专利名称：：细胞应激应答的缓解的制作方法
技术领域：
：本发明致力于对于治疗哺乳动物中的癌症有用的组合物和使用那些组合物来治疗哺乳动物中的癌症的方法。
背景技术：
：恶性肿瘤(癌症)是美国第二位死因，排在心脏病之后(Boring等，CACancelJ.Clin.43:7(1993))。癌症的特征在于衍生自正常组织的赘生性细胞或异常细胞的数目增加，所述细胞增殖而形成肿瘤块，这些赘生性肿瘤细胞侵入邻近组织，和产生经称作转移的过程最终经血液或淋巴系统扩散至局部淋巴结和远端部位。在癌性状态中，细胞在正常细胞不会生长的条件下增殖。癌症自身表现为极其多种形式，特征在于不同程度的侵入性和攻击性。在试图发现癌症疗法的有效细胞靶物的尝试中，研究人员试图鉴定与一种或多种正常的非癌性细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性表达的跨膜的或以其它方式与膜结合的多肽。通常，此类膜结合多肽在癌细胞表面上表达的丰度要高于非癌性细胞表面上的。此类膜结合细胞表面抗原多肽的鉴定产生了特异性靶向癌细胞的能力，供经基于抗体的疗法进行的破坏用。在这点上，注意到基于抗体的疗法在某些癌症的治疗中证明是非常有效的。例如，HERCEPTIN⑧和RITUXAN⑧(二者都来自Genentech公司(SouthSanFrancisco,California))是分别已经成功用于治疗乳腺癌和非何杰金氏淋巴瘤的抗体。更具体的说，HERCEPTIN⑧是重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，其选择性结合人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因的胞外结构域。在25-30%的原发性乳腺癌中观察到HER2蛋白过表达。RITUXAN⑧是遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，其针对在正常和恶性B淋巴细胞的表面上找到的CD20抗原。这两种抗体都是在CH0细胞中重组生产的。在试图发现癌症疗法的有效细胞靶物的其它尝试中，研究人员试图鉴定(1)与一种或多种特定类型的非癌性正常细胞相比由一种或多种特定类型的癌细胞特异性生成的非膜结合的多肽，(2)由癌细胞以显著高于一种或多种非癌性细胞的表达水平生成的多肽，或(3)其表达特异性限制于只有一种(或非常有限数目的不同)组织类型的多肽，所述组织出于癌性和非癌性两种状态(例如正常前列腺和前列腺肿瘤组织)。此类多肽可以保持胞内定位，或者可以由癌细胞分泌。此外，此类多肽可以是不是由癌细胞自身表达的，而是由生成或分泌对癌细胞具有强化或生长增强效果的多肽的细胞表达的。此类分泌多肽常常是给癌细胞提供胜过正常细胞的生长或存活优势的蛋白质，而且包括诸如例如血管发生因子、细胞粘附因子、生长因子等等的物质。此类非膜结合多肽的拮抗剂的鉴定预期会充当此类癌症治疗的有效治疗剂。而且，此类多肽的表达样式的鉴定对于哺乳动物中特定癌症的5诊断会是有用的。尽管有哺乳动物癌症疗法中的上述进展，对分别能够检测哺乳动物中的肿瘤和有效抑制赘生性细胞生长或存活的别的治疗剂存在大大的需要，尤其对于前列腺癌更是这样。前列腺癌是美国男性癌症死亡的首要原因，而且是此人群中的最常见恶性病(Landis等，CACancerJ.Clin.49:8-31，1999)。此类癌症的初始阶段一般以雄激素依赖性肿瘤细胞为特征，并且通过雄激素消减来治疗。随着癌症的进展，它一般变成雄激素不应的，而且目前没有有效的特异性疗法。使用化疗的传统癌症治疗常常具有非故意的后果，其干扰治疗的成功。特别重要的是某些化疗剂的施用触发细胞应激应答。细胞应激应答可能给化疗所靶向的癌细胞提供存活优势。发明概述本发明涉及RAlc在癌性细胞的应激应答(stressresponse)中的作用。一方面，本发明提供了缓解细胞中的细胞应激应答的方法，包括使所述细胞(优选癌细胞，更优选前列腺癌肿瘤细胞)接触降低或阻断所述细胞中RAlc表达或活性的化合物。在一个实施方案中，所述细胞应激应答是由化疗剂诱导的。优选的是，所述化合物提高所述细胞对所述化疗剂的敏感性。本发明的另一方面提供了缓解前列腺癌肿瘤细胞中的细胞应激应答的方法，包括使所述肿瘤细胞接触降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。在一个实施方案中，所述肿瘤细胞正在经历用诱导细胞应激应答的化疗剂进行的化疗。优选的是，所述化合物提高所述肿瘤细胞对所述化疗剂的敏感性。对所述化疗剂敏感的肿瘤细胞可以例如以比未接触所述化合物的细胞要高的比率(rate)经历凋亡或以比未接触所述化合物的细胞要高的比率经历生长停滞。又一方面提供了缓解(改善)患者的细胞中的细胞应激应答的方法。此方法包括对所述患者施用有效量的降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。在一个实施方案中，所述患者是癌症患者。在另一个实施方案中，所述细胞是前列腺癌肿瘤细胞。在又一个实施方案中，所述肿瘤细胞正在经历用诱导细胞应激应答的化疗剂进行的化疗。优选的是，所述化合物提高所述肿瘤细胞对所述化疗剂的敏感性。对所述化疗剂敏感的肿瘤细胞可以例如以比未接触所述化合物的细胞要高的比率经历凋亡或以比未接触所述化合物的细胞要高的比率经历生长停滞。在本发明的这些方面，所述化疗剂优选是mTor抑制剂或Aktl/2抑制剂。合适的mTor抑制剂的例子包括雷帕霉素(r即amycin)、CCI-779、RAD001、AP23573、XL7F65、和TAFA93、以及它们的活性衍生物或类似物。合适的Aktl/2抑制剂的例子包括GSK690693、哌立福辛(perifosine)、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。本发明的各个方面的一些实施方案中所使用的化合物是RAlc拮抗剂，诸如抗体、抗体片段、抗体偶联物、适体、小分子、或寡肽。优选的是，所述RAlc拮抗剂特异性阻断RAlc活性。在其它实施方案中，所述化合物降低RAlc表达。在又一些其它实施方案中，所述化合物阻断RAlc表达。在降低或阻断RAlc表达中有用的化合物包括反义多核苷酸、沉默RNA分子、催化性RNA分子、和RNA-DNA嵌合物。本发明的另一方面提供了组合物，其包含RAlc拮抗剂，诸如抗RAlc抗体，和提高RAlc表达的化合物，诸如雷帕霉素、CCI-779、RAD001、AP23573、XL7F65、TAFA93、SK690693、哌立福辛、和XL418、或其活性衍生物或类似物，任选进一步包含药学可接受载体。本发明的又一方面提供了测定化疗剂是否诱导癌细胞(优选前列腺癌细胞，更优选LNCaP细胞)中的细胞应激应答的方法。所述方法包括使癌细胞接触所述化疗剂并测定所述癌细胞中的RAlc表达水平。RAlc表达超过对照细胞或超过接触所述化疗剂之前所述癌细胞中的RAlc表达水平的升高指示对细胞应激应答的诱导。所述化疗剂优选是mTor抑制剂或Aktl/2抑制剂、以及它们的活性衍生物或类似物。本发明的又一方面提供了用联合疗法治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤，使癌细胞接触提高RAlc表达的化疗剂，并使所述癌细胞接触有效量的特异性结合RAlc多肽的化合物，诸如抗RAlc抗体。所述抗体优选是偶联至细胞毒剂的。所述化疗剂和所述化合物的癌症治疗效果协同地超过所述化疗剂或化合物任一单独的效果。在一个实施方案中，所述化疗剂是mTOR或Aktl/2抑制剂。在阅读本说明书后，本发明的又一些其它实施方案对于熟练技术人员会是显而易见的。附图简述图1A和lB描绘了组织和细胞系RAlc表达的寡阵列分析，如实施例1中所描述的。在图1A中，正常组织是每个组织样品最左边的结果，而癌症/其它疾病是每个组织样品最右边的结果。图2A-2C显示了LNCaP细胞中应答某些细胞因子剌激的RAlc表达的定量实时RT-PCR(Q-PCR)分析，如实施例2中所描述的。图3A-3B显示了在缺乏或存在IL_6的情况中测试血清剥夺对LNCaP细胞中RAlc表达的影响的实验的结果，如实施例2中所描述的。图3A描绘了Q-PCR数据，如实施例2(b)中所描述的。图3B描绘了经处理或未处理LNCaP细胞的细胞周期状态的FACS分析，如实施例2(c)中所描述的。图4A-4B显示了LUCaP77离体(exvivo)细胞和LNCaP细胞中RAlc表达的Q-PCR分析的结果，如实施例2(d)中所描述的。图5描绘了检测磷酸化胞内信号传导途径成分的存在的Western印迹，如实施例3a中所描述的。图6描绘了用于评估添加PI3K抑制剂对IL-6处理的LNCaP细胞的效果的Q-PCR数据。图7描绘了用于评估添加P38抑制剂对IL-6处理的LNCaP细胞的效果的Q-PCR数据。图8是预期通过IL-6处理或血清剥夺活化的主要信号传导途径的示意图。图9描绘了显示添加mTor抑制剂对IL_6处理的LNCaP细胞的效果的Q-PCR数据。图10描绘了显示添加Aktl/2抑制剂对IL-6处理的LNCaP细胞的效果的Q-PCR数据。图11描绘了显示携带预测STAT3结合位点的构建体的表达和STAT3位点的诱变的效果的测定法。图12描绘了STAT3位点的诱变。图13描绘了显示添加JAK抑制剂对IL-6处理的LNCaP细胞的效果的数据。图14A-14B显示了用于评估DHT对LNCaP细胞中IL_6诱导的或血清剥夺诱导的RAlc表达的效果的Q-PCR研究的结果，如实施例4中所描述的。图14C显示LNCaP细胞中胞内RAlc表达调控的一种潜在方案的示意图，该示意图基于本文中所描述的数据。图15描绘了293S细胞中RAlc细胞表面表达的FACS分析，如实施例5中所描述的。发明详述I.定义术语"RAlc多肽"和"RAlc蛋白"在用于本文时涵盖天然序列多肽、多肽变体、及天然序列多肽和多肽变体的片段(本文中有进一步定义)。本文所述RAlc多肽可以从多种来源分离，诸如人组织类型或其它来源，或者通过重组或合成方法制备。术语"RAlc多肽"和"RAlc蛋白"还包括本文中所公开的RAlc多肽的变体。"天然序列RAlc多肽"包括与衍生自自然界的相应RAlc多肽具有相同氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中，天然序列RAlc多肽包含SEQIDN0:2的氨基酸序列TKQIRTRVLAMFKISCDKDLQAVGGK。在另一个实施方案中，天然序列RAlc多肽包含成熟蛋白序列的氨基酸序列且进一步包含信号肽，例如SEQIDNO:3:MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYLLPPVINPIIYGAKTKQIRTRVLAMFKISCDKDLQAVGGK。在另一个实施方案中，天然序列RAlc多肽是由GenBank编号NM030774所列多核苷酸序列编码的。在另一个实施方案中，天然序列RAlc多肽包含缺乏信号肽的氨基酸序列。在又一个实施方案中，天然序列RAlc多肽包含用前蛋白转化酶酶促切割SEQIDN0:2的序列而产生的氨基酸序列。此类天然序列RAlc多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语"天然序列RAlc多肽"明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的具体RAlc多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。天然序列RAlc还报告于Xu等，CancerRes.60:6568-6572(2000);Yuan等，Gene278:41-51(2001);Xia等，Oncogene20:5903-5907(2001);及美国专利No.6，372，891)。"RAlc多肽变体"意指与本文中所公开的天然序列RAlc多肽序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的RAlc多肽，优选本文中所定义的活性RAlc多肽。此类RAlc多肽变体包括例如在天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的RAlc多肽。通常，RAlc多肽变体与本文中所公开的天然序列RAlc多肽序列具有至少约80%的氨基酸序列同一性，或者至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，RAlc变体多肽的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320个氨基酸，或更多个氨基酸。任选的是，RAlc变体多肽与天然RAlc多肽序列相比具有不超过一处保守氨基酸替代，或者与天然RAlc多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10处保守氨基酸替代。关于本文中所鉴定的RAlc多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定RAlc多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序获得的。作为一个非限制性例子，ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(SouthSanFrancisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从众多出版物中提供的源代码编译，例如美国专利No.7，087，738。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIXV4.OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:分数X/Y乘100其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。"RAlc变异多核苷酸"或"RAlc变异核酸序列"意指编码本文中所定义的RAlc多肽，优选活性RAlc多肽且与编码本文中所公开的天然序列RAlc多肽序列的核苷酸序列具有至少约80%核酸序列同一性的核酸分子。通常，RAlc变异多核苷酸与编码本文中所公开的全长天然序列RAlc多肽序列的核酸序列具有至少约80%的核酸序列同一性，或者至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列同一性。变体不涵盖天然核苷酸序列。通常，RAlc变异多核苷酸的长度为至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、9490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200U201、或1204个核苷酸，其中在此语境中，术语"约"意指所述核苷酸序列长度加上或减去该所述长度的10%。关于RAlc核酸序列(编码天然序列RAlc多肽，例如SEQIDNO:1的核酸序列ATGTGTGACAAGGACTTGCAGGCTGTGGGAGGCAAGTGA，包含RAlc编码区)的"百分比(％)核酸序列同一性"定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与目的RAlc核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。为测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为了本发明的目的，％核酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2(上文所述)获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)得到ALIGN-2程序，或者可从众多出版物中提供的源代码编译，例如美国专利No.7，087，738。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算分数W/Z乘100其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相对于C的％核酸序列同一性。作10为使用这种方法计算^核酸序列同一性的例子，表3和4演示了如何计算指派为"比较DNA"的核酸序列相对于指派为"RAlc-DNA"的核酸序列的X核酸序列同一性，其中"RAlcDNA"代表目的理论RAlc核酸序列，"比较DNA"代表目的"RAlcDNA"核酸分子针对其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，而"N"、"L"和"V"各自代表不同理论核苷酸。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的RAlc变体多肽。在其它实施方案中，RAlc变异多核苷酸是编码RAlc多肽且能够与本文中所公开的编码RAlc多肽的核苷酸序列杂交(优选在严格杂交和清洗条件下)的核酸分子。RAlc变体多肽可以是那些由RAlc变异多核苷酸所编码的。"分离的"意指已经鉴定且与/自它的天然环境成分分开和/或自它的天然环境回收的分子/化合物(诸如多肽)。多肽的天然环境的污染性成分指通常会干扰该分子/化合物(诸如多肽)治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将多肽或寡肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少10-15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用例如考马斯蓝或银染色的非还原性或还原性条件下的凝胶电泳(例如SDS-PAGE)，达到同质。既然RAlc多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。"分离的"多核苷酸指已经鉴定且与该编码多肽或寡肽的核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的编码多肽或寡肽的核酸分子。分离的编码多肽或寡肽的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或情形。分离的编码多肽或寡肽的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的特定的编码多肽或寡肽的核酸分子有区别。然而，分离的编码多肽或寡肽的核酸分子包括通常表达编码多肽或寡肽的细胞中所包含的编码多肽或寡肽的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体或染色体外定位时。术语"控制序列"指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是"可操作连接的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretoryleader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(pr印rotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，"可操作连接的"意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。杂交反应的"严格性"容易为本领域普通技术人员所确定，并且通常取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度用于正确的退火，而较短的探针则需要较低的温度。当互补链存在于低于它们解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA重新退火的能力。探针和能杂交的序列之间的期望同源性程度越高，11就可使用越高的相对温度。作为结果，推出，更高的相对温度趋向于使反应条件更加严格，而更低的温度则更不严格。对于杂交反应的严格性的补充细节及解释参见Ausubel等的《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，WileyIntersciencePublishers，(1995)。如本文中所定义的，"严格条件"或"高严格条件"可以定义如下(1)对于洗涤使用低离子强度和高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠，50°C;(2)在杂交期间使用变性剂，诸如甲酰胺，例如，50%(v/v)甲酰胺及O.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，42t:，或(3)在使用50X甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1X焦磷酸钠，5xDenhardt氏溶液，超声处理的鲑精DNA(50yg/ml)，O.1%SDS和10X硫酸右旋糖苷的溶液中于42t:杂交过夜，于42t:在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着是于55°C由含有EDTA的0.lxSSC组成的10分钟高严格洗涤。"中等严格条件，，可规定为如Sambrook等的《MolecularCloning"LaboratoryMa皿al》(NewYork:CoIdSpringHarborPress,1989)所描述的，而且包括使用与上文所述那些相比较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是在含20%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM拧檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10%硫酸右旋糖苷和20mg/ml变性的剪切的鲑精DNA的溶液中于37t:温育过夜，然后于约37-5(TC在lxSSC中洗涤滤膜。本领域熟练技术人员应当认识到如何根据适应诸如探针长度等因素的需要来调节温度、离子强度等。术语"适体"指能够结合靶分子(诸如多肽)的核酸分子。例如，本发明的适体可特异性结合RAlc多肽或信号传导途径中调控RAlc表达的分子。适体的生成和治疗用途是本领域已完全建立的。参见例如美国专利No.5，475，096，以及Macugen⑧(Eyetech，NewYork)用于治疗年龄相关黄斑变性的治疗功效。术语"表位标记的"在用于本文时指包含RAlc多肽或抗RAlc抗体且其与"标签多肽"融合的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间(优选的是，在约10个和约20个氨基酸残基之间)。标签多肽的非限制性例子包括可检测标志物，诸如多组氨酸和人胎盘碱性磷酸酶。"有活性的"或"活性"为了本发明的目的指RAlc多肽保留天然或天然存在RAlc多肽的生物学和/或免疫学活性的形式，其中"生物学"活性(或是抑制性的或是剌激性的)指由天然或天然存在RAlc多肽引起的，除诱导针对天然或天然存在RAlc多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能力外的生物学功能，而"免疫学"活性指诱导针对天然或天然存在RAlc多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能力。术语"拮抗剂"以最广义使用，包括任何降低、部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的天然RAlc多肽的生物学活性的分子。合适的拮抗剂分子明确包括拮抗性抗体或抗体片段、天然RAlc多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子或无机小分子、等。用于鉴定RAlc多肽的拮抗剂的方法可包含使RAlc多肽接触候选拮抗剂分子，并测量通常与RAlc多肽有关的一项或多项生物学活性的可检测变化。"处理"或"治疗"或"缓和"指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或紊乱。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及倾向于患上病症的受试者或要预防病症的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的至少一种RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合后，患者在如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者或哺乳动物成功"治疗"了癌症癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积縮小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。就RAlc拮抗剂可预防现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是抑制细胞的和/或毒害细胞的。这些征候或症状的减轻还可以由患者感受到。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以容易地通过内科医师所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展时间(TTP)和/或测定响应速率(RR)来测量功效。转移可通过分期测试(stagingtest)来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可进行CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的淋巴结。分别使用胸腔X射线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。"长期"施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。"间歇"施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。为了治疗癌症、减轻癌症症状目的，"哺乳动物"指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园动物、体育用动物或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、家兔等。优选的是，哺乳动物指人。"患者"指任何动物，优选哺乳动物，更优选人。与一种或多种其它治疗剂"联合"施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。"载体"在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是PH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；或非离子表面活性剂，诸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)禾口PLURONICS⑧。"固相"或"固体支持物"意指本发明的抗体、RAlc多肽结合寡肽或RAlc多肽结合有机或无机小分子可粘着或附着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No.4，275，149中所记载的。"脂质体"指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如本文中所披露的RAlc多肽、其抗体或RAlc多肽结合寡肽)的小囊泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。"小"分子或有机"小"分子在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。本文中所公开的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合的"有效量"指足以实现明确规定的目的的量。"有效量"可凭经验且以常规方式，联系规定的目的来确定。术语"治疗有效量"指RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合在受试者或哺乳动物中有效"治疗"疾病或紊乱的量。在癌症的情况中，RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合的治疗有效量可减少癌细胞数；縮小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。参见本文中"治疗"的定义。就RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、调控细胞应激的化合物、或一种或多种此类化合物的组合可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。本文中所公开的RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合的"生长抑制量"指能够在体外或在体内抑制细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞生长的量。RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合为了抑制肿瘤性细胞生长的"生长抑制量"可凭经验且以常规方式来确定。RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合的"细胞毒性量"指能够在体外或在体内引起细胞，尤其是肿瘤，例如癌细胞破坏的量。RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合为了抑制肿瘤性细胞生长的"细胞毒性量"可凭经验且以常规方式来确定。术语"抗体"以最广义使用，明确覆盖例如单一抗RAlc多肽单克隆抗体(包括拮抗性、结合性和/或中和性抗体)、具有多表位特异性的抗RAlc多肽抗体组合物、多克隆抗体、单链抗RAlc多肽抗体、及抗RAlc多肽抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学或免疫学活性。术语"免疫球蛋白"(Ig)在本文中与"抗体"可互换使用。在本发明的方法中有用的抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95X，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的电泳诸如SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合而形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在lgG的情况中，4链单元通常是约150，000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在N-末端具有一个可变区(VH)，接着是三个(对于a和Y链)或四个(对于P和e同种型)恒定区(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变区(VL)，接着是其另一端的一个恒定区(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链第一恒定区(CHI)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。一个VH和一个VL—起配对而形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic和ClinicalImmunology,第8版，DanielP.Stites，AbbaI.Terr禾口TristramG.Parslow(编)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(k)和拉姆达(A)。根据其重链恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白lgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作a、S、e、Y禾Pii的重链。根据Q序列和功能的较小差异，Y和a类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。术语"可变的"指可变域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的实情。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域跨越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作"高变区"的极度变异的较短区域组成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取P-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成P-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicallnterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。术语"高变区"在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如、中的残基24-34(LI)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中的残基1-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)附近;Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))和/或那些来自"高变环"的残基(例如VL中的残基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(HI)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们可以在未受到其它抗体污染的情况中合成。修饰语"单克隆"不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature256:495记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利No.4，816，567)。"单克隆抗体"还可使用例如Clackson等(1991)Nature352:624-628;及Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。单克隆抗体在本文中包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见美国专利No.4，816，567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(OldWorldMonkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的"灵长类化"抗体。"完整抗体"指包含抗原结合位点以及和至少重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5，641，870，实施例2;Z即ata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995));单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作"Fab"片段，和一个残余"Fc"片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由一条完整轻链及一条重链的可变区(VH)和第一恒定区(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个大的F(ab')2片段，它大体相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab'片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab'h抗体片段最初是作为成对Fab'片段生成的，在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的所有两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)所识别的部分。"Fv"是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中生发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。"单链Fv"，也可縮写为"sFv"或"scFv"，是包含连接成一条多肽链的抗体VH和、结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和、结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Pliickthun，《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，vol.113，Rosenburg禾口Moore编，Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315，1994;Borrebaeck1995，见下文。术语"双抗体"指通过在VH和、结构域之间使用短接头(约5-10个残基)构建16sFv片段(见上一段)而制备的小型抗体片段，由于接头短，使得V结构域实行链间而非链内配对，导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个"交叉"sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和、结构域存在于不同多肽链上。双抗体更完整的描述于例如EP404,097;W093/11161;Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。非人(例如啮齿类)抗体的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature321:522-525Q986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。"物种依赖性抗体"，例如哺乳动物抗人IgE抗体，指对来自第一哺乳动物物种的抗原具有强于对该抗原来自第二哺乳动物物种的同系物的结合亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体"特异性结合"人类抗原(即具有不超过约1x10—7M，优选不超过约1x10—8M，最优选不超过约1x10—9M的结合亲和力(Kd))，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物具有比其对人类抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结合亲和力。物种依赖性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体，但优选人源化抗体或人抗体。"RAlc多肽结合寡肽"指结合，优选特异性结合本文所述RAlc多肽的寡肽。RAlc多肽结合寡肽可使用已知的寡肽合成方法学而化学合成，或者可使用重组技术来制备和纯化。RAlc多肽结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多，其中此类寡肽能够结合，优选特异性结合本文所述RAlc多肽。RAlc多肽结合寡肽可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域众所周知的(参见例如美国专利5，556，762，5，750，373，4，708，871，4，833，092，5，223，409，5，403，484，5，571，689，5，663，143;PCT公开号W084/03506和WO84/03564;Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3998-4002(1984);Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:178-182(1985);Geysen等，inSyntheticP印tidesasAntigens,130-149(1986);Geysen等，J.Immunol.Meth.102:259-274(1987);Schoofs等，J.Immunol.140:611—616(1988);Cwirla，S.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378(1990);Lowman，H.B.等，Biochemistry30:10832(1991);Clackson，T.等，Nature352:624(1991);Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222:581(1991);Kang，A.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8363(1991);及Smith,G.P.，CurrentOpin.Biotechnol.2:668(1991))。"RAlc多肽结合有机或无机小分子"指本文所定义的寡肽或抗体以外，结合，优选特异性结合本文所述RAlc多肽的有机或无机小分子。小分子RAlc拮抗剂优选是有机小分子。RAlc多肽结合有机分子可使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO00/00823和W000/39585)。RAlc多肽结合有机小分子的大小通常是小于约2000道尔顿，或者大小为小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中能够结合，优选特异性结合本文所述RAlc多肽的此类有机小分子可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。在这点上，注意到用于对有机小分子文库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域众所周知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和WO00/39585)。"结合"目的抗原例如RAlc多肽的本发明抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子指以足够亲和力结合该抗原，使得该抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞或组织且不显著与其它蛋白质发生交叉反应的。在此类实施方案中，根据荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的测定，抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子结合"非耙物"蛋白质的程度将小于该抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子对其特定靶物蛋白质的结合的约10%。对于抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子对靶分子的结合，术语"特异结合"或"特异性结合"特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其"特异"意味着可测量的不同于非特异相互作用的结合。特异结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如过量的未标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制，则指示特异结合。术语"特异结合"或"特异性结合"特定多肽或特定多肽耙物上的表位或对其"特异"在用于本文时可由例如对耙物的Kd为至少约10—4M，或至少约10—5M，或至少约10—6M，或至少约10—7M，或至少约10—8M，或至少约10—9M，或至少约10—1QM，或至少约10—"M，或至少约10—"M或更大的分子展现。在一个实施方案中，术语"特异结合"指这样的结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。"抑制表达RAlc多肽的肿瘤细胞生长"的抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子、其它RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合或者"生长抑制性"抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子、其它RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、调控细胞应激的化合物、或一种或多种上述化合物的组合指导致可测量的表达或过表达RAlc多肽的前列腺癌细胞生长抑制的那些上述物质。在某些实施方案中，生长抑制性抗RAlc抗体、寡肽、有机或无机小分子、其它RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种上述化合物的组合与适宜对照相比对表达RAlc多肽的肿瘤细胞生长的抑制超过大约20%、或者大约20%到大约50%、或者超过50%(例如大约50%到大约100%)，所述对照通常是未用所测试的抗体、寡肽、其它有机或无机小分子、其它RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、调控细胞应激的化合物、或一种或多种此类化合物的组合处理的肿瘤细胞。在一个实施方案中，生长抑制可以在细胞培养物中的抗体浓度为大约0.1-30iig/ml或大约0.5nM到200nM时测量，其中生长抑制在肿瘤细胞暴露于抗体后l-10天测定。如果抗RAlc多肽抗体大约1Pg/kg到大约100mg/kg体重的施用导致在距首次施用抗体大约5天到3个月内或大约5-30天内肿瘤体积縮小或肿瘤细胞增殖减慢，那么该抗体在体内是生长抑制性的。"诱导细胞应激应答"意指引起细胞启动至少一种细胞过程，诸如信号传导途径或级联反应，该细胞过程是从通常的细胞状况和稳态进行急性或慢性转换触发的且目的是抵消损伤、修复损害、和保护细胞。"缓解细胞应激应答"意指对与细胞应激应答有关的或由细胞应激应答引起的任何生理状况的任何降低、抑制、或预防。在一个实施方案中，细胞应激应答的缓解导致细胞变得对诱导细胞应激应答的化疗剂更加敏感。对化疗剂的敏感性升高可通过例如测定细胞在接触所述化疗剂时与细胞应激应答缓解前的细胞的凋亡率相比是否经历凋亡率升高来监测。凋亡或程序性细胞死亡可通过监测膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收縮、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成来测定。对凋亡的诱导还可通过对样品细胞群的FACS分析来测定。所述细胞通常是过表达RAlc多肽的。优选的是，所述细胞是前列腺癌症的肿瘤细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓縮。凋亡的增加指在膜联蛋白结合测定法中相对于未处理细胞导致大约2倍至50倍、或者大约5倍至50倍、或者大约10倍至50倍、或更大的对膜联蛋白结合的诱导的。对化疗剂的敏感性升高还可通过测定细胞在接触所述化疗剂时与细胞应激应答缓解前的细胞的生长停滞相比是否经历生长停滞(例如G0/G1停滞)增加来监测。用于测定G0/G1停滞的方法可见于实施例2。生长停滞的增加指相对于在未处理细胞中所观察到的导致大约2倍至50倍、或者大约5倍至50倍、或者大约10倍至50倍、或更大的G0/G1停滞细胞的增加。抗体"效应器功能"指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"或"ADCC"指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体"武装"(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。Ravetch和Kinet，An皿.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5，500，362或5，821，337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，(USA)95:652-656(1998)中所披露的。术语"Fc受体"或"FcR"描述能结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是能结合IgG抗体的FcR(y受体)，包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包括这些受体的各等位变体和各可变剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("活化受体")和FcyRIIB("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，区别主19要在于其胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcYRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITM)(参见综述DaSron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch禾口Kinet，A匪.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel等，I匪謹ethods4:25-34(1994);及deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-341(1995)。术语"FcR"在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。"人效应细胞"指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcyRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。术语"癌症"和"癌性的"指向或描述哺乳动物中通常以失调的细胞数目增加(在本文中一般称作细胞生长)(其可以是由于细胞增殖的异常升高、细胞死亡的异常降低、或细胞增殖与细胞死亡的量的失衡)为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于前列腺癌症。前列腺癌症的例子包括但不限于前列腺肿瘤、腺癌、和前列腺上皮内瘤形成(postateintraepithelialneoplasia)。术语"细胞增殖性病症"和"增殖性病症"指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。"肿瘤"在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语"癌症"、"癌性"、"细胞增殖性病症"、"增殖性病症"和"肿瘤"在本文中提到时并不互相排斥。"诱导细胞死亡"的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合指引起可存活细胞变得不能存活的抗体。所述细胞指表达RAlc多肽的细胞，而且是表达或过表达RAlc多肽的细胞类型的细胞。所述细胞可以是特定细胞类型的癌性的或正常的细胞。RAlc多肽可以是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽，或者可以是由癌细胞生成和分泌的多肽。所述细胞可以是癌细胞，例如前列腺癌细胞。体外细胞死亡可在不存在补体或免疫效应细胞时测定，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如此，用于细胞死亡的测定法可使用热灭活血清(即不含补体)在不存在免疫效应细胞时进行。为了确定抗体、寡肽或其它有机小分子、其它RAlc拮抗剂、调控RAlc表达的化合物、调控细胞应激的化合物、或一种或多种此类化合物的组合是否能够诱导细胞死亡，可相对于未处理细胞评估膜完整性的丧失，它是通过碘化丙啶(propidiumiodide)(PI)、锥虫蓝(参见Moore等，Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD的摄取来评估的。优选的诱导细胞死亡的抗体、寡肽或其它有机小分子、其它RAlc调控剂、调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合是在PI摄取测定法中在前列腺癌细胞模型的一个非限制性例子LNCaP细胞中诱导PI摄取的。"表达RAlc多肽的细胞"指例如以分泌形式表达内源或转染的RAlc多肽的细胞。可在检测或预后测定法中通过评估细胞中的和/或细胞表面上的和/或细胞分泌的RAlc蛋白质水平(例如通过免疫组织化学测定法，使用针对分离的RAlc多肽制备的抗RAlc多肽抗体，所述RAlc多肽可使用重组DNA技术从编码RAlc多肽的分离的核酸制备；FACS分析；等)来确定RAlc多肽表达。或者/另外，可测量细胞中编码RAlc多肽的核酸或mRNA的水平，例如通过荧光原位杂交，使用对应于编码RAlc多肽的核酸或其互补链的基于核酸的探针(FISH;参见WO98/45479，公开于1998年10月);Southern印迹;Northern印迹;或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。还可使用基于抗体的测定法，通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原来研究RAlc多肽表达(还可参见例如美国专利4，933，294，授权于1990年6月12日；WO91/05264，公开于1991年4月18日；美国专利5，401，638，授权于1995年3月28日；Sias等，J.Immunol.Methods132:73-80(1990))。除了上述测定法，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查切片。在用于本文时，术语"免疫粘附素"指将异源蛋白质("粘附素")的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是"异源"的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。词语"标记物"在用于本文时指与抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子直接或间接偶联从而生成"带标记物的"或"经过标记的"抗体、寡肽、或其它有机或无机小分子的可检测化合物或组合物。标记物可以是通过自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语"细胞毒剂"在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)"苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的具体实例包括抑制mTor或AKT途径的药剂，包括但不限于雷帕霉素/西罗莫司(sirolimus)、CCI-779/temsirolimus(Wyeth)、RAD001/依维莫司(everolimus)(Novartis)、AP23573(Ariad)、XL7F65、TAFA93(Isotechnika)、GSK690693(GlaxoSmithKline)、哌立福辛(AEterna21Zentaris)、和XL418(Exelixis)、以及它们的活性衍生物和类似物。化疗剂的其它实例包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN⑧环磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯类(alkylsulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氣丙淀类(aziridines)，i者如苯佐替派(benzod印a)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替？底(metured印a)禾口乌5詣替？底(ured印a);乙撑亚月安类(ethylenimines)禾口甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酉先胺(triethylen印hosphoramide)、三乙撑硫代磷酉先胺(triethylenethiophosphoramide)禾口三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));S_9_四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL);P-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸(betulinicacid);喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东茛菪亭(scopoletin)禾P9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard);亚石肖脈类(nitrosoureas)，i者如卡莫司汀(carmustine)、氣脈菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾P雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是力口利车毒素YII禾口力口利车毒素wII(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽环类抗生素(dy固icin)，包括dy固icinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(da皿orubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧_L_正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、*g比g(epirubicin)、亍衣*比g(esorubicin)、#;ii比g(idarubicin)、g罗素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic22acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(p印lomycin)、泊非毒素(potfiromycin)、卩票吟毒素(puromycin)、三铁阿毒素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(str印tonigrin)、链佐星(str印tozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧啶(eniluracil);安口丫啶(咖sacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酉先月安(defosfamide);t也美可辛(demecolcine);t也口丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptiniumacetate);埃坡霉素(印othilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟脲(hydroxyurea);香燕多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物减类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)禾口美登醇(maytansinol);安丝菌素(ansamitocin);米托月瓜月宗(mitoguazone);米托惠酉昆(mitoxantrone);莫呢达醇(mopidamol);二胺石肖口丫啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);批柔比星(pirarubicin)J各索惠酉昆(losoxantrone);2_乙基酉先月井(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);螺方定错(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(te皿azonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2，2'，2〃-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T_2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露酉享(mitobronitol);二溴卫矛酉享(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C，，)；塞替派(thiot印a);类紫杉醇(taxoids)，例如TAXOL⑧帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉酉享(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)禾口TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer，Antony，France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin);长春碱(vinblastine)(VELBAN);钼；依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新23碱(vincristine)(ONCOVIN);奥沙利钼(oxaliplatin);亚叶酸(leucovorin);长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE);能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMF0);类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoicacid);卡培他滨(capecitabine)(XELODA);任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CH0P(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的縮写)和F0LF0X(奥沙利铂(EL0XATIN)联合5_FU和亚叶酸的治疗方案的縮写)。该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(on即ristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动齐U，诸如LUPRON⑧和ELIGARD⑧醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏罗唑(vorozole)、FEMARA⑧来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、DIDROCAL依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、ZOMETA⑧唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX⑧阿伦膦酸盐(alendronate)、AREDIA⑧帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID⑧替鲁膦酸盐(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸盐(risedronate);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3_二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如THERATOPE⑧疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH;l即atinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。"生长抑制剂"在用于本文时指在体外或在体内抑制表达RAlc多肽的癌性细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达RAlc多肽的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔红毒素(da皿orubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5_氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn禾口Israel编，第l章，题为"Cellcycleregulation，oncogenes,andantieioplasticdrugs，，，Murakaini等人，WBSa皿ders，Philadelphia,1995，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE,Rhone-Pou1encRorer)是紫杉醇(TAXOL⑧,Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。"多柔比星(Doxorubicin)"是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S_顺式)普[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-a_L_来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基_8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-a-L-lyxo-hex邓yranosyl)oxy]_7，8，9，10_tetrahydro_6，8，1l_trihydroxy_8_(hydroxyacetyl)_l_methoxy_5，12-n即hth3cenedione术语"细胞因子"是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和-P;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF);整联蛋白；血小板生成素(TP0);神经生长因子，诸如NGF-P;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-a和TGF-P;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EP0);骨诱导因子(osteoinductivefactor);干扰素，诸如干扰素-a、-P和-Y;集落剌激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL)，诸如IL-l、IL-la、IL_2、IL_3、IL_4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12;肿瘤坏死因子，诸如TNF-a或TNF-P;及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。"包装插页"用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、和/或警告的信息。II.本发明的组合物和方法RAlc在前列腺癌细胞中高度表达，而且在大多数其它通常测试的正常和患病组织中基本上不表达，正如本文中和下列参考文献中所记载的，例如美国已公布的专利申i青No.20050106644，Xu等，CancerRes.60:6568-6572(2000)，Yuan等，Gene278:41-51(2001)，Xia等，Oncogene20:5903-5907(2001);及美国专利No.6，372，891。RAlc具有与七次跨膜G蛋白偶联受体蛋白家族的序列同源性。25本文中首次显示了RAlc位于前列腺癌细胞的胞外膜上，因此作为前列腺癌鉴定和治疗的耙物是可及的。本文中还显示了前列腺癌细胞模型中的RAlc表达应答IL-6处理或血清剥夺而上调，提示RAlc表达受到细胞应激升高的剌激。细胞应激应答在所有活生物体中在进化方面是保守的，而且导致命令正在经历应激的生物体或是适应、或是存活、或是死亡的分子应答。细胞应答牵涉许多特定信号传导事件，其为代谢、膜、细胞骨架中特定细胞适应步骤及为其它细胞元件和功能的特定细胞适应步骤做好准备。Szalay等，FEBSLetters,581(19):3675-3680(2007)。这些对应激的分子应答大部分是对生物体有益的。然而，如果细胞应激应答是在癌细胞中诱导的，那么它可能干扰化疗剂治疗的功效。Herr，I.和Debatin，K_M，Blood，98:2603-2614(2001);Tiligada，E.，Endocrine-RelatedCancer，13:S115-S124(2006)。一般而言，化疗剂在敏感性肿瘤细胞中抑制细胞生长和/或诱导凋亡。这些药剂可引起细胞稳态的失衡，导致细胞应激。作为响应，细胞经历细胞应激应答，试图使细胞恢复其先前的状态。细胞环境内应激的类型和剂量似乎规定细胞应答的结果。细胞应激应答可确定细胞是对化疗剂治疗敏感的或是对化疗剂治疗抵抗的。Blood，98:2603-2614。用被认为牵涉IL-6或本文中所描述的细胞应激应答的某些胞内信号传导途径的抑制剂进行的研究证明了对P38MAP激酶的抑制或对PI3K的抑制中任一导致所处理细胞中的RAlc表达降低。然而，对组成性有活性的mT0R和Akt1/2的抑制具有相反的效果，即剌激RAlc表达，而且这种效果对于对单独的IL-6所观察到的效果至少是相加性的。本文实施例中所呈现的数据指明了RAlc是应激诱导的基因，能给癌细胞提供存活优势。图14C。在正常的充足的生长条件下，RAlc表达受到遏制，而RAlc表达应答有益于细胞应激的条件(IL-6处理或血清剥夺)而上调。另外，RAlc表达应答细胞应激的上调能通过促生长途径激活(DHT)来逆转或减轻，而且在促生长途径受到进一步抑制时(雷帕霉素)放大。对Aktl/2或mT0R的抑制与IL_6至少是相加性的观察结果提示这些抑制剂与抗RAlc分子的组合在癌症治疗中可具有治疗益处。数种靶向mT0R的药剂正处于临床评估中，例如雷帕霉素/西罗莫司(sirolimus)、CCI-779/temsirolimus、RAD001/依维莫司(everolimus)、AP23573、XL7F65、和TAFA93、以及它们的活性衍生物或类似物。Akt的抑制剂目前同样已经进入临床开发，包括GSK690693、哌立福辛、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。因而，本发明提供了缓解细胞应激应答的方法，特别是在前列腺癌细胞中，其通过降低或阻断那些细胞中的RAlc表达或RAlc活性来实现。降低或阻断细胞中的RAlc表达或活性的化合物包括RAlc拮抗剂和调控RAlc表达的化合物。降低或阻断细胞中的RAlc表达或活性的化合物的例子包括但不限于抗体、抗体片段、抗体偶联物、适体、小分子、寡肽、反义多核苷酸、沉默RNA分子、催化性RNA分子、和RNA-DNA嵌合物，而且在本文中有进一步描述。多种因子能诱导细胞应激应答。例如，通过将细胞置于血清剥夺条件下能在细胞中诱导细胞应激应答。通过将细胞暴露于IL-6也能诱导细胞应激应答。化疗剂常常在所述药剂所靶向的细胞中诱导细胞应激应答。细胞应激应答能成功地容许细胞在化疗剂治疗中存活。结果，细胞对药剂不太敏感，而且化疗治疗的功效受到不利影响。对细胞应激应答的缓解提高细胞对化疗剂治疗的敏感性。在一个实施方案中，细胞应激应答已经缓解了的细胞在接触化疗剂后以比未接触所述化合物的细胞要高的速率发生凋亡。在另一个实施方案中，细胞应激应答已经缓解了的细胞在接触化疗剂后以比未接触所述化合物的细胞要高的速率发生生长停滞。本发明的一个方面提供了在正在接受使用诱导细胞应激应答的化疗剂进行的化疗的癌症患者中缓解细胞应激应答的方法，包括对所述患者施用至少一种降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。在一个具体的实施方案中，所述癌症患者患有前列腺癌。接受这种治疗方法的患者具有对化疗治疗更加敏感的癌细胞。诱导细胞应激应答的化疗剂包括但不限于mT0R或Aktl/2途径的抑制剂。本发明进一步提供了用于治疗癌症的联合疗法。在一个实施方案中，所述联合疗法包括使癌细胞接触提高RAlc表达的化疗剂和特异性结合RAlc多肽的化合物。提高RAlc表达的化疗剂的例子包括诱导细胞应激应答的药剂。提高RAlc表达的化疗剂的具体例子包括但不限于mTOR或Aktl/2途径的抑制剂。特异性结合RAlc多肽的化合物包括但不限于抗RAlc抗体或其片段、RAlc结合寡肽、特异性结合RAlc的小分子、和其它RAlc拮抗剂诸如适体。RAlc多肽表达的升高为识别和结合RAlc的化合物提供了上调的靶物。优选的是，特异性结合RAlc多肽的化合物是偶联至细胞毒剂的。化疗剂和特异性结合RAlc的化合物的联合治疗提供协同效应，导致改善的癌症治疗。在一个具体的实施方案中，所述癌细胞是前列腺癌细胞。在另一个实施方案中，联合疗法包括使癌细胞接触提高RAlc表达的化疗剂和降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。提高RAlc表达的化疗剂的例子包括诱导细胞应激应答的药剂。提高RAlc表达的化疗剂的具体例子包括但不限于mTOR或Aktl/2途径的抑制剂。RAlc表达的升高为识别RAlc的化合物提供了上调的靶物。化疗剂和降低或阻断RAlc表达或活性的化合物的联合治疗提供协同效应，导致改善的癌症治疗。在一个具体的实施方案中，所述癌细胞是前列腺癌细胞。在治疗癌症患者的背景中，联合疗法牵涉给癌症患者施用提高RAlc表达的化疗剂和降低或阻断RAlc表达或活性和/或特异性结合RAlc多肽的化合物。本发明还提供了单独地或组合地包含上述化合物的组合物，正如本文中进一步描述的。本发明还提供了癌症诊断和分期方法。因为RAlc在细胞表面可及，而且是前列腺细胞(特别是癌性前列腺细胞)的特异性标志物，本发明的RAlc结合分子(包括但不限于抗RAlc抗体或其片段、RAlc结合寡肽、RAlc抗体偶联物、特异性结合RAlc的无机或有机小分子、和其它RAlc拮抗剂诸如适体)的使用应该容许表达RAlc的细胞的体内或体外鉴定。可以将一种或多种适宜标记物(包括但不限于放射性标记物、荧光标记物、酶标记物、比色标记物、自旋标记物、和本领域公知的任何其它适宜标记物)附着至RAlc结合分子以帮助显影。本发明的另一个方面涉及测定化疗剂是否在癌细胞中弓|起细胞应激应答的方法。此类方法在确定是否需要用降低或阻断RAlc表达或活性的化合物治疗正在经历化疗的患者方面是有用的。27因而，本发明提供了测定化疗剂是否在癌细胞中诱导细胞应激应答的方法，包括使癌细胞接触化疗剂并测定癌细胞中的RAlc表达水平。RAlc表达水平超过对照细胞或超过接触化疗剂之前的癌细胞中的RAlc表达水平的升高指示对细胞应激应答的诱导。合适的对照细胞包括未处理的、与所测定的癌细胞相同类别的癌细胞。此测定法中所使用的癌细胞优选是前列腺癌细胞，诸如LNCaP细胞。这些方法中所测定的化疗剂是任何怀疑能够引起细胞应激应答的药剂。在一个实施方案中，所述化疗剂是mTor抑制剂。在另一个实施方案中，所述化疗剂是Aktl/2抑制剂。本发明还提供了试剂盒和制品，正如本文中进一步描述的。以下部分更为详细地描述了这些方法和组合物及它们的具体方面。A.抗RAlc抗体在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂或诊断剂的抗RAlc多肽抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体。1.多克隆抗体多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。将相关抗原(尤其在使用合成肽时)与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的偶联)、N_羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0Cl2、或R、=C=NR，其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔i戚血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。在某些实施方案中，用于生成抗体的动物可以是转基因动物。在某些此类实施方案中，可以工程化改造动物使得它们展现编码RAlc的多核苷酸的完全缺失，使得它们没有RAlc表达(称作"敲除"动物)。生成此类动物的方法是本领域公知的，参见例如Snouwaert等，Science257:1083，1992;Lowell等，Nature366:740-42，1993;C即ecchi，M.R.，Science244:1288-1292,1989。在针对特定蛋白质或多肽的敲除动物中生成针对该蛋白质或多肽的抗体可能是有利的，因为该动物中不会发生可能降低抗体生成或产量的抗自身反应，正如本领域公知的。通过将例如100g或5g蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5-1/10初始量的肽或偶联物对动物进行强化免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定的高水平。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。2.单克隆抗体单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，Nature256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(美国专利No.4，816，567)。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples28andPractice,pp.59-103，AcademicPress,1986)。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合配偶)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的选择性培养基通常会含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiege，California,USA)获得的M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia,USA)获得的SP-2及衍生物，例如X63-Ag8_653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133:3001(1984);及Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107:220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。—旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，MonoclonalAntibodies-PrinciplesandPractice,pp.59-103，AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞i.P.注射到小鼠中。可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-S印harose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离并测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.OpinioninImmunol.5:256-262(1993)及Pliickthun，Immunol.Revs.130:151-188(1992)。在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature348:552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature352:624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.AcidsRes.21:2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定域(Ch和Cl)序列替代同源鼠序列(美国专利No.4，816，567;及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851(1984))，或通过融合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。3.人抗体和人源化抗体本发明的抗RAlc抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式指最低限度包含自非人免疫球蛋白衍生的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或家兔的CDR残基替换而得到的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体或所输入的CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作"输入"残基，它们通常取自"输入"可变域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法实施(Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列来进行。因而，此类"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利No.4，816，567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是将人抗体中的一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代而得到的抗体。当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于生成人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)非常重要。依照所谓的"最适(best-fit)"方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等，J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用自轻链或重链特定亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992);Presta等，J.Immunol.151:2623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。本发明涵盖人源化抗RAlc多肽抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，诸如完整的IgGl抗体。作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致对内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列(array)转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993)Jakobovits等，Nature362:255-258(1993);Bruggema皿等，YearinI匪no.7:33(1993);美国专利No.5，545，806，5，569，825，5，591，669(都是GenPharm的);5,545,807;及WO97/17852。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多禾中形式进行，综述参见例如Johnson,KevinS.禾口Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等，EMB0J.12:725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5，565，332和5，573，905。如上所述，还可通过体外激活B细胞(参见美国专利No.5，567，610和5，229，275)来生成人抗体。4.抗体片段在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。片段的体积较小，容许快速清除，并且可导致对实体瘤的接近和进入提高。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);及Brennan等，Science229:81(1985))。然而，现在可直接由31重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，并通过化学方法偶联以形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利No.5，869，046。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见W093/16185;美国专利No.5，571，894;及美国专利No.5，587，458。Fv和sFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一种类；如此，它们是合适的，因为在体内使用过程中具有降低的非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应物蛋白质位于sFv氨基或羧基末端的融合物。参见《AntibodyEngineering》，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是"线性抗体"，例如如美国专利No.5，641，870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。5.双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合本文所述RAlc多肽的两种不同表位。其它此类抗体可将RAlc多肽结合位点与针对另一种多肽的结合位点组合。或者，可以将抗RAlc多肽抗体臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcyR)诸如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦和定位于表达和/或结合RAlc多肽的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达和/或结合RAlc多肽的细胞。这些抗体拥有RAlc多肽结合臂及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白(s即orin)、抗干扰素-a、长春花生物碱(Vincaalkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。W096/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcyRIII抗体，而美国专利No.5，837，234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcYRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fca抗体显示于W098/02463。美国专利No.5，821，337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链_轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。W093/08829及Traunecker等，EMB0J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的流程。依照一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，融合使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链_轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于W094/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等，MethodsinEnzymology121:210(1986)。依照美国专利No.5，731，168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小型氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大型氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生大小与大型侧链相同或相似的补偿性"空腔"。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或"异源偶联"抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4，676，980)，及用于治疗HIV感染(WO91/00360、W092/200373及EP03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利No.4，676，980。文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science229:81(1985)描述了一种规程，其中通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'_TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段变得更加容易，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.E邓.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。每个Fab'片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶的溶解活性。还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的"双抗体(diabody)"技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的VH和、，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域33之间不能配对。因而，迫使一个片段上的VH和、结构域与另一个片段上的互补\和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152:5368(1994)。涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。6.异源偶联抗体异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4，676，980)及用于治疗HIV感染(WO91/00360;W092/200373;EP03089)。可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)禾口4—疏基丁亚氛酸甲酉旨(methyl_4_mercaptobutyrimidate)及例如美国专利No.4，676，980中所公开的。7.多价抗体多价抗体可以比二价抗体更快地受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(不同于IgM类)，其可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达来生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体可包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽链可包含VH-CHl-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CHl-VH-CHl-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。8.效应器功能的工程改造可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如为了增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中弓I入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.E邓.Med.176:1191-1195(1992)及Shopes，B.，J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等，CancerResearch53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5，739，277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中。在用于本文时，术语"补救(salvage)受体结合表位"指IgG34分子(例如IgGpIgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。9.免疫偶联物本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，也称作抗体偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。在癌症的治疗中使用抗体-药物偶联物局部递送细胞毒性或细胞抑制性试剂(即杀死或抑制肿瘤细胞的药物)(Syrigos和Epenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614;Niculescu-D證z禾口Springer(1997)Adv.DrgDel.Rev.26:151-172;US4，975，278)，理论上容许将药物模块靶向递送至肿瘤并在那里在细胞内积聚，其中全身给药这些未偶联的药剂可在对要试图消除的肿瘤细胞造成毒性的同时对正常细胞也造成无法接受的毒性水平(Baldwin等，(1986)Lancetpp.(Mar.15，1986):603-05;Thorpe，(1985)〃AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview"，于MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,A.Pinchera等(编)，pp.475-506)。由此获得最大功效而毒性最小。多克隆抗体和单克隆抗体据报道都可用于这些策略(Rowland等，(1986)CancerImmunol.Immunother.，21:183-87)。这些方法中所用的药物包括道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、和长春地辛(Rowland等，(1986)同上)。抗体-毒素偶联物中所用的毒素包括细菌毒素(诸如白喉毒素)、植物毒素(诸如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(诸如格尔德霉素(Mandler等(2000)Jour,oftheNat.CancerInst.92(19):1573-1581;Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028;Mandler等(2002)BioconjugateChem.13:786-791)、美登木素生物碱(EP1391213;Liu等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)、和加利车霉素(Lode等(1998)CancerRes.58:2928;Hinman等(1993)CancerRes.53:3336-3342))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合、或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性效应。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联后趋于失活或活性降低。ZEVALIN(ibritumomabtiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgGlk单克隆抗体与通过硫脲接头_螯合剂所结合的min或^Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77;Wiseman等(2002)Blood99(12):4336-42;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(10):2453-63;Witzig等(2002)J.Clin.Oncol.20(15):3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYL0TARGTM(gemtuzumabozogamicin，WyethPharmaceuticals)，即由huCD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体_药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(DrugsoftheFuture(2000)25(7):686;美国专利No.4，970，198;5，079，233;5，585，089;5，606，040;5，693，762;5，739，116;5，767，285;5，773，001)。Cantuzumabmertansine(Imm皿ogen，Inc.)，艮卩由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体_药物偶联物，正在进入用于治疗表达CanAg的癌症(诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌)的II期试验。MLN-2704(MillenniumPharm.，BZLBiologies,ImmunogenInc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块匿l连接而构成的抗体-药物偶联物，在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。已经将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatinE(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌瘤上的LewisY特异)和cACIO(对血液学恶性肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina等(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784)，且正在进行治疗性开发。上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(s即雄ariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、mI、mIn、，和皿Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基_3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/11026。本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065，及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。美登素和美登木素牛物碱类在一个实施方案中，本发明的抗RAlc多肽抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Mayte皿sserrata)分离得到(美国专利No.3，896，111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4，151,042)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利No.4，137,230;4，248，870;4，256，746;4，260，608;4，265，814;4，294，757;4，307，016;4，308，268;4，308，269;4，309，428;4，313，946;4，315，929;4，317，821;4，322，348;4，331，598;4，361，650;4，364，866;4，424，219;4，450，254;4，362，663;及4，371，533，明确将其公开内容收入本文作为参考。美登木素牛物碱-抗体偶联物在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途公开于例如美国专利No.5，208，020;5，416，064;及欧洲专利EP0425235Bl，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等，CancerResearch52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3xl05个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。杭RAlc多肽杭体-美登木素牛物碱偶联物(免疫偶联物)抗RAlc多肽抗体_美登木素生物碱偶联物可通过将抗RAlc多肽抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一分子毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5，208，020和上文提及的其它专利及非专利出版物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利No.5，208，020或欧洲专利0425235Bl;及Chari等，CancerResearch52:127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基_3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基_4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-l-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对_叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对_重氮苯甲酰基)_乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基_4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫化物连接。根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。加利车霉素另一种感兴趣的免疫偶联物包括偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗RAlc多肽抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5，712，374;5，714，586;5，739，116;5，767，285;5，770，701;5，770，710;5，773，001;5，877，296(都属于美国Cya謹id公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于Y卩、a/、a/、N-乙酰基-Y厶PSAG和9、(Hinman等，CancerResearch53:3336-3342(1993);Lode等，CancerResearch58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。其它细胞毒剂可与本发明的抗RAlc多肽抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(str印tozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5，053，394、5，770，710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利No.5，877，296)。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII禾口PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(s即aonariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺毒素(enomycin)禾口单端抱菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。本发明还涵盖抗体与具有核酸分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗RAlc抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘_123、碘-131、铟_111、氟_19、碳-13、氮-15、氧-17、礼、锰或铁。可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物中。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如tc"m或im、Re皿、Re，和Inm。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。10D0GEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Co匪n.80:49-57(1978))可用于惨入碘-123。《MonoclonalAntibodiesinImm皿oscintigraphy》(Chatal，CRCPress,1989)详细记载了其它方法。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，所述偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基_3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基_4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-l-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如l，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基_3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，CancerResearch52:127-131(1992);美国专利No.5，208，020)。本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联接头试剂制备的ADC:BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、1X-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、禾口3乂58(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。参见2003-2004年度应用手册和产品目录(2003-2004ApplicationsHandbookandCatalog)第467-498页。碰-靴勿鹏麵燃在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，抗体(Ab)经接头(L)偶联有一个或多个药物模块(D)，例如大约1个到大约20个药物模块每个抗体。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件、和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括(l)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。Ab-(L-D)pI抗体的亲核基团包括但不限于(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基基团是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括(i)活性酯类，诸如NHS酯、H0Bt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。可将额外亲核基团引入抗体中，经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇。还可通过修饰抗体以导入能与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块来生成本发明的抗体-药物偶联物。可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白质中生成羰基(醛和酮)，其能与药物上的适宜基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，(1992)Bioconj卿teChem.3:138-146;US5362852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。类似的，药物模块上的亲核基团包括但不限于胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、縮氨39基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酉旨、卤代甲酸酉旨、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗RAlc多肽抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。在又一个实施方案中，可将抗体与"受体"(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂自循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的"配体"(例如亲合素)。10.免疫脂质体本文中所公开的抗RAlc多肽抗体还可配制成免疫脂质体。"脂质体"指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物递送药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980);美国专利No.4，485，045和4，544，545;及1997年10月23日公布的W097/38731中所述。循环时间延长的脂质体披露于美国专利No.5，013，556。可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab'片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等，J.NationalCancerInst.81(19):1484(1989)。B.RAlc多肽结合寡肽本发明的RAlc多肽结合寡肽指结合，优选特异性结合本文所述RAlc多肽的寡肽。RAlc多肽结合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成，或者可使用重组技术制备和纯化。RAlc多肽结合寡肽的长度通常是至少约5个氨基酸，或者长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类寡肽能够结合，优选特异性结合本文所述RAlc多肽。RAlc多肽结合寡肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利5，556，762，5，750，373，4，708，871，4，833，092，5，223，409，5，403，484，5，571，689，5，663，143;PCT公开号W084/03506和W084/03564;Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3998—4002(1984);Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:178-182(1985);Geysen等，inSyntheticP印tidesasAntigens,130-149(1986);Geysen等，J.Immunol.Meth.102:259-274(1987);Schoofs等，J.Immunol.140:611-616(1988);Cwirla，S.E.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378;Lowman，H.B.等，(1991)Biochemistry30:10832;Clackson，T.等，(1991)Nature352:624;Marks，J.D.等，(1991)，J.Mol.Biol.222:581;Kang，A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8363;Smith，G.P.，(1991)CurrentOpin.Biotechnol.2:668)。在这点上，噬菌体展示是一种可以筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特异性结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott，J.K.和Smith,G.P.(1990)Science249:386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大型文库迅速且有效地分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla，S.E.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等，(1991)Biochemistry30:10832;Clackson，T.等，(1991)Nature352:624;Marks，J.D.等，(1991)J.Mol.Biol.222:581;Kang，A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8363)文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些多肽或寡肽(Smith,G.P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.2:668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和扩充大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果的手段。参见美国专利5，223，409，5，403，484，5，571，689和5，663，143。尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，A类(lambdoid)噬菌体展示系统(W095/34683;US5，627，024)、T4噬菌体展示系统(Ren等，Gene215:439(1998);Zhu等，CancerResearch58(15):3209-3214(1998);Jiang等，Infection&Immunity65(11):4770-4777(1997);Ren等，Gene195(2):303-311(1997);Ren，ProteinSci.5:1833(1996);Efimov等，VirusGenes10:173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott，MethodsinEnzymology217:228-257(1993);US5,766,905)也是已知的。现在已经对基础噬菌体展示概念开发了很多其它改进和变通。这些改进增强了展示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(W098/14277)，而且噬菌体展示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(W098/20169;W098/20159)和受约束(constrained)螺旋肽的特性(W098/20036)。W097/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展示文库接触第一种溶液和第二种溶液以选择性分离结合的配体，在第一种溶液中配体将结合靶分子，而在第二种溶液中亲和配体将不会结合耙分子。W097/46251描述了这样一种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A作为亲和标签的使用(Li等，(1998)Mol.Biotech.9:187)。W097/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用可以是噬菌体展示库的组合文库。WO97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。美国专利5，498，538，5，432，018和W098/15833中描述了选择特异性结合的蛋白质的其它方法。产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利5，723，286，5，432，018，5，580，717，5，427，908，5，498，530，5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192，和5，723，323。C.RAlc多肽结合小分子RAlc多肽结合小分子优选指本文所定义的寡肽或抗体以外，结合、优选特异性结合本文所述RAlc多肽的有机分子。RAlc多肽结合有机小分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO00/00823和W000/39585)。RAlc多肽结合有机小分子的大小通常小于约2000道尔顿，或者其大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类能够结合、优选特异性结合本文所述RAlc多肽的有机小分子无需过多实验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对有机小分子文库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO00/00823和W000/39585)。RAlc多肽结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、縮氨基脲(semicarbazone)、卡巴肼(carbazide)、伯胺、仲胺、叔胺、^取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、S旨、酰胺、脲、氨基甲酸酯(carbamate)、碳酸酯(carbonate)、縮酮、硫縮酮(thioketal)、縮醛、硫縮醛、芳基卤、芳基磺酸酯(arylsulfonate)、烃基卤、烃基磺酸酯(alkylsulfonate)、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺(sulfonamide)、环氧化物、吖丙啶(aziridine)、异氰酸酯(isocyanate)、磺酰氯、重氮化合物、酰基氯(acidchloride)等。D.调控RAlc表达的化合物本发明的调控RAlc表达的化合物是反义多核苷酸、沉默RNA分子、催化性RNA分子、RNA-DNA嵌合物、适体(aptamers)、抗体、寡肽、无机或有机小分子、或其它调控细胞中RAlc多肽表达的化合物，如本文中所描述的。某些此类化合物激活或提高RAlc多核苷酸的转录。某些此类化合物激活或提高RAlc多核苷酸的翻译。某些此类化合物激活或提高RAlc多肽表达。某些此类化合物降低或阻断RAlc多核苷酸的转录。某些此类化合物降低或阻断RAlc多核苷酸的翻译。某些此类化合物降低或阻断RAlc多肽表达。调控RAlc表达的化合物可作用于一种或多种牵涉RAlc表达的胞内信号传导途径。例如，调控RAlc表达的化合物可调控p38MAP激酶信号传导途径。又例如，调控RAlc表达的化合物可调控PI3K信号传导途径。又例如，调控RAlc表达的化合物可调控通常由IL-6激活的信号传导途径。本发明的调控RAlc表达的化合物可以以适合化合物本质的方式来制备。例如，调控RAlc表达的抗体或抗体片段可使用本文中关于制备抗RAlc抗体或其片段所描述的相同技术来制备。又例如，调控RAlc表达的寡肽可通过本文中关于制备RAlc多肽结合寡肽所描述的相同技术来制备。又例如，调控RAlc表达的有机小分子可使用本文中关于制备RAlc多肽结合小分子所描述的相同技术来制备。又例如，调控RAlc表达的适体可通过本文中关于制备RAlc结合适体所描述的相同技术来制备。E.筛选调控RAlc表达的RAlc拮抗剂和化合物上文已经描述了用于产生RAlc拮抗剂(诸如结合RAlc多肽的抗体、寡肽和小分子)和调控RAlc表达的化合物的技术。根据需要，可进一步选择具有某些生物学性质的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物。可通过本领域公知的方法，例如使用内源性或在用RAlc多肽基因转染后表达RAlc多肽的细胞，来评估本发明RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物的生长抑制效果。例如，可将适宜的肿瘤细胞系和RAlc多肽转染细胞用不同浓度的本发明RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法来分析。测量增殖的另一种方法是通过比较在存在或缺乏本发明的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物时所处理细胞的3H-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射性的量进行测量。适宜的阳性对照包括用已知抑制所选细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。可以本领域知道的多种方法来测定体内肿瘤细胞的生长抑制。所述肿瘤细胞可以是过表达RAlc多肽的细胞。与未处理的肿瘤细胞相比，RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物将在体外或在体内抑制表达RAlc多肽的肿瘤细胞的细胞增殖达约25-100%，更优选约30-100%，甚更优选约50-100%或70-100%，在一个实施方案中，抗体浓度为约O.5-30iig/ml。在某些实施方案中，可在细胞培养物中在抗体浓度为约0.5-30iig/ml或约0.5nM至200nM时测量生长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1_10天测量生长抑制。在某些实施方案中，如果以约1yg/kg至约100mg/kg体重施用抗RAlc多肽抗体导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积縮小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗体是体内生长抑制性的。为了选择诱导细胞死亡(凋亡)的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物，可相对于对照评估膜完整性的丧失，这由例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取来指示。PI摄取测定法可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将表达RAlc多肽的肿瘤细胞与单独的培养基或含有适宜的抗RAlc多肽抗体(例如约10iig/ml)、RAlc多肽结合寡肽、RAlc多肽结合有机小分子、其它RAlc拮抗剂、或调控RAlc表达的化合物的培养基一起温育。将细胞温育3天的时间段。每次处理后，清洗细胞并等分(aliquot)到35mm带滤盖的(strainer-capped)的12x75试管中(每支试管lml，每个处理组3支试管)用于去除细胞团块。然后向试管加入PI(10yg/ml)。在一个非限制性例子中，可使用FACSCAN⑧流式细胞仪和FACSCONVERT⑧CellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。可选择那些通过PI摄取确定为诱导统计学显著水平的细胞死亡的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物作为诱导细胞死亡的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物。为了筛选结合RAlc多肽上目的抗体所结合的表位的抗体、寡肽或其它有机小分子、或其它RAlc拮抗剂，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow禾口DavidLane(1988)中所描述的。此测定法可用于确定测试抗体、寡肽、其它有机小分子、和其它RAlc拮抗剂是否与已知的抗RAlc多肽抗体结合相同的位点或表位。或者/另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图(mapping)。例如，可通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。首先对突变体抗体测试与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在不同的方法中，可在竞争测定法中使用对应于RAlc多肽不同区域的肽，使用几种测试抗体或者一种测试抗体和具有已表征或已知表位的抗体。F.依赖抗体的酶介导的前体药物疗法(ADEPT)通过将抗体与前体药物活化酶偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT,所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO88/07378和美国专利4，975，278。可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serrati即rotease)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L);可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如P-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用P-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作"抗体酶"，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature328:457-458(1987))。可如本文所述制备抗体_抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗RAlc抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger等，Nature312:604-608(1984))。G.抗RAlc多肽抗体和变体除了本文所述抗RAlc多肽抗体，设想了可制备抗RAlc多肽抗体变体。抗RAlc多肽抗体可通过将适宜的核苷酸改变引入编码DNA或通过合成期望抗体来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸改变可改变抗RAlc多肽抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。可在本文所述抗RAlc多肽抗体中进行变异，例如使用例如美国专利5，364，934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基酸序列相对于天然序列抗体的改变。任选的是，变异是通过抗RAlc多肽抗体的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较抗RAlc多肽抗体的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统进行氨基酸插入、替代或删除，并对所得变体测试由亲本序列展示的活性来确定可容许的变异。本文提供了抗RAlc多肽抗体和RAlc多肽的片段。例如，在与全长天然抗体或蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于抗RAlc抗体或RAlc多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。抗RAlc抗体和RAlc多肽片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生抗体或多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA，并分离期望片段。还有一种合适的技术牵涉分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望抗体或多肽片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5'和3'引物。优选的是，抗RAlc抗体和RAlc多肽片段与本文所公开的天然抗RAlc多肽抗体或RAlc多肽共享至少一种生物学或免疫学活性。在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见表1标题"优选替代"下所示。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可引入表1中称为"例示替代"的更实质性改变，或者如44下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>对抗RAlc抗体或RAlc多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，于Biochemistry,第2版，pp.73-75，WorthPublishers,NewYork(1975)):(1)非极性的:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不带电荷的、极性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的:Asp(D)、Glu(E)(4)碱性的:Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组(1)疏水性的:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性的Asp、Glu;(4)碱性的His、Lys、Arg;(5)影响侧链取向的残基Gly、Pro;禾口(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点。变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter等，Nucl.AcidsRes.13:4331(1986);Zoller等，Nucl.AcidsRes.10:6487(1987))、盒式诱变(Wells等，Gene34:315(1985))、限制性选择诱变(restrictionselectionmutagenesis)(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA317:415(1986))或其它已知技术以产生抗RAlc多肽抗体或RAlc多肽变体DNA。还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着连续序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了P-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham和Wells，Science244:1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都能发现它(Creighton，TheProteins,W.H.Freeman&Co.，N.Y.;Chothia，J.Mol.Biol.150:1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。任何不涉及保持抗RAlc多肽抗体或RAlc多肽正确构象的半胱氨酸残基也可被替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗RAlc抗体或RAlc多肽中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如人源化或人抗体)。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原_抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和人RAlc多肽之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中有优良特性的抗体用于进一步的开发。编码抗RAlc抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式的抗RAlc抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。H.对抗RAlc抗体和RAlc多肽的修饰对抗RAlc多肽抗体和RAlc多肽的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使抗RAlc抗体或RAlc多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与抗RAlc多肽抗体或RAlc多肽的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如使抗RAlc抗体或RAlc多肽与不溶于水的支持基质或表面交联，以用于抗RAlc抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮_乙酰基)_2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3'-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-l，S-辛烷和诸如甲基_3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺酯等试剂。其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的a-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins-StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco,pp.79-86(1983"，N-末端胺的乙酰化，及任何c-末端羧基的酰胺化。本发明范围内所包括的对抗RAlc抗体或RAlc多肽的另一类共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化样式。"改变天然糖基化样式"在本文中意图指删除一个或多个在天然序列抗RAlc抗体或RAlc多肽中发现的碳水化合物模块(moiety)(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学或酶促手段删除糖基化)，或添加一个或多个在天然序列抗RAlc抗体或RAlc多肽中不存在的糖基化位点。另外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的质的改变，牵涉所存在的多种碳水化合物模块的本质和比例的改变。抗体和其它多肽的糖基化通常或是N-连接的或是0-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生潜在的糖基化位点。o-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗RAlc抗体或RAlc多肽中添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向原始抗RAlc抗体或RAlc多肽的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于0-连接的糖基化位点)。可任选通过DNA水平的变化来改变抗RAlc抗体或RAlc多肽的氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。增加抗RAlc抗体或RAlc多肽上糖模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO87/05330，及Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259—306(1981)。去除抗RAlc抗体或RAlc多肽上存在的糖模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割多肽上的糖模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等，Meth.Enzvmol.138:350(1987)所述。对抗RAlc抗体或RAlc多肽的另一类共价修饰包括，以美国专利4，640，835;4，496，689;4，301，144;4，670，417;4，791，192或4，179，337所述方式，将抗体或多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧亚烷(polyoxyalkylene)。抗体或多肽还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol，A.Ed.，1980。还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的抗RAlc抗体或RAlc多肽，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的抗RAlc抗体或RAlc多肽。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的抗RAlc抗体或RAlc多肽的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于抗RAlc抗体或RAlc多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的抗RAlc抗体或RAlc多肽的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使抗RAlc抗体或RAlc多肽易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988));c-myc标签及其抗体8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体(Evan等，MolecularandCellularBiology5:3610-3616(1985));及单纯疱疹病毒糖蛋48白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等，ProteinEngineering3(6):547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等，BioTechnology6:1204-1210(1988));KT3表位肽(Martin等，Science255:192-194(1992));a-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.266:15163-15166(1991));及T7基因IO蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6393-6397(1990))。在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括抗RAlc抗体或RAlc多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为"免疫粘附素")，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式(跨膜结构域删除或失活)的抗RAlc抗体或RAlc多肽置换Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、C^区、C^区和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日授权的美国专利5，428，130。I.抗RAlc抗体和RAlc多肽的制备下面的描述主要涉及通过培养用包含编码抗RAlc抗体和RAlc多肽的核酸的载体转化或转染的细胞来制备抗RAlc抗体和RAlc多肽。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备抗RAlc抗体和RAlc多肽。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜的氨基酸序列或其部分(参见例如Stewart等，Solid-PhaseP印tideSynthesis,W.H.FreemanCo.，SanFrancisco,CA，1969;Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用AppliedBiosystemsP印tideSynthesizer(FosterCity，CA)依照制造商的说明书来完成。抗RAlc抗体或RAlc多肽的多个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成期望的抗RAlc抗体和RAlc多肽。1.编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的DNA的分离编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述抗RAlc抗体或RAlc多肽mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人的抗RAlc抗体或RAlc多肽DNA可以方便地从以人组织制备的cDNA文库获得。抗RAlc抗体或RAlc多肽编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化核酸合成)获得。可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al，NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989所述。分离编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrook等，见上文；Dieffenbach等，PCRPrimer:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)。用于筛选cDNA文库的技术是本领域公知的。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射标记物，像"P-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook等，见上文。在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。所述分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断的氨基酸序列筛选选定的cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook等，见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工的中间产物。2.宿主细胞的选择和转化将宿主细胞用本文所述用于抗RAlc抗体或RAlc多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、PH等等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler，ed.，IRLPress,1991和Sambrook等，见上文。真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、CaPOp脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook等，见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumt咖efaciens)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw等，Gene23:315(1983)和1989年6月29日公开的W089/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham和vanderEb，Virology52:456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4，399，216。进入酵母的转化通常依照VanSolingen等，J.Bact.130:946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown等，MethodsinEnzvmology185:527-537(1990)和Mansour等，Nature336:348-352(1988)。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株匪294(ATCC31,446);大肠杆菌X1776(ATCC31,537);大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53，635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌)(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志贺氏菌属(Shigella),以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、禾口链霉菌属(Str印tomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用50于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA;大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonAptr3;大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55，244)，其具有完整基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degPompTkanr;大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonAptr3phoAE15(argF-lac)169degPompTrbs7ilvGkanr;大肠杆菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6;及具有1990年8月7日授权的美国专利4，946，783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。全长抗体、抗体片段及抗体融合物蛋白质可在细菌中制备，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如当治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联且免疫偶联物自身显示出肿瘤细胞破坏的效力时。全长抗体在循环中具有较长半衰期。大肠杆菌中的制备更快且更加省钱。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US5，648，237(Carter等人)，US5，789，199(JoIy等人)，和US5，840，523(Simmons等人)，它们描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，在此收入这些专利作为参考。表达后，从大肠杆菌细胞糊在可溶性级分中分离抗体，并且可例如根据同种型通过蛋白A或G柱来纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法类似的进行。除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach和Nurse，Nature290:140(1981);EP139，383，1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4，943，529;Fleer等，Bio/Technology9:968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(丽98-8C，CBS683，CBS4574;Louvencourt等，J.Bacteriol.154(2):737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilar咖)(ATCC36，906;VandenBerg等，Bio/Technology8:135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(K.marxia皿s);亚罗酵母属(Yarrowia)(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183，070;Sreekrishna等，J.BasicMicrobiol.28:265-278(1988));假丝酵母属(Candida);瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234);粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5259-5263(1979));许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)(EP394，538，1990年10月31日公开);和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(W091/00357,1991年1月10日公开)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidul雄)(Balance等，Biochem.Biophys.Res.Comm皿.112:284-289(1983);Tilburn等，Gene26:205-221(1983):Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMB0J.4:475-479(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropicyeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs，269(1982)。适用于表达糖基化抗RAlc抗体或RAlc多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞诸如棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、烟草的细胞培养物。。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许的昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodopterafrugiperda(毛虫)、埃及伊岐Aedesaegypti(岐子)、白纹伊岐Aedesalbopictus(岐子)、黑月复果虫虽Drosophilamelanogaster(果蝇)、和家蚕Bombyxmori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographacalifornica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyxmori)NPV的Bm_5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。然而，对脊椎动物细胞最感兴趣，而且通过培养(组织培养)脊椎动物细胞来繁殖已经成为常规流程。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(C0S-7，ATCCCRL1651);人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，1977，J.GenVirol.36:59);幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CH0，Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216);小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather,1980，Biol.R印rod.23:243-251);猴肾细胞(CV1，ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VER0-76，ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝细胞(H印G2，HB8065);小鼠乳腺肿瘤(匪T060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等，1982，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44—68);MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(H印G2)。用上述用于抗RAlc抗体或RAlc多肽生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。3.复制型载体的选择和使用可以将编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。RAlc多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的a-因子前导序列，后者见美国专利或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP362，179)、或1990年11月15日公开的WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒PBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2ii质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等，1979，Nature282:39;Kingsman等，1979，Gene7:141;Tschemper等，1980，^10:157)。trpl基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了选择标志(Jones，1977，Genetics85:12)。表达和克隆载体通常包含与编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括P-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等，Nature275:615(1978);Goeddel等，Nature281:544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，NucleicacidsRes.8:4057(1980);EP36，776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.7:149(1968);Holland，Biochemistry17:4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛_3_磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖_6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP73,657。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗RAlc抗体或RAlc多肽受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的區2，211，504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组获得的启动子、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由53热休克启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加转录。已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、a-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于抗RAlc抗体或RAlc多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗RAlc抗体或RAlc多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成抗RAlc抗体或RAlc多肽的其它方法、载体和宿主细胞见Gething等，Nature293:620-625(1981);Mantei等，Nature281:40-46(1979);EP117，060;和EP117,058。4.培养宿主细胞可以在多种培养基中培养用于生成本发明抗RAlc抗体或RAlc多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham等，1979，Meth.Enz.58:44;Barnes等，1980，Anal.Biochem.102:255;美国专利4，767，704;4，657，866;4，927，762;4，560，655;或5，122，469;WO90/03430;WO87/00195;或U.S.PatentRe.30，985。任何这些培养基可以根据需要补充激素或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、PH等即先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显然的。5.检测基因扩增/表达基因的扩增或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列RAlc多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与RAlc多肽DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。6.纯化抗RAlc抗体和RAlc多肽可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的抗RAlc抗体和RAlc多肽。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促裂解使其从膜释放。抗RAlc抗体和RAlc多肽表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化抗RAlc抗体和RAlc多肽。下面的流程是合适纯化流程的例示在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE;硫酸铵沉淀；使用例如S印hadexG_75的凝胶过滤；蛋白AS印harose柱以除去污染物诸如IgG;及结合抗RAlc抗体和RAlc多肽的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher，MethodsinEnzymology，182(1990);Scopes，ProteinPurification:Princioes肌dPractice,Springer-Verlag，NewYork(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用生成方法的性质和所产生的具体抗RAlc抗体或RAlc多肽。在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等，Bio/Technology10:163-167，1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单地说，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓縮滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元浓縮来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人Yl、Y2或Y4重链的抗体(Lindmark等，1983，J.Immunol.Meth.62:1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人Y3(Guss等，1986，EMB0J.5:1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含Q3结构域的抗体而言，可使用BakerbondABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行低pH疏水相互作用层析。J.RAlc多肽和编码RAlc多肽的核酸一具体形式和应用编码RAlc多肽的核苷酸序列(或其互补序列)在分子生物学领域具有多种应用，包括用作杂交探针，用于染色体和基因作图，及用于生成反义RNA和DNA探针。编码RAlc多肽的核酸还可用于通过本文所述重组技术来制备RAlc多肽，其中那些RAlc多肽可用于例如制备本文所述抗RAlc抗体。全长天然序列RAlc多肽基因或其部分可作为杂交探针用于cDNA文库以分离与本文所公开的天然RAlc多肽序列具有期望序列同一性的其它cDNA(例如那些编码RAlc多肽的天然存在变体或来自其它物种的RAlc多肽的cDNA)。任选的是，探针的长度为约20个到约50个碱基。杂交探针可衍生自全长天然核苷酸序列的至少部分新的区域，其中那些区域不需要过多试验就可以确定，或者来自包含天然序列RAlc多肽的启动子、增强子元件和内含子的基因组序列。举例来说，筛选方法将包括使用已知DNA序列分离RAlc多肽基因的编码区以合成约40个碱基的选定探针。杂交探针可用多种标记物标记，包括放射性核苷酸，诸如32P或35S，或酶标记物，诸如通过亲合素/生物素偶联系统与探针偶联的碱性磷酸酶。具有与本发明RAlc多肽基因的序列互补的序列的标记探针可用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA文库以确定探针与此类文库的哪些成员杂交。下面的实施例更详细的描述了杂交技术。使用本文所公开的方法，本申请中公开的任何EST序列可类似地用作探针。编码RAlc多肽的核酸的其它有用片段包括反义或有义寡核苷酸，包括能够结合靶RAlc多肽mRNA(有义)或RAlc多肽DNA(反义)序列的单链核酸序列(或是RNA或是DNA)。依照本发明，反义或有义寡核苷酸包含RAlcDNA编码区的片段。此类片段通常包含至少约14个核苷酸，优选约14至30个核苷酸。根据编码给定蛋白质的cDNA序列来衍生反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein和Cohen，CancerRes.48:2659，1988和vanderKrol等，BioTechniques6:958，1988。反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，其通过多种手段之一阻断靶序列的转录或翻译，所述手段包括双链体的降解增强、转录或翻译的过早终止、或其它手段。此类方法涵盖在本发明中。反义寡核苷酸因此可用于阻断RAlc蛋白质的表达，其中所述RAlc蛋白质可能在哺乳动物中起诱导癌症的作用。反义或有义寡核苷酸还包括具有经过修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖键(linkage)，诸如WO91/06629中所述)的寡核苷酸，且其中此类糖键对内源核酸酶有抗性。具有抗性糖键的此类寡核苷酸在体内是稳定的(即能够抵抗酶促降解)，但保留了能够结合靶核苷酸序列的序列特异性。用于反义结合的优选基因内位点包括掺入基因可读框(ORF)的翻译起始密码子(5'-AUG/5'-ATG)或终止密码子(5'-UAA、5'-UAG和5-UGA/5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA)的区域。这些区域指mRNA或基因中涵盖从翻译起始或终止密码子起任一方向(即5'或3')的约25个至约50个毗连核苷酸的部分。用于反义结合的其它优选区域包括内含子；外显子；内含子-外显子连接处；可读框(ORF)或"编码区"，即翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域；mRNA的5'巾冒，其包含经由5'-5'三磷酸键与mRNA的最5'端残基连接的^-甲基化鸟苷残基，包括5'帽结构自身以及与帽相邻的前50个核苷酸；5'非翻译区(5'UTR)，即mRNA中从翻译起始密码子起5'方向的部分，因此包括mRNA中5'帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸；和3'非翻译区(3'UTR)，即mRNA中从翻译终止密码子起3'方向的部分，因此包括mRNA中翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸或基因上的相应核苷酸。可用于抑制RAlc多肽表达的优选反义化合物的具体例子包括包含经修饰骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有经修饰骨架的寡核苷酸包括那些在骨架中保留磷原子的以及那些在骨架中没有磷原子的寡核苷酸。为了本说明书的目的，而且有时候在本领域内参考，在其核苷间骨架中没有磷原子的经修饰寡核苷酸也可认为是寡核苷酸。优选的经修饰寡核苷酸骨架包括例如具有正常3'-5'键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯(aminoalkylphosphotriester)、甲基和其它烃基膦酸酯包括3'_亚烃基膦酸酯(3'-alkylenephosphonate)、5'_亚烃基膦酸酯(5'-alkylen印hosphonate)和手性膦酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯(3'-aminophosphoramidate)和氨烃基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫羰氨基磷酸酉旨(thionophosphoramidate)、硫羰烃基膦酸酉旨(thionoalkylphosphonate)、石t幾:S基石粦酸三酉旨(thionoalkylphosphotriester)、石西代磷酸酯(selenophosphate)和溴代磷酸酯(borano-phosphate)，它们的2'_5'连接类似物，及那些具有反向极性的类似物，其中一个或多个核苷酸间键是3'到3'、5'到5'、或2'到2'键。具有反向极性的优选寡核苷酸在最3'端核苷酸间键包含单一3'到3'键，即可以是无碱基(核碱基缺失或以羟基取代)的单一反向核苷残基。多种盐、混合盐和游离酸的形式也包括在内。教导含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3，687，808;4，469，863;4，476，301;5，023，243;5，177，196;5，188，897;5，264，423;5，276，019;5，278，302;5，286，717;5，321，131;5，399，676;5，405，939;5，453，496;5，455，233;5，466，677;5，476，925;5，519，126;5，536，821;5，541，306;5，550，111;5，563，253;5，571，799;5，587，361;5，194，599;5，565，555;5，527，899;5，721，218;5，672，697;和5，625，050，在此收入每一项作为参考。其中不含磷原子的优选经修饰寡核苷酸骨架具有由短链烃基或环烃基核苷间键、混合杂原子和烃基或环烃基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括那些具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；核糖乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯(sulfamate)骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺酸酯和磺酰胺(sulfonamide)骨架；酰胺骨架；及其它具有混合N、0、S和CH2组成部分的骨架。教导此类寡核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5，034，506;5，166，315;5，185，444;5，214，134;5，216，141;5，235，033;5，264，562;5，264，564;5，405，938;5，434，257;5，466，677;5，470，967;5，489，677;5，541，307;5，561，225;5，596，086;5，602，240;5，610，289;5，602，240;5，608，046;5，610，289;5，618，704;5，623，070;5，663，312;5，633，360;5，677，437;5，792，608;5，646，269;和5，677，439，在此收入每一项作为参考。在其它优选的反义寡核苷酸中，核苷酸单元的糖和核苷间键，即骨架，用新基团取代。保持碱基单元以与适宜的核酸靶化合物杂交。已显示出具有卓越杂交特性的这样一种寡聚化合物，即寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架以含酰胺骨架取代，特别是氨乙基甘氨酸骨架。核碱基得到保留并直接或间接结合骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5，539，082;5，714，331;和5，719，262，在此收入每一项作为参考。PNA化合物的更多教导可参见Nielsen等，1991，Science254:1497-1500。优选的反义寡核苷酸掺入了硫代磷酸酯(phosphorothioate)骨架或杂原子骨架，特别是_CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N(CH3)-0_CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或匪I骨架)、-CH2-0-N(CH3)-(^2-、上述美国专利5，489，677中描述的-CH2-N(CH3)_N(CH3)-(^2-禾口-0-^(^3)-(^2-(^2-(其中天然磷酸二酯骨架表示为-0--0-(^2-)、及上述美国专利5，602，240的酰胺骨架。上述美国专利5，034，506的具有吗啉代骨架结构的反义寡核苷酸也是优选的。经修饰的寡核苷酸还可以包含一种或多种取代糖模块。优选的寡核苷酸在2'位置包含如下之一0H;F;0-烷基，S-烷基，或N-烷基；0-烯基，S-烯基，或N-烯基；0-炔基，S-炔基，或N-炔基；或0-烃基-0-烃基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的Q到C10烷基或C2到C10烯基和炔基。特别优选的是0[(CH2)n0]mCH3、0(CH2)n0CH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)n0NH2、和0(CH2)n0N[(CH2)nCH3)]2，其中n禾卩m是1到约10。其它优选的反义寡核苷酸在2'位置包含如下之一Q到Q。低级烃基，取代的低级烃基，烯基，炔基，烃芳基，芳烃基，0-烃芳基或0-芳烃基，SH，SCH3，0CN，Cl，Br，CN，CF3，0CF3，S0CH3，S02CH3，0N02，N02，N3，NH2，杂环烃基，杂环烃芳基，氨烃基氨基(aminoalkylamino)，聚烃基氨基(polyalkylamino)，取代的甲硅烷基，RNA切割基团(cleavinggroup)，报道基团(r印ortergroup)，嵌入剂，用于提高寡核苷酸的药动学性质的基团，或用于提高核苷酸的药效学性质的基团，及具有相似性质的其它取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-0-(^2(:1120(:113，也称作'_0-(2-甲氧基乙基)或2'-M0E)(Martin等，1995，Helv.Chim.Acta78:486-504)即烃氧基烃氧基(alkoxyalkoxy)。进一步优选的修饰包括2'-二甲氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH^基团，也称作2'-DMAOE，如下文实施例所述，和2'-二甲氨基乙氧基乙氧基(本领域也称作2'-O-二甲氨基乙氧基乙基或2'-DMAE0E)，即2'-0-(CH2)2_0-(CH2)2_N(CH3)2。进一步优选的修饰包括锁定核酸(LockedNucleicAcid，LNA)，其中2'-羟基与糖环的3'或4'碳原子相连，由此形成双环糖模块。所述键优选是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(methelyne)(-CH厂)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备参见W098/39352和W099/14226。其它优选的修饰包括2'_甲氧基(2'-0-CH3)，2'-氨丙氧基(2'-0CH2CH2CH2NH2)，2'-烯丙基(2'_CH2_CH=CH2)，2'-0-烯丙基(2'-0_CH2-CH=CH》和2'_氟(2'-F)。2'-修饰可以在阿拉伯糖(arabino)(上)位或核糖(ribo)(下)位。优选的2'_阿拉伯糖修饰是2'_F。也可在寡核苷酸上的其它位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷酸的糖的3'位置或在2'-5'连接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，诸如用环丁基模块取代呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖。教导此类经过修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4，981,957;5，118,800;5,319,080;5，359,044;5，393,878;5,446，137;5，466，786;5，514，785;5，519，134;5，567，811;5，576，427;5，591，722;5，597，909;5，610，300;5，627，053;5，639，873;5，646，265;5，658，873;5，670，633;5，792，747;和5，700，920，在此完整收入每一项作为参考。寡核苷酸还可包括核碱基(本领域内通常简称为"碱基")修饰或替代。在用于本文时，"未修饰的"或"天然的"核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核碱基包括其它合成的和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烃基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烃基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-CeC-ch3或-CH2-CeCH)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮(azo)尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基(thiol)、8-硫代烃基(让10&11^1)、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][l，4]苯丙噁嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯丙噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹环(G-clamp)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5，4-b][l，4]苯丙噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5_b]口引哚_2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3'，2':4，5]吡咯[2，3_d]嘧啶_2_酮)。经修饰的核碱基还可包括那些其中嘌呤或嘧啶碱基用其它杂环，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2_氨基吡啶和2-吡啶酮取代的核碱基。更多核碱基包括美国专利3，687，808中公开的那些；TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,pages858-859，Kroschwitz，J.L，ed.JohnWiley&Sons,1990中公开的那些；和Englisch等，AngewandteChemie，InternationalEdition,1991，30，613中公开的那些。这些核碱基中的某些特别可用于提高本发明寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出将核酸双链体的稳定性提高O.6-1.2°C(Sanghvi等，AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton，1993，pp.276-278)而且是优选的碱基取代，甚至在与2'-0-甲氧基乙基糖修饰结合时更加优选。教导经修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利3，687，808，以及美国专利4，845，205;5，130，302;5，134，066;5，175，273;5，367，066;5，432，272;5，457，187;5，459，255;5，484，908;5，502，177;5，525，711;5，552，540;5，587，469;5，594，121，5，596，091;5，614，617;5，645，985;5，830，653;5，763，588;6，005，096;5，681，941;和5，750，692，在此收入每一项作为参考。反义寡核苷酸的另一种修饰牵涉将提高寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种模块或偶联物(conjugate)化学连接至寡核苷酸。本发明的化合物可包含与功能基团诸如伯羟基或仲羟基共价连接的偶联基团(conjugategroup)。本发明的偶联基团包括嵌入剂、报道分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、提高寡聚体药效学性质的基团、和提高寡聚体药动学性质的基团。典型的偶联基团包括胆固醇、脂质、阳离子脂质、磷脂、阳离子磷脂、生物素、吩嗪、叶酸(folate)、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、和染料。在本发明的内容中，提高药效学性质的基团包括提高寡聚体摄取、提高寡聚体对降解的抗性、或增强与RNA的序列特异性杂交的基团。在本发明的内容中，提高药动学性质的基团包括提高寡聚体摄取、分布、代谢或排泄的基团。偶联物模块包括但不限于脂质模±央，诸如胆固醇模土央(Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6553-6556)，胆59酸(Manoharan等，1994，Bioorg.Med.Chem.Let.4:1053-1060)，硫醚例如己基_S_三苯甲基硫醇(tritylthiol)(Manoharan等，1992，Arm.N.Y.Acad.Sci.660:306-309;Manoharan等，1993，Bioorg.Med.Chem.Let.3:2765-2770)，硫代胆固醇(0berhauser等，1992，Nucl.AcidsRes.20:533-538)，脂肪族链例如十二烷二醇或^^一烷基残基(Saison-Behmoaras等，1991，EMB0J.10:1111-1118;Kabanov等，1990，FEBSLett.259:327-330;Svinarchuk等，1993'Biochimie75:49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-0-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，1995，TetrahedronLett.36:3651-3654;Shea等，1990，Nucl.AcidsRes.18:3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等，1995，Nucleosides&Nucleotides14:969-973)，或醋酸金刚烷(Manoharan等，1995，TetrahedronLett.36:3651-3654)，棕榈基模±央(Mishra等，1995，Biochim.Biophys.Acta1264:229-237)，或十八烷胺或己氨基-羰基-氧胆固醇模块。本发明的寡核苷酸还可与活性药物物质偶联，例如阿司匹林(aspirin)、华法林(warfarin)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺酰肌氨酸(dansylsarcosine)、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸(flufen咖icacid)、亚口十酸(folinicacid)、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、二氮草杂革(diaz印ine)、口引哚美辛(indomethacin)、巴比妥酸盐(barbiturate)、头孢菌素(cephalosporin)、磺胺药(sulfadrug)、抗糖尿病药(antidiabetic)、抗菌药(antibacterial)或抗生素。寡核苷酸_药物偶联物及其制备参见美国系列申请09/334，130(1999年6月15日提交)和美国专利4，828，979;4,948,882;5，218，105;5，525，465;5，541，313;5，545，730;5，552，538;5，578，717，5，580，731;5，580，731;5，591，584;5，109，124;5，118，802;5，138，045;5，414，077;5，486，603;5，512，439;5，578，718;5，608，046;4，587，044;4，605，735;4，667，025;4，762，779;4，789，737;4，824，941;4，835，263;4，876，335;4，904，582;4，958，013;5，082，830;5，112，963;5，214，136;5，082，830;5，112，963;5，214，136;5，245，022;5，254，469;5，258，506;5，262，536;5，272，250;5，292，873;5，317，098;5，371，241，5，391，723;5，416，203，5，451，463;5，510，475;5，512，667;5，514，785;5，565，552;5，567，810;5，574，142;5，585，481;5，587，371;5，595，726;5，597，696;5，599，923;5，599，928;和5，688，941，在此收入每一项作为参考。不必对给定化合物中的所有位置作均一的修饰，事实上可以在单一化合物中甚至在寡核苷酸内的单一核苷处掺入超过一种上述修饰。本发明还包括作为嵌合化合物的反义化合物。在本发明的内容中，"嵌合的"反义化合物或"嵌合物"指包含两个或多个在化学上不同的区的反义化合物，特别是寡核苷酸，每个区由至少一个单体单元构成，在寡核苷酸化合物的情况中即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个区，其中寡核苷酸经过修饰而赋予该寡核苷酸以提高的对核酸酶降解的抗性、提高的细胞摄取、或提高的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的额外区可充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合物的酶的底物。举例而言，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的活化导致对RNA耙物的切割，由此大大提高寡核苷酸对基因表达的抑制效率。因此，在使用嵌合寡核苷酸时，与杂交于相同靶区的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，用较短的寡核苷酸通常获得相当的结果。本发明的嵌合反义化合物可形成为如上所述的两种或多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷或寡核苷酸模拟物的复合结构。优选的嵌合反义寡核苷酸在3'_末端掺入至少一个2'修饰的糖(优选2'-0-(CH2)2_0-CH3)以赋予核酸酶抗性，及具有至少4个相连2'_H糖的区域以赋予RNA酶H活性。此类化合物在本领域也称为杂合物(hybrid)或接合物(g即mer)。优选的接合物(g即mer)在由具有至少4个相连2'_H糖的至少一个区分隔的3'-末端和5'末端具有2'修饰的糖(优选2'-0-(CH2)2-0-CH3)的区，且优选掺入硫代磷酸酯骨架键。教导此类杂合物结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5，013，830;5，149，797;5，220，007;5，256，775;5，366，878;5，403，711;5，491，133;5，565，350;5，623，065;5，652，355;5，652，356;和5，700，922，在此完整收入每一项作为参考。依照本发明使用的反义化合物可方便且常规的通过众所周知的固相合成技术来制备。有多家销售商销售用于此类合成的设备，包括例如AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)。另外/或者，可采用本领域已知的用于此类合成的任何其它手段。众所周知使用类似技术来制备寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯和烃基化衍生物。本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物的混合物混合、胶囊化、偶联或以其它方式关联成例如脂质体，受体靶向分子，口服的、直肠的、局部的或其它剂型以帮助摄取、分布或吸收。教导此类摄取、分布或吸收辅助剂型的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利5，108,921;5，354，844;5，416，016;5，459，127;5，521，291;5，543，158;5，547，932;5，583，020;5，591，721;4，426，330;4，534，899;5，013，556;5，108，921;5，213，804;5，227，170;5，264，221;5，356，633;5，395，619;5，416，016;5，417，978;5，462，854;5，469，854;5，512，295;5，527，528;5，534，259;5，543，152;5，556，948;5，580，575;和5，595，756，在此收入每一项作为参考。有义或反义寡核苷酸的其它例子包括那些与有机模块，诸如W090/10048中描述的那些，及提高寡核苷酸对靶核酸序列的亲和力的其它模块，诸如聚_(L-赖氨酸)共价连接的寡核苷酸。而且，嵌入剂，诸如玫瑰树碱(ellipticine)和烷化剂或金属络合物可附着于有义或反义寡核苷酸以调整反义或有义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。可通过任何基因转移方法将反义或有义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，包括例如CaP04介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基因转移载体诸如埃巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)。在一种优选的流程中，将反义或有义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体。使包含靶核酸序列的细胞在体内或回体接触重组逆转录病毒载体。合适的逆转录病毒载体包括但不限于那些衍生自鼠逆转录病毒M-MuLV的那些，N2(衍生自M-MuLV的逆转录病毒)，或命名为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(见W090/13641)。还可通过与配体结合分子形成偶联物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核苷酸序列的细胞，如W091/04753中所述。合适的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子、或结合细胞表面受体的其它配体。优选的是，与配体结合分子的偶联基本不干扰所述配体结合分子结合其相应分子或受体的能力或者阻断有义或反义寡核苷酸或其偶联物型式进入细胞。或者，可通过形成寡核苷酸_脂质复合物将有义或反义寡核苷酸导入包含靶核酸序列的细胞，如W090/10448中所述。有义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选在细胞内由内源脂肪酶解离。反义或有义RNA或DNA分子的长度通常是至少约5个核苷酸，或者长度为至少约6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670，680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860，870，880，890，900，910，920，930，940，950，960，970，980，990，或1000个核苷酸，其中在此内容中术语"约"指所述核苷酸序列长度加或减该长度的10%。还可将探针用于PCR技术以产生用于鉴定密切相关的RAlc多肽编码序列的序列池。编码RAlc多肽的核苷酸序列还可用于构建杂交探针，用于给编码该RAlc多肽的基因作图和用于给患遗传性紊乱的个体作遗传分析。可使用已知技术将本文提供的核苷酸序列定位于染色体和染色体特定区域，诸如原位杂交、针对已知染色体标志的连锁分析、和筛选文库的杂交。可以在测定法中使用RAlc多肽以鉴定参与与RAlc多肽发生的结合相互作用的其它蛋白质或分子。通过此类方法，可鉴定受体/配体结合相互作用的抑制物。参与此类结合相互作用的蛋白质还可用于筛选结合相互作用的肽或小分子抑制物。可设计筛选测定法以发现模拟天然RAlc多肽或RAlc多肽受体的生物学活性的领先化合物。此类筛选测定法将包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。所设想的小分子包括合成的有机或无机化合物。可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质_蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。编码RAlc多肽的核酸或其修饰形式还可用于生成转基因动物或"敲除"动物，它们继而可用于开发和筛选治疗上有用的试剂。转基因动物(例如小鼠或大鼠)指具有包含转基因的细胞的动物，其中将转基因导入动物或产前的动物前体(ancestor)，例如胚胎阶段。转基因指整合到发育成转基因动物的细胞的基因组中的DNA。在一个实施方案中，可依照已建立的技术用编码RAlc多肽的cDNA克隆编码RAlc多肽的基因组DNA，并将该基因组序列用于生成转基因动物，所述转基因动物包含表达编码RAlc多肽的DNA的细胞。用于生成转基因动物，特别是诸如小鼠或大鼠等动物的方法在本领域已经是常规的，参见例如美国专利4，736，866和4，870，009。通常，用组织特异性增强子使RAlc多肽转基因的掺入靶向特定细胞。包含在胚胎阶段导入动物种系的编码RAlc多肽的转基因拷贝的转基因动物可用于检验编码RAlc多肽的DNA表达提高的效果。此类动物可作为测试动物用于测试认为针对例如与其过表达有关的病理状况赋予保护的试剂。依照本发明的这个方面，用所述制剂治疗动物，与携带转基因的未处理动物相比病理状况的发病率下降将表明对该病理状况的潜在治疗性干预。或者，RAlc多肽的非人同源物可用于构建RAlc基因"敲除"动物，它由于编码RAlc多肽的内源基因和导入该动物胚胎干细胞的改变的编码RAlc多肽的基因组DNA之间同源62重组而具有缺陷的或改变的编码RAlc多肽的基因。例如，编码RAlc多肽的cDNA可依照已建立的技术用于克隆编码RAlc多肽的基因组DNA。可以将编码RAlc多肽的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替代，所述另一基因诸如可用于监测整合的、编码选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧翼DNA(5'和3'末端都有)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas和C即ecchi，1987，Cell51:503)。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选择其中所导入DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(参见例如Li等，1992，Cell69:915)。然后将所选细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley,inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCells:APracticalApproach,E.J.Robertson,ed.IRL，Oxford,1987，pp.113—152)。然后可4f嵌合胚植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎足月产生"敲除"动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以根据例如由于缺乏RAlc多肽而具有抵御某些病理状况的能力和形成了病理状况而得到鉴定。编码RAlc多肽的核酸还可用于基因疗法。在基因疗法应用中，将基因导入细胞以实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如用于替代缺陷基因。"基因疗法"包括常规基因疗法和施用基因治疗剂两种，前者通过一次处理获得持续的效果，后者涉及一次或反复施用治疗上有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于在体内阻断某些基因的表达。已经显示可以将短反义寡核苷酸输入它们在其中起抑制剂作用的细胞，尽管由于细胞膜对它们的摄取有限，因而它们的胞内浓度低(Zamecnik等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4143-4146)。可以修饰寡核苷酸以提高它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移到体外的培养细胞中，还是体内的预期宿主的细胞中而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括使用病毒(通常是逆转录病毒)载体的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等，1993，TrendsinBiotechnology11:205-210)。在有些情况中，期望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸来源，所述试剂诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、耙细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，结合与胞吞有关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中经历内化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并增强胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞的技术参见例如Wu等，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432;和Wagner等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3410-3414。关于基因标记和基因疗法方案的综述见Anderson等，1992，Science256:808-813。本文所述编码RAlc多肽的核酸分子或其片段可用于染色体鉴定。在这点上，鉴定新染色体标志的需求在增加，因为根据实际的序列数据，现在只有相对较少的染色体标记试剂可用。本发明的每种RAlc核酸分子都可用作染色体标志。其它在降低或阻断RAlc表达或活性中有用的核酸化合物有核酶。核酶是能够催化对RNA的特异性切割的酶性RNA分子。核酶通过与互补耙RNA发生序列特异性杂交，随后进行内切核酸水解(endo皿cleolytic)切割来起作用。可通过已知技术来鉴定潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点。更多细节参见例如Rossi，CurrentBiology,4:469-471(1994)和PCT公开号WO97/33551(1997年9月18日公开)。K.组合物和药用配制剂本发明还提供了包含RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物及载体的组合物。在一个进一步的实施方案中，所述组合物可包含与其它治疗剂诸如细胞毒剂或生长抑制剂诸如化疗剂组合的RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物。本发明还提供了包含RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物及载体的配制剂。在一个实施方案中，所述配制剂是冻干配制剂或水溶液形式的，包含至少一种药学可接受载体、赋形剂和/和稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编，1980)的治疗用配制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;张力调节剂(tonicifier)，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；或非离子表面活性剂，诸如TWEEN、PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。所述抗体的配制剂优选包含浓度为5-200mg/ml，优选10-100mg/ml的抗体。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。例如，在RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物、或一种或多种此类化合物的组合之外，可能还期望在一种配制剂中含有另一种抗体，例如结合RAlc多肽上不同表位的第二抗RAlc抗体，或针对一些其它靶物诸如影响特定癌生长的生长因子的抗体。或者/另外，所述组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。所述活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol，A.编，1980。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPR0NDEP0T(由乳酸_乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚_0-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地使用标准技术来实现，例如通过无菌滤膜过滤。L.治疗应用RAlc拮抗剂和调控RAlc表达的化合物在缓解细胞应激应答中是有用的，尤其在表达RAlc的癌症诸如前列腺癌中是有用的。对癌细胞中细胞应激应答的缓解通过提高细胞对化疗剂的敏感性而增强对癌症的化疗治疗。RAlc拮抗剂和调控RAlc表达的化合物在用于治疗表达RAlc的癌症的疗法中是有用的，诸如前列腺癌，尤其是在与提高RAlc表达的化疗剂组合时。提高RAlc表达的化疗剂的例子包括诱导细胞应激应答的药剂。提高RAlc表达的化疗剂的具体例子包括但不限于mT0R或Aktl/2抑制剂。在一个实施方案中，联合疗法包含特异性结合RAlc多肽的化合物，诸如抗RAlc抗体或其片段、RAlc结合寡肽、特异性结合RAlc的无机或有机小分子、和其它RAlc拮抗剂诸如适体。在一个具体的实施方案中，所述化合物是抗RAlc抗体。优选的是，所述抗RAlc抗体是偶联至细胞毒剂的。在另一个实施方案中，所述联合疗法包含降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。RAlc表达的升高提供了能与抗RAlc化合物相互作用的RAlc的量的增加。化疗剂与降低或阻断RAlc表达或活性的化合物的联合处理提供了协同效果，导致癌症治疗改善。对于治疗性应用，可单独使用RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物，或者用于与例如激素、抗血管发生剂(antiangiogen)或放射标记的化合物，或者与手术、冷冻疗法、或放疗的联合疗法。RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物可与其它形式的常规疗法联合施用，与常规疗法连续施用、在之前或之后施用。化疗药物诸如TAXOTERE⑥多西他塞(doxetaxel)、TAXOL⑧帕利他塞(paclitaxel)、雌莫司汀(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是较小风险(goodrisk)的患者。在一项治疗性处理中，可以连同一种或多种化疗剂的处理给患者施用RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物。具体而言，本发明涵盖与mT0R或Aktl/2抑制剂的联合疗法。RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物与治疗有效剂量的化疗剂一起施用。Physicians'DeskReference(PDR)公开了已经在多种癌症的治疗中使用的这些药剂的剂量。这些前述化疗药物在治疗上有效的剂量给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、疾病的程度、及有本领域技术的内科医师所熟悉的其它因素、且可以由内科医师确定。将RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物依照已知方法施用给人类患者，诸如静脉内施用，例如作为推注(bolus)或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内或皮下施用抗体、寡肽或有机小分子。RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物的施用可联合其它治疗方案。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，及任意顺序的连续施用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类联合疗法导致协同治疗效果。可能还期望将RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物的施用与针对与特定癌症有关的另一种肿瘤抗原的抗体的施用联合。RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物可与抗激素化合物以此类分子的已知剂量联合，所述化合物例如抗雌激素化合物，诸如他莫昔芬(tamoxifen);抗孕酮化合物，诸如奥那司酮(on即ristone)(见EP616,812);或抗雄激素化合物，诸如氟他米特(flut咖ide)。有时，还给患者共施用心脏保护剂(以预防或降低与疗法有关的心肌功能障碍)或一种或多种细胞因子可能也是有益的。除了上述治疗方案，在抗体、寡肽或有机/无机小分子疗法之前、同时、或之后，可给患者进行手术去除癌细胞或放疗。任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可由于该药剂与RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物的联合作用(协同作用)而降低。为了预防或治疗疾病，施用的剂量和模式可以由内科医师依照已知标准来选择。RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物的适宜剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史及对RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物的响应、及主治医师的判断。恰当的将化合物一次性或在一系列治疗中施用给患者。优选的是，将RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物通过静脉内输注或通过皮下注射来施用。在一个具体的实施方案中，约1yg/kg至约50mg/kg体重(例如约0.l_15mg/kg/剂)的抗RAlc抗体可作为初始侯选剂量施用给患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。剂量给药方案可包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，后续约2mg/kg抗RAlc抗体的每周维持剂量。然而，其它剂量方案也可使用。根据上述因素，典型的每日剂量可在约1Pg/kg到100mg/kg或更大的范围内。对于持续几天或更长时间的重复施用，根据状况，维持治疗直到发生对疾病症状的期望遏制。这种疗法的进展可容易地通过常规方法和测定法，并基于内科医师或其它本领域技术人员知道的标准来监测。在将本发明的抗体蛋白质或抗体片段蛋白质施用给患者之外，本申请涵盖通过基因疗法来施用抗体。编码抗体的核酸的此类施用涵盖在表述"施用治疗有效量的抗体"中。关于使用基因疗法来产生胞内抗体的用途参见例如1996年3月14日公开的WO96/07321。在制备和施用抗体时可以考虑本发明抗体的结合靶的位置。若结合靶是胞内分子(即对于调控RAlc表达的本发明化合物)，则本发明的某些实施方案提供了将抗体或其抗原结合片段导入细胞中结合靶所在位置。在一个实施方案中，本发明的抗体可以胞内表达成胞内抗体(intrabody)。术语"胞内抗体"在用于本文时指在胞内表达且能够选择性结合靶分子的抗体或其抗原结合部分，参见Marasco,GeneTher即y4:11-15(1997);Kontermann，Methods34:163-170(2004);美国专利号6，004，940和6，329，173;美国专利申请公开号2003/0104402;及PCT公开号W02003/077945。胞内抗体的胞内表达可以如下实现，即将编码期望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺乏通常与编码该抗体或抗原结合片段的基因相连的野生型前导序列和分泌信号)导入靶细胞。可以使用将核酸导入细胞的任何标准方法，包括但不限于显微注射，弹道注射，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体，及使用携带目的核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和痘苗病毒载体的转染。可以将编码整个或部分本发明化合物的一种或多种核酸递送至靶细胞，使得一种或多种胞内抗体表达，其能够胞内结合信号传导途径构件多肽和调控一种或多种直接或间接牵涉RAlc表达或活性的细胞途径。另一种使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞的办法是回体(exvivo)。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利4，892，538和5，283，187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至预期宿主的体外培养细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。在一个实施方案中，提供了内在化抗体。抗体可具有某些特征，或者经过修饰后具有此类特征，以致于增强抗体进入细胞的递送。用于实现这一效果的技术是本领域已知的。例如，抗体的阳离子化已知促进其进入细胞的摄取(参见例如美国专利号6，703，019)。脂转染(lipofection)或脂质体也可用于将抗体递送入细胞。若使用抗体片段，则特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片段一般是有益的。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计保留与靶蛋白质序列结合能力的肽分子。此类肽可以化学合成或通过重组DNA技术生成。参见例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:7889-7893(1993)。可通过本领域已知的方法增强抗体进入靶细胞。例如，某些序列诸如衍生自HIVTat或触角足(Ante皿即edia)同源结构域蛋白的那些序列能够指导异源蛋白穿过细胞膜从而有效地摄入。参见例如Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96:4325-4329(1999)。M.诊断和非治疗用途RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物具有多种非治疗性应用。例如，RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物可用于表达RAlc多肽的癌症的分期(例如在放射成像中)。RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物还可在诊断上用于组织分型，其中RAlc多肽可能在一种组织中与另一种组织相比，优选在患病组织中与相同组织类型的正常组织相比差异表达。这些化合物还可用于从细胞中纯化或免疫沉淀RAlc多肽，用于RAlc多肽的体外检测和定量例如在ELISA或Western印迹中，作为纯化其它细胞的一个步骤从混合细胞群中杀死和消除表达RAlc多肽的细胞。RAlc核酸分子可用于生成探针，用于PCR、Northern分析、Southern分析、禾口Western分析。为了测定癌症中的RAlc多肽表达，可利用多种检测测定法。在一个实施方案中，可通过免疫组化(IHC)来分析RAlc多肽过表达。可对来自肿瘤活组织检查的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法，并给予如下RAlc多肽染色强度标准得分0:未观察到染色或者在少于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。得分1+:在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜上有染色。得分2+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。得分3+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。那些RAlc多肽表达得分0或1+的肿瘤可鉴定为未过表达RAlc多肽，而那些得分2+或3+的肿瘤可鉴定为过表达RAlc多肽。或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法诸如INFORM(由Ventana，Arizona销售)或PATHVISION⑧(Vysis，Illinois)以测定肿瘤中RAlc多肽过表达的程度(如果有的话)。还可使用体内检测测定法来评估RAlc多肽过表达或扩增，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物(例如放射性同位素或荧光标记物)的分子(诸如抗体、抗体片段、抗体偶联物、寡肽、或有机小分子、或适体)，然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。本发明还提供了测定细胞是否正在经历细胞应激应答的方法。这些方法在测定特定化疗剂处理是否在癌细胞中诱导细胞应激应答中特别有用。对细胞应激应答的诱导可以给细胞提供存活优势，而且使得细胞对化疗剂的效果较不敏感，或有抗性。如果发现化疗剂在靶癌细胞中诱导细胞应激应答，那么希望缓解细胞应激应答，例如用降低或阻断RAlc表达或活性的化合物，以提高细胞对化疗剂的敏感性。对细胞应激应答的诱导通过监测用化疗剂处理的细胞中的RAlc表达水平来测定。在一个实施方案中，所述方法包括使癌细胞接触化疗剂并测定癌细胞中的RAlc表达水平。将此测试细胞中的RAlc表达水平与接触化疗剂之前的测试细胞中的RAlc表达水平进行比较，接触化疗剂之后的测试细胞中的表达水平与接触治疗剂之前的测试细胞中的表达水平相比的升高指示该化疗剂诱导细胞应激应答。或者，可以将测试细胞中的RAlc表达水平同与测试细胞相同类型的对照细胞中的RAlc表达水平进行比较。在一个具体的实施方案中，所述RAlc表达的升高为大约50倍，或者大约2-50倍，或者大约5-50倍，或者大约10-50倍。正如本领域中已知的，有利的是监测持家基因来作为校准测试和/或对照细胞中的基因表达水平的方法。此测定法中所使用的癌细胞优选是前列腺癌细胞，诸如LNCaP细胞。所述测定法能监测RAlc基因的表达水平或RAlc多肽的表达水平。这些方法中所测定的化疗剂是任何怀疑能够引起细胞应激应答的药剂。在一个实施方案中，所述化疗剂是mTor抑制剂。在另一个实施方案中，所述化疗剂是Aktl/2抑制剂。本发明进一步涵盖筛选化合物以鉴定那些阻止RAlc多肽作用((拮抗剂)的化合物的方法。用于拮抗剂药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文鉴定的基因所编码的RAlc多肽结合或复合，或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物，包括例如抑制细胞表达RAlc多肽。此类筛选测定法包括适应高通量筛选化学文库的测定法，使得它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。可以多种形式进行测定法，包括本领域已经完善的蛋白质-蛋白质结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。用于拮抗剂的所有测定法的共同之处在于它们需要使药物候选物接触本文鉴定的核酸所编码的RAlc多肽，其条件和时间足以使这两种组分相互作用。在结合测定法中，相互作用指结合，所形成的复合物可在反应混合物中分离或检测。在一个具体的实施方案中，将RAlc多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着通常通过用RAlc多肽溶液包被固相表面并干燥来实现。或者，对待固定的RAlc多肽特异的固定化抗体例如单克隆抗体可用于将它锚定到固相表面上。测定法如下进行，将可以用可检测标记物标记的非固定化组分加到固定化组分例如包含锚定组分的包被表面上。在反应完成时，例如通过清洗除去未反应的组分，并检测锚定到固相表面上的复合物。若最初的非固定化组分携带可检测标记物，检测出固定到表面上的标记物表明发生了复合作用。若最初的非固定化组分不携带标记物，可例如通过使用特异性结合已固定复合物的标记抗体来检测复合作用。如果候选化合物与RAlc多肽相互作用但不结合，那么它与该多肽的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的公知方法来测定。此类测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共沉淀、和通过梯度或层析柱的共纯化。另外，可以如Chevray和Nathans,1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5789-5793所公开的，使用Fields及其同事(Fields和Song，1989，Nature(London)340:245-246;Chien等，1991'Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9578-9582)描述的基于酵母的遗传系统来监测蛋白质_蛋白质相互作用。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个空间上离散的模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个起转录激活结构域的功能。上述出版物中描述的酵母表达系统(通称为"双杂交系统")利用了此特性，采用两种杂合蛋白质，在一个中将靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，而在另一个中将候选激活蛋白质与激活结构域融合。GALl-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经由蛋白质-蛋白质相互作用的重建。用P-半乳糖苷酶的显色底物检测包含相互作用多肽的菌落。使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKER)可从Clontech购买。此系统还可延伸到对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。干扰本文鉴定的基因所编码的RAlc多肽与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物可如下测试通常在足以使两种产物相互作用和结合的条件和时间条件下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂(placebo)，作为阳性对照。如上所述监测混合物中存在的RAlc多肽和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应物中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰RAlc多肽与其反应配偶体的相互作用。为了测定拮抗剂，可将RAlc多肽与要筛选特定活性的化合物一起加到细胞中，在存在RAlc多肽时该化合物抑制目的活性的能力表明，该化合物是RAlc多肽的拮抗剂。或者，可如下检测拮抗剂，将RAlc多肽和潜在的拮抗剂与膜结合的RAlc多肽受体或所编码的受体在适于竞争性抑制测定法的条件下组合。RAlc多肽可进行标记，诸如通过放射性标记，使得与受体结合的RAlc多肽分子的数目可用于测定潜在拮抗剂的效力。编码受体的基因可通过本领域技术人员知道的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选。Coligan等，1991，CurrentProtocolsinImmun.1(2):Ch即ter5。优选的是，采用表达克隆，其中从对RAlc多肽有响应的细胞制备多腺苷酸化RNA，将从此RNA构建的cDNA文库分成几个集合，并用于转染COS细胞或对RAlc多肽没有响应的其它细胞。使在载玻片上培养的转染细胞暴露于经过标记的RAlc多肽。可通过多种手段来标记RAlc多肽，包括碘化或包含位点特异性蛋白质激酶的识别位点。固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合，制备子集，并用相互作用的子集进行再次转染和再次筛选过程，最后产生编码推定受体的单个克隆。作为受体鉴定的备选方法，可使经标记的RAlc多肽与表达受体分子的细胞膜或提取制备物光亲和性相连。通过PAGE解析交联物质并对X-射线胶片曝光。可切下包含受体的标记复合物，解离成肽片段，并进行蛋白质微量测序。从微量测序获得的氨基酸序列可用于设计一组简并寡核苷酸探针，用于筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。在用于拮抗剂的另一种测定法中，在存在候选化合物时将表达受体的哺乳动物细胞或膜制备物与经过标记的RAlc多肽一起温育。然后测量所述化合物增强或阻断此相互作用的能力。N.制品和试剂盒本发明的另一个实施方案是包含可用于治疗表达RAlc多肽的癌症(诸如前列腺癌)的物质的制品。所述制品包括容器及容器上或与容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述癌症疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可剌穿的塞子的药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是RAlc拮抗剂或调控RAlc表达的化合物。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗癌症。所述标签或包装插页进一步包含关于对癌症患者施用所述抗体、寡肽或有机/无机小分子组合物的说明书。另外，所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于表达RAlc多肽的细胞杀伤测定法、用于自细胞纯化或免疫沉淀RAlc多肽、和测定对细胞应激应答的诱导的测定法。为了分离和纯化RAlc多肽，所述试剂盒可包含与珠子(例如s印harose珠子)偶联的抗RAlc抗体、抗RAlc抗体片段、抗RAlc抗体偶联物、寡肽、有机/无机小分子、或其它结合RAlc的拮抗齐U。可提供包含用于RAlc多肽体外检测和定量(例如在ELISA或Western印迹中进行的)的抗RAlc抗体、抗RAlc抗体片段、抗RAlc抗体偶联物、寡肽、有机/无机小分子、或其它结合RAlc的拮抗剂。与制品一样，所述试剂盒包括容器及容器上或与容器相连的标签或包装插页。所述容器装有包含至少一种本发明抗RAlc抗体、抗RAlc抗体片段、抗RAlc抗体偶联物、寡肽、有机/无机小分子、或其它结合RAlc的拮抗剂的组合物。可包括装有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的别的容器。所述标签或包装插页可提供该组合物的描述以及意图体外或检测使用的说明书。包括以下实施例以表明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当领会，以下实施例中所公开的技术代表发明人所发现的、在本发明的实施中运行良好的技术，如此可以认为这些技术构成实施本发明的优选模式。然而，依照本公开，本领域技术人员应当领会，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以在所公开的具体实施方案中产生许多变化，且仍获得相像的或类似的结果。通过提及明确而完整地收录整篇说明书中所引用的所有参考文献。实施例实施例l:RAlc表达使用AffymetrixHGU133P寡聚物阵列(GeneLogic)检查了数种组织和肿瘤中的RAlc表达。在GeneLogic公司(Gaithersburg，MD)通过用设计成与人RAlc3'UTR(NMJ)30774的碱基2349-2742)杂交的探针测定寡核苷酸微阵列(HG-U133，Affymetrix)评估了RAlc表达，如先前所记载的(Shen-0ng等，CancerRes.2003:63(12):3296-3301)。结果显示了前列腺组织中的RAlc表达显著高于任何其它测试组织(图1A)。另外，癌性前列腺组织中的RAlc表达显著高于正常前列腺组织中的表达(图1A)。在数份正常的和患病的前列腺样品中进行的一项更相近的检查(图IB)显示了正常前列腺组织和良性前列腺肥大具有相似的RAlc表达水平，而前列腺上皮间新生物(neoplasm)样品具有比那两种组织显著更低量的RAlc表达，而且Gleason得分为7的三份不同腺癌样品具有比那两种组织显著更高量的RAlc表达。实施例2:对RAlc表达的调控(a)细胞因子对RAlc表达的影响—项先前的研究发现了一种永生化前列腺细胞系中的RAlc表达受到对该细胞施用白介素6(IL-6)的增强(Weng等，J.Cell.Biochem.96:1034-1048(2005))。因而，测i式了对LNCaP细胞(一种永生化、雄激素敏感性前列腺癌细胞系)施用IL-6和其它细胞因子的效果。将LNCaP细胞以相等的密度(大约0.5xl(f个细胞/孔)涂布在六孔板中，并在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM:F12K培养基中于37。C在5XC02中培养48小时，之后用无酚红的完全培养基或无血清、无酚红的培养基替换，所述培养基含有所示浓度的IL-6、胰岛素、EGF、或IGF-1。IL-6、EGF、和IGF-1处理进行24小时，而胰岛素处理进行7小时。处理后，通过机械提升来收获细胞。使用RNAeasyTM试剂盒(Qiagen)和DNA酶处理自所收获的细胞分离RNA。使用来自PEBiosystems和Q-PCR系统(TaqmanTM，PEBiosystems)的试剂依照制造商的指示实施定量实时RT-PCR(Q-PCR)。所使用的Q-PCR引物为正向CCCATCATCTATGGTGCCAAA(SEQIDNO:4)，反向TCCTTGTCACAGCTGATCTTGAA(SEQIDNO:5)。所使用的探针为CCAAACAGATCAGAACACGGGTGCTG(SEQIDNO:6)。结果在图2A和2B中显示为使用如下公式通过与核糖体蛋白L19(RPL19)比较而标准化的RAlc值2KPU9平均Cty^KAk平均ct值结果显示了，与较早的报告一致，IL-6处理显著增强完全培养基处理的细胞中的RAlc表达，超过对照水平(见图2A)。虽然对在无血清培养基中培养的细胞的EGF和IGF-1处理观察到提高的RAlc表达，超过在完全培养基中培养的对照细胞中所看到的，但是该表达没有显著不同于在无血清培养基中培养的对照细胞中所观察到的(见图2A，并与图4B和14A比较)。类似地，与培养基匹配的对照细胞相比，胰岛素处理对RAlc表达没有显著影响(图2B)。RPL19的Ct值在每个实验的各样品间是一致的，而且在完全培养基处理的细胞与无血清培养基处理的细胞间也是一致的。如此，这些实验证明了IL-6处理提高所处理的LNCaP细胞中的RAlc表达，超过相关对照细胞，而且还提示，血清剥夺可能也独立于IL_6处理而提高细胞中的RAlc表达。进一步调查了这两项发现。为了评估IL-6处理上调RAlc表达的时机，实施了LNCaP细胞中的时间进程研究。将细胞以相等的密度(大约O.5xl(f个细胞/孔)涂布在六孔板中，并在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM:F12K培养基中于37。C在5%C02中培养72小时，之后先用IL-6处理(24小时处理样品)。因此，自涂布至实验终止的总时间是96小时。细胞时间点处理是交错的，使得在同一时间通过机械提升来收获所有样品。将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗一次，之后使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)裂解和分离RNA。在RNA分离期间用DNA酶处理所有样品。使用上文所述Q-PCR系统、引物、和探针实施Q-PCR，并如上所述将结果相对于RPL19标准化。结果显示于图2C。RAlc表达应答IL_6处理在4小时时升高，而且在8小时时达到峰值。24小时处理也升高，超过对照细胞RAlc表达，但是与在4小时时间点观察到71的水平相似。此结果提示，RAlc是LNCaP细胞中IL-6途径的早期靶基因。(b)血清剥夺对RAlc表达的影响还实施了实验来进一步评估血清剥夺对LNCaP细胞的影响。将细胞以相等的密度(大约0.5x106个细胞/孔)涂布在六孔板中并让其在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM:F12K培养基中于37t:在5XC02中静置24小时。将无血清且无酚红的培养基("50/50")添加至细胞。将所示量的胎牛血清(FBS)添加至某些样品，而且处理持续18小时。温育后，通过机械提升来收获细胞，并如上所述使用RNAeasyTM试剂盒(Qiagen)分离RNA，在RNA分离期间用DNA酶处理。使用Q-PCR系统和试剂(PEBiosystems)及实施例2(a)中所描述的引物和探针，如实施例2(a)中所述实施Q-PCR。结果如上所述相对于RPL19标准化。在50/50培养基中，在血清的缺乏与RAlc表达的升高之间显然有相关性(图3A)。随着添加至细胞的胎牛血清的百分比升高，RAlc表达的量降低(图3A)。如此，RAlc表达表现出受到对正常细胞系统施加应激的条件(诸如血清剥夺和IL-6处理)的诱导。使用另一类无血清培养基(即RPMI)测试时的结果是类似的。进一步研究指示，RAlcmRNA在血清剥夺下的升高不仅仅是由于血清所携带的雄激素的消除。用活性碳(CDS)处理肽牛血清以消除雄激素和其它有机小组分(诸如生物活性脂)。在补充有CDS的培养基中培养的LNCaP细胞以与在具有完全胎牛血清的培养基中培养的细胞相比类似的水平表达RAlc。相反，在无血清的培养基中培养的细胞表达升高的RAlc，正如先前所观察到的。DHT处理遏制所有条件下的RAlc表达。(c)血清剥夺对IL-6处理的LNCaP细胞中的细胞周期调控的影响在IL-6处理前一天，将LNCaP细胞以0.5xl06个细胞/孔的密度涂布在六孔板中。涂布后一天，用新鲜的完全培养基或无血清且无酚红的培养基更换培养基，且某些孔另外用10或50ng/mLIL-6处理。处理于37。C在5%C02中持续48小时，此时使用lmLIX胰蛋白酶/10mMEDTA自板中取出细胞，并用冷的PBS清洗两次。然后将细胞彻底重悬在冷的100%乙醇中并保持于41:直至分析。为了碘化丙啶(PI)染色，将细胞旋转下来，然后重悬在lmLPI染色液(0.4%NP40，0.05mg/mLPI，O.02mg/mLRNA酶)中并温育过夜，直至使用FACScaliburTM系统(BDBiosciences)通过荧光激活细胞分拣(FACS)分析来分析。在培养基获取设置情况下，每份样品获得了25x103个细胞。从图3B中能看出，与在无血清培养基中培养的对照细胞相比，在完全培养基中培养的对照细胞具有显著更低比例的处于G0/G1停滞中的细胞。考虑到血清含有许多剌激活跃细胞生长和分裂的生长因子和细胞因子，此结果是意料之外的。随着IL-6浓度升高，观察到离开G0/G1停滞细胞、朝向凋亡细胞的转换。应当注意，RAlc表达升高所需要的IL-6暴露(图2C)比图3B中所示为了生成凋亡细胞所施加的要短得多。这些结果提示RAlc表达升高可能是对细胞应激的早期应答，最终导致生长停滞或凋亡。(d)血清剥夺在其它前列腺癌症模型中的效果为了评估在实施例2(a)和2(b)中在LNCaP细胞中观察到的血清剥夺的效果是否更广泛适用，使用其它前列腺癌症模型重复了实验。一种这样的模型是LUCaP77前列腺癌异种移植物模型(见Chen等，Am.J.Pathol.162:1349-1354(2003))。使用筛子和玻璃杵将LUCaP77肿瘤匀浆，然后涂布在含20%FBS的完全培养基中。让细胞生长10天，之后用新鲜的完全培养基或无血清且无酚红的培养基更换培养基。也以相同的方式处理LNCaP72细胞。IL-6处理持续7小时，之后通过机械提升来收获。将收获的细胞用PBS清洗一次。使用RNAeasyTM试剂盒(Qiagen)自所收获的细胞分离RNA，如实施例2(a)中所描述的。在RNA分离期间用DNA酶处理所有样品。使用实施例2(a)中所描述的定量实时PCR试剂、引物、和探针实施Q-PCR。如实施例2(a)中所描述的，将结果相对于RPL19标准化，并显示于图4A和4B。与实施例2(a)和2(b)中所描述的LNCaP结果类似，LUCaP77细胞在缺乏血清的情况中表达比在存在血清中培养时显著更多的RAlc。值得注意的是，完全培养基背景中的IL-6处理不导致这些细胞中的RAlc表达升高，尽管在将细胞血清饥饿时，随着IL-6浓度的升高观察到RAlc表达的适度额外升高(见图4A，比较图的左半部与图的右半部)。LUCaP77离体(exvivo)细胞中的RAlc和RPL19表达的平均Ct值不受培养基类型或IL-6浓度的影响。在与LUCaP77细胞相同的条件下测定LNCaP细胞(见图4B)。在完全培养基中培养的那些细胞中没有观察到RAlc生成应答渐增浓度的IL-6而发生的显著升高，但是在无血清培养基中培养的细胞中观察到RAlc表达的显著升高，而且在使用IL-6来处理无血清细胞时观察到进一步升高(图4B)。LNCaP细胞中RAlc表达应答血清剥夺和IL-6处理而发生的升高显著大于在LUCaP77细胞中所观察到的，尽管这两种细胞类型显然证明了应答血清剥夺和IL-6处理二者而发生的表达升高。这些结果证明了RAlc基因调控的某些方面(应答IL-6处理而发生的上调和应答血清剥夺而发生的上调)在前列腺癌的体外模型间是保守的。实施例3:信号传导途径抑制剂对RAlc表达的影响像许多细胞因子一样，IL-6可剌激数种不同胞内信号传导级联，而且这些信号传导可继而受到其它胞内因子的调控。例如，已知p38MAP激酶介导对IL-6信号传导的抑制(Ahmed等，J.LeukocyteBiol.72:154-162(2002);Chang等，Am.J.Physiol.Lung细胞.Molec.Physiol.289:L446_L453(2005))，而且已知IL-6在LNCaP细胞中激活4，5-磷脂酰-肌醇3-激酶(PI3K)(Xie等，Prostate60:61-67(2004))(见图8)。已知PI3K的活化具有多种下游后果，包括促存活Akt/mTOR途径以及蛋白激酶PDK1的活化，后者经由p70S6激酶的活化而调控转录。LNCaP细胞缺乏功能性PTEN，一种与PI3K的作用相反的肿瘤阻抑物，因此，在LNCaP细胞中，PI3K的下游效应器可以是组成性有活性的。JAK/STAT3途径还受到IL-6的活化(Hirano等，Oncogene,19:2548-2556(2000))。因此，评估了数种不同已知信号传导抑制剂对IL-6诱导的RAlc表达的影响。(a)特异性PI3K和p38MAP激酶抑制剂的效果将LNCaP细胞以相等的密度(大约0.5xl06个细胞/孔)涂布在六孔板中并让其静置72小时，之后添加无血清和酚红的培养基并让其静置24小时。或是在没有抑制剂的情况中培养细胞，或是用LY294002(具有针对PI3K的特定功效的广谱激酶的抑制剂)或高度特异性P38MAP激酶抑制剂SB203580(其阻断主要细胞应激应答途径)处理细胞。将LY294002(2yM和4yM)添加至适宜的孔并温育1小时，之后添加50ng/mLIL_6，再温育24小时。将SB203580(5iiM和10yM)添加至适宜的孔并温育1小时，之后添加50ng/mLIL-6，再温育7小时。通过机械提升来收获细胞，并用PBS清洗一次。使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)自所收获的细胞分离RNA，如实施例2(a)中所描述的。在RNA分离期间用DNA酶处理所有样品。使用实施例2(a)中所描述的Q-PCR系统、试剂、引物、和探针实施Q-PCR。73如实施例2(a)中所描述的，将结果相对于RPL19标准化。还评估了PI3K和P38MAP激酶信号传导途径内的某些分子在LNCaP细胞中用已知激活那些途径的生长因子剌激后被适当活化的能力。将LNCaP细胞以大约0.5xl06个细胞/孔的密度涂布在六孔板中。将细胞培养72小时，之后用各种抑制剂处理1小时，之后用10nMEGF剌激10分钟。将细胞用冷的PBS清洗一次，之后在冷的含有P-巯基乙醇的2X样品缓冲液中裂解。加载351!1溶胞物并在4-20%聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后使用标准规程转移至PVDF膜。使用下列抗体(都来自CellSignalingTechnologies)使用标准规程通过Western印迹评估活化的(即磷酸化的)PI3K和p38MAP激酶信号传导途径构件的存在兔多克隆抗磷酸化AKTSer473，小鼠单克隆抗磷酸化MAP激酶p44/42，小鼠单克隆抗磷酸化p38MAP激酶，和小鼠单克隆抗磷酸化mT0R。印迹标准化使用抗P_肌动蛋白抗体。结果显示于图5，并且证明了LNCaP细胞中那些信号传导构件每一种的磷酸化形式的存在，及所示抑制剂调控这些磷酸化的(活化的)蛋白质群体的效力。如图6中所示，添加LY294002至血清饥饿的和IL_6处理的细胞显著降低在将血清饥饿的LNCaP细胞与单独的IL-6—起温育时所观察到的RAlc过表达。另外，添加LY294002至血清饥饿的细胞还降低不存在IL_6时由血清剥夺诱导的RAlc表达(比较图6中最右边的两条柱与最左边的那条柱)。虽然LY294002处理降低磷酸化Akt水平，但是与PI3K抑制无关的活性同样能潜在解释LY294002的效果。p38MAPK抑制剂SB203580处理也抑制IL-6诱导的RAlc表达(图7)，尽管p38自身不受IL-6上调。(b)特异性mTOR抑制剂的效果将LNCaP细胞以大约0.5xl06个细胞/孔的密度涂布在六孔板中并让其在完全培养基中于37t:和5%C02生长24小时。更换培养基，并用新鲜的完全培养基替换，将细胞于37"和5%0)2培养过夜。将雷帕霉素(100nM或500nM)添加至适宜的孔并温育1小时，之后添加50ng/mLIL_6，再温育7小时。通过机械提升来收获细胞，并用冷的PBS清洗一次。将所收获的、经过清洗的细胞保存于-8(TC。自-8(TC取出后，立即将来自RNAeasyTM试剂盒的RLT裂解缓冲液添加至细胞沉淀物并重悬浮细胞。冷冻的细胞从未保存超过一周。再次将重悬浮的细胞用PBS清洗一次。使用RNAeasyTM试剂盒(Qiagen)自所收获的细胞分离RNA，如实施例2(a)中所描述的。在RNA分离期间用DNA酶处理所有样品。使用实施例2(a)中所描述的Q-PCR系统、试剂、引物、和探针实施Q-PCR。如实施例2(a)中所描述的，将结果相对于RPL19标准化。如图9中所示，单独的雷帕霉素处理或单独的IL-6处理均引起LNCaP细胞RAlc表达的可测量升高。然而，IL-6和雷帕霉素二者一起处理表现出协同地增强所处理细胞中的RAlc表达(图9)。不限于任一解释，协同性可能是由来自IL-6处理与mT0R活性抑制组合的相互叠加的细胞应激引起的。IL-6在LNCaP细胞中引起生长停滞，而PI3K/Akt/mT0R途径在那些细胞中也是组成性有活性的，而且对于LNCaP细胞生长是重要的。如此，IL-6处理和mTOR抑制的组合应激可引起RAlc表达的协同上调。(c)AKTl/2抑制剂的效果以大约0.5xl06个细胞每孔的密度涂布LNCaP细胞，并培养48小时。然后将培养基更换成新鲜的生长培养基，24小时后用所示浓度的Aktl/2抑制剂(Calbiochem)处理。Aktl/2抑制剂处理1小时后添加50ng/mLIL_6。IL-6处理进行7小时。然后通过机械提升来收获细胞，用冷的IXPBS清洗一次，然后在液氮中快速冷冻并于-8(TC保存过夜。然后使用Qiagen的RNAeasy试剂盒自细胞沉淀物分离RNA。在RNA分离期间用DNA酶处理样品。添加Aktl/2抑制剂引起RAlc信使(message)水平升高(图10)。更重要的是，AKT抑制剂与外源IL-6的组合进一步提高RAlc信使(图10)。这些效果显然是相加性的。与上文所讨论的mT0R抑制结果一起考虑，此结果反对Akt/mTOR途径是RAlc表达应答IL_6存在的正调节物。(d)JAK/STAT3抑制的效果为了评估JAK/STAT3途径的作用，实施了启动子分析。Weng等报告了推定的RAlc启动子含有一个预测的STAT3结合位点(J.CellBioch.2005;96:1034-1048)。构建了由推定RAlc启动子的不同区域驱动的萤光素酶报告构建体。携带STAT3结合位点的构建体表达超过对照水平(由pGL-3-基础载体代表)的萤光素酶，而且此表达通过添加外源IL-6得到了进一步增强(图11)。STAT3位点的突变(图12)剧烈降低组成性活性并消除此启动子的IL-6应答(图11)。还有，JAK抑制剂AG490虽然自身轻微增强萤光素酶活性，但是在与IL-6组合时阻止萤光素酶活性的进一步升高(图13)。总之，这些结果提示，负责RAlc表达应答IL-6而升高的主要途径是JAK/STAT3途径。实施例4:DHT对RA1c表达的影响LNCaP细胞对雄激素敏感，而且在存在睾酮和相关分子的情况中受到剌激而生长。先前的研究显示了IL-6介导的对LNCaP细胞中神经内分泌分化的诱导受到对那些细胞施用雄激素的阻断(Xie等，Prostate60:61-67(2004))。由于上文所述研究显示了IL-6处理剌激RAlc表达，因此调查了雄激素对IL-6诱导的和血清剥夺诱导的RAlc表达的影响。以相等的密度涂布LNCaP细胞并培养三天，之后用新鲜的含有5a-二氢睾酮(DHT)的完全培养基或不含血清、不含酚红、含DHT的培养基更换所述培养基。对于IL-6处理，在完全培养基和不含血清、不含酚红的培养基中与10ng/mLIL-6组合地使用10nM、25nM、100nM和liiMDHT剂量。所有处理进行过夜，之后通过机械提升来收获细胞。将收获的细胞用PBS清洗一次，之后使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA。在RNA分离期间用DNA酶处理所有样品。使用实施例2(a)中所描述的Q-PCR系统、试剂、引物、和探针实施Q-PCR。如实施例2(a)中所描述的，将结果相对于RPL19标准化。DHT处理对于IL-6诱导的RAlc表达和血清剥夺诱导的RAlc表达具有实质性抑制效应(图14A和14B)。该效应是剂量依赖性的，而且在存在100nMDHT的情况中最显著。RPL19的Ct值在DHT处理范围内是一致的，指示了细胞存活力的变化不是DHT处理后所观察到的RAlc表达降低的原因。与来自实施例2和3的结果一起考虑，此数据提示RAlc是应激诱导的基因，其能给癌细胞提供存活优势(图14C)。在正常的和充足的生长条件下，RAlc表达受到遏制。一起考虑数据，提示应激条件下(例如IL-6处理或血清剥夺)的RAlc表达升高可通过促生长途径激活(DHT)来逆转或减轻，及在促生长途径受到进一步抑制时(雷帕霉素)放大。实施例5:RAlc表面表达的证明虽然RAlc具有与七次跨膜G蛋白偶联受体蛋白家族的同源性，但是本领域先前并未提供RAlc是在细胞表面膜上可及的而非仅仅定位在细胞内膜上的证据。为了评估RAlc蛋白的细胞定位，使用FuGene⑧(Roche)转染试剂在人胚肾细胞(293S细胞)中过表达N端带gD标签的RAlc。以2xl06个细胞/10cm皿的密度涂布293S细胞，并让其于37。C和在5%C02中在完全生长培养基中生长24小时，之后转染。使用FuGene⑧试剂用5.gRAlc-pRK-N端gD质粒转染细胞，并让其休息48小时，之后用5mMEDTA自板中取出细胞。然后用FACS缓冲液(含3%BSA、lmMEDTA的IXPBS)清洗细胞2次，之后悬浮在4yg/mL抗gDmAb中并在冰上温育1小时。然后用冷的FACS缓冲液清洗细胞三次，之后悬浮在藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠二抗(1:500稀释)中并在冰上温育l小时。用FACS清洗细胞三次，之后进行FACS分析。如图15中所示，FACS分析检测到一大群特异性结合至PE标记的抗小鼠二抗的细胞，指明RAlc是在293S细胞表面处可及的。使用CHO细胞表达(结果未显示)证实了该结果，指明在来自不同生物体的不同细胞系中观察到RAlc的细胞表面表达。7权利要求一种缓解细胞中的细胞应激应答的方法，包括使所述细胞接触降低或阻断所述细胞中的RA1c表达或活性的化合物。2.权利要求l的方法，其中所述细胞是癌细胞。3.权利要求2的方法，其中所述癌细胞是前列腺肿瘤细胞。4.权利要求2或3的方法，其中所述细胞应激应答是由化疗剂诱导的。5.权利要求4的方法，其中所述化疗剂选自mTor抑制剂和Aktl/2抑制剂。6.权利要求5的方法，其中所述化疗剂是选自下组的一种或多种mTor抑制剂雷帕霉素、CCI-779、RAD001、AP23573、XL7F65、和TAFA93、以及它们的活性衍生物或类似物。7.权利要求5的方法，其中所述化疗剂是选自下组的一种或多种Aktl/2抑制剂GSK690693、哌立福辛、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。8.权利要求1的方法，其中所述化合物是RAlc拮抗剂。9.权利要求8的方法，其中所述RAlc拮抗剂选自下组的一种或多种抗体、抗体片段、抗体偶联物、适体、小分子、和寡肽。10.权利要求9的方法，其中所述RAlc拮抗剂特异性阻断RAlc活性。11.权利要求1的方法，其中所述化合物降低RAlc表达。12.权利要求1的方法，其中所述化合物阻断RAlc表达。13.权利要求11或12的方法，其中所述化合物选自下组的一种或多种反义多核苷酸、沉默RNA分子、催化性RNA分子、和RNA-DNA嵌合物。14.权利要求4的方法，其中所述化合物提高所述细胞对所述化疗剂的敏感性。15.—种缓解前列腺癌肿瘤细胞中的细胞应激应答的方法，包括使所述肿瘤细胞接触降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。16.权利要求15的方法，其中所述肿瘤细胞正在经历用诱导细胞应激应答的化疗剂进行的化疗。17.权利要求16的方法，其中所述化疗剂选自mTor抑制剂和Aktl/2抑制剂。18.权利要求17的方法，其中所述化疗剂是选自下组的一种或多种mTor抑制剂雷帕霉素、CCI-779、RAD001、AP23573、XL7F65、和TAFA93、以及它们的活性衍生物或类似物。19.权利要求17的方法，其中所述化疗剂是选自下组的一种或多种Aktl/2抑制剂GSK690693、哌立福辛、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。20.权利要求15的方法，其中所述化合物是RAlc拮抗剂。21.权利要求20的方法，其中所述RAlc拮抗剂选自下组的一种或多种抗体、抗体片段、抗体偶联物、适体、小分子、和寡肽。22.权利要求21的方法，其中所述RAlc拮抗剂特异性阻断RAlc活性。23.权利要求15的方法，其中所述化合物降低RAlc表达。24.权利要求15的方法，其中所述化合物阻断RAlc表达。25.权利要求23或24的方法，其中所述化合物选自下组的一种或多种反义多核苷酸、沉默RNA分子、催化性RNA分子、和RNA-DNA嵌合物。26.权利要求16的方法，其中所述化合物提高所述肿瘤细胞对所述化疗剂的敏感性。27.权利要求26的方法，其中所述肿瘤细胞以比未接触所述化合物的细胞高的比率经历凋亡。28.权利要求26的方法，其中所述肿瘤细胞以比未接触所述化合物的细胞高的比率经历生长停滞。29.—种缓解患者的细胞中的细胞应激应答的方法，包括对所述患者施用有效量的降低或阻断RAlc表达或活性的化合物。30.权利要求29的方法，其中所述患者是癌症患者。31.权利要求30的方法，其中所述细胞是前列腺癌肿瘤细胞。32.权利要求31的方法，其中所述肿瘤细胞正在经历用诱导细胞应激应答的化疗剂进行的化疗。33.权利要求32的方法，其中所述化疗剂选自mTor抑制剂和Aktl/2抑制剂。34.权利要求33的方法，其中所述化疗剂是选自下组的一种或多种mTor抑制剂雷帕霉素、CCI-779、RAD001、AP23573、XL7F65、和TAFA93、以及它们的活性衍生物或类似物。35.权利要求33的方法，其中所述化疗剂是选自下组的一种或多种Aktl/2抑制剂GSK690693、哌立福辛、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。36.权利要求29的方法，其中所述化合物是RAlc拮抗剂。37.权利要求36的方法，其中所述RAlc拮抗剂选自下组中的一种或多种抗体、抗体片段、抗体偶联物、适体、小分子、和寡肽。38.权利要求37的方法，其中所述RAlc拮抗剂特异性阻断RAlc活性。39.权利要求29的方法，其中所述化合物降低RAlc表达。40.权利要求29的方法，其中所述化合物阻断RAlc表达。41.权利要求39或40的方法，其中所述化合物选自下组的一种或多种反义多核苷酸、沉默RNA分子、催化性RNA分子、和RNA-DNA嵌合物。42.权利要求32的方法，其中所述化合物提高所述肿瘤细胞对所述化疗剂的敏感性。43.权利要求42的方法，其中所述肿瘤细胞以比未接触所述化合物的细胞高的比率经历凋亡。44.权利要求42的方法，其中所述肿瘤细胞以比未接触所述化合物的细胞高的比率经历生长停滞。45.—种组合物，其包含RAlc拮抗剂和提高RAlc表达的化合物，任选进一步包含药学可接受载体。46.权利要求45的组合物，其中所述化合物选自如下的一种或多种雷帕霉素、CCI-779、RAD001、AP23573、XL7F65、TAFA93、SK690693、哌立福辛、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。47.权利要求46的组合物，其中所述RAlc拮抗剂是抗体且所述化合物选自如下的一种或多种雷帕霉素、CCI-779、RADOOl、AP23573、XL7F65、TAFA93、SK690693、哌立福辛、和XL418、以及它们的活性衍生物或类似物。48.—种测定化疗剂是否诱导癌细胞中的细胞应激应答的方法，包括a)使所述癌细胞接触所述化疗剂，b)测定所述癌细胞中的RAlc表达水平，c)比较所述癌细胞中的RAlc表达水平与1)接触所述化疗剂之前所述癌细胞中的RAlc表达水平，或2)对照细胞中的RAlc表达水平，其中RAlc表达升高指示对细胞应激应答的诱导。49.权利要求48的方法，其中所述癌细胞是前列腺癌细胞。50.权利要求49的方法，其中所述前列腺癌细胞是LNCaP细胞。51.权利要求48的方法，其中所述化疗剂选自mTor抑制剂和Aktl/2抑制剂。52.—种用联合疗法治疗癌症的方法，包括a)使癌细胞接触提高RAlc表达的化疗剂，并b)使所述癌细胞接触有效量的特异性结合RAlc多肽的化合物，由此所述化疗剂和所述化合物的组合的癌症治疗效果是协同的，其超过所述化疗剂或化合物任一单独的效果。53.权利要求52的方法，其中所述化疗剂是mTOR或Aktl/2抑制剂。54.权利要求52的方法，其中所述化合物是抗RAlc抗体。55.权利要求54的方法，其中所述抗RAlc抗体是偶联至细胞毒剂的。全文摘要本发明致力于对于治疗癌症和对于缓解化疗所触发的细胞应激应答有用的组合物和方法。文档编号A61K45/06GK101790539SQ200880014513公开日2010年7月28日申请日期2008年3月3日优先权日2007年3月2日发明者威廉·马利特,查尔斯·廷德尔申请人:健泰科生物技术公司