反应，但以前的感染可能对疫苗的效果产生负面影响。2、以细菌为载体的疫苗。该类疫苗能产生高滴度的抗体，但细胞免疫反应没有以病毒为载体的疫苗效果好。如以李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌或大肠杆菌作为载体的疫苗。3、多肽疫苗。主要优点合成方便，但细胞和体液免疫反应均较弱，并且该类疫苗受到HLA的限制。4、蛋白质疫苗。该类疫苗不受HLA的限制，能产生抗体，为了产生强烈的CTL反应，常需要与其它分子进行耦联，如热休克蛋白或添加佐剂。5、DNA疫苗。主要优点是制备方便、稳定性好，但其安全性值得注意。6、以树突细胞为基础的疫苗。其免疫原性强，但常需要在体外培养，再回输到体内，在肿瘤的治疗中开始被重视。7、肿瘤细胞疫苗或来源于肿瘤细胞成分或肿瘤相关性抗原，或对肿瘤细胞进行修饰。目前HPV疫苗研究存在的主要问题是①如何形成免疫记忆；②如何诱导有效的粘膜免疫；③如何控制生产成本。目前VLP疫苗预防效果好但成本过高，在发展中国家不可能被广泛应用；合成多肽疫苗与DNA疫苗一样，免疫功效较差，即使辅以各种佐剂，仍不能完全预防同型HPV感染或使已生成肿瘤消退，其应用还受MHC-l类分子限制，短期内难有大的进展。相形之下，具有长期、大规模人类接种史的病毒载体疫苗才是目前发展中国家可行性最强的HPV疫苗策略。其中腺病毒载体不但外源基因表达水平高，引起免疫反应强而持久，制备方法成熟，免疫途径方便，还是已知的唯一能诱发有效粘膜免疫的病毒载体，已取代逆转录病毒成为当前应用最广泛的载体。加之近年来复制缺陷腺病毒不断重组改良，其使用安全性已大大增强，用以开发HPV疫苗的条件进一步成熟。治疗性疫苗主要以E6和E7作为靶蛋白，其目的是诱导机体产生特异性细胞免疫反应、清除已感染的HPV、治疗由感染引起的癌前病变和肿瘤。但高危型HPV的E6和E7蛋白是公认的致癌因子，在HPV相关的永生化和致瘤性中起着重要作用。E7蛋白能失活肿瘤抑制蛋白Rb，并有激活端粒酶、活化周期素E和A的作用(MichelN,OsenW，GissmannL，etal.EnhancedimmunogenicityofHPV16E7fiisionproteinshiDNAvaccination.Virology,2002，294:47259.)。E6可通过E6AP-泛素途径降解P53蛋白，使P53蛋白控制的G,/S节点失去控制，导致细胞染色体不稳定和基因突变增加，使外源DNA整合到染色体中的机率大大升高(ZhengZMand.BakerCC.papillomavirusgenomestructure,expression,andpost-transcriptionalregulation.FrontBiosci.2006,11:2286-2302.);同时还可作用于凋亡相关蛋白，抑制细胞凋亡、激活端粒酶、维持端粒长度使细胞永生化。所以，必须去除E6和E7的转化活性才能用于疫苗的构建。研究表明，E6的N端主要与蛋白的稳定性有关，N端发生缺失突变会显著影响蛋白在体夕卜的半衰期(GrossmanSR,MoraR,LaiminsLA.IntracellularlocalizationandDNA~Ifindingpropertiesofhumanpapillomavirustype18E6proteinexpressedwithabaculovirusvectorl,JviroU989,63(l):366-374.)。E6的两个锌指区都是改变病毒转化活性和引起蛋白反式激活所必需的，均与蛋白间的相互作用有关(KandaT,WatanabeS,ZanmaS,etal.Humanpapillomavirustype16E6proteinswithglycinesubstitutionforcysteineinthemetal-bindingmotif.ViroIog，1991,185(2):536-543.)。许多资料证实，E6的C端含有大多数的抗原表位。Nakagawa等详细研究了HPV18型E6蛋白各位点与HEK293细胞转化和p53失活的关系，发现除锌指结构外，L-52突变对其影响也非常显著(NakagawaS，WatanabeS,YoshikawaH，etal.Mutationalanalysisofhumanpapillomavirustype16E6protein:transformingfonctionforhumancellsanddegradationofp53invitro.Virolog,1995,212(2):535-542.)。E7蛋白为全长105个氨基酸残基的酸性蛋白，是HPV18的主要转化蛋白。E7蛋白分为3个功能区1区和2区与腺病毒E1A的第1、2保守区高度同源；3区为锌指区。2区中的"L-X-E-X-C"被认为是结合Rb的关键位点。研究表明，该位点突变可明显降低E7蛋白对猴CA-l细胞系的转化活性，但并不影响人角化细胞的永生化，而锌指区的突变则可完全破坏E7蛋白的转化和永生化能力。E7蛋白可能是以二聚体的形式存在，此二聚体以"Cys-X-X-Cys"基序与Zine结合，l个锌指突变会减弱其与Zine的结合能力、缩短半衰期、降低稳定性、丧失其转化性；而2个锌指突变则彻底失去其与Zine结合的能力、引起半衰期的严重縮短、完全丧失其转化性，并有可能丧失抗原性。此外，有研究报导对HPV16型E7蛋白进行T20V突变，可以提高其所诱导的CTL反应，但不影响E6和E7蛋白的功能活性(SchreursMWJ,KueterEWM，ScholtenKBJ,etal.AsingleaminoacidsubstitutionimprovestheinvivoimmunogenicityoftheHPV16oncoproteinE7(l1—20)cytotoxicTlymphocyteepitope.Vaccine，2005,23:4005.)。
发明内容本发明的一个目的是提供一种转录融合三基因片段。本发明所提供的转录融合三基因片段，包括HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67以及连接三者的短核苷酸片段；所述HPV16mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列8;所述连接HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段为核糖体内部进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)。所述HPV16mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列1;所述HPV18mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列2;所述HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列3，所述核糖体内部进入位点的脱氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。上述转录融合三基因片段的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列5，其中HPV16raE67、HPV18mE67和HPV58mE67均具有起始密码子和终止密码子。含有上述转录融合三基因片段的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为复制缺陷型重组腺病毒表达载体。上述复制缺陷型重组腺病毒表达载体可用于制备预防和/或治疗人宫颈癌的疫苗。含有上述转录融合三基因片段的复制缺陷型重组腺病毒也属于本发明的保护范围。所述复制缺陷型重组腺病毒是用Adeno-X表达系统制备的。本发明的另一个目的是提供人宫颈癌的一种治疗性疫苗，它的活性成分是上述复制缺陷型重组腺病毒。根据我国HPV感染型别的分布特点，选择HPV16、18和58这三个最常见的亚型(涵盖国内80y。以上的宫颈癌HPV感染病例，东南部比例更高)，对影响其转化活性和提高CTL反应的位点进行突变，对E6基因，选择突变其P53结合位点及其中一个锌旨结构；对E7基因，选择突变其Rb结合位点和其中一个锌指，在不影响蛋白稳定性和免疫原性的前提下，彻底去除其转化活性。构建了各亚型HPV的E6和E7蛋白的融合基因，并将其转入腺病毒载体，检测E6和E7蛋白转化活性的去除情况。动物试验结果表明，该疫苗能在细胞中表达，用纯化的腺病毒颗粒直接免疫动物，对已形成的肿瘤有明显的治疗效果，其作用机制主要由于该疫苗能在动物体内产生强烈的CTL反应。图1为HPV16、18和58型E6和E7基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图2为融合基因HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为重组质粒pShuttle2-16mE67-IRES2-18fflE67-工RES2-58mE67被NheI和NotI双酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果图4为转入重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16，18，58raE67的大肠杆菌PCR鉴定结果图5为重组质粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67转染HEK293细胞8天后细胞的形态图6为重组腺病毒的滴度测定结果图7为重组质粒pAdeno-X-HPV16,18mE67-EGFP转染HEK293细胞48h后，转基因细胞的荧光显微镜观察结果图8为重组腺病毒转染HEK293细胞后的WesternBlot检测结果图9为小鼠的成瘤情况图10为小鼠肿瘤体积的测量结果图ll为小鼠存活率的测量结果图12为CTL检测结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.,Russell,DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物及DNA序列如无特别说明均由上海生工合成。实施例1、HPVE6和E7基因的来源及其突变HPV基因组DNA来自深圳市中医院门诊病人(年轻女性)的宫颈刮片标本，PCR扩增，测序后证实为HPV的基因组咖A。以该HPV基因组DNA为模板，分别设计HPV16、18和58型E6和E7基因的特异性引物，扩增HPV16型E6基因的特异性引物为Pl和P2，扩增HPV16型E7基因的特异性引物为P3和P4，扩增HPV18型E6基因的特异性引物为P5和P6，扩增HPV18型E7基因的特异性引物为P7和P8，扩增HPV58型E6基因的特异性引物为P9和PIO，扩增HPV58型E7基因的特异性引物为Pll和P12(具体的引物序列如表l所示)，用DNA聚合酶分别扩增HPV16、18和58型E6和E7基因，并在引物上添加相应的酶切位点，PCR反应体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR反应条件先95。C预变性5min;然后95°Clmin，56°Clmin，72°Clmin，共32个循环，最后72"C延伸lOmin。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体检测结果如图l所示。其中，M为DL2000Marker,泳道1-3分别为HPV16、18和58型E6基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果；泳道4-6分别为HPV16、18和58型E7基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果。结果表明，获得大小为500bp的HPV16、18和58型E6基因和大小为300bp的HPV16、18和58型E7基因。PCR扩增产物经纯化后分别与pMD18Tsimple(购自Takara公司)相连并进行测序，测序结果表明，扩增得到的HPV16、18和58型E6基因的脱氧核糖核苷酸序列与GenBankAccenssionNumberEF029179、EF202153和D90400的序列一致，扩增得到的HPV16、18和58型E7基因的脱氧核糖核苷酸序列与GenBankAccenssionNumberEU430687、EF202153和D90400的序列一致。分别对上述扩增得到的HPV16、18和58型E6和E7基因的与转化活性相关的位点以及能增强细胞免疫功能的部位进行突变，突变后的序列经测序分析证实突变成功，具体的突变方法如下以上述HPV16型E6基因的PCR扩增产物为模板，以PM1和PM2为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-16E6ml;再以pMD18丁-16E6ml为模板，以PM3和PM4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV16mE6。以上述HPV16型E7基因的PCR扩增产物为模板，以PM5和PM6为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-16E7ml;再以pMD18T-16E7ml为模板，以PM7和PM8为弓I物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV16mE7。以上述HPV18型E6基因的PCR扩增产物为模板，以PM9和PM10为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-l犯6ml;再以pMD18T-18E6ml为模板，以PM11和PM12为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV18mE6。以上述HPV18型E7基因的PCR扩增产物为模板，以PM13和PM14为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-18E7ml;再以pMD18T-18E7ml为模板，以PM15和PM16为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV18mE7。以上述HPV58型E6基因的PCR扩增产物为模板，以PM17和PM18为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-58E6ml;再以pMD18T-58E6ml为模板，以PM19和PM20为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV58mE6。以上述HPV58型E7基因的PCR扩增产物为模板，以PM21和PM22为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-58E7ml;再以pMD18T-58E7ml为模板，以PM23和PM24为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连并进行测序，将测序结果正确的PCR产物命名为HPV58mE7。其中，HPV16mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第57位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)，第110位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV16mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第22位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)，第91位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV18mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第52位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)，第68位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，HPV18mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第27〗立的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，第98位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV58mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第50位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G)，第66位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV58mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第26位的谷氨酰胺(E)突变为甘氨酸(G)，第92位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)。表l引物设计扩增引物引物序列突变引物引物序列基因编号(5,-3，)位点编号(5，-3，)l犯6PlGGG7T腦ATGGACCAMAGAGA16E6L57GPM1TTTTCGGGATCGTTGCATAGTATATAGP2TCT藩6"7TCAGCTGGGTT丁CTCPM2GCAAAGTCATATACCTCACGTCGC16E7P3GGC腐C7TCATGGAGATACA16E6C110GPM3TAATTAGG§GTATTAACTGTCAAAAGCCp4GG脇7CrTTATGGTTTCTGApm4ACAAATCACACAACGGTTTGTTGTA16E7L22GPM5ACTGATQ5CTACTGTTATGAGCpm6TGTCTCTGGTTGCAAATCTAAC18E6P5TAC^7TCATGGCGCGCTTTGA16E7C91GPM7AGGAATTGTG蹄CCCATCTGTTCP6CGGGCCTO^CTTCTACTTGTGPM8AGTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCAAAG18E7P7Tff腦CCATGGACCTAAGGl咖L52GPM9CATTTAAAGAT55ATTTGTGGTGTATAGAP8TTT(Tra必TTACTGCTGGGAPM10CAAATTCAAATACCTCTGTAAGTTCCAiV18E6C68GPM11GCATGCCATAAAgGTATAGATTpm12AGCATGGGGTATACTGTCTCTA5犯6P9TTAC腦(JATGTTCCAGGACG18E7C27GPM13GTTGACCTTCTAgGTCACGAGCAP10GGC^477TCACTTGTGTTTGTCPM14CGGAATTTCATTTTGGGGC58E7PUTCtf/W77TAGAGGAAACAACCC丽C98GPM15CTGTCCTTTGTG§GTCCGTGGTGTp12TGCtfara:tgtttattgctgpm16GGTGTTaGAAACAGCTGCTGGAATGP12'TTCmCOK"TGTTTATTGCTG58E6L50GPM17TTGCAGATGGCAGAATAGTGTATAGAGPM18ATACMAGTCATATACCTCAGATCGCTGIRESP13TT6WCCTTACCTCTCCCTC58E6C66GPM19AGTATGTAAAGTGgGCTTACGATTGCP14GCG,77rGGTGGCCATAPM20GCAAATGGATTTCCATCTCTATACACP14'TAC腦tfTGTGGCCATATTATC58E7E26GPM21ATTCTGCTACG^CAM7ATGTGACPM22AGGTCAGTTGCTTCAGGATGTAAATC58E7C92GPM23CATTGTG5GCCCTAGCTPM24GTACATGTGCCCATAAGCA注表中斜体字部分为酶切位点，带下划线部分为突变位点。实施例2、融合基因的获得及mE67基因转化活性去除情况检测一、融合基因的获得用T-Vector载体(购自Takara公司)分别将上述实施例1获得的野生型HPV16的E6和E7基因、HPV18的E6和E7基因、HPV58的E6和E7基因以及突变后的HPV16的raE6和mE7基因、HPV18的mE6和mE7基因、HPV58的mE6和mE7基因相连接，产生融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58raE67，具体的连接方法如下将HPV16E6、HPV16mE6用引物P1、P2进行PCR扩增，HPV16E7、HPV16mE7用引物P3、P4进行PCR扩增，电泳产物分别用进行酶切，回收酶切产物，将HPV16E6与HPV16E7，HPV16mE6与HPV16mE7经历'/wHI酶切后的产物用T4连接酶进行连接，然后以连接产物为模板，以P1和P4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连，将得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV16E67和T-HPV16mE67;同样的方法，将HPV1犯6、HPV18mE6用引物P5、P6进行PCR扩增，HPV18E7、HPV18mE7用引物P7、P8进行PCR扩增，电泳产物分别用进行酶切，回收酶切产物，将HPV18E6与HPV18E7，HPV18mE6与HPV18mE7经&n酶切后的产物用T4连接酶进行连接，然后以连接产物为模板，以引物P5和P8为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连，将得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV18E67和T-HPV18mE67;将HPV58E6、HPV58mE6用引物P9、P10进行PCR扩增，HPV16E7、HPV16mE7用引物Pll、P12进行PCR扩增，电泳产物分别用&0旦进行酶切，回收酶切产物，将HPV58E6与HPV58E7，HPV58mE6与HPV58mE7经fcaI酶切后的产物用T4连接酶进行连接，然后以连接产物为模板，以引物P9和P12为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD18Tsimple相连，将得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV58E67和T-HPV58mE67。对上述得到的含有融合基因的载体T-HPV16raE67、T-HPV18mE67和T-HPV58mE67分别进行PCR、电泳检测，结果如图2所示。其中，1为1^].611￡67PCR产物的电泳检测结果，2为HPV18mE67PCR产物的电泳检测结果，3为HPV58mE67PCR产物的电泳检测结果。对T-HPV16mE67、T-HPV18mE67和T-HPV58mE67质粒进行测序，结果表明HPV16mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列6所示；HPV18mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列7所示；HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列8所示。二、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67基因转化活性去除情况检测1、转基因细胞的获得将上述步骤一获得的融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67用顺el和fe/dil酶切后，分别连入真核表达质粒pIRES2-EGFP(购自BD公司)的Mel和"s/zHI酶切位点间，得到含有融合基因HPV16E67的重组表达载体pIRES2-HPV16E67,含有融合基因HPV18E67的重组表达载体pIRES2-HPV18E67，含有融合基因HPV58E67的重组表达载体pIRES2-HPV58E67，含有融合基因HPV16mE67的重组表达载体pIRES2-HPV16mE67,含有融合基因HPV18mE67的重组表达载体pIRES2-HPV18mE67和含有融合基因HPV58mE67的重会且表达载体pIRES2-HPV58mE67。将上述构建的重组表达载体用脂质体法(详见Lipofectamin2000试剂盒说明)分别转染Balb/c3T3细胞，经G418筛选，得到含有相应基因的细胞克隆。同时以未转入任何真核表达质粒的Balb/c3T3细胞f乍为对照，用以观察去转化活性情况。2、常规体外细胞培养，观察其接触抑制情况将质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67、pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67和pIRES2-HPV58mE67分别转染Balb/c3T3细胞，经G418筛选，得到含有相应基因的细胞克隆。培养上述转基因细胞3天后，进行光镜观察，结果发现，转入质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的细胞呈融合状并重叠生长，提示失去生长接触抑制，而转入质粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的细胞始终存在接触抑制现象。3、软琼脂培养在直径为35mm的塑料培养皿上铺一层0.35%的琼脂，每个培养皿中分别接种5X104个对数生长期的上述步骤1获得的转基因的Balb/c3T3细胞和未转入任何真核表达载体的Balb/c3T3细胞，每种处理5个重复，37°C5%〔02常规培养3周，倒置显微镜下观察集落形成情况。结果表明，在软琼脂培养基上培养2-3周后，转入质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的细胞呈集落性生长，而转入质粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的细胞和未转基因的Balb/c3T3细胞一样，均未见50个细胞以上的集落形成。4、裸鼠体内致瘤实验取Balb/c小鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)，每只小鼠皮下接种5Xl06个上述步骤l的获得的转基因和未转基因的Balb/c3T3细胞，每种细胞接种5只小鼠，观察小鼠皮下成瘤情况。结果表明，接种40天后，用转入质粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的Balb/c3T3细胞接种的小鼠和用未转基因的Balb/c3T3细胞接种的小鼠无一成瘤，而用转入质f立pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2「HPV58E67的Balb/c3T3细胞接种的小鼠有80%皮下成瘤，瘤的平均直径为2.5mm。软琼脂培养和裸鼠体内致瘤实验证明，突变后的三个亚型的mE67基因已经失去E6和E7基因的转化活性，为疫苗的安全使用提供了保障。实施例3、重组腺病毒质粒的构建将上述实施例2构建的HPV16mE67基因经顺el和酶切后与用同样酶切的载体pCDNA3.1(+)相连，产生重组质粒pCDNA3.1(+)16mE67;以质粒pIRES2-EGFP(购自BD公司)为模板，用P13、P14为引物进行PCR扩增，产物分离纯化后得到663bp的IRES2片段，对IRES2片段进行测序，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。将该IRES2片段用和fcoZ[双酶切后连入质粒pCDNA3.1(+)16mE67的^Mil和fcoM酶切位点间，得到重组表达载体pCDNA3.1(+)16mE67-IRES2。将上述实施例2构建的HPV18mE67基因经fcoZI和酶切后与用同样酶切的载体pCDNA3.1(+)相连，产生重组质粒pCDNA3.1(+)18mE67;以质粒pIRES2-EGFP(购自BD公司)为模版，用P13、P14，为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用^棚ffl和Xhol双酶切后连入质粒pCDNA3.1(+)18mE67的万<3/^和Xhol酶切位点，得到重组表达载体pCDNA3.1(+)18mE67-IRES2。然后用fcoM和Z/wI双酶切该pCDNA3.1(+)18mE67-IRES2质粒，回收1471bp的小片段，并将其连入上述pCDNA3.1(+)16mE67-IRES2的fcoM和J力o/位点间，将产生的重组表达载体命名为pCDNA3.1(+)—Kozak16mE67-IRES2-18mE67-IRES2。将上述实施例2构建的HPV58mE67基因用P9、P12'为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经/力o1和双酶切后，与用同样酶切的载体pCDNA3.1(-)(Invitrogen公司)相连，产生重组质粒pCDNA3.1(-)58mE67，然后用顺el和J力。1双酶切上述pCDNA3.1(+)-Kozak16mE67-IRES2-18mE67-IRES2质粒，回收2915bp的小片段，并将其连入上述pCDNA3.1(-)58raE67的Mel和J力ol位点间，将产生的重组表达载体命名为-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。用煱el和iV"I双酶切重组表达载体pCDNA3.1(-)16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67，得到3.7kb的融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。对该融合基因进行测序，测序结果表明，16raE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示。融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67中均去除了HPV16mE6、HPV18mE6和HPV58mE6的E6终止密码子和HPV16mE7、HPV18raE7和HPV58raE7的E7起始密码子，而保留了E6起始密码子和E7终止密码子。以上操作均按常规分子生物学操作规程及TakaraMutanBESTKit(Takara公司)说明进行。将重组表达载体pCDNA3.1(-)16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67经」奶el和他rt双酶切后插入穿梭质粒pShuttle2(购自BD公司)的顺el和船tl酶切位点间，得到重组表达载体pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58fflE67。将重组表达载体pShuttle2-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67用PI-SceI和I-CeuI双酶切(NewEnglandLab公司)，酶切体系如下试剂体积PI-Sce1(1un帥l)2^aI-CeuI(5units/|il)0，重组表达载体pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67(500ng/nl)2|il10xDoubleDigestBuffer3jxllOxBSA3|ildH205(il总体积30jli1将酶切体系混匀后置37'C水浴中精确酶切3h，回收并纯化酶切产物。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示。其中，Ml为DL2000marker,泳道1为重组表达载体pShuttle2-16mE67-IRES2-18raE67-IRES2-58mE67酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，泳道4为空载体pShuttle2酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果，M2为DL15000marker。将回收的含有16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的酶切产物用TakaraligationMixture连入Adeno-X表达系统(购自BD公司)中的Adeno-X病毒DNA中，置PCR仪中16。C连接过夜。将连接产物用Swal酶切消化(Swal酶切位点位于PI-SceI与I-CeuI之间)，以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的基因片段。再次回收酶切产物，将融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为Adeno-X-HPV16，18，58mE67。用重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16,18,58mE67转化大肠杆菌DH5ot，Amp抗性平板挑选阳性克隆，分别以表1中的P3和P4、P7和P8、PU和P12为引物进行PCR扩增，PCR检测结果如图4所示。其中，M为DL2000bp的DNA分子量标准，1为HPV16E7的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，2为HPV18E7的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果，3为HPV58E7的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。提取重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16，18，58mE67的DNA，将所得的重组质粒命名为pAdeno-X-HPV16，18,58mE67。对重组质粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67进行PCR扩增、酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送上海博亚测序。Pacl酶切pAdeno-X-HPV16，18，58mE67用于转染HEK293细胞。实施例4、重组缺陷性腺病毒的制备与滴度的测定一、重组缺陷性腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67的制备用线性化后的重组质粒pAdeno-X-HPV16,18，58mE67转染HEK293细胞，培养转染后的细胞至细胞出现明显的病态效应(cytopathiceffect,CPE)。转染8天后，细胞的具体形态如图5所示。其中，A为转染重组质粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67的HEK293细胞的形态，B为正常HEK293细胞的形态。重组腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67的制备按照Adeno-XExpressionSystemUserManual进行，具体过程如下(1)用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次，直接将HEK293细胞吹打下来(不用胰酶)，1，500rpm室温下离心5min;500^1PBS重悬细胞；(2)-20'C和37'C水浴反复冻融细胞3次，每次融化后短时间混匀细胞悬液；(3)12000rpm室温离心10min，收集含病毒的上清，加入10%甘油，过滤除菌后作为重组病毒原液置-70'C冻存备用；(4)培养服K293细胞，待细胞铺满瓶底50-70%时，加入步骤(3)制备的病毒原液250yl，继续培养；(5)观察细胞的病态效应，待50%以上的细胞从培养板底浮起时，重复上述(1)-(3)步骤制备重组腺病毒rAd-HPV16，18,58mE67，-2Q。C存放，以备测定病毒滴度或进一步制备高滴度病毒用。二、重组缺陷性腺病毒rAd-LacZ的制备将质粒pShuttle2-LacZ(购自BD公司)用PI-SceI和I-CeuI双酶切，酶切产物与经同样酶切的Adeno-X表达系统中的Adeno-X病毒DNA相连，将得到的重会且腺病毒载体命名为Adeno-X-LacZ。提取重组腺病毒载体Adeno-X-LacZ的DNA，将所得的重组质粒命名pAdeno-X-LacZ。用重组质粒pAdeno-X-LacZ转染HEK293细胞，制备重组缺陷性腺病毒rAd-LacZ。重组缺陷性腺病毒rAd-LacZ制备的具体过禾呈同步骤一。三、重组腺病毒rAd-HPV16,18，58mE67的滴度测定因HEK293细胞能表达腺病毒活化的早期蛋白E1和E3，重组质粒pAdeno-X-HPV16，18，58mE67能够在HEK293细胞中进行包装并释放到培养基中，用超高速离心机回收上述步骤一制备的重组腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67，然后用腺病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度，滴度测定结果如图6所示。其中，第1-10列为加入不同浓度重组腺病毒rAd-HPV16,18，58mE67的HEK293细胞，第11和12列为正常的HEK293细胞，灰色孔表示没有产生CPE效应的细胞，CPE孔表示产生CPE效应的细胞。结果表明，病毒滴度为3.2Xl(^pfu/ml。四、荧光显微镜观察重组质粒pAdeno-X-HPV16，18mE67-EGFP(其构建过程同pAdeno-X-HPV16，18，58mE67，用EGFP取代重组质粒pAdeno-X-HPV16，18,58mE67中的HPV58mE67基因)转染HEK293细胞48h后开始，定时观察HEK293细胞表达绿色荧光的情况，估算HPV58mE67的表达强度。400X显微镜下荧光检测结果如图7所示，结果表明HPV58mE67在HEK293细胞中能表达。五、Westernblot检测用上述步骤三纯化的感染复数(MOD为5:l的重组腺病毒rAd-HPV16，18，58mE67感染COS-7细胞，一天后收集细胞，RIPA裂解细胞提取蛋白，分别以小鼠抗人HPV16，18E6单抗(购自Cheraicon公司)、HPV16E7单抗(购自Neomarker公司)、HPV18E7单抗(购自GeneTex公司)和HPV58单抗(购自SantaCruz公司)为一抗，Westernblot检测HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的表达。Westernblot检测结果如图8所示。其中，泳道1、3、5和7表示未转染腺病毒的C0S-7细胞的Westernblot检测结果；泳道2、4、6和8分别表示转染重组腺58mE67的C0S-7细胞用不同抗体检测的Westernblot检测结果。结果表明HPV16mE67和HPV18mE67有较高的表达，但HPV58mE67的表达量较HPV16mE67和HPV18mE67的表达量少，可能存在表达的极性问题。实施例6、动物试验一、抑制肿瘤生长由于TC-1细胞(购自上海肯强生物仪器有限公司)能表达HPV16E6和HPV16E7蛋白，取小鼠在其后腿部上方皮下注射5W05个TC-1细胞，4天后形成肿瘤。小鼠的成瘤情况如图9所示。其中，A为注射TC-1细胞的模型组小鼠，B为没有注射TC-1细胞的对照组小鼠。将已成瘤的小鼠随机分成PBS组、rAd-LacZ组和腺病毒治疗组，每组10只小鼠，PBS组每只小鼠注射pH为7.4的PBS0.2ml，rAd-LacZ组每只小鼠注射l*106pfu的腺病毒rAd-LacZ0.2ml，腺病毒治疗组每只小鼠注射l*106pfu实施例5制备的重组腺病毒rAd-HPV16,18，58mE670.2ml。每周免疫上述各组小鼠一次，连续两周，每两天用游标卡尺测量肿瘤的大小，按公式肿瘤的大小二长*宽*高*0.52计算肿瘤的大小。肿瘤体积的测量结果如图IO所示所示。实验设三次重复，图IO中的数值为三次重复的平均值。结果表明，腺病毒治疗组的小鼠肿瘤生长明显被抑制。二、存活率实验将按照上述步骤一制备的成瘤小鼠随机分成PBS组、rAd-LacZ组和腺病毒治疗组，每组10只小鼠，每周免疫一次，共免疫2次，各组的免疫原和免疫剂量均同步骤一。观察各组小鼠的存活情况。各组小鼠存活率的测量结果如图ll所示。实验设三次重复，图ll中的存活率为三次重复的平均值。结果表明，腺病毒治疗组小鼠42天内的存活率为100%，而作为对照的PBS组和rAd-LacZ组小鼠存活的天数不超过32天。三、疫苗的作用机制研究将上述步骤一的成瘤小鼠随机分成PBS组、rAd-LacZ组和腺病毒治疗组，每组10只小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫3次，各组的免疫原和免疫剂量均同步骤一。六周后，处死小鼠取脾细胞作CTL反应。具体的实验过程如下将各组小鼠脾的单细胞悬浮培养在RPMI1640(GIBCO/BRL)中，补充10%FCS、2mML-谷氨酰胺、lmM丙酮酸钠(GIBCO/BRL)、50,2-巯基乙醇和504g/ral的硫酸庆大霉素(GIBCO/BRL)。用上述实施例1制备的1MMHPV16E7重新刺激脾细胞。一星期后分析各组细胞的裂解活性。以刺激的脾细胞作为效应细胞，以TC-l细胞作为靶细胞，将上述细胞以不同比例50:1、25:1和12.5:1混合，将混合细胞培养在96孔板中，37"条件下5%C02培养箱中培养4小时，然后用BeckmanG5-6R(BeckmanCoulterCanada,Mississauga,ON)以200xg离心5min。从每个孔收集100ul培养上清，用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的活性。乳酸脱氢酶活性的i十算公式为(LDHtest-LDHspont)/(LDHtotal-LDHspont)]x100。公式中LDHtest、LDHspont和LDHtotal分别代表试验孔、自发释放和最大释放。实验设三次重复，具体结果如图12所示。结果表明，腺病毒治疗组能产生强烈的CTL反应，腺病毒治疗组的CTL反应比PBS组和rAd-LacZ组均高。序列表<歸8<210〉1<211〉777<212〉DNA<213〉人工序列<400>1atgcacc犯sagagaactgcaatgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttacc360catttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatattagaatgtgtgtactgc120aagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgggatggttgcatagta180t3ta_ga_g3tgggaatccatatgcagtgtgtgataaatgtttaaeigttttattctaaaatt240agtgagtatagatattattgttatagtgtgtatggaacaacattagaacagc犯tacaac300aaaccgttgtgtgatttgttaattaggggtattaactgtcaaaagccactgtgtcctgaa360gaaaagcaaaga^cgitctggacaaaaagceiaagattccataa^t肪ggggtcggtggacc420ggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacccgtagagaaacccagCtgEL8LgCtt480atgcatgg3geLtacscctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaact540gatggctactgttatgagcaattaaa/tgacagctcagaggaggaagatgaaatagatggt600ccagctggacaagcag朋ccgg3C3gsgcccatta_caM￡ittgtaaccttttgttgcaag660tgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagscattcgtactttgg肪720gacctgttaatgggcacactaggaattgtggggccceitctgttctcagaaaccataa777<210>2<211>798<212>DNA<213〉人工序列<400〉2atggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatctgtgcacggaa60ctgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagacagtat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有明显的治疗效果，其作用机制主要由于该疫苗能在动物体内产生强烈的CTL反应。本发明的疫苗可以用于治疗由HPV感染所致的肿瘤。文档编号A61K39/12GK101280316SQ20081011276公开日2008年10月8日申请日期2008年5月26日优先权日2008年5月26日发明者骏万,杨峥嵘,义郑,马原栋,黄来强申请人:清华大学深圳研究生院