一种用于改变含有多酚的植物材料的方法以及经过改变的含有多酚植物材料的医学用途的制作方法

专利名称：：一种用于改变含有多酚的植物材料的方法以及经过改变的含有多酚植物材料的医学用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于改变一种或多种含有多酚的植物材料的方法并且涉及一种或多种不同的、经过改变的含多酚植物材料的新颖的医疗用途。
背景技术：
：世界卫生组织(WHO)预测在2025年3亿人(目前人口的约5%)将发展成2型糖尿病。这意味着相当数量的人口将患有不同的代谢紊乱，如代谢性综合征。术语"代谢性综合征"作为一种临床诊断并作为一种定义均受到争议。然而，它表现为一组令人担忧的代谢的危险因素，这些因素识别了发展成2型糖尿病和心血管疾病的高危险的受试者。目前，存在着通常被国际糖尿病联合会(IDF)和世界卫生组织(WHO)接受的三项主要指标，这些指标是对肥胖、血脂障碍、和胰岛素抵抗的度量方式。这些危险因素中的每一个均是心血管疾病的良好的预测指标。然而，胰岛素抵抗被认为为代谢性综合征的一个关键因素，因为它预测了2型糖尿病和心血管疾病。胰岛素分泌不仅对于维持葡萄糖代谢是必需的，而且对于控制脂类代谢和血管紧张度也是必不可少的。胰岛素抵抗引起了对13细胞进行不精密调节以保持血糖正常，导致高胰岛素血症，这进而在主要的代谢组织和器官(像肌肉、脂肪组织和肝脏)中切断胰岛素抵抗的作用，并且在胰岛素抵抗与高胰岛素血症之间形成一种恶性循环。胰岛素抵抗的原因还没有得到完全理解，并且存在着几种遗传易感性(基因遗传、多态性)、分子因素(如氧化应激)、以及可能干扰胰岛素信号传导的不同的炎症标志物。最后但同样重要的是强烈的生活方式改变的主要影响，在干预性研究中已经发现强烈的生活方式改变延迟或者防止2型糖尿病的发展达40-58%。这些干预性研究中的饮食目的是通过减少从脂肪中(最重要的是从饱和的脂肪中)摄入能量(由单不饱和脂肪进行部分替换)而减轻体重，并且这种饮食额外富含纤维素、全谷粒、蔬菜、以及水果。这些饮食限制伴随着每天30分钟的体力活动。强烈的生活方式改变的生理益处是降低了体重和血压，并且在胰岛素敏感度和血脂方面得到改善。这将影响整个范围的危险因素并且已经发现其延迟或者防止涉及到代谢性综合征的疾病的形成。鉴于以上所述情况，并不出人意料的是已经付出大量的努力来从事对于以上提及的患者背后的机制的研究连同寻找新的防止、减轻、或者治疗这些疾病的途径。造成低胰岛素反应的食品被认为是有利的，因为餐后高胰岛素水平(高胰岛素血症)是形成代谢性综合征之内的疾病(心血管疾病、2型糖尿病、以及肥胖)的危险因素。因此，对于世界的工业化地区中的人类而言，在人体内造成较低的胰岛素水平的食品是有益的，在这些地区中心血管疾病的问题(如2型糖尿病、肥胖、以及代谢性综合征)正在增加。根据本发明，已经发现了治疗并防止此类疾病的新颖的方法。发明概述在一方面，本发明提供了用于改变一种或多种含有多酚的植物材料的方法，其中所述方法包括a)将至少一种含有多酚的材料与至少一种溶剂进行混合以提供一种混合物；b)对这种混合物进行加热以便除去存在的细菌种类来提供一种经加热的混合物；c)以可任选的顺序或者同时地将至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株以及可任选地至少一种蛋白质来源加至这种经加热的混合物中以提供一种发酵混合物；并且d)使这种发酵混合物经受适宜于这种发酵混合物发酵的条件以提供一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的混合物；并且a)可任选地除去这种改变多酚的乳酸菌的菌株以提供一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的混合物。在另一个方面，本发明提供了一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的混合物或者一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的混合物，用于制造预防或治疗糖尿病、代谢性综合征、以及心血管疾病的一种组合物的用途。附图简要说明图l示出了由测试个体摄入不同的黑果越桔(blueberry)饮料之后所获得的相对于一种葡萄糖参比饮料的餐后血浆葡萄糖曲线。图2示出了与一种葡萄糖参比物相比在摄入了经受不同的处理/添加剂的不同的黑果越桔产品之后的血清胰岛素反应。图3示出了与一种未处理的对照物(B-未处理)相比在摄入了经受不同的处理/添加剂的不同的黑果越桔产品之后的胰岛素反应。在30分钟后，B-ferm给出了与对照物(B-未处理)相比显著更低的胰岛素反应(P<0.05，用B-未处理的作为对照物的丹内特检验(Du騰t，stest))。图4示出了在摄入一种具有活菌的经发酵的黑果越桔饮料以及此后通过巴氏消毒法将其中的细菌杀死的一种经发酵的黑果越桔饮料之后所获得的餐后的血浆葡萄糖曲线。图5示出了在摄入一种具有活菌的发酵的黑果越桔饮料以及此后通过巴氏消毒法将其中的细菌杀死的一种经发酵的黑果越桔饮料之后所获得的胰岛素反应。图6示出了在发酵之前与发酵之后蔷薇果浓浆、黑果越桔、黑果越桔果皮、以及红豆越桔(lingonberry)果皮中的儿茶素(catechine)、表儿茶素(印icatechine)、原花色素二聚物苷元、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羟基苯基丙酸、3-苯基乳酸、原儿茶酸、矢车菊素_3-半乳糖苷/矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量。图7示出了在用植物乳杆菌HEAL19、植物乳杆菌299v或者乳酸片球菌进行发酵之前和发酵之后黑果越桔中儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羟基苯基丙酸、卜(-)-3-苯基乳酸、原儿茶酸、以及矢车菊素_3-半乳糖苷/矢车菊素_3-葡萄糖苷的含量。本发明的实施方案的详细说明在本发明的方法的一个实施方案中，该至少一种含有多酚的植物材料与至少一种溶剂的混合物是通过均化作用而获得的。这种溶剂优选是水、自来水、或者蒸馏水，但可以是另一种可食用的水性溶剂，如矿泉水、榨汁(如果汁和蔬菜汁)、乳类、以及其他饮料。为了消除在该至少一种含有多酚的材料与该至少一种溶剂的所制备的混合物中存在的任何一种何细菌种类(如细菌和/或微生物)，为了防止这些细菌种类的任何生长，步骤b)中的加热发生在6(TC至10(TC的温度，优选8(TC至IO(TC，更优选9(TC至IO(TC，即一个足以杀死细菌和微生物的温度，例如，在9fC进行2s的巴氏消毒或者使用一种常规的高压灭菌器来消除存在的细菌。在步骤b)中所提供的发酵应该只发生在当将乳酸菌的特定的菌株加至该混合物中时。因此，在发酵之前消除可能在加热步骤b)中存在的任何其他种类的细菌是必需的。考虑到所希望的结果而定(即，杀死存在的任何细菌和微生物)来确定加热温度和加热的持续时间。在加热步骤b)之后，(例如)可以通过加入KOH(因为含有多酚的材料可能是酸性的)将经加热的混合物的pH调节到在大约4.5至9、优选5至7范围内的pH值。这是因为所加入的乳酸菌的菌株在这个pH区间会生长良好。该至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株所添加的量值是大约105至109cfu/ml混合物。优选地，在至少一种蛋白质来源(例如一种氨基酸来源)的存在下发生这种发酵，所述蛋白质来源是选自但不限于下组，该组包括蛋白胨、胰蛋白胨(含奶肉汤)、酵母提取物、以及它们的组合。另一个例子是肉汤或者燕麦片，它们也包含这些细菌所必需的组分。在没有加入蛋白质来源(即，在仅存在所加入的含有多酚的一种或多种植物材料的组分，即在这些植物材料中存在蛋白质以及碳水化合物)的情况下发生这种发酵也是可能的。该至少一种蛋白质所加入的或存在的量值是按总混合物的重量计O.0001-0.1%。在本发明的一个实施方案中，所述至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株是选自下组，包括乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属、明串珠菌属、酒球菌属、乳球菌属、以及系统发生意义上相关的属。在本发明的另一个实施方案中，所述至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株是选自下组，该组包括植物乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、以及Lactobacillusargentoratensis。优选地，这种植物乳杆菌是选自下组的菌株，其构成为于1991年7月2日在德国国家菌禾中保藏中心(DeutscheSammlimgvonMikroorganismenimdZellkulturenGmbH)保藏的植物乳杆菌299，DSM6595，于1995年3月16日在德国国家菌种保藏中心保藏的植物乳杆菌299v，DSM9843，于2002年11月27日在德国国家菌种保藏中心保藏的植物乳杆菌HEAL9，DSM15312，植物乳杆菌HEAL19，DSM15313，以及HEAL99，DSM15316，并接着给出了以上提到的登录号。在加入特定的乳酸菌的菌株之后，这些发酵条件是在大概3(TC至5(TC的温度、优选大约35t:至45t:、尤其是大约37t:至4(rc、在大气压下的液体培养基中。这种发酵经常进行到直至达到<5的pH值，优选<4.如果对酸奶进行发酵，则这种发酵持续到pH<4.6至4.7。这种发酵发生了大概10至30小时，优选大概15至25小时，例如大概20至24小时。发酵的持续时间应该是充足的，以便提供这种或这些有益的、经过改变的含有多酚的植物材料。在完成发酵之后，对该改变多酚的乳酸菌的菌株的可任选的清除步骤f)是通过加热、紫外辐射、Y辐射、压力、电流、放电、脉冲电场、电击(electricchock)、或者无菌过滤。通过清除乳酸菌的菌株，在可由个体服用的任何组合物中使用所获得不含乳酸菌的、经6过改变的含有多酚的植物混合物的混合物，这将是可能的。例如，通过乳酸菌的菌株进行发酵而得到改变的一种或多种含有多酚的植物材料是选自下组，该组包括水果、蔬菜、浆果、茶、谷物、绿茶、咖啡、可可、巧克力、以及树皮。例如，这些水果和桨果是选自下组黑果越桔、红豆越桔、蔓越莓(cranberry)、苹果、香蕉、黑醋栗、草莓、覆盆子、蔷薇果、葡萄、柑橘、腺肋花楸(aronia)、日本木瓜(Japanesequince)、黑剌李、蔷薇果和接骨木果、橄榄、剌山柑浆果、或者其他富含多酚的果实。树皮优选是选自肉桂。蔬菜是选自(例如)豆类。本发明并不限于以上提及的具体例子。考虑到所选定的一种或多种含有多酚的植物材料，重要的方面是有待使用的一种或多种含有多酚的植物材料应该受到用乳酸菌的菌株进行的发酵的影响，并且提供一种经过改变的含有多酚的植物材料。在本背景中，短语"改变含有多酚的植物材料"是指一种所加入的乳酸菌的菌株的发酵已经在一种含有多酚的植物材料的存在下发生。这种发酵发生并且影响存在的多酚基团以便提供一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料。在本背景中，术语"一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料"旨在表示在如此处指明的条件下含有多酚的植物材料在一种乳酸菌的菌株的存在下进行发酵之后所获得的一种或多种产物。在实验部分中，所测试的含有多酚的材料是黑果越桔、红豆越桔、以及蔷薇果，并且已显示仅有经发酵的含测试产物的黑果越桔、红豆越桔和蔷薇果造成了更低的胰岛素反应的显著性作用，这意味着最可能是含有多酚的材料的发酵造成了更低的胰岛素反应。因此，根据本发明术语"一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料"是指在含有多酚的植物材料进行发酵之后所获得的此类物质。与摄入没有用乳酸菌的菌株进行发酵的含有一种多酚的植物材料相比，在摄入此类"经过改变的含有多酚的植物材料"之后，它们应该提供所希望的降低胰岛素反应的作用。通过摄入经过改变的含有多酚的植物材料(处于任何适宜的形式)，胰岛素水平的降低应该是在大概1_50%的区间，优选大概5_40%，更优选大概10-30%，甚至更优选大概15-25%，例如大概25%。本发明进一步涉及一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的混合物或者一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的混合物用于制造预防或治疗糖尿病、代谢性综合征、肥胖、以及心血管疾病的一种组合物的用途。这种组合物优选是一种药物组合物或者食品组合物。这种食品组合物例如是一种食物产品或者食品增补剂。这种食物产品可以选自下组，该组包括面包类、乳酪类、酸奶类、果汁类、健康饮料、健康食品棒类(healthbar)、涂抹酱类(spread)、饼干类、以及谷类食品。便利的是在一种食品组合物中包括一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的混合物或者一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的混合物，这是因为这种组合物容易被个体服用来保持健康，并且可以预防如以上所提及的心血管疾病。方法和材料测试产品为了显示出本发明的作用，已经进行测试来评价在摄入不同的基于含有一种多酚的植物材料(如黑果越桔和蔗糖)的组合物之后餐后血糖和胰岛素反应的潜在差异，这取决于1)黑果越桔组合物的热处理的类型和程度；2)在该组合物中产生乳酸的细菌(分别为植物乳杆菌299v和植物乳杆菌HEAL19)的存在，以及；3)用植物乳杆菌HEAL19对黑果越桔组合物进行的发酵。五种不同的测试饮料和一种参比饮料(Ref.)被包括在该研究之中。这些测试饮料包括一种未处理未发酵的黑果越桔饮料(B-皿tr)、一种基于经巴氏消毒的未发酵的黑果越桔的饮料(B-past)、两种经巴氏消毒但没有分别加入植物乳杆菌299v和HEAL19而进行发酵的饮料(B-299v和B-HEAL)、以及一种经巴氏消毒并且用植物乳杆菌HEAL19进行发酵的饮料(B-ferm)。这种参比饮料包括溶于水中的葡萄糖。在储存于_20°0之前，将黑果越桔(Vacciniummyrtillus)混合成浓桨。在解冻之后，用水(1:1)将这些黑果越桔稀释并且使用家用混合器将其均匀化5分钟。此后，对黑果越桔进行再一次稀释(1:l)，获得25%的黑果越桔溶液。然后，用高效能分散机(UltraTurraxT25，Janke&KunkelIKA，WerkeGmbH&Co.KG，Staufen，Germany)在25000rpm将黑果越桔溶液均匀化。取出未发酵的黑果越桔饮料样本(B-未处理)，并且将其冷冻在-2(TC直到用于膳食研究中。将剩余的黑果越桔溶液进行巴氏消毒(94t:，2s)，并且储存在-2(TC(B-经巴氏消毒)。两种具有分开加入的植物乳杆菌299v(B-299v)和植物乳杆菌HEAL19(B_HEAL19)的饮料是通过在研究前一天将这种B-经巴氏消毒的饮料解冻并且加入各自的乳杆菌属菌株而进行制备的，并且此后允许将这种饮料在冷藏箱中(+4°C)放置过夜直到供应时。在供应前大概一周，将600ml经巴氏消毒的黑果越桔溶液在一个容器中进行发酵，加入K0H以便将pH调节至5。此后，使用植物乳杆菌HEAL19将这种黑果越桔溶液进行接种(lxl(f个菌落形成单位(cfu)/ml)。加入一克经高压灭菌的蚕豆花作为氮源。将这种黑果越桔溶液发酵20h直至达到lxl07ml(pH3，8)的最终cfu(B-经发酵)。在发酵之后将这种黑果越桔溶液储存在4t:。通过ProbiAB(Lund，Sweden)进行发酵。将一种葡萄糖饮料用作参比食品(在300ml水中包含30gD+葡萄糖(VWRinternationalLtd.Poole，England))。所有的膳食均贡献了30g碳水化合物。在研究开始时向每位测试受试者提供一块小麦白面包(丽B，DollarStorfranska，Lockarp，Sweden)。将在每次试验之前的晚上摄入逐个选择的切片量。表1示出了这些测试饮料和参比物的不同组成。表1饮料量来自浆果来自浆果来自浆果所加入的所加入的碳水化合(g)的低分子的果糖的葡萄糖葡萄糖蔗糖物的总量碳水化合(g)(g)(g)(g)(g)物的总量(g)Ref.3003030B-皿t.*3003.822.191.6326.18308<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>这些浆果含有<0.04的蔗糖。*所有黑果越桔饮料进一步含有72.8mg抗坏血酸，320.lmgtrecomex、291mgCNK。在供应72.8mg抗坏血酸之前，将320.lmgtrecomex(经过改变的马铃薯淀粉)、291mgCNK(角叉菜聚糖E407)、以及26.18g蔗糖加至每种黑果越桔饮料中。此外，将l.18g葡萄糖加至B-经发酵的饮料中来补偿在发酵过程中碳水化合物的损失。最后，用32.0g水对所有黑果越桔饮料进行调节，这样就获得了含有20%黑果越桔以及30g碳水化合物的300g黑果越桔饮料。测试饮料的研究将所有饮料作为早餐来供应并且进行随机提供，间隔至少五天。从所有受试者中获取书面的知情同意书。他们也完全意识到以下事实，即他们可以在任何时间从该研究中撤出并且无需另外的解释。隆德大学(LundUniversity)医学系的伦理委员会批准了这项研究。测试受试者十五位健康的、不吸烟的志愿者(7女8男)参加了这项急性膳食研究。平均年龄是25士2.4(平均值士SD)岁，并且平均体重指数是在正常范围之内(22.4±2.0kg/m2;平均值±SD)。这些受试者没有接受任何药物治疗。他们被要求在测试前一天避免酒精摄入、体力活动、以及富含纤维素的晚餐。这些受试者在每次试验之前的晚上9点和IO之间食用了逐个选择量的WWB。在整个研究中将逐个选择的切片量保持相等。在WWB膳食之后，这些受试者被要求在到达实验室之前不要摄入更多的东西。然而，若有必要，允许在10pm之后摄入少量的水。每位受试者参加四次试验，间隔至少一周。研究设计和血液采样这些受试者在早上07.45到达实验室，并且肘前静脉被插入一根外周导管。在每次试验时，所有参与者都填写了一份有关他们这一天身体状况的调查表，包括压力或焦虑的感觉。膳食在10分钟的过程中以平稳的方式被消耗掉。在禁食以及在膳食摄入后的15、30、60、90、120、180、240分钟采集毛细血管血用于血清胰岛素和血桨血糖(plasmabloodglucose)的分析。葡萄糖分析用B-GlucoseAnalyser(Hemocue201+，HemocueAB，Angelholm，Sweden)领lj定血糖。胰岛素分析将血清胰岛素样本储存在-2(TC。通过使用一种酶免疫测定试剂盒(MercodiaInsulinElisa;MercodiaAB，U卯sala，Sweden)在一个一体化的酶免疫测定分析仪(CODAOpenMicroplateSystem;Bio-RadLaborato:ries，HerculesCA)上进行分析。计算和统计分析针对每位参与者和每种测试饮料，通过使用GraphPdPRISM(version3.02;Gr即hPadSoftwareInc，SanDiego)计算出血糖和血清胰岛素在0-45分钟并且在0-120分钟增加的曲线下面积(AUC)。将所有在基线以下的面积从计算结果中排除。在每个时间点对血糖和血清胰岛素进行统计学分析。用MINITAB统计软件(发行了13.l用于windows)进行统计计算。显著性是由在广义线性模型(AN0VA)之后跟随接图基多重比较检验(Tukey—smultiplecomparisonstest)或者丹内特检验而进行确定。产生P<0.05的差异被认为是显著性的。血浆葡萄糖与葡萄糖参比物相比，在摄入黑果越桔饮料之后，早期(0-45min)和晚期(0-90min)的葡萄糖曲线下面积都同样是显著更低的。在区间58-64中很好地收集了黑果越桔饮料的GI值并且它显著低于葡萄糖参比(GI=100)。血浆葡萄糖反应示于图1中。表2-在经巴氏消毒、经发酵的和/或补充有细菌的葡萄糖参比物和黑果越桔饮料之后的血浆葡萄糖。葡萄3瞎饮料ii禁食值(mmol/L)在30min的峰值(S)(mmol/L)0-45min的曲线下面积(mmolmin/L)GI(0-90min)葡萄糖155.2±0.14.1±0.3a115.6±8.2a100±0.0aB-untr145,2±0.13.0±0.2b80.8±7.2b58±4.6bB-past.135.2±0.13.0±0.3b82.4±7.1b64±5.5bB-ferm.155,2±0.12.8±0.3b76.6±8.0b61±6.9bB-299v145.3±0.13.2±0.2b81.1±6.9b60±4.7bB-HEAL19145.2±0.12.9±0.2b80.2±5.3b63±4.4b这些数字指出了平均值±SD，n=测试人员的数目。在同一栏中带有不同字母的平均值是显著不同的(P<0.05)。血清胰岛素在摄入不同的黑果越桔饮料和参比物之后的胰岛素反应示于图2中。在区间30-60min中，与葡萄糖参比物相比，所有黑果越桔饮料引起了显著更低的胰岛素反应。在15min后，与葡萄糖参比物相比，摄入B-ferm之后胰岛素水平显著更低。在餐后的早期(表达为0-45minAUC)，与B-HEAL19相比，B-ferm引起了更低的胰岛素反应。为了研究巴氏消毒法和发酵(用植物乳杆菌HEAL19)或将植物乳杆菌加至黑果越桔原料中的重要性，将B-past、B-ferm、B_299v、以及B-HEAL19的胰岛素反应与未处理10的对照饮料(B-皿tr)进行比较。在摄入后30min，与B-未处理相比，B-ferm显著更低。在120min，与B-未处理相比，B-299v和B-HEAL19显示出显著更低的胰岛素反应。早期胰岛素反应(0-45minAUC)的比较显示，与未处理的黑果越桔饮料相比B-ferm给出了显著更低的胰岛素反应(25%)(P<0.05，表4)。巴氏消毒法或分别加入植物乳杆菌299v或植物乳杆菌HEAL19均没有显著性地影响有关未处理的黑果越桔饮料的餐后胰岛素面积。表3-健康的测试受试者在摄入葡萄糖饮料和基于经受巴氏消毒法、发酵和/或补充有细菌的黑果越桔原料的饮料之后的血清胰岛素反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>这些图指出了平均值±SD，n=测试人员的数目。在同一栏中具有不同字母的平均值是显著不同的(P<0.05)。用植物乳杆菌HEAL19对黑果越桔进行的发酵对于降低的胰岛素反应似乎是一个关键因素。这些结果提示这种发酵过程改进了胰岛素的经济性。表4-将经巴氏消毒和经发酵的黑果越桔饮料与作为对照物的未处理的黑果越桔饮料进行胰岛素反应的比较。饮料<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>^旨出针对对照饮料B-未处理的显著差异(P<0.05，用B-未处理作为对照饮料的丹内特检验)。在摄入用植物乳杆菌HEAL19进行发酵的黑果越桔之后，降低25%的胰岛素反应未见伴随在血浆葡萄糖方面的类似的下降，这是因为在黑果越桔饮料之后餐后血浆葡萄糖反应处于相同的水平。然而，使用植物乳杆菌HEAL19对黑果越桔进行的发酵似乎是对于含有经发酵的黑果越桔的饮料所见到的降低的胰岛素反应的一个关键因素。当在摄入之前将相同的细菌植物乳杆菌HEAL19加至黑果越桔饮料中时，没有看到这种作用。因此，并不是细菌本身的存在引起了降低的胰岛素反应，相反重要的却是发酵其自身。造成这种有趣的作用的活性机制可能是因为通过这种发酵所产生或者经过改变的组分，即在发酵之后在黑果越桔中可供使用的经过改变的多酚组分。总之，可以得出结论，与未经发酵的黑果越桔饮料相比，经发酵的黑果越桔饮料使胰岛素反应降低了25%。将来，以患有代谢紊乱的人们为目标的产品可呈现出一种额外的预防方式，并且也可以减少2型糖尿病和内皮紊乱的发展。从更大的视角来观察"代谢紊乱流行"，优选通过整合问题的所有方面来进行，即不仅有营养的和临床方面，而且还有文化和经济方面，人们能够在西方国家和在发展中国家中引入一种全面的健康生活方式。所有消费者的知识的增加将有希望使工业界遵从市场的希望。将具有活菌的饮料的效应与消除了细菌的饮料的作用讲行比较的测li式在一项研究中包括两种不同的测试饮料以便评价一种饮料(其中在发酵之后植物乳杆菌HEAL19的培养物进行巴氏消毒)是否给出了与另一种饮料(其中在发酵之后植物乳杆菌HEAL19的培养物仍然存活)相同的低胰岛素反应。这些测试饮料包括一种经巴氏消毒并且用植物乳杆菌HEAL19进行发酵的饮料，以及一种经巴氏消毒并且用植物乳杆菌HEAL19进行发酵并接着在发酵之后进行巴氏消毒的饮料。在储存于-2(TC之前，将黑果越桔(Vacciniummyrtillus)混合成浓浆。在解冻之后，用水(l:1)将这些黑果越桔稀释，并且用家用混合器将其均匀化5分钟。此后，对黑果越桔进行再一次稀释(1:1)，获得25%的黑果越桔的溶液。然后，用高效能分散机(UltraTurraxT25，Janke&KunkelIKA，WerkeGmbH&Co.KG，Staufen，Germany)在25000rpm将黑果越桔溶液均匀化。服用未经发酵的黑果越桔饮料的样本(B-未处理)，并且将其冷冻于-2(TC直到用于膳食研究中。将剩余的黑果越桔溶液进行巴氏消毒(94t:，2s)，并且储存在-2(TC(B-past)。在供应前大概一周，将600ml经巴氏消毒的黑果越桔溶液在一个容器中进行发酵，加入K0H以便将pH调节到5。此后，用植物乳杆菌HEAL19对黑果越桔溶液进行接种(lx107个菌落形成单位(cfu)/ml)。加入一克经高压灭菌的蚕豆花作为氮源。将黑果越桔溶液发酵20h直至达到lxl07ml(pH3，8)的最终cfu。在发酵之后，将这种黑果越桔溶液储存在4"C或再次进行巴氏消毒(94°C，2s)并且储存在4t:。通过ProbiAB(Lund，Sweden)进行发酵。表5示出了测试饮料的不同组成。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>~~这些浆果含有<0.04的蔗糖。*所有黑果越桔饮料进一步含有72.8mg抗坏血酸、320.lmgtrecomex、291mgCNK。在供应72.8mg抗坏血酸之前，将320.lmgtrecomex(经过改变的马铃薯淀粉)、291mgCNK(角叉菜聚糖E407)以及26.18g蔗糖加至每种黑果越桔饮料中。此外，将l.18g葡萄糖加至B-经发酵的饮料中来补偿在发酵过程中碳水化合物的损失。最后，用32.Og水对所有黑果越桔饮料进行调节，这样就获得了含有20%黑果越桔以及30g的碳水化合物的300g黑果越桔饮料。测试饮料的研究将所有饮料作为早餐来供应并进行随机提供，相隔至少五天。从所有受试者获取了书面的知情同意书。他们也完全意识到以下事实，即他们可以在任何时间从该研究中撤出并且无需另外的解释。隆德大学医学系的伦理委员会批准了这项研究。测试受试者十三位健康的、不吸烟的志愿者参加了这项急性膳食研究。平均年龄是25.5士1.34(平均值士SD)岁，并且平均体重指数是在正常范围内(20.8±0.24kg/m2;平均值士SD)。受试者之一在一次测试期之前患有胃性流行性感冒(gastricinfluenza)，并且因此被排除在这项研究之外。这些受试者没有接受任何药物治疗。他们被要求在测试前一天避免酒精摄入、体力活动、以及富含纤维素的正餐。这些受试者在每次试验之前的晚上9点和IO之间食用逐个选择量的WWB。在整个研究中将逐个选择的切片量保持相等。在WWB膳食之后，这些受试者被要求在到达实验室之前不要摄入更多的东西。然而，若有必要，允许在10pm之后摄入少量的水。每位受试者参加四次试验，间隔至少一周。研究设计和血液采样这些受试者在早上07.45到达实验室，并且肘前静脉被插入一根外周导管。在每次试验时，所有参加者都填写了一个关于他们这一天身体状况的调查表，包括压力或者焦虑的感觉。膳食在10分钟的过程中以平稳的方式被消耗掉。在禁食以及在膳食摄入后的15、30、60、90、120分钟采集毛细血管血用于血清胰岛素和血浆血糖的分析。葡萄糖分析用B-GlucoseAnalyser(modelno.120401，HemocueAB，Angelholm，Sweden)测定血糖。胰岛素分析将血清胰岛素样本储存在-2(TC。通过使用一种酶免疫测定试剂盒(MercodiaInsulinElisa;MercodiaAB，U卯sala，Sweden)在一个一体化的酶免疫测定分析仪(CODAOpenMicroplateSystem;Bio-RadLaborato:ries，HerculesCA)上进行分析。计算和统计分析针对每位参加者和每种测试饮料，通过使用Gr即hPadPRISM(version3.02;Gr即hPadSoftwareInc，SanDiego)计算出血糖和血清胰岛素在0-45分钟和在0-120分钟的增加的曲线下面积(AUC)。将所有在基线以下的面积从计算结果中排除。在每个时间点对血糖和血清胰岛素进行统计学分析。用MINITAB统计软件(发行了13.1用于windows)进行统计计算。显著性是由在广义线性模型(AN0VA)之后跟随Tukey多重比较检验或者丹内特检验而进行测定的。产生P<0.05的差异被认为是显著性的。血浆葡萄糖与具有活菌的测试饮料相比，在摄入发酵之后进行巴氏消毒的测试饮料之后，早期(0-45min)和晚期(0-120min)的葡萄糖曲线下面积均轻微更低，如在图4中所见。通过将血糖保持在血糖方面具有最大增加的禁食值之上的持续时间除以该禁食值来对葡萄糖曲线的特点进行分析。这一商值被称为葡萄糖持续时间/峰值定额(min/AmM)。在葡萄糖持续时间/峰值定额上的高值意味着葡萄糖曲线是长而低的，而低值表明了具有短而高的曲线的不利的曲线特点。不能确定GI值，这是因为在此测试中不包括参比物。表6-具有活菌的经发酵的饮料和经发酵的并且经巴氏消毒的饮料的AUC120min(血桨葡萄糖)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>这些图指出了平均值士SD，n=测试人员的数目。表7-具有活菌的发酵饮料和经发酵的并且经巴氏消毒的饮料的AUC45min(血浆葡萄糖)和葡萄糖持续时间/峰值定额。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>这些图指出了平均值士SD，n=测试人员的数目。血清胰岛素在摄入这两种黑果越桔饮料之后的胰岛素反应示于图5中。与具有活菌的测试饮料相比，在摄入发酵之后进行巴氏消毒的测试饮料之后AUC更低。不能确定NoII值，这是因为在此测试中不包括参比物。表8-具有活菌的经发酵饮料和经发酵的并且经巴氏消毒的饮料的AUC120min(血清胰岛素反应)。饮料AUC120minSEM(n=12)B_ferm.活的6.651.06B-ferm.并且经巴氏消毒4.750.51这些值已经在分析之前用BoxCox变换进行转化。讨论两种饮料给出了针对葡萄糖的近似相同的反应。与具有活菌的饮料相比，经巴氏消毒(即将细菌杀死)的饮料在胰岛素反应上显示出更好的结果。在更早的研究中，从单独的巴氏消毒法中在胰岛素反应上没有见到作用，即经巴氏消毒的黑果越桔给出了与非经巴氏消毒的黑果越桔相同的结果。然而，本研究表明，在一个较大程度上，发酵之后的热处理的程度可能影响胰岛素反应。这种作用的机制需要进行进一步评价。一种理论是，一种更为强大的热处理，通过对多酚类和其他黑果越桔中的生物活性组分的作用而给出一种胰岛素降低的作用，这种效应是通过由于额外的热处理步骤而具有热灭活的细菌的饮料来进行阐述的。酚类化合物的分析为了提供发生了一种含有多酚的植物材料的改变的证据，进行了一项研究，这项研究比较了在发酵之前和发酵之后蔷薇果浓浆、黑果越桔、黑果越桔果皮、以及红豆越桔果皮中的儿茶素、表儿茶素、原花色素二聚物苷元、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羟基苯基丙酸丄-(_)-3-苯基乳酸、原儿茶酸以及矢车菊素_3-半乳糖苷/矢车菊素_3-葡萄糖苷。在发酵之前将所有水果部分进行巴氏消毒以避免其他微生物影响发酵。为了分析酚类化合物，将样本称重并且加入了用于进行萃取的溶液(在样本中的浓度50%乙醇、0.05M磷酸，或可替代地50X甲醇，0.5%)。此后，在超声浴中将这些样本萃取10min并接着进行离心，之后将上清液转移至小瓶中并且通过HPLC-MS分析法进行分析。如在以下文献中所述通过API150EXTurboIonspray进行HPLC-MS分析Salminenetal.Characterisationofproanthocyanidinaglyconesandglycosidesfromrosehipsbyhigh_performancceliquidchromatogr即hy—massspectrometry"andtheirrapidquantificationtogetherwithVitaminC.JChromA2005;1077:170-180、以及Salminenetal.CharacterisationofhydrolysabletanninsfromleavesofBetul即ubescensbyhigh—performanceliquidchromatogr即hy-massspectrometry.JChromA1999;864:283-291。将该仪器设定在阴性模式中，即对阴离子进行分析。HPLC系统包括一个PerkinElmerLC-200MicroPump型的HPLC泵，并且还有一个PerkinElmer200自动进样器。样本的注射容积是8iU。对遍及90-1000m/z之间的质量数进行扫描。用于检测的具体的质量数儿茶素，m/z289(M-H)表儿茶素，m/z289(M-H)原花青素B2，m/z577(M-H)原花色素二聚物苷元，m/z577(M-H)原花色素三聚物苷元，m/z865(M-H)原花色素四聚物苷元，m/z1153(M-H)3，4-二羟基苯基丙酸，m/z181(M_H)L-(-)-3-苯基乳酸，m/z165(M-H)原儿茶酸，m/z153(M-H)矢车菊素-3-半乳糖苷/矢车菊素_3-葡萄糖苷，m/z447(M_H)这项研究的结果可以在图6中看到，它显示出含有多酚的植物材料的改变在黑果越桔连同在红豆越桔和蔷薇果中均发生。表9-在黑果越桔、红豆越桔以及蔷薇果中含有多酚的植物材料的改变<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在一项关于大鼠的研究中，已经显示将如果消耗了蔷薇果加上植物乳杆菌299v或植物乳杆菌HEAL19与如果仅消耗了蔷薇果进行比较，则在盲肠中所选择的酚类化合物的浓度是不同的(表IO)。这表明多酚成分在盲肠内进行发酵的过程中被改变。表IO.在盲肠内容物中所选择的酚类化合物。峰l=yg儿茶素/g鲜重，峰2、3、4以及6=g儿茶素当量/gfw，峰5=g槲皮素-鼠李糖苷/gfw。峰1儿茶素Rtl3.8min，m/z289峰2Rtl6.1min，m/z291峰3Rtl7.1min，m/z385峰4Rtl8.6min，m/z291峰5Rt23.1min，m/z447峰6Rt29.3min，m/z289结肠炎对照1.65.301.70.69.3Lp299v0.95.803.31.08.2HEAL191.25.402.20.82.4蔷薇果29.9122.7跳812.20.28.6蔷薇果+Lp299v38.7119.851.511.30.218.2蔷薇果+HEAL1940.9134.228.217.10.264.4对用棺物乳杆菌HEAL19、棺物乳杆菌299v、或者乳酸片球菌讲行的发酵讲行比綱则i式为了提供在用其他细菌进行发酵时发生了一种含有多酚的植物材料的改变的证据，进行了一项研究，该研究比较了用植物乳杆菌HEAL19、植物乳杆菌299v或乳酸片球菌在进行发酵之前和之后在黑果越橘中的儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、原花色素三聚物苷元、原花色素四聚物苷元、3，4-二羟基苯基丙酸、L-(-)-3-苯基乳酸、原儿茶酸、以及矢车菊素_3-半乳糖苷/矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量。这项研究的结果可以在图7中看到，它显示出含有多酚的植物材料的改变发生在用所有测试的细菌(即植物乳杆菌HEAL19、植物乳杆菌299v或乳酸片球菌)进行发酵之后。表11-在用植物乳杆菌HEAL19、植物乳杆菌299v或乳酸片球菌进行发酵之后含有多酚的植物材料的改变<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求用于改变一种或多种含有多酚的植物材料的一种方法，其中所述方法包括a)将至少一种含有多酚的材料与至少一种溶剂进行混合以提供一种混合物；b)对该混合物进行加热以消除存在的细菌种类来提供一种经加热的混合物；c)以可任选的顺序或者同时地将至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株以及可任选地至少一种蛋白质来源加至该经加热的混合物中来提供一种发酵混合物；并且d)使该发酵混合物经受适宜于该发酵混合物的发酵的条件以提供一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的一种混合物；并且e)可任选地消除该改变多酚的乳酸菌的菌株以提供一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的一种混合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中该含有多酚的至少一种植物材料与该至少一种溶剂的混合物是通过均化作用获得的。3.根据权利要求l或者2所述的方法，其中在步骤b)中的加热发生在6(TC至10(TC的温度，优选80°C至IO(TC，更优选90°C至IO(TC。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将该经加热的混合物的pH调节到在大约4.5至g、优选5至7范围内的一个pH值。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中加入了该至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株，其量值是大约105至109cfu/ml混合物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该至少一种蛋白质来源是选自下组，该组包括蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、以及它们的组合。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中加入了该至少一种蛋白质，其量值按该混合物的重量计是0.0001-0.1%。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株是选自下组，该组包括乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、魏斯氏菌属、明串珠菌属、酒球菌属、乳球菌属、以及系统发生意义上相关的属。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株是选自以下系统发生的组，该组包括植物乳杆菌、类植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、以及Lactobacillusargentoratensis。10.根据权利要求9所述的方法，其中该植物乳杆菌是选自以下菌株的组，该组包括植物乳杆菌299、DSM6595、植物乳杆菌299v、DSM15316、植物乳杆菌HEAL9、DSM15312、植物乳杆菌HEAL19、DSM15313、以及植物乳杆菌HEAL99、DSM15316。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中这些发酵条件是在3(TC至5(TC的温度、在大气压下的一种液体培养基中。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该发酵进行到直至达到<5的一个pH值，优选〈4。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中对该改变多酚的乳酸菌的菌株的消除是通过加热、紫外辐射、Y辐射、压力、电流、放电、脉冲电场、无菌过滤、或者电击而发生的。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该含有多酚的一种或多种植物材料是选自下组，该组包括水果、蔬菜、浆果、茶、绿茶、咖啡、可可、谷物、巧克力、以及树皮。15.根据权利要求14所述的方法，其中这些水果和浆果是选自下组黑果越桔、红豆越桔、蔓越莓、苹果、香蕉、黑醋栗、草莓、覆盆子、蔷薇果、葡萄、柑橘、腺肋花楸、日本木瓜、黑剌李、蔷薇果和接骨木果、剌山柑浆果、橄榄、或者其他富含多酚的果实。16.根据权利要求14所述的方法，其中该树皮是选自肉桂。17.根据权利要求14所述的方法，其中这些谷物是选自燕麦、大麦、小麦、高粱、粟类、水稻、以及玉米。18.—种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的一种混合物、或者一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的一种混合物用于制造预防或治疗糖尿病、代谢性综合征、肥胖、以及心血管疾病的一种组合物的用途。19.根据权利要求18所述的用途，其中所述组合物是一种药物组合物或者食品组合物。20.根据权利要求19所述的用途，该食品组合物是一种食物产品或者食品增补剂。21.根据权利要求20所述的用途，其中所述食物产品是选自下组，该组包括面包类、乳酪类、酸奶类、果汁类、健康饮料类、健康食品棒类、涂抹酱类、饼干类、以及谷类食品。全文摘要本发明涉及用于改变一种或多种含有多酚的植物材料的方法，其中所述方法包括将至少一种含有多酚的材料与至少一种溶剂进行混合以提供一种混合物；对该混合物进行加热以消除存在的细菌种类来提供一个经加热的混合物；以可任选的顺序或者同时地将至少一种改变多酚的乳酸菌的菌株以及可任选地至少一种蛋白质来源加至该经加热的混合物中以提供一种发酵混合物；并且使该发酵混合物经受适宜于该发酵混合物发酵的条件以提供一种或多种经过改变的含有多酚的植物材料的混合物；并且可任选地消除该改变多酚的乳酸菌的菌株以提供一种或多种不含活乳酸菌的、经过改变的含有多酚的植物材料的混合物。文档编号A61P3/08GK101715347SQ200880019313公开日2010年5月26日申请日期2008年6月5日优先权日2007年6月8日发明者A·伯格伦,J·阿伦法尔申请人:普罗比公司