专利名称：：改善肠道小型生物群的合益素的制作方法
技术领域：
：本发明涉及向剖宫产术^H免的婴儿施用特定的合益素混合物，即，益生菌(probiotic)和絲，其能够促进早期的狄杆菌促进性(bifidogenic)肠道小型生物群。发明的背景婴儿出生前的胃肠道一般认为是无菌的。在出生的正常过程中，婴儿的胃肠道遭遇来自母亲的消化道、皮肤和环境的细菌，并且这些细菌开始建群。健康、阴道M、母乳喂养的2-4周大嬰儿的粪便小型生物群可作为此年龄段最优化的小型生物群，其中双歧杆菌属物种占优势地位，带有一些乳杆菌属物种和更少量诸如脆弱拟杆菌(5a"肌V^^yhig/to)等的拟杆菌属物种，而没有诸如梭状芽孢杆菌属(Clostridia)等潜在病原菌。在大约两岁完全断奶以后，开始建立类似成年A^式的肠道小型生物群模式。应注意的是，在健康、阴道分娩、母乳喂养的婴儿中，双歧杆菌属物种形成小型生物群的基础，占婴儿肠道中全部细菌的60-90%。母乳喂养也促进了肠道屏障的发育，与占优势地位的双歧杆菌属物种一起增强了所摄取营养的吸收并因此增强其利用。Gronlimd等已经研究了剖宫产术出生的健康嬰儿的粪便小型生物群，并将其与阴道^t出生的婴儿对照組比较。他们得出结论剖宫产术^L出生的婴儿的肠道菌群可被扰乱至出生后六个月。他们特别注意到在剖宫产术组中^L杆菌属物种和乳杆菌属物种的建群水平分别只在一个月和十天后达到阴道分娩組的建群7JC平(Gronlund等人，"FecalMicroflorainHeathyInfantsBornbyDifferentMethodsofDelivery:PermanentChangesinIntestinalFloraAfterCesareanDelivery",JournalofPediatricGastroenterologyandNutrition,28:19-25)。其它工作已经提示上述延迟的/异常的建群对嬰儿的后续发育可具有特定的影响，并且已经将这些效果与肠道菌群的差异相联系。例如，Laubereau等人发现，剖宫产术出生的婴儿具有比阴道分娩的婴儿更大的腹玛风险(Laubereau等人，CaesareanSectionandgastrointestinalsymptoms,atopicdermatitisandsensitisationduringthefirstyearoflife",ArchDisChild2004;89:993-997)。Negele等人发现，直到2周岁，剖宫产M都是喘鸣和对食物过敏原的过敏性敏化的额外风险因子(Negele等人，"Modeofdeliveryanddevelopmentofatopicdiseaseduringthefirst2yearsoflife"PediatrAllergyImmunol2004:15:48-54)。还提示系统性低度炎症和亚优化肠道小型生物群还可涉及肥胖的发展(FantuzziG."Adiposetissue,adipokines，andinflammation"JAllergyClinImmunol.2005;115:911-919，；BackhedF，DingH，WangT等人，"Thegutmicrobiotaasanenvironmentalfactorthatregulatesfatstorage"ProcNatlAcadSciUSA.2004;101:15718-15723)。对所有的婴儿都建议使用母乳。但是，在某些情况下，由于医学原因母乳喂养不足或不成功，或者母亲选择不进行母乳喂养。针对这些情况目前已经开发了嬰儿配方乳。最近，已发现人们如果摄取某些菌林的话，这些菌林会呈现有价值的性质，这已引起了相当的重视。具体来说，已发现乳杆菌属和双歧杆菌属的特定菌林能够在肠道建群，降低病原菌贴附肠上皮的能力，具有免疫调节效应并且能够协助维持健康状态。有时候这样的细菌被称为益生菌，并且已经提出将适宜的益生菌加入到嬰儿配方乳中。已经进行了广泛的研究来鉴定新型益生菌株。例如，EP0199535、EP0768375、WO97/00078、EP0577903和WO00/53200公开了乳杆菌属和双歧杆菌属的特定菌林及其有益效果。近期，表达了对于向作为最初六个月龄嬰儿的单一营养物源的婴儿配方乳(formula)添加益生菌的一些关注。这些关注总结在营养学ESPGHAN协会的名为"ProbioticBacteriainDieteticProductsforInfants"的医学类文献中(JournalofPaediatricGastroenterologyandNutrition,38:365-374)。向食品中添加益生元是促进结肠中有益细菌的数量和/或活性增长的另一种方法。益生元是不易消化的食品成分，其通过选择性的刺激结肠中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性来有益的影响宿主，从而增进宿主健康。此类成分是不易消化的，因为其在胃或小肠中不能被分解和吸收，从而可以完整的通过并到达结肠，在此处由有益细菌选择性的进行发酵。益生元的例子包括某些^t，例如果^t(FOS)和半乳M(GOS)。已知人乳比大多数其它动物乳含有更大量的不能消化的^i瞎。事实上，不能消化的S^代表了母乳中第三大固体成分(在乳糖和脂类之后)，初乳中存在的浓度是12-15g/1，成熟乳汁中以5-8g/l存在。人乳^瞎非常耐受酶水解，表明这些S^可以显示出与其热量值不直接相关的关键性功能。由于对人乳的组成已经有更好的了解，已经建议将益生元添加到嬰儿配方乳中。多种补充了益生元例如果寡糖和半乳^t混合物的嬰儿配方乳是可商购的。但是，此类混合物只是粗略的近似人乳中的^t混合物。在人乳中已经检测到超过100种不同的寡糖成分，其中一些至今尚未在动物乳例如牛奶中检测到，或仅检测到少量。仅以非常小的量存在与牛奶和初乳中或者完全不存在的人乳寡糖的实例是唾液酸化和岩藻糖基化的寡糖。对生产婴儿配方乳的持续呼声还已经建"R嬰儿配方乳既含有益生菌又含有益生元，其尽可能的复制接近人乳的组成和效果。例如在WO2005/000748中，建议在婴儿配方乳中补充短^L杆菌菌林、半乳寡糖和果S^瞎(菊粉)的混合物。它声称，被描述为合益素的该混合物，调节婴儿结肠中的双歧杆菌种群，使补充配方乳适合更"嬰儿样"的群体消费，即，更少的链状)ML杆菌(5析^6flcte/7'Mmcflte""/W"w)、假链状双歧杆菌(c)和青春双岐杆菌(5折^^""/附afto/^c柳泡)物种，而更多的嬰儿双岐杆菌菌(5折甴6fl"enV/附/卵gw附)物种。还陈述了混合物可用于预防和治疗免疫病况。肠道小型生物群在以下作用中扮演了重要的角色，所述作用即将不消化的寡糖和多糖水解为可吸收的单糖，以及通过直接作用于绒毛上皮激活脂蛋白脂肪酶。此外，近日还证实人乳不仅含有WI,还含有双歧杆菌。同时，基因组研究已经有力的显示，母乳喂养的嬰儿的肠道中存在的M杆菌，例如长X5U^杆菌，是特别装备以利用母乳^t作为营养物的。长双歧杆菌还适应大肠内的环境，其中进行着从可緩慢吸收的碳水化合物收获能量。简而言之，出现了越来越多的证据提示，在生命早期建立正确的肠道小型生物群对后续的健^iJtAA重要的。同时，剖宫产M的比例持续增高，在一些国家达到了总出生的70%。因此很明显存在这样的需求，即提供一种方式来促进在非自然出生的婴儿中快速建立适当的肠道小型生物群。考虑到目前的实践是向接受电子剖宫产分娩的孕妇常规施用预防剂量的抗生素，因而上述需求是特别迫切的。发明概述如上所述，在健康的、阴道^JL乳汁喂养的嬰儿中，X3U^L杆菌构成了小型生物群的基础，占嬰儿肠道总细菌的60-卯％。在此类婴儿中主要发现的X5U^杆菌种是短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、嬰儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)和长^J^t杆菌(Bifidobacteriumlongum)。本发明人已经令人惊讶的发现，将特定乳杆菌亚种，即鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)的益生菌林,与##;昆合物的共同施用，协同的促进剖宫产术^t的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群的发育，其中，所述M混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化寡糖，20-卯wto/o的至少一种中性寡糖，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal,3Gal(31，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi，4GIc，所述中性寡糖选自Gaipi,6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Glc、Galpl，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3GaljJl，3Glc、Gaipi，3Gal卩l，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gal卩l，4Glc、Gaipi，6Gal卩l，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gal卩l，6Gaipi，4Glc和Gaipi，3Galpl，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2,6Gal卩l,4Glc。因此，本发明提供了鼠李糖乳杆菌的益生菌林与^l混合物在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于促进剖宫产术分娩的婴儿中的早期M杆菌促进性肠道小型生物群的发育，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt。/o的至少一种N-乙酰化^t，20-卯wt。/。的至少一种中性^t，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的^t，所述N-乙酰化S^选自GalNAcal，3Galpl，4Glc和Galpl，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc,所述中性寡糖选自GalJ51，6Gal、GalJ31，6Galj31，4Glc、GalJ31，6Gal卩l，6Glc、Gaipi，3Gal卩l，3Glc、Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gaipi，6Gaipi，4Glc和Gaipi，3Gaipi，3Gal(51，4Glc,所述唾液酸的寡糖选自NeuAca2,3Gaipi，4Glc和NeuAca2,6Gal卩l，4Glc。本发明还提供了鼠李糖乳杆菌的益生菌林与^t混合物在生产药物或治疗性营养組合物中的用途，所述药物或组合物用于降低在剖宫产术M的婴儿中后来出现过敏反应的风险，其中，所述S^混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt。/o的至少一种中性^瞎，以及5-50wtVo的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal,3Gaipi，4Glc和Galpl，6GalNAcal,3Gaipi,4Glc,所述中性S^t选自Gaipi，6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3Gaipi，3GIc、Gal(31，3Gal(51,4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gal(51，4GIc、Gaipi，6Gaipi，3Gal卩l，4Glc、Gal(il，3Gaipi，6Galpl,4Glc和Gaipi，3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4GIc和NeuAca2，6Gaipi，4Glc。在另一个方面，本发明提供了鼠李糖乳杆菌的益生菌林与##混合物在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或組合物用于预防或治疗剖宫产术M的嬰儿的腹泻，其中，所述S^混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化S^瞎，20-90wt。/o的至少一种中性S^瞎，以及5-50wt0/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Galpl，4Gk和Gaipi，6GalNAcal，3Gal(il,4Glc，所述中性絲选自Gaipi，6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Gk、Gaipi，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3Gaipi，3Glc、Gaipi，3Gal卩l，4Glc、Gal卩l，6Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gaipi，6Galpl，4Glc和Ga职，3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2,6Gaipi，4Glc。本发明^至促进剖宫产术^t的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群的发育的方法，包括向剖宫产术出生的婴儿和具有相同需要的婴儿提供治疗量的鼠李糖乳杆菌的益生菌林与S^混合物，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化S^t，20-卯wt。/。的至少一种中性M，以及5-50wty。的至少一种唾液酸化的^1，所述N-乙酰化S^选自GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi,4Glc，所述中性寡糖选自Galpl,6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Gle、Gal(51，6Gaipi，6Gle、Galpl，3Gaipi，3Glc、Gaipi，3Gal卩l，4Glc、Gal卩l，6Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Galpl，3Gaipi，6Gaipi，4Glc和Gaipi，3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Galpl，4Glc和NeuAca2，6Gal卩l，4Glc。本发明还逸艮至减少由剖宫产术分娩的嬰儿将i^iL^过敏反应的风险的风发，包括向剖宫产术出生的婴儿和具有相同需要的嬰儿提供治疗的鼠李糖乳杆菌的益生菌林与寡糖混合物，其中，所述寡糖混合物包括5-70wto/。的至少一种N-乙酰化S^，20-90wt。/o的至少一种中性^t，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc，所述中性S^t选自Galpl，6Gal、Gal(51,6Gaipi，4Glc、Gal卩l，6Galpl，6Glc、Gaipi，3Gal卩l，3Glc、Gal卩l，3Galpl，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gal(51，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gaipi，6Galpl，4Glc和Gaipi，3Gal卩l，3Gaipi，4Glc,所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2，6Gaipi，4GIc。本发明还l艮至预防或治疗剖宫产术M的嬰儿的腹泻的方法，包括向剖宫产术出生的嬰儿和具有相同需要的嬰儿提供治疗量的鼠李糖乳杆菌的益生菌林与S^t混合物，其中，所述S^混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙跣化l^瞎，20-卯wt。/。的至少一种中性寡糖，以及5-50wt。/o的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi,6GalNAcal，3Gaipi，4Glc，所述中性寡糖选自Gaipi，6Gal、Galpl，6Gal卩l，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gk、Galpl，3Gaipi,3Glc、Gal卩l，3Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Galpl，4Glc、Galpl，3Galpl，6Gaipi，4Glc和Gaipi,3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAcot2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2，6Gaipi,4Gk。不希望受限于理论，本发明人认为，向剖宫产术出生的婴儿施用鼠李糖乳杆菌的益生菌林与^t混合物，以尚未完全了解的一些方式引发嬰儿的胃肠道，使其有利于由通常在健康的、阴道M嬰儿的胃肠道中发现的双歧杆菌的那些物种进行的随后的建群，其中，所述寡糖混合物包括5-70wty。的至少一种N-乙酰化^瞎，20-90wt。/o的至少一种中性寡糖，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gal(51，4Glc，所述中性^t选自GalfH，6Gal、Galpl，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3Galpl，3Glc、Gal卩l，3Galpl，4Gk、Gaipi，6Gal(31，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gal卩l，3Galpl，6Galpl，4Glc和Gal(31，3Gaipi^Gall31，4Glc,所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2，6Gaipi，4Glc。认为该有利的建群降低了腹泻发作的风险，所述腹泻例如已经显示出影响剖宫产术分娩的嬰儿。还认为有利的建群降低了后续出现过敏反应的风险，例如表现为喘鸣和/或对食物过敏原的敏化(sensitisation)。应该注意，此类治疗的目标或效果不是促进益生的鼠李糖乳杆菌自身的建群，而是促进用其他种的建群，从而实现与健康的、母乳喂养的、阴道分娩嬰儿的肠道中发现的相当的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群。附图的筒要说明图l显示了在治疗的第14天，用人类婴儿小型生物群管饲的限菌小鼠的粪便和样品中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)计数；和图2显示了在治疗的第14天，用人类婴儿小型生物群管饲的限菌小鼠的粪便样品中的短^ML杆菌和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)计数；发明的详细说明在本i兌明书中，下列术语具有下列含义"早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群，，是指至多12月龄的婴儿的肠道小型生物群，其中双歧杆菌属占优势地位，例如短双歧杆菌(忍zy7rfo6flcte/7.M附6feve)、嬰^Li"5^L杆菌(丑iy^;toAfl"e""附Z"/a"rfs)和长双歧杆菌(5诉r;to6flcteWii附/owgM/w)，并排除诸如梭状芽孢杆菌属(Clostridia)和链球菌(Streptococci)等可估计的菌群，这种早期X5U^杆菌促进性肠道小型生物群与同龄的阴道分娩且母乳喂养的婴儿中发现的相当。"嬰儿"是指12个月以下的孩子；"益生元(prebiotic)"是指一种不可消化的食品成分，其通过选择性刺激一种或限制数量的细菌在结肠中的生长和/或活性来对宿主产生有益影响，从而改善宿主健康(GibsonandRoberfroid"DietaryModulationoftheHumanColonicMicrobiota:IntroducingtheConceptofPrebiotics"J.Nutr125:1401-1412)。"益生菌"是指对宿主的健康或良好状态有有益效果的微生物细胞制品或微生物细胞成分。(SalminenS,OuwehandA.BennoY.等人"Probiotics:howshouldtheybedefined"TrendsFoodSciTechnol.1999:10107-10);如无特殊说明，所有提及的百分数都是重量百分数。合适的益生鼠李糖乳杆菌菌林包括除可从芬兰ValioOy等处获得的商标为LGG的鼠李糖乳杆菌ATCC53103,和鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724。合适的每日剂量是10e5至10e"菌落形成单位(cfu)，更优选的10e至10e10cfu。益生的鼠李糖乳杆菌与寡糖混合物共同施用，所述寡糖混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wto/。的至少一种中性寡糖，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Gal(51，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi，4GIc，所述中性^t选自Gaipi，6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3Ga叫3Glc、Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gaipi，6Gaipi，4Glc和Gaipi，3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2，6Gaipi，4Glc。此类S^混合物更详细的描述在WO2007/090894中，其内容通过引用整合到本文中，并在后文中称为"上述S^t混合物"。术语共同施用既包括同时施用益生的鼠李糖乳杆菌和^t混合物，又包括先后施用鼠李糖乳杆菌和S^混合物。优选上述^t混合物包含10-70wt。/。的特定N-乙酰化寡糖、20-80wt%的特定中性絲和10-50wt。/。的特定唾液酸化的(sialylated)絲。更优选的混合物包含15-40wt。/。的N-乙酰化S^瞎，40-60wt。/o的其他中性S^和15-30wt。/。的唾液酸化的S^。特别优选的混合物是30wt。/。的N-乙酰化寡糖、50wt。/。的中性^瞎和20wt。/。的唾液酸化的^瞎。可选地，上述^t混合物可适宜包含5-20wty。的特定N-乙酰4C、60-90wt。/。的特定中性》瞎和5-30wt。/。的特定唾液酸化的寡糖。上述M混合物可以从一种或多种动物乳制备。该乳可以来自任何哺乳动物，特别是牛、山羊、水牛、马、大象、骆駝或绵羊。可选的可以通过购买和混合单个组分来制备上述^t混合物。例如，合成的半乳勤奮，例如商标为Vivinal@和Elix，or⑧的Gaipi，6Gal卩l，4Glc、Gal卩l，6Gaipi，6Glc、Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gal卩l，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc和Gaipi，3Gaipi，6Gal卩l，4Glc及其混合物是可商购的。其它^4I供应商是DextraLaboratories,Sigma-AldrichChemieGmbHKyowaHakkoKogyo公司。可选的，可以使用特定的糖基转移酶例如半乳糖基转移酶来生产中性寡糖。可以通过氨基葡糖苷酶和/或氣基半乳糖普酶对N-乙酰基-葡萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用来制备N-乙酰化S^瞎。相同的，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或N-乙酰基-糖基转移酶也可以用于该目的。还可以通过使用不同的酶(重组的或天然的)的发酵技术和/或微生物发酵来生产N-乙酰化f^t。在后一种情况下，微生物可以表达它们的天然的酶和底物，或者可以被改造为生产不同的底物和酶。可以使用单个微生物培养物或混合培养物。可以从DP=1起始的任何聚合度(DP)开始，通过接纳体底物开始N-乙酰化S^形成。另一个选择是从游离或与寡糖(例如，乳酮糖)结合的己酮糖(例如，果糖)化学转换为N-乙酰己糖胺或含有^瞎的N-乙酰己糖胺，如Wrodnigg，T.M.;Stutz，A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38:827-828中描述的。可以通过色镨或过滤技术从天然来源例如动物乳中分离唾液酸化的寡糖3，唾液酸-乳糖和6，唾液酸-乳糖。可选的，可以通过使用特定的唾液酸转移酶的生物技术来生产它们，所述生物技术或者是通过基于酶的发酵技术(重组的或天然的酶)或者是通过微生物发酵技术。在后一种情况下，微生物可以表达它们的天然的酶和底物，或者可以被改造为生产不同的底物和酶。可以使用单个微生物培养物或混合培养物。可以从DP-1起始的任何聚合度(DP)开始，通过接纳体底物开始唾液酸*#形成。其它益生菌可以与益生的鼠李糖乳杆菌一起施用。可以使用具有已确立的益生特征的任何乳酸菌或双歧杆菌。合适的益生乳酸菌包括可从Biogaia获得的路氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)ATCC55730或类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CNCM1-2116,合适的益生双歧杆菌菌林包括乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)CNCM1-3446，由丹麦的ChristianHansen公司等以商标Bb12销售；长X5UL杆菌ATCCBAA画999，由日本的MorinagaMilkIndustryCo.Ltd以商标BB536出售；由Danisco以商标Bb-03出售的短^t杆菌菌株；由Morinaga以商标M-16V出售的短双歧杆菌菌林；和由InstitutRosell(Lallemand)以商标R0070出售的短双歧杆菌菌林。可以使用乳酸菌和双歧杆菌的混合物。优选的在M后立即向嬰儿施用益生的鼠李糖乳杆菌和上述S^混合物，及其后至少在婴儿生命的前2个月施用。更优选的，持续施用直到嬰儿达到6月龄。可以以婴儿配方乳方^更的施用益生的鼠李糖乳杆菌和上述絲混合物。根据本发明所4吏用的嬰儿配方乳可以以不超过2.0g/100kcal，优选1.8-2.0g/100kcal的量包含蛋白质源。相信蛋白质类型对于本发明并不关键，只要满足必需氨基酸的最小需求量并且能够保证满意的生长即可，但是，优选其中超过50wt。/o的蛋白质源是乳清。所以，可以使用基于乳清、酪蛋白及其混合物的蛋白质源，和基于大豆的蛋白质源。就乳清蛋白质来说，蛋白质源可以基于酸乳清或甜乳清或其混合物，而且可包括以任何所需比例存在的a-乳清蛋白和p-乳球蛋白。蛋白质可以是完整的或水解的或完整和水解蛋白质的混合物。优选提供部分水解的蛋白质(水解度2-20%),例如对于相信有发生牛奶过敏反应风险的婴儿。如果需要水解的蛋白质，可以根据需要如本领域已知进行水解过程。例如，乳清蛋白质水解物可以通过在一个或多个步骤中酶水解乳清组分来制备。如果用作起始材料的乳清组分基本不含乳糖，那么发现蛋白质在水解过程中会遇到非常少的赖氨酸阻断(lysineblockage)。这使得赖氨酸阻断的程度从总赖氨酸的大约15wt。/。降低至少于赖氨酸的约10wt%;例如大约7wt。/。的赖氨酸，这大大提高了蛋白质源的营养质量。该嬰儿配方乳可包含碳7jc化合物源。可以使用任何常规用于嬰儿配方乳中的碳7K化合物源，例如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉及其混合物，但是优选的碳7K化合物源为乳糖。优选该碳7jC化合物源贡献该配方乳总能量的35-65%之间。该嬰儿配方乳可包含脂类源。脂类源可以是适用于婴儿配方乳的任何脂或脂肪。优选脂肪源包括棕榈油酸甘油酯、高油酸葵花籽油和高油酸红花油。如可以加入含有大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的小量油类，例如鱼油或微生物油一样，也可以加入必需脂肪酸亚油酸和a-亚麻酸。总的来i兌，优选脂肪含量例如贡献该配方乳总能量的30-55%。优选脂肪源中n-6脂肪酸与n-3脂肪酸的比例为大约5:1至大约15:1，例如大约8:1至大约10:1。该嬰儿配方乳也可以以营养显著量包^S人为对于日常饮食必须的所有维生素和矿物质。已经确定了对某些维生素和矿物质的最低需求。任选地存在于嬰儿配方乳中的矿物质、维生素和其他营养物质的例子包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、尼克酸、生物素、泛酸、胆喊、钾、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸、和L-肉碱。矿物质通常以盐的形式加入。特定矿物质和其他维生素的存在和量根据所针对的婴儿人群改变。根据需要，该婴儿配方乳可包含乳化剂和稳定剂，例如大豆卵磷脂、甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯等等。优选该婴儿配方乳含有上述*#混合物，含量为每升重构的配方乳中0.2-5克，优选l-2克/升。该嬰儿配方乳可任选地包含具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。上述的婴儿配方乳和营养配方乳都可以以任何适宜的方式制备。例如，可以通过将蛋白质、碳水化合物源和脂肪源以合适比例共混制备。此时，如果使用，可以包括乳化剂。此时，可以加入维生素和矿物质，但是通常后加入，以避免热降解。任何亲脂维生素、乳化剂等可在共混前溶解入脂肪源中。然后，将水，优选经过反渗透的水混合进入，以形成液体混合物。水温适宜为大约50至大约80°C，以协助上述成分的介軟。可用可商购的液化剂形成上述液体混合物。然后将该液体混合物均质化；例如在两阶段中均质化。然后可热处理液体混合物以减少细菌的携带，例如通过快速加热液体混合物至大约80至大约15(TC大约5秒至大约5分钟。这可以通过蒸汽注入、高压灭菌或热交换器进行，例如平板热交换器。然后，可以将液体混合物冷却至大约60-大约85°C，例如通过瞬时冷却。然后再次将液体混合物均质化，例如在两个阶段中均质化，第一阶段大约10MPa-大约30MPa，第二阶段大约2MPa至大约lOMPa。然后均质化的混合物可以进一步冷却，以加入任何热敏感的成分，例如维生素和矿物质。此时可以适宜调节均质化混合物的pH值和固体含量。将均质化的混合物转移至适宜的干燥装置中，例如喷雾千燥器或冻干机中，变成粉末。这些粉末应该具有少于大约5wt。/。的含湿量。可以根据任何合适的方法培养益生的鼠李糖乳杆菌，并制备其，以用于添加到营养配方乳或嬰儿配方乳中，例如通过冷冻干燥或喷雾干燥。可选的，从芬兰ValioOy购买商标为LGG的鼠李糖乳杆菌ATCC53103，其已经被制备成用于向食物产品添加的合适形式，例如营养配方乳或嬰儿配方乳。配方乳添加的益生鼠李糖乳杆菌的量是在10e3至10e12cfu/g粉末之间，更优选的在10e7至10e12cfu/g粉末之间。本发明将通过参考下列实施例进行进一步说明实施例1本发明将使用的合适的嬰儿配方乳组合物的实例显示如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>生物素(jig)2.215胆碱(mg)1067Fe(mg)1.28I(照)15100Cu(mg)0.060.4Zn(mg)0.755鼠李糖乳杆菌ATCC531032.1()7cfu/克粉末，活菌实施例2该实施例将具有寡糖成分的鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724对剖宫产^L的限菌小鼠模型建立早期M杆菌促进性肠道小型生物群的影响(其中所述寡糖成分包括N-乙酰化寡糖，中性寡糖和唾液酸化的寡糖(后文称为CMOS-GOS))，与单独的益生菌和单独的^t混合物，以及对照进行了比较。该模型是剖宫产分娩出生婴儿的合适的动物模型，具有在M杆菌群体方面的亚优化的肠道小型生物群。除了对X5U^杆菌群体大小的观察外，该模型还适合躍J宗双歧杆菌作为抗潜在病原菌(如产气荚膜梭状芽胞杆菌)的屏障的有利效果。材料和方法从CharlesRiverLaboratoriesFrance购买了无菌的C3H雌性和雄性小鼠，并在运输隔离器中船运至Nestle研究中心。在控制了无菌状态后，将动物转移至饲育隔离器中。该研究使用该繁殖群体的雌性后代。动物随后随机分入4个研究组之一A，对照餐和对照饮用物；B，补充3%*#混合物的对照餐和对照饮用物；C,对照餐和益生的鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724的饮用物；D，补充3%*#混合物的对照餐和含有益生的鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724的饮用物。动物保持在2个不同的隔离器中，每笼各5只。组A和B保持在一个隔离器中，组C和D保持在另一个隔离器中，从而避免与研究后期的鼠李糖乳杆菌交叉污染。每周以新鲜收集的来自每个笼子的一个动物的粪便来监控无菌状态。在该期间，用AIN-93^ftl餐饲喂动物。在7-8周龄时，按2只动物/笼，重新进行无菌控制，然后每只动物接受管饲单剂量的200nl人幼儿微生物混合物(HBF),如表1所述。同一天，饮食改变为AIN-mix(组A和C)或AIN-CMOS-GOS(组B和D)，饮用水改变为含有0.5%(v/v)MRS的盐7jC饮用水(组A和B)或含有0.5%(v/v)MRS和终浓度为2xl(^cfu/ml鼠李糖乳杆菌的盐7jC饮用水。将该天计为第-l天。第二天(本文中认为是第0天)，收集各动物的新鲜粪便，然后立即通过平板计数进行小型生物群分析。从工业去蛋白化和去矿质的乳清渗透物(LactoserumFrance,France)开始制备了富含牛乳*#的样品(CMOS)。简而言之，在配备了电子透析模块和阴离子-和阳离子-交换器(LactoserumFrance)的工业去矿质线上，将超滤的牛乳乳清渗透物去矿质。然后，将去矿质的乳清渗透物经过2次连续工业乳糖结晶循环，然后进行喷雾干燥(LactoserumFrance)。将获得的粉末状修饰的母液以30%(w/v)溶解在水中，经过活性先來然后是0.22jim滤器(Millipore)过滤进行澄清。将获得的滤液上样至已制备的Bio-GelP2(BioRad)柱(50x850mm)上，用流速为2ml/min的20mM碳酸氢铵(NH4HC03)运行。收集含有寡糖并在乳糖之前洗脱的级分，混合并冻干。冻干的痴瞎与商购的半乳糖基-絲(VivinalGOS，DOMOFrieslandFoods)混合，获得终混合物，其含有约9wt。/。N-乙酖化S^，约85wt0/。中性寡糖和约6wt。/。唾液酸化的寡糖。将该CMOS-GOS成分掺入到AIN-93半合成的啮齿类餐中，产生终寡糖含量为3wt%。对照AIN-93餐补充了葡萄糖和乳糖，来对照通过使用的原料而引入CMOS-GOS餐中的葡萄糖和乳糖。从Nestle培养物收集中心(NestleCultureCollection)制备鼠李糖乳杆菌。简而言之，将NCC4007重活化，在MRS(ManRogosaSharpe)培养基中生长至约4-5xl0eScfu/ml。然后，在其棘的MRS培养基中离心来浓缩鼠李糖乳杆菌，并用新鲜的MRS培养基稀释至4xl0e、fu/ml。然后，将鼠李糖乳杆菌分为lml等分试样，将其在-80"C冷冻直到使用。各第1天，将lml在MRS中的新鲜解冻的等分试样鼠李糖乳杆菌，或lmlMRS(用于无鼠李糖乳杆菌的组)引入隔离器中，溶解在200ml盐水内，等分为4个饮水瓶。在平均消耗5ml/天/小鼠下，具有益生元的组的每只动物每天接受约10e8cfu鼠李糖乳杆菌。在第14天收集粪便样品并平板计数分析。简而言之，对于每只小鼠，将1个粪l更团块在补充了0.05%(w/v)L-半胱氨酸(HC1)的0.5mlRinger溶液(Oxoid，UK)中均质化，将不同稀释度的细菌溶液在选择性和半选择性培养基上涂板，用于计数特定的微生物体M杆菌在EugomTomato培养基，乳杆菌在补充了抗生素(磷霉素(phosphomycine)、磺胺甲^悉唑(sulfamethoxazole)和曱氧千咬(trimethoprime))的MRS培养基，产气荚膜梭状芽胞杆菌在NN-琼脂培养基上，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在Drigalski培养基上，以及拟杆菌属(Bacteroides)在ShaedlerNeoVanco培养基。在37X:有氧条件下孵育平板24小时，用于计数肠杆菌，在厌氧条件下孵育48小时，用于计数X5U^杆菌、乳杆菌、拟杆菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌。表l-小型生物群组成菌林平板上的菌落表型施用浓度log(cfu/ml)短双歧杆菌NCC452(viv4)白色，大<2长双歧杆菌NCC572(viv5)灰色，小<2金黄色葡萄球菌白色，大7.0<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>结果图l显示了在用HBF管饲组A、B、C和D两周后，粪便中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)计数。可见虽然在组B和D中，金黄色葡萄球菌的计数降低，在组C和D中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数降低；但是仅在组D中发现了两种病原体都显著降低。图2显示了在用HBF管饲组A、B、C和D两周后，粪便中的短X5^杆菌和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)计数。可见在组D中，两种物种(在阴道M、乳汁喂养的婴儿中一般占优势的肠道小型生物群)构成了比其它组更高的小型生物群的比例。总而言之，上述结果表明，益生的鼠李糖乳杆菌和*#混合物在促进双歧杆菌建群，和防止金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭状芽胞杆菌建立显著的群体中显示出协同效应。权利要求1、鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于促进剖宫产术分娩的婴儿中的早期双歧杆菌促进性肠道小型生物群的发育，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。2、鼠李糖乳杆菌的益生菌林与*#混合物在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于降低在剖宫产术分娩的婴儿中后来出现过敏反应的风险，其中，所述S^混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt。/。的至少一种中性勤象，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc，所述中性寡糖选自Gaipi，6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gal卩l，6Gal卩l，6Glc、Galpl，3Gaipi，3Glc、Ga叫3Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gal卩l，6Gaipi，4GIc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gaipi，6Gaipi，4Glc和GalJ31，3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi,4Glc和NeuAca2，6Gaipi，4Glc。3、鼠李糖乳杆菌的益生菌林与S^混合物在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物用于预防或治疗剖宫产术M的嬰儿的腹泻，其中，所述S^混合物包括5-70wt。/。的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt。/。的至少一种中性S^，以及5-50wt。/。的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcal，3Gaipi，4Glc和Gaipi，6GalNAcal，3Gaipi，4Glc，所述中性寡糖选自Gal卩l，6Gal、Gaipi，6Gaipi，4Glc、Gaipi,6Gaipi，6Glc、Gaipi,3Gaipi，3Glc、Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gal(51,6Gal卩l，6Gaipi，4Glc、Gaipi，6Gaipi，3Gaipi，4Glc、Gaipi，3Gaipi，6Gaipi，4Glc和Gaipi，3Gaipi，3Gaipi，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAca2，3Gaipi，4Glc和NeuAca2，6Gaipi，4Glc。4、权利要求l-3中任一项用途，其中益生的鼠李糖乳杆菌是鼠李糖乳杆菌ATCC53103或鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724。5、任一上ii^L利要求的用途，其中所述S^混合物包括10-70wt。/o的N-乙酰化S^，20-80wt。/。的中性^t，以及10-50wt。/o的唾液酸化的S^t。6、任一上述权利要求的用途，其中所述^t混合物包括15-40wt。/。的N-乙酰化^t，40-60wt。/。的中性S^，以及15-30wt。/o的唾液酸化的S^t。7、权利要求l-5的任一项的用途，其中所述S^混合物包括5-20wt。/。的N-乙酰化絲，60-90wt。/o的中性^t，以及5-30wt。/o的唾液酸化的寡糖。8、任一上i^3L利要求的用途，其中将药物或治疗性营养组合物在^4t后立即向嬰儿施用，并且在之后施用至少2个月。9、任一上述权利要求的用途，其中将药物或治疗性营养组合物在M后向嬰儿施用至少6个月。10、任一上述权利要求的用途，其中治疗性营养组合物是嬰儿配方乳。11、权利要求10的用途，其中婴儿配方乳包括在l(^至10e^cfu之间的益生鼠李糖乳杆菌/g组合物(干重)，和0.2-5克/升的f^t混合物的重构配方乳。全文摘要本申请公开了鼠李糖乳杆菌的益生菌株与寡糖混合物在生产药物或治疗性营养组合物中的用途，所述药物或组合物促进剖宫产术分娩的婴儿中的早期双歧杆菌促进性(bifidogenic)肠道小型生物群的发育，其中，所述寡糖混合物包括5-70wt％的至少一种N-乙酰化寡糖，20-90wt％的至少一种中性寡糖，以及5-50wt％的至少一种唾液酸化的寡糖，所述N-乙酰化寡糖选自GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc，所述中性寡糖选自Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc和Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc，所述唾液酸化的寡糖选自NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。文档编号A61K39/05GK101646453SQ200880010593公开日2010年2月10日申请日期2008年3月27日优先权日2007年3月28日发明者F·罗沙,K-J·胡贝尔-哈格,M-C·菲绍,N·斯普伦格申请人:雀巢产品技术援助有限公司