细胞材料的干粉的制作方法

专利名称：细胞材料的干粉的制作方法
细胞材料的干粉对相关申请的交叉引用本申请要求提交于2007年10月5日的美国申请流水号60/997923的优先权，将 该申请的全部内容以引用的方式并入本文中。背景病毒颗粒、细胞生物和其它膜被材料(membrane bound material)的干燥形式 (dry form)在制药与综合医疗保健(general healthcare)工业中可以具有巨大的应用。 干燥细胞形式(dry cellular form, DCF)展示了在长期储藏、便于加工和运输方面具有实 用性以供食品、农业和人类健康应用。DCF的示例包括供食品应用的干酵母，冷冻保存细 胞(例如血细胞)和供基因递送的全细胞(Trsic-Milanovic等，J. Serb. Chem. Soc. ,66 435-42，2001 ；Diniz-Mendes 等，Biotechnol. Bioeng.，65 :572_8，1999 ；以及 Seville 等， J. Gene Med.，4 :428_37，2002)。DCF通常通过两种方法制备i)冻干法(lyophilization)或冷冻干燥，其涉及大 量干燥所述细胞形式的水性悬浮液，或者ii)冷冻保存，其涉及将高水平的冷冻保护剂注 入水性细胞悬浮液中，并以规定的(prescribed)速率将所述悬浮液的温度降低到0°C以下 以将细胞死亡降到最低。冻干法(或冷冻干燥)和冷冻保存的一个不利之处为难以以大容 量低成本制备DCF并同时保全(preserve)大部分细胞材料(Kirsop和Snell，编者，1984， Maintenance ofMicroorganisms AManual of Laboratory Methods, London, Academic Press)。两个技术均受到跨脂质双层膜的质量传递和相关的渗透应力(osmotic stress) 的限制。冻干法用于商业制备卡介苗(BCG)疫苗。每年BCG通过注射施与数百万新生婴儿 以针对结核(TB)进行保护，结核是一种由称为结核杆菌(tuberclebacillus)或结合分枝 木干胃(Mycobacterium tuberculosis)白勺_胃弓Ife白勺双_ (Roche Trends Microbiol.， 3 :397-401，1995)。当下，TB为第六大死亡原因，且其全球流行以预计每年3%的速率增长。 AIDS的出现与其和TB的联系招致对新疫苗的紧急需求的增加，这是因为BCG在人针对TB 感染的脆弱(vulnerability)期间内，通常为人的生命的前30年，仅为一般有效的(Fine， Lancet, 346 1339-1345，1995)。BCG缺乏效力的一个潜在原因为BCG在制成的DCF中的低 存活力。概述本发明部分基于下述喷雾干燥细胞材料的新方法和组合物的发现，即所述材料展 现显著的产品产率、高生物活性(例如，存活力)和良好的粉末加工性质。以一定比例含有 棒状和球状两种颗粒的粉末综合了载体和多孔颗粒系统(porous particle system)的益 处，并较之标准球形并具有类似几何直径的颗粒提供更好的分散(dispersion)和更高的 雾化(aerosolize)能力。这些性质提供了新的方法和组合物，其作为疫苗(例如，通过注 射、口服或吸入施用的疫苗)是有用的，并产生天然掺入干细菌(如卡介苗(BCG))的配制 剂(formulation)，同时允许使用简单且低成本的吸入器用于递送气雾剂(aerosol)。在一个方面，本发明的特征在于包括球状颗粒形式的赋形剂和棒状颗粒形式的细胞材料的干粉，其中按重量计所述粉末的70%或更多包含球状颗粒，且按重量计所述粉末 的30%或更少包含棒状颗粒。在多个实施方案中，所述细胞材料可包括细菌，例如结核分枝杆菌、耻垢分枝杆 菌(Mycobacterium smegmatis)细菌、卡介苗(BCG)细菌。所述赋形剂可为或包括亮氨 酸、甘露醇、海藻糖、葡聚糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、白蛋白、甘油、乙醇或其混合物。所述棒 状颗粒可具有约1-4 μ m的长度和200-400nm的直径。所述球状颗粒可具有约1_4 μ m的 平均几何直径。所述粉末可具有约2-3μπι的质量中值空气动力学直径(mass median aerodynamicdiameter) 0在一些实施方案中，所述粉末包含按重量计少于10%的水。这些干粉可用于施用细胞材料、刺激针对细胞材料的免疫应答的方法，并通常用 作疫苗。在另一个方面，本发明包括方法，所述方法包括(a)测定要向患者施用的包含细 胞材料的干粉的颗粒的几何性状(geometry)；并(b)若所述粉末包含按重量计70%或更 多球状颗粒和按重量计30%或更少棒状颗粒，则选择所述干粉作为供通过吸入施用的组合 物。在这些方法中，所述棒状颗粒可包含细胞材料，如细菌，例如，本文所述的那些，且 可具有本文所述的尺寸。球状颗粒亦可具有本文所述的尺寸。包含球状与棒状两种颗粒的混合物的干粉可包含按重量计60%或更多(例如， 70%或更多，80%或更多，85%或更多，90%或更多，95%或更多)的球状颗粒和按重量 计40%或更少(例如，30%或更少，20%或更少，15%或更少，10%或更少，5%或更少) 的包括细胞材料的棒状颗粒。在一些实施方案中，所述棒状颗粒具有约0.5-10 μ m(例 如，约 1-10 μ m, 2-10 μ m, 4-10 μ m, 0. 5-8 μ m, 1-8 μ m, 2-8 μ m, 4-8 μ m, 0. 5-6 μ m, 1-6 μ m, 2-6 μ m，0· 5-4 μ m 或 1-4 μ m)的长度，以及约 IOO-IOOOnm (例如，约 100_800nm，100_600nm， 200-1000nm，200-800nm，200-600nm 或 200-400nm)的直径。在一些实施方案中，所述球 状颗粒具有约 0. 5-10 μ m(例如，约 1-10 μ m，1-8 μ m，1-5 μ m，1-4 μ m，1-3 μ m，3-10 μ m， 3_8μπι或3_5μπι)的平均几何直径。在一些实施方案中，所述干粉具有约1_4μπι(例如， 约 1-3. 5 μ m，1-3 μ m, 1. 5-4 μ m, 1. 5-3. 5 μ m，L 5-3 μ m, 2-4 μ m, 2-3. 5 μ m 或 2-3 μ m)的质 量中值空气动力学直径。如本文所使用的术语“棒状(rod-like) ”指具有至少为其宽度或直径两倍的长度 的颗粒或细胞材料，且大致具有圆柱形外观。棒状颗粒或细胞材料不必需具有平滑表面。如本文所使用的“球状(sphere-like) ”颗粒或细胞材料的总体外观为球，但不必 需为完美的球，且不必需具有平滑表面。举例而言，椭球可视为球状颗粒，只要其长度小于 两倍宽度或直径。在另一方面，本发明包括产生包含细胞材料的干粉方法，所述方法通过如下进行 提供包括至少0. 01mg/ml (例如，至少0. 1，1，2，5，10，20，50，100或200mg/ml)赋形剂和至 少IO5单位/ml (例如，至少IO6, IO7, IO8, IO9或IO10单位/ml)细胞材料的水溶液，并将所 述溶液在下述条件下喷雾干燥，即在所述条件下产生包括所述细胞材料(例如，棒状细胞 材料)、与按重量计少于约10% (例如，少于约8%，5%，4%，3%，2%或)的水(例如， 游离水)的干粉。在一些实施方案中，赋形剂质量对细胞材料单位数的比例为至少每单位 细胞材料 0. 25 皮克(picogram)赋形剂(例如，至少 0. 25，0. 5，1，2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000，10，000或20，OOOpg赋形剂每单位细胞材料)。在一些实施方案中， 赋形剂质量对细胞材料质量的比例为至少0. 1 (例如，至少0. 25，0. 5，1，2，5，10，15，20，25， 30，40，50，100，200，500，1000或2000)。在一些其中所述细胞材料包括细菌(例如，棒状细 菌(rod-shaped bacteria)或革兰氏阳性细菌)的实施方案中，所述溶液不含添加的盐或 冷冻保护剂。在一些其中所述细胞材料包括真核细胞(例如，哺乳类细胞)的实施方案中， 所述溶液可包含盐或其它足以使渗透压降到最低(minimize)的溶质。在一些实施方案中，所述溶液按干重计包含至少10% (例如，至少25%，30%， 40%，50%，60%，70%，80%，90%，92%，94%，96%，98%，99%或更多)赋形剂。在一些 实施方案中，所述溶液包含少于IO10单位/ml (例如，少于IO9, IO8, IO7或IO6单位/ml)的 细胞材料。在一些实施方案中，所述细胞材料，例如，棒状细胞材料，包括细菌(例如，分枝 杆菌属(Mycobacterium)的细菌，例如，结核分枝杆菌，耻垢分歧杆菌，或卡介苗)，病毒， 真核微生物，哺乳动物细胞(例如，红细胞，干细胞，粒细胞，成纤维细胞或血小板)，膜被 细胞器(membrane-bound organelles)，月旨质体，基于膜的生物反应器(membrane-based bioreactor)或基于膜的药物递送系统。在一些实施方案中，所述赋形剂包括亮氨酸，甘露 醇，海藻糖，葡聚糖，乳糖，蔗糖，山梨醇，白蛋白，甘油，乙醇或其混合物。在一些实施方案 中，水溶液不含冷冻保护剂，例如，非赋形剂的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述方法进 一步包括将所述干粉配制在药物组合物中，例如，以供通过吸入施用。本发明亦包括由所述 新方法产生的包含细胞材料的干粉。在另一方面，本发明包括喷雾干燥细胞材料，例如，棒状细胞材料，以通过降低渗 透应力而使对所述材料的损害减至最小。渗透应力可通过下述方法降低，即获取待喷雾 干燥的所述细胞材料单位(本文中亦称为细胞)的半径的初始值or(0))，选择下述诸项 的值(i)喷雾干燥器入口与出口气体温度的差异(ΔΤ)，(ii)平均小滴尺寸(average droplet size) (Rd)，(iii)溶剂汽化的潜热(λ)，(iv)所述细胞材料的膜对冷冻保护剂的 液压渗透性(hydraulicpermeability) (Lp), (ν)胞外溶质的摩尔数(Xes)，(vi)胞内溶质的 摩尔数(Xis), (vii)胞外冷冻保护剂的摩尔数(χ:)，(viii)冷冻保护剂的初始胞内浓度 (Cici(O))，和(ix)细胞数(n。ells)，使用所选值求解方程式36 且，若Re (t)在整个预期的干燥时间内保持在最小与最大极限值之间，则使用所选 值的条件对所述细胞材料进行喷雾干燥以使对所述材料的损害减为最小。在一些实施方案 中，所述方法亦包括确定预测的干燥时间。干燥时间的最小与最大极限值可经选择而使对 所述材料的损害减为最小。举例而言，所述最小极限值可设为在干燥后所得半径至少为初 始半径的约60% (例如，至少70%，80%，90%，95%，98%或99% )。举例而言，所述最大极限值可为初始半径的至多160% (例如，至多140%，125%，110%，105%，102%或101%)。在一些实施方案中，所述细胞材料包括细菌(例如，分枝杆 菌属的细菌，例如，结核分枝杆菌，耻垢分歧杆菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳动物 细胞(例如，红细胞，干细胞，粒细胞，成纤维细胞或血小板)，膜被细胞器，脂质体，基于膜 的生物反应器或基于膜的药物递送系统。在一些实施方案中，在喷雾干燥之前即刻将所述 冷冻保护剂添加于所述细胞材料(例如，在所述细胞材料之内或之外)。在一些实施方案 中，所述方法进一步包括将所述干粉配制到药物组合物中，例如，以供通过吸入施用。本发 明亦包括由所述新方法产生的包含细胞材料的干粉。在又一个方面，本发明包括干粉，其具有少于约10% (例如，少于约8%，5%，4%， 3%，2%或1%)的水(例如，游离水)，细胞材料(例如，棒状细胞材料)，和按干重计至少 25 % (例如，至少 30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，92 %，94 %，96 %，98 %，99 % 或 更多)的赋形剂(例如球状颗粒赋形剂)的干粉。在一些实施方案中，所述粉末通过喷雾 干燥产生。在一些实施方案中，所述细胞材料包括细菌(例如，分枝杆菌属的细菌，例如，结 核分枝杆菌，耻垢分歧杆菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳动物细胞(例如，红细胞， 干细胞，粒细胞，成纤维细胞或血小板)，膜被细胞器，脂质体，基于膜的生物反应器或基于 膜的药物递送系统。在一些实施方案中，赋形剂质量对细胞材料单位数的比例为至少0. 25pg赋形剂 每单位细胞材料(例如，至少 0. 25，0. 5，1，2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000， 10000或20000pg赋形剂每单位细胞材料)。在一些实施方案中，赋形剂质量对细胞材料质 量的比例为至少 0. 1(例如，至少 0. 25，0. 5，1，2，5，10，15，20，25，30，40，50，100，200，500， 1000 或 2000)。在一些实施方案中，当所述粉末包含活细胞(例如，细菌)时，多于0.5% (例 如，1%，2%，4%，5%，6%，8%，10%，12%，15%，18%，20%，25%或更多)的细胞为存活 的。在一些实施方案中，在粉末中的活细胞在储藏于高于0°C (例如，高于41，101，201， 251，301，401，或501)下超过 10 天(例如，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110 或 120 天)的时间后保留大于1/1000 (例如，大于1/500，1/200，1/100，1/50，1/20或1/10)的其 初始活性。在一些实施方案中，所述赋形剂包括亮氨酸，甘露醇，海藻糖，葡聚糖，乳糖，蔗糖， 山梨醇，白蛋白，甘油，乙醇或其混合物。在一些实施方案中，所述粉末不包括冷冻保护剂， 例如，添加的冷冻保护剂或显著量的冷冻保护剂(例如，非赋形剂的冷冻保护剂)。在一些 实施方案中，所述粉末不包括盐，例如，添加的盐或显著量的盐。所述干粉可配制为药物组 合物，例如，以供通过吸入施用。本发明进一步包括产生包括少于约10% (例如，少于约8%，5%，4%，3%，2%或 1%)的水(例如，游离水)、和分枝杆菌属细菌的干粉的方法，所述方法通过如下进行，即 提供包含至少0. 01mg/ml (例如，至少0. 1，1，2，5，10，20，50，100或200mg/ml)的赋形剂和 至少IO5菌落形成单位/ml (例如，至少IO6, IO7, IO8, IO9或IO10菌落形成单位/ml)的分枝 杆菌属细菌的水溶液，并将所述溶液在下述条件下喷雾干燥，即在所述条件下产生包含少 于约10% (例如，少于约8%，5%，4%，3%，2%或1%)的水(例如，游离水)、和分枝杆菌 属细菌的干粉。在一些实施方案中，所述溶液包括至少0. 25pg赋形剂每菌落形成单位(例 如，至少0. 5，1，2，5，10，15，20，25，35或50pg赋形剂每菌落形成单位)的分枝杆菌属细菌。在一些实施方案中，所述水溶液不含冷冻保护剂，例如，非赋形剂的冷冻保护剂。在一些实 施方案中，所述分枝杆菌属的细菌为结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌(Mbovis)， 或卡介苗细菌。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述干粉配制到药物组合物中， 例如，以供通过吸入施用，或在将所述粉末在药学上可接受的液体载体中重建后通过注射 施用。本发明亦包括由所述新方法产生的包含分枝杆菌属细菌的干粉。在另一方面，本发明包括疫苗组合物，其包含具有少于约10% (例如，少于约8%， 5 %，4 %，3 %，2 %或1 % )的水(例如，游离水)，细胞材料(例如，棒状细胞材料)，和按干重 计至少 25% (例如，至少 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%或更多)的赋形剂(例如，球状颗粒材料)的干粉。在一些实施方案中，所述干粉通过 本文所描述的方法产生。所述疫苗组合物可配制用于胃肠外或粘膜(例如，口服或吸入)施 用。在一些实施方案中，所述细胞材料包括细菌(例如，分枝杆菌属的细菌，例如，结核分枝 杆菌，耻垢分枝杆菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳动物细胞(例如，红细胞，干细胞， 粒细胞，成纤维细胞或血小板)或膜被细胞器。疫苗组合物可包含一种或多种佐剂。在一 些实施方案中，将所述一种或多种佐剂与所述细胞材料一起喷雾干燥以形成干粉。在一些 实施方案中，将所述一种或多种佐剂与所述干粉在其产生后混合。本发明亦包括将细胞材料向受试者施用的方法，其包括向受试者施用下述组合 物，即所述组合物包含本文所述的干粉或由本文所述方法产生的干粉。在一些实施方案中， 施用为通过吸入，口服摄入，或表皮，皮下或静脉内注射进行的。本发明还包括刺激或诱导免疫应答的方法(例如，免疫的方法)，所述方法通过如 下进行，即通过向受试者(例如，人或动物)施用包含本文所述干粉的疫苗组合物。在一些 实施方案中，所述干粉是通过本文所述方法产生的。所述疫苗组合物可配制用于胃肠外或 粘膜(例如，口服或吸入)施用。在一些实施方案中，所述受试者为婴儿，儿童或成人。在 一些实施方案中，所述细胞材料包括细菌(例如，分枝杆菌属的细菌，例如，结核分枝杆菌， 耻垢分枝杆菌，或卡介苗)，病毒，真核微生物，哺乳动物细胞(例如，红细胞，干细胞，粒细 胞，成纤维细胞或血小板)或膜被细胞器。供免疫方法使用的疫苗组合物可包含一种或多 种佐剂。本方法亦包括本文所述的干粉或由本文所述方法产生的干粉治疗多种疾病的用 途，或在药物(例如，疫苗)制备中的用途。在进一步的方面，本发明包括储藏本文所述干粉的方法，所述方法通过将所述 粉末保持在高于冻结的温度，例如，4°C -50 0C (例如，4°C -40°C,40C -30°C,4°C -20°C, 4°C -10°C,10°C -50°C, 10°C -40°C, 10°C -30°C )至少一天(例如，至少一周，两周，三周，一 个月，两个月，三个月，四个月，五个月，六个月，七个月，八个月，九个月，十个月，十一个月， 一年或更长)的时间段。在一些实施方案中，将所述干粉保持在环境温度下。在一些实施 方案中，所述干粉由本文所述方法产生。在一些实施方案中，将所述干粉配制为药物或疫苗 组合物。在更进一步方面，本发明包括运输药物或疫苗组合物的方法，所述组合物包含具 有少于约10% (例如，少于约8%，5%，4%，3%，2%或1%)的水(例如，游离水)，细胞材 料，和按干重计至少 25% (例如，至少 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，92%，94%， 96%,98%,99%或更多)的赋形剂的干粉。所述方法包括产生包含干粉(例如，由本文所述
7方法产生的干粉)的药物或疫苗组合物，并将所述药物或疫苗组合物或疫苗组合物以高于 冻结的温度，例如，4°C -500C (例如 40C -400C，40C -300C，40C -200C，4°C -IO0C，10°C -500C， IO0C -40IO0C -300C )运输。在一些实施方案中，所述药物或疫苗组合物在环境温度下 运输。在另一方面，本发明包括干粉递送装置用于向婴儿递送干粉(例如，本文所述的 干粉，药物，疫苗，或由本文所述方法产生的干粉)。所述装置包含安慰器(pacifier)，其核 心含有主动或被动干粉递送系统。空气流经所述干粉系统，在该系统中使空气充满粉状药 物或疫苗。充满粉状药物或疫苗的空气通过进入口腔的乳头装置(参见图24)或者通过进 入鼻腔的管状装置(参见图25)排离安慰器。干粉气雾剂较之喷雾溶液的优势在于它们可 更易于储藏，通常以更高效率递送于肺部，并允许递送化学上更加复杂的物质。在另一方面，本发明包括用于组合物的经口递送装置(oral deliverydevice), 其包含安慰器，所述安慰器带有涂覆在置于所述安慰器的乳头上的口相容性带(oral compatible tape)上或浸渍于置于所述安慰器的乳头上的口相容性带中的组合物(例如， 本文所述的干粉，药物，疫苗，或由本文所述方法产生的干粉)。当婴儿吮吸所述安慰器时， 来自他或她口中的唾液导致所述组合物溶解并经口摄入。在一些实施方案中，所述组合物 可制备为具有长效性质的可生物降解多聚物配制剂或药物前体。在一些实施方案中，所述 带可移除并丢弃，并于其位置放置新带条。本文所描述的组合物包含具有两个纳米级尺寸的轴(例如，棒状材料的宽度或直 径)和微米尺寸的第三轴(例如，棒状材料的长度)的颗粒；所述第三轴尺寸允许有效的类 微米物理分散(micrometer-like physical dispersion)，且前两个尺寸使主要纳米尺寸 颗粒轴与空气流的方向能够校直(alignment)。由此纳米与微米级尺寸组合而形成的颗粒 较之标准球形各相同性形状并具有相似几何直径的颗粒拥有更好的雾化能力。除非另行定义，本文所用的所有技术与科学术语与本发明所属领域普通技术人员 通常理解的含意相同。虽然在本发明的实践或测试中可使用类似于或等价于本文所述的方 法与材料的方法与材料，但是下面描述了合适的方法与材料。本文所提及的所有公开出版 物，专利申请，专利与其它参考文献均以其全文引用的方式包含于本文中。当出现冲突时， 应以包括定义的本说明书为准。此外，所述材料，方法与实施例仅为说明所用，并无进行限 定的意图。本发明的一个或多个实施方案的细节呈于下述附图和描述中。本发明的其它特 征，目标与益处从所述描述与图、以及权利要求而言为显而易见的。附图详述

图1为描述由水包围的细胞材料模型的概略图。『表示所述细胞的半径。Ces, Cecp, Cis与Cici分别表示胞外盐浓度、胞外冷冻保护剂浓度、胞内盐浓度与胞内冷冻保护剂浓度。图2A为平行膜的二维描述。图 2B 为凸坪边界(convex plateau border)的二维描述。图3为80 20Leu 耻垢分枝杆菌喷雾干燥产物的电镜显微照片。图4为95 5Leu 耻垢分枝杆菌喷雾干燥产物的电镜显微照片。图5为90 IOLeu 耻垢分枝杆菌喷雾干燥产物的荧光显微照片。使用的耻垢 分枝杆菌表达GFP并且在该显微照片中显示荧光。
图6为95 5Leu 耻垢分枝杆菌在储藏于25°C—周后的电镜显微照片。图7为描述在下述条件下干燥的小滴中相对细胞体积(V/X)的数值解的图(a) 细胞内冷冻保护剂量较之细胞外为大；(b)无冷冻保护剂；(c)细胞内外的冷冻保护剂等量。图8为描述甘油和盐因相似渗透应力而产生的对喷雾干燥的耻垢分枝杆菌存活 力的作用的图。图9为描述耻垢分枝杆菌的存活率(viability yield)相对赋形剂(亮氨酸)溶 液在喷雾干燥粉末中百分比的图。图10为描述对于50 50亮氨酸/耻垢分枝杆菌(smeg)粉末在三种储藏条件下 耻垢分枝杆菌存活率的经时线性图。图11为描述对于95 5亮氨酸/耻垢分枝杆菌粉末在三种稳定条件下耻垢分枝 杆菌存活率的经时线性图。所示结果为五次实验的平均值。图12A与12B为描述对于95 5亮氨酸/耻垢分枝杆菌粉末在三种稳定条件下， 包含或不包含单磷脂A时，耻垢分枝杆菌存活率的经时线性图。图13为描述在表面活性剂泰洛沙泊与Plur0niCTM-F68存在下喷雾干燥的95 5 与50 50Leu 耻垢分枝杆菌的存活率的图。图14为描述牛分枝杆菌BCG在两种储藏条件下存活率的经时线性图。图15为活NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞在喷雾干燥一个月后的显微照片。图16A到16F为一组原代收获大鼠心肌成纤维细胞在喷雾干燥后第3日与第8日 的20X相差显微照片图像。图17A到17F为一组NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞在喷雾干燥后第3日与第8日 的20X相差显微照片图像。图18为具有挤压启动(squeeze actuation)的功能活性婴儿干粉吸入装置的表 示图。图19为包括描述于图18的吸入器和机电挤压固定机械装置从而允许所述吸入器
可靠并可重复启动的体外启动系统。图20为95 5耻垢分枝杆菌L-亮氨酸粉末的电镜显微照片。棒状耻垢分枝 杆菌细菌与球状亮氨酸颗粒相关联。[需更佳的清晰度/对比度，或放弃该图]图21为不同比例的亮氨酸耻垢分枝杆菌喷雾干燥材料的质量中值空气动力学 直径(MMAD)的柱形图。水平线表示在2. 3 μ m处喷雾干燥的100%亮氨酸在2bar下测定的 几何尺寸(d50)。图22为在用细菌攻击(challenge)用95 5颗粒或BCG溶液通过所示路径免疫 的动物后，在肺和脾组织中的尸体剖检中每ml组织勻浆中活细菌数(CFU/ml)的柱形图。 未处理的对照(Unt. Ctl.)，用下述免疫的动物皮下2 X IO6CFU的BCG溶液(SC sol MED)， 皮内 2X IO6CFU 的 BCG 溶液(ID sol MED)，吹入 2X IO6CFU 的颗粒(Ins LPP MED)，皮下 2 X IO6CFU 的 95 5 颗粒(SC LPPMED)，皮下 2 X IO5CFU 的 BCG 溶液(SC sol LOW)，以及吹 入2X IO5CFU的95 5颗粒(Ins LPP LOW)。结果表示为平均值士标准偏差，对于每组η =6。图23A-23D为一组在用细菌攻击用95 5颗粒或BCG溶液通过所示路径免疫的动物后的肺组织病理学显微照片。未处理的对照(23A)，经下述免疫的动物皮下2X106CFU 的BCG溶液(23B)，皮下2 X IO6CFU的95 5颗粒(23C)，以及吹入2 X IO6CFU的95 5颗 粒(23D)。图24为用于经口腔吸入的干粉递送系统的示意图，所述系统包括安慰器外罩和 干粉递送系统。通过该装置的空气流方向如箭头所示。图25为用于经鼻腔吸入的干粉递送装置的示意图，所述装置包括安慰器外罩和 干粉递送系统。通过该装置的空气流方向如箭头所示。详细描述本发明涉及用于制造干燥细胞形式(DCF)的新组合物和方法。这些组合物和方 法促进细胞材料干燥形式以大容量生产，并具有良好的加工特征与细胞存活力。在优选 的实施方案中，所述细胞材料通过按干重计通常为至少50% (例如，至少60 %，70%，80% 或90%)的初始赋形剂浓度进行干燥。然而，在一些情况下，所述初始赋形剂浓度可低至 25%。这些赋形剂可以下述方式选择或加工，所述方式使得所述细胞材料与冷冻保护剂一 起干燥以减低所述干燥过程中的渗透应力。本文所述的组合物方法可用于干燥任何细胞材料，例如，与药物，农业或食品应用 相关的细胞材料。在本文中“细胞材料”与“膜被材料”可互换使用，并指由脂双层构成的 膜所包围的材料。细胞材料的示例包括细菌(例如，革兰氏阴性与革兰氏阳性细菌，及其疫 苗形式)，膜被病毒(例如，HIV)，真核微生物(例如，酵母)，哺乳动物细胞(例如，血细胞 (例如，脐带血细胞)，血小板，干细胞，粒细胞，成纤维细胞，内皮细胞(例如，脉管内皮细 胞)，肌肉细胞，皮肤细胞，骨髓细胞与其它细胞)，膜被细胞器(例如，线粒体)，脂质体，基 于膜的生物反应器(Bosquillon 等，J. Control. Release, 99 =357-367,2004)与基于膜的药 物递送系统(Smith 等，Vaccine，21 :2805_12，2003)。细胞材料的进一步示例包括膜被病毒(例如，流感病毒，狂犬病病毒，痘苗病毒， 西尼罗河病毒(West Nile virus), HIV, HVJ(仙台病毒)，乙型肝炎病毒(HBV)，正痘病 毒(orthopoxvirus)(例如，天花病毒与痘苗病毒)，单纯疱疹病毒(HSV)与其它疱疹病 毒)。其它示例性细胞材料的示例包括病毒性传染病(例如，AIDS，AIDS相关综合症(AIDS Related Complex)，水痘(varicella)，普通感冒，巨细胞病毒感染，科罗拉多蜱热，登革热， 埃博拉出血热，流行性腮腺炎，手足口病，肝炎，单纯疱疹，带状疱疹，人乳头瘤病毒(HPV)， 流感(flu)，拉沙热，麻疹，马尔堡出血热，传染性单核细胞增多症，流行性腮腺炎，脊髓灰 质炎，进 亍个生多病灶脑白质病(progressivemultifocal leukencephalopathy),狂犬病， 风疹，SARS，天花(variola)，病毒性脑炎，病毒性胃肠炎，病毒性脑膜炎，病毒性肺炎，西尼 罗河病和黄热病)的病原体，细菌性传染病(例如，炭疽，细菌性脑膜炎，布鲁菌病，弯曲 菌病，猫抓病，霍乱，白喉，流行性斑疹伤寒，淋病，脓疱病，军团杆菌病，麻风病(Hansen氏 病)，钩端螺旋体病，李斯特菌病，莱姆病，类鼻疽，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感 染，诺卡菌病，百日咳(whoopingcough)，鼠疫，肺炎球菌性肺炎，鹦鹉热，Q热，落基山斑疹 热(RMSF)，沙门氏菌病，猩红热，志贺氏菌病，梅毒，破伤风，沙眼，结核，土拉菌病，伤寒， 斑疹伤寒以及尿道感染)的病原体，寄生虫传染病(例如，非洲锥虫病，阿米巴病，蛔虫 病，巴贝虫病，恰加斯氏病(Chagas disease)，枝睾吸虫病，隐孢子虫病，囊尾蚴病，裂头绦 虫病，龙线虫病(dracunculiasis)，棘球蚴病，蛲虫病，肝片吸虫病，姜片虫病，丝虫病，自生阿米巴感染，贾第虫病，颚口线虫病，膜壳绦虫病，等孢子球虫病，黑热病，利什曼病，疟 疾，后殖吸虫病，蝇蛆病，盘尾丝虫病，虱病，蛲虫感染，疥疮，血吸虫病，绦虫病，弓蛔虫病， 弓形体病，毛线虫病(trichinellosis)，旋毛虫病(trichinosis)，鞭虫病与锥虫病)的 病原体，以及真菌传染病(例如，曲霉病，芽生菌病，念珠菌病(dandidiasis)，球孢子菌 病(doccidioidomycosis)，隐球菌病(cryptococcosis)，组织胞浆菌病与脚癣)的病原 体。此外，减弱的(例如营养缺陷的)版本的病原体与相关的可促进针对该病原体的免 疫的物质(例如，BCG与痘苗)可用于本文所述方法中，例如，用于疫苗生产(参见，例如， Sambandamurthy 等，Nat. Med.，9 9,2002 ；Hondalus 等，Infect. Immun. ,68 :2888_98，2000 ； 以及 Sampson 等，Infect. Immun. ,72 :3031_37，2004)。用于本文所述方法和组合物的赋形剂包括但不限于，相容性碳水化合物，天然和 合成多肽，氨基酸，表面活性剂，聚合物或其组合。通常的赋形剂对所干燥的细胞材料的 膜会具有小于1.0的反射系数(例如，小于0. 9，0. 8，0. 7，0. 6，0. 5，0. 4，0. 3，0. 2或0. 1) (参见，例如，Adamski and Anderson, Biophys J. ,44 79-90,1983 ；以及 Janacek and Sigler，Physiol. Res. ,49 191-195，2000)。合适的碳水化合物包括单糖，例如半乳糖， D-甘露糖，山梨糖，葡萄糖(dextrose)等。亦可使用二糖，例如乳糖，海藻糖，麦芽糖，蔗 糖等。其它的赋形剂包括环糊精，例如2-羟丙基-β -环糊精；和多糖，例如棉子糖，麦芽 糊精，葡聚糖等；和糖醇，例如甘露醇，木糖醇，山梨醇等。合适的多肽包括二肽阿斯巴甜 (aspartame)。合适的氨基酸包括任何在标准药物加工技术中形成粉末的天然存在的氨基 酸并包括非极性(疏水)氨基酸和极性(不带电荷的，带正电荷和带负电荷的)氨基酸，这 些氨基酸通常被FDA认为是安全的(GRAS)。非极性氨基酸代表性的示例包括丙氨酸，异亮 氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸和缬氨酸。极性、不带电荷的氨基酸的代 表性示例包括半胱氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸。极性、带正电荷的氨基酸的代 表性示例包括精氨酸，组氨酸和赖氨酸。带负电荷的氨基酸的代表性示例包括天冬氨酸和 谷氨酸。合适的合成有机聚合物包括聚[1-(2_氧-1-吡咯烷基)乙烯]，亦即，聚维酮或 PVP。干燥的组合物通常，细胞材料与相对少量的赋形剂一起干燥，常常涉及冻结。在不进行冻结时， 所得的粉末趋向于包含显著量的水，这是由于下述事实，即所述细胞材料，如不进行冻结， 无法干燥至给定含水量以下(例如，按重量计大约40%的水)，且仍保持活性。具有良好加 工和稳定性质的干燥的粉末通常需要按重量计少于10%，并优选少于5%的水。这是因为 较大的水组分导致在粉末颗粒之间显著的毛细管力(capillary force)并从而使所述粉末 聚集。因而为获取具有良好粉末加工和稳定性性质的DCF涉及用大量赋形剂进行喷雾干 燥。具体而言，为获取具有少于10%或5%总含水量的干粉，应将按重量计至少25% (例 如，至少 30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，92%，94%，96%，98%，99% 或更多)的 赋形剂与所述细胞形式一起干燥，产生含有相对较小重量份的细胞材料的干粉，其尽管保 留足够的水以维持活性，但对于粉末并不存在太多的水而损害所述粉末的总体加工性质。喷雾干燥是食品工业、制药工业和农业中使用的标准方法。在喷雾干燥中，通过将 喷雾的小滴与干燥介质(例如，空气或氮气)混合而使水分自雾化的进料(atomized feed) 蒸发。该过程使小滴中的挥发性物质干燥，并留存“干”颗粒的非挥发性组分，其尺寸、形态、密度和挥发物含量由干燥过程所控制。进行喷雾的混合物可为溶剂，乳剂，悬浮液或分 散液。干燥过程中的许多因素可影响干颗粒的性质，包括喷嘴的类型，圆筒的尺寸，挥发 性溶液的流速和循环的气体，以及环境条件(Sacchetti and Van Oort, SprayDrying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxoffellcome Inc.,1996)。通常，喷雾干燥的过程涉及四个步骤，将混合物分散为小滴，将喷雾与干燥介质 (例如，空气)混合，从喷雾中蒸发水分，并将干产物从干燥介质中分离(Sacchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques, Glaxo Wellcome Inc. ，1996)。将混合物分散为小滴极大地增加了待干燥体积的表面积，导致更加快速的干燥过 程。通常，更高能量的分散导致获得更小的小滴。所述分散可通过任何本领域已知方法达 成，包括压力喷嘴(pressure nozzle)，气动雾化喷嘴(two-fluid nozzle)，旋转式雾化器 (rotary atomizer)禾口超声喷嘴(Hinds, Aerosol Technology, 2nd Edition, New York, John Wiley and Sons，1999)。在一些实施方案中，所述混合物在低于200psi的压力下喷 雾。在所述混合物分散(喷雾)后，将所得喷雾与干燥介质(例如，空气)混合。通 常，所述混合过程发生于加热空气的连续流中。所述热空气改善向所述喷雾小滴的热转移 并增加蒸发速率。在干燥后空气流可排到大气中，或循化并重新利用。空气流通常通过在 所述气流任一端提供正和/或负压来保持(S acchetti and Van Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques, Glaxo Wellcome Inc.,1996)。当所述小滴与干燥介质发生接触时，蒸发迅速发生，这是由于所述小滴的比表面 积高且尺寸小。基于所述干燥系统的性质，可在干燥产物内保留残余水平的水分(Hinds， Aerosol Technology, 2ndEdition, New York, JohnWiley and Sons，1999)。所述产物随即自所述干燥介质分离。通常，所述产物的初步分离发生于干 燥室的基部，且随即使用，例如，旋风分离器(cyclone)、静电沉积器(electrostatic precipitator)(scrubber)(Masters SprayDrying Handbook. Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。终产物的性质，包括颗粒大小、最终湿度和收率取决于干燥过程中的许多因素。 通常，调整参数如进气温度、空气流速、液体进样的流速、小滴大小和混合物浓度以产生所 期望的产物(Masters 等，Spray DryingHandbook, Harlow, UK, Longman Scientific and Technical，1991)。进气温度指加热的干燥介质(通常为空气)如在流入干燥室之前测量的温度。通 常，进气温度可根据需要调整。所述干燥介质在产物回收位点的温度称为出口温度，且取决 于进气温度、干燥介质流速和喷雾的混合物的性质。通常，更高的进气温度使得终产物中水 分的量减少(Sacchetti and VanOort, Spray Drying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc.，1996)0空气流速涉及所述干燥介质流经所述系统。所述空气流可通过在所述喷雾干燥 系统任一末端或在所述喷雾干燥系统内保持正和/或负压来提供。通常，较高空气流速导 致所述颗粒在所述干燥装置中的较短停留时间(亦即，干燥时间)并导致在终产物中较大 量的残余水分(Masters 等，Spray DryingHandbook, Harlow, UK, Longman Scientific andTechnical,1991)。所述液体进样的流速指每单位时间递送到所述干燥室的液体量。所述液体的通过 量越高，则需要更多能量来将小滴蒸发成为颗粒。因而，较高流速导致较低输出温度。通常， 当保持进气温度和空气流速常数恒定而降低流速时终产物的水分含量降低(Masters等， Spray Drying Handbook，Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。小滴尺寸指由喷雾喷嘴分散的小滴的尺寸。通常，较小的小滴在终产物中提供较 低的水分含量与较小的颗粒尺寸(Hinds, Aerosol Technology, 2ndEdition, New York, John Wiley and Sons,1999)。待喷雾干燥的混合物的浓度亦影响终产物。通常，较高的浓度导致终产物中较大 的颗粒尺寸，这是因为每喷雾的小滴含有更多材料(Sacchetti andVan Oort, Spray Drying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques, Glaxo Wellcome Inc., 1996)。喷雾干燥系统为可商购的，例如，可购自Armfield，Inc. (Jackson,NJ),Brinkmann Instruments(Westbury, NY), BUCHI Analytical(New Castle, DE), Niro Inc (Columbia, MD), Sono-Tek Corporation(Milton, NY), Spray DryingSystems, Inc. (Randallstown, MD),以及 Labplant, Inc. (North Yorkshire, England)。喷雾干燥粉末的最终水分含量可通过任何本领域已知方法来确定，例如，通过热 重量分析。所述水分含量通过下述方法用热重量分析确定，即加热所述粉末，并测定在水分 蒸发过程中的质量损失(Maa等，Pharm. Res.，15 :5，1998)。通常，对含有细胞材料(例如，细 菌)的样品，水将蒸发成两相。第一相，称为游离水，主要为干赋形剂所含的水。第二相，称 为结合水，主要为所述细胞材料所含的水。游离水和结合水二者均可经测量以确定所述粉 末是否在所述赋形剂或细胞材料中含有所期望的水分含量(Snyder等，Analytica Chimica Acta, 536 :283_293，2005)。在一些实施方案中，所述干粉包括球状和棒状颗粒的混合物以形成有效的干粉 气雾剂作为有效吸入疫苗的基底。空气播散的棒作为极小的颗粒可具有穿过空气的能力 (而作为较大颗粒则表现为粉末形式)(Gonda等，Aerosol Sci. Tech.，4 =233-238,1985 ； Crowder 等，Pharm. Res.，19 :239_245，2002)，虽然有聚集的倾向(Hickey 等，Adv. Drug Del. Rev.，26 29-40,1997 ；Fults 等，Pharm. Dev. Tech.，2 :67_79，1997)。通过在粉末中保 持细菌的低重量浓度，赋形剂(例如，亮氨酸)可充当载体颗粒的角色，赋予与球状亮氨酸 颗粒相关的流动性质。一旦播散于空气中，所述细菌以棒状结构优异的气雾剂性质传播。这 导致兼具载体和多孔颗粒系统的优势的粉末。虽然大百分比的细菌妨碍气雾剂的流动(吸 入器散布(inhaler emission))性质，但是小百分比则允许自所述吸入器的优异散布(如 由所述球状亮氨酸颗粒所赋予)以及所期望的MMAD值(如由所述棒状细菌颗粒所赋予)。 这导致形成下述配制剂，即其自然地掺入干细菌，例如BCG，同时允许使用简单且低成本的 吸入器以供递送所述气雾剂。在喷雾干燥过程中降低渗透应力导入待喷雾干燥的细胞溶液的赋形剂可以下述方式选择和/或导入，即该方式使 对所述细胞材料膜的总体渗透应力最小化，并从而保持活性。尽管由于上述理由，保留所期 望的相对于细胞材料质量分率(mass fraction)的赋形剂质量分率是重要的，但是这些赋形剂的性质，以及在喷雾干燥前导入它们的方法，对细胞存活亦是重要的，甚至是至关重要 的。对细胞材料，在喷雾干燥圆筒中小滴的干燥可视为类似于在标准冷冻保存过 程中对生物体的冻结，如图 1 所示(James，"Maintenance of ParasiticProtozoa by Cryopreservation, "Maintenance of Microorganisms, AcademicPress, London,1984.)。当含生物体的小滴蒸发时，在小滴中(且在细胞外)的盐浓度(Ces)相对于生物体 内的盐浓度(Cis)会增加。其理由为细胞膜对于盐的转移而言为不可渗透的，但其对于水的 转移是相对可渗透的。其结果为小滴的干燥增加蒸发小滴中盐的浓度，并对所述细胞膜形 成了渗透应力(由所述膜两侧盐浓度的不平衡所造成)，其导致水被挤出细胞。该脱水过 程可视为所述膜试图通过消除盐浓度不平衡而机械地减少渗透应力的尝试(Batycky等， Phil. Trans. Roy. Soc. Lond.，A355 :2459_88，1997)。在小滴蒸发过程中细胞材料的“脱水”与细胞材料发生冻结时产生的过程基本上 相同。过分脱水，如上所述，能够裂解所述细胞材料，为避免如此，已开发了与冷冻保存领域 相关的技术，即使用冷冻保护剂和控制冻结与解冻循环。冷冻保护剂为药理学上惰性的物 质，其以低于水但高于盐的速率渗透细胞膜。因这些技术与喷雾干燥细胞材料的方法相关， 所以在下文对其简单综述(Karlsson and Toner，Biomaterials，17 :243_256，1996)。首先，考虑到膜对冷冻保护剂的半渗透性，冷冻保护剂对所述膜施加渗透 压-其与冷冻保护剂浓度成比例，且对于最有效的冷冻保护剂，其非常接近于相同浓度 (equivalent concentration)的盐所施加的渗透压。这表明浸于含与不可渗透的盐浓度相 似量冷冻保护剂的水介质中的细胞膜会趋向于承受渗透应力和不等渗状况，其受冷冻保护 材料的存在的显著影响。冷冻保护剂的跨膜扩散因此提供了即使在当盐浓度在所述膜两侧 不一致的状况下亦抵消渗透应力的手段。由于此理由，冷冻保护剂提供了分散渗透应力的 机制。可供用于所述新方法的合适冷冻保护剂包括但不限于，二甲亚砜，乙二醇，丙二醇与 甘油(Chesne and Guillouzo, Cryobiology，25 :323_330，1988.)。在一些实施方案中，7令 冻保护剂被排除在已干燥的混合物外。在冷冻保存方法中，冷冻保护剂以与盐浓度显著相关的浓度(CT。p)添加至细胞材 料的悬浮液中。值得注意的是，该添加可加以控制而使所述细胞不遭受过多的渗透应力， 即，所述冷冻保护剂可以以足够低的速率添加，从而使得所述冷冻保护剂可跨细胞膜扩散 而不使细胞脱水。随即，在冻结过程中_由于所述细胞内天然冷冻保护剂的存在，其导致 冰形成于所述细胞外，从而增加了所述细胞外盐浓度-所述冷冻保护剂能够跨细胞膜扩 散并增加细胞内部浓度，其增加冷冻保护剂的内部浓度(C、)。这缓解了针对细胞膜的渗 透压力，尤其是当冻结以足够慢的速率发生时。以此方法，冷冻保护剂促成对细胞存活力 的保护，这解释了其用于保存血液、精子以及其它有用细胞的用途(Karlsson and Toner, Biomaterials, 17 :243_256，1996)。即使不考虑其与冷冻保存的相似性，喷雾干燥亦提供了针对细胞材料的特殊益 处，其尤其与大规模应用相关。大体积的细胞悬浮液使细胞的冷冻保存受到挑战，这是因为 质量转移的动力学要求(涉及添加或移除冷冻保护剂，以及冻结细胞)在细胞和悬浮液规 模上非常不同，其中后者远高于前者。这可为为何通过标准冷冻保存方法冻结血液无法简 单适用于冻结整个器官的理由。喷雾干燥自动将所述细胞悬浮液分割成小体积(亦即，小滴)，其可大致视为小的冷冻保存单位。规模放大(scale-up)并不需要喷雾小滴的体积显 著增加相反，规模放大是通过增加喷雾干燥的容器的尺寸，增加悬浮液通过喷嘴的流速以 及其它标准规模放大方法来达成的。喷雾干燥可因此提供产生大体积DCF的方法，且其具有较之另外通过冷冻保存和 冻干技术可获得的更高的活性。接下来，描述了提供喷雾干燥细胞形式的法则的理论形式，遵循所述法则将使膜 应力最小化并因此使存活力最大化。所述方法依赖于使用冷冻保护剂和控制标准喷雾干燥 参数，例如，溶剂类型，进气温度，和喷雾干燥喷嘴形状尺寸(nozzle dimensions)与旋转速 度(小滴尺寸)。所述方法确定在加热环境内能够使喷雾小滴干燥的速度，从而使得，在冷冻保存 试剂存在的情况下，能够调制悬浮材料的膜半径。从而，可防止所述膜收缩至Rcfflin以下或扩 展至Rcfflax以上。为了在Rcfflin的情况下加以说明的目的，所有悬浮材料将不会因渗透驱动的 脱水的后果而收缩至临界半径(Rcrai)以下。在刚性细胞壁的情况下，该条件可直接等同于 导致失活的临界应力。首先，考虑所述问题内理想化的几何性状与浓度，其后考虑两个极限 条件下的运动学。之后，导出流体动力学和质量转移方程以描述作为系统参数的函数的细 胞半径变化率。为了方便说明起见，可想像在细胞悬浮液中细胞为具有平衡半径Rc0的球体。在细 胞内，盐和冷冻保护剂以细胞内浓度Cis和Cici存在，并在细胞外以浓度CTs和cr。p存在。在喷雾干燥时，形成悬浮材料的单独小滴。在此，假定细胞在喷雾溶液和喷雾过程 中保持均勻分布，且因此在单独喷雾小滴中处于相等浓度。流速，其可在喷雾干燥过程中能 够用物理方法控制，可明确的如下求解
N ηΛa =- (J)
ncdlsK其中α为每单位时间小滴的形成率，Iirells为悬浮于每个单独喷雾小滴中的细胞 数，N为该体积中的细胞总数，而t。为将体积V。喷雾所需时间的量。将在需喷雾的悬浮液中细胞的体积分率称为Φ。，而
伞^ 总细胞体积⑵
° 悬浮液体积Vd且N为所述悬浮液体积Φ。中的细胞总数。这些小滴假定拥有均一的半径Rd。气，从而使得细胞材料的分率可表达为
r Rc yφ0 =Ticens -^1(3)其中η为悬浮于每个单独喷雾小滴中的细胞数。假定其为均勻，那么在原始悬浮液中测得的四个浓度(Ts，Cecp, Cis, Cicp与每个喷雾 小滴细胞内的盐和冷冻保护剂的初始浓度相等。这些浓度会随着时间基于小滴直径和细胞 直径的变化而变化，考虑到盐和冷冻保护剂的绝对摩尔数在每个小滴内必需守恒。用Xis和X^以及Xicp和X:分别表示在盐和冷冻保护剂分散于单独小滴内之后细 胞外侧和内侧的盐以及冷冻保护剂的摩尔数。这给出下述方程
其中Vcex。^d为盐和/或冷冻保护剂无法分配的每个单独细胞的体积，并应视为相 对于时间的常数。参数Xis和X6s(代表细胞内和细胞外盐的摩尔数)亦是相对于时间的常 数，这是由于盐无法渗透过膜。那么这些表达式中仅有的时间变量为IT和Rd，且细胞内和 细胞外冷冻保护剂的摩尔数为Ρ。ρ和Xecp0每个单独的小滴在喷雾干燥圆筒中会以依赖于外界条件，小滴尺寸，小滴挥发性 等等的速率蒸发。起初，平均而言单独细胞会彼此远离，使所述悬浮液具有初始的稀释性质 (Φ。<< 1)。随着时间的推移，细胞将逐渐互相靠近接触，从而能够想到两种极限情况在此，在干燥过程中Φ (t) << 1。在此情况下，假定每个单独细胞如其悬浮于无 限大的水浴中一般是彼此分离的，且响应于变化的盐和冷冻保护剂浓度(以及其导致的渗 透应力)。该问题的对称性(参见以下质量转移方面的考虑)使得所述小滴和细胞均径向 地收缩(或扩展)。因此，考虑图1，在单独细胞内或周围由于渗透应力而非流体运动造成 的速度分布可表达为ν =trvr(l)(8) 其中t ^为球面坐标系中在沿坐标轴r方向的单位矢量，起始于细胞中心，且、(t) 为径向速度的大小。 此外，考虑到所述细胞和小滴流体为不可压缩的。 或者
由于细胞中心处的径向速度必须为零，可得出结论在任何地方ν = 0(11)。该结论暗示细胞膜的任何径向运动都必须是“非实质的(non-material) ”，意指所 述膜运动不等同于邻接流体的质量平均运动。因此，情况1的问题为其中小滴内单独细胞的演变受扩散驱动。在极限情况Φ。一 1时，干燥中的小滴中的单独细胞变得处于非常靠近的接触中。 细胞膜的演化，作为渗透应力的后果，在下述环境内确定，即在所述环境中细胞膜或者挨着 相邻细胞变平，或者在所谓“坪边界(plateauborder)”处以凸状弯曲。这些膜的情况示于 图2。
几个情况1中的基本假定在情况2中不再有效。首先，考虑到所述细胞的紧密接 触，以及由所述细胞的排除体积所造成的所述小滴“邻接”相中对质量转移的抵抗，无法期 待在外界或连续相中盐和冷冻保护剂浓度的增加相对于跨细胞膜的水分运输是即时的。这 意味着随着小滴体积持续减少，在所述小滴外周的盐和冷冻保护剂的浓度会相对于靠近所 述小滴中央的浓度显著增加，因而靠近小滴外周的细胞经受高渗透应力，而在中央的细胞 则会受极小的渗透应力甚至不受渗透应力。在所述干燥过程中使每个细胞的径向扩展或收 缩最小化的目标则因此具有暧昧的含意，这是因为随着时间的推移每个细胞均将经受多种 状况。或者在情况2中的目标为针对最容易受损的细胞(那些在外周的)使其细胞膨胀最 小化，或者为考虑到在干燥时的合理时限，在所述小滴内救回最多数量的细胞。(注意在外 周使细胞死亡最小化所需的终极干燥限制可能在极限条件下需要无限缓慢的干燥。)就此分析而言，剩下的考虑将仍全部集中于情况1。可在情况1中识别出两个明显的质量转移问题，其一涉及在所述干燥中的小滴内 盐和冷冻保护剂的质量转移，考虑到在所述干燥中的小滴内盐和冷冻保护剂的浓度作为时 间的函数均勻增长。由于所述细胞悬浮液的稀释度，小滴干燥问题可分开考虑。此后一问 题为球状水滴在连续热空气中干燥的问题。在外界的盐和冷冻保护剂浓度突然均勻变化的无边界环境内球状细胞的质量转 移问题之前由Batycky等(1997)所解决。在其分析中，将细胞流体描述为连续介质，其中 将细胞内的盐和冷冻保护剂浓度视为在胞质溶胶(cytosolic fluid)和内部细胞器中为均 一的，或尤其为平均的。使用对膜渗透压的标准定义，即Reynolds Transport Theorem与 Darcy定律对水穿膜渗透性的描述，膜的速度可显示为， 其中Lp为所述膜的液压渗透性(m/s -atm)，而σ，即所谓反射系数(0 < σ < 1)， 代表膜对冷冻保护剂的渗透性相对于对盐减少的比率。在细胞内在膜处盐和冷冻保护剂浓度变化的时间速率可通过解出相关质量转移 守恒方程来确定。尽管有盐和冷冻保存试剂在细胞内的高浓度，亦可假定恒定盐和冷冻 保护剂遵循 Fickian 扩散。根据 Batycky 等(1997)并结合 Edwards 和 Davis (Chem. Eng. Sci. ,50 =1441-54,1995)的结果，这些扩散性可表达为依赖过程的系数(course-scale
coefficients) (f，《),其反映细胞器在所述细胞内的存在。盐浓度的支配微分方程在Batycky等(1997)中可表述为 ζ"=有限的,Vr= 0乂(14) 给定起始条件为 在上述方程中，C丨与ζ"的关系为
0145] 可求解上述方程得到
0146]
0147]
0148] 冷冻保护剂浓度的支配微分方程在Batycky等(1997)中可表述为
0149]
(20)
0150]服从边界条件，
0151]Clp =有限的，V r=0,t.
(21)
为所述细胞器的比表面积，而K为分配至所述细胞器中的分配系数。
0159]根据方程(14)求解这些方程得到(Batycky等1997)
0160]
(22)
与起始条件
Cjp =C^(0乂当 t = 0(23) IT (t) = JC当 t = 0(24) 其关系为
其中θ为细胞中对渗透为无活性的部分(细胞器)，k = Henry定律吸收系数，α
服从初始条件
这里λ n为该超越方程非零根的本征值
其中Psp为半渗透性溶质进入细胞的速率，而系数β定义为 注意尽管λ η基本上在扩散的快速时间尺度上是恒定的，但是其在整个细胞膜扩张的时间尺度上缓慢变化。方程(28)将细胞半径Rlt)与外界盐和冷冻保存浓度相联系， 其继而依赖于所述小滴蒸发的速率。这种关系在下文描述。许多研究者对在气相中干燥的球形小滴进行了检查，尤其是当忽略气体中的对流 作用时。在喷雾干燥器中蒸发依赖于蒸发的支配速率与蒸发的停留时间。所述停留时间为 干燥器中喷雾-空气运动的函数。在小滴相对于周围空气移动的情况下，在移动中的小滴 周围的流动情况影响蒸发速率。在此情况下，当空气与小滴间相对速度非常缓慢时，所述小 滴完全受空气流影响。根据边界层理论，以零相对速度移动的小滴的蒸发速率等同于在静 止空气状况下的蒸发。从而，将所述小滴通过喷雾干燥的蒸发作为与在静止空气状况下相 似的蒸发机制建模。见于小滴半径与喷雾干燥过程中支配参数之间的一般性关系，在实验上与理论 上肖由(Masters, 1991, Spray Drying Handbook, Longman Scientificand Technical, Harlow, UK)给出 其中，D = 2R。，Kd为围绕蒸发中小滴的气态薄膜的平均热导率，P ！为所述气相的 密度，λ为所述小滴蒸发的潜热，而LMTD为如下定义的对数平均温度差异 其中八！；与AT1为所述小滴与所述气相间的起始与最终温度差异。将(30)进行 积分得到
(32)其中 将(32)代入(6)与(7)，得到盐和冷冻保护剂即时浓度与小滴蒸发参数的关系 喷雾干燥的方法可以下述微分方程的形式表达
(36)通过计算上述方程，可确定所述喷雾干燥器进气和出气温度的条件(亦即，ΔΤ)， 喷嘴类型与小滴大小的旋转速度(Rd)，溶剂类型(λ )，以及使对悬浮膜被材料的应力最小 化，允许保持屺, <^ υ<< ，或将应力最大化所必需的冷冻保护剂类型(Lp)。发现这些 规律与冷冻保存中关于冻结和解冻细胞的速率的规律相似。药物组合物本文所述的干燥细胞形式，例如，用新组合物产生的或由新方法产生的，可制备为 药物组合物，例如，疫苗组合物。所述细胞材料可与多种药学上可接受的稀释剂，填充剂， 盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂和其它本领域众所周知的材料一同喷雾干燥以制成药物粉末。 或者，在喷雾干燥后，可将产物与多种药学上可接受的稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂， 增溶剂与其它本领域众所周知的材料中至少一种一起配制以制成药物组合物，例如，药物 粉末。术语“药学上可接受的”意指不干扰活性成分生物学活性效力的无毒材料。所述组 合物的特性可取决于施用途径。在一些实施方案中，所述组合物可在施用前储藏于受控温 度下。施用药物组合物(例如，包含干燥细胞形式的药物组合物)可用多种常规方法进 行，例如吸入，口服摄入，或表皮，皮下或静脉内注射。优选通过吸入施用。在一些实施方案 中，所述组合物作为疫苗施与。所述干燥细胞形式可经配制以供使用医疗装置进行吸入，例如，吸入器(参见，例 如，美国专利Nos. 6102035 (粉末吸入器)和6012454 (干粉吸入器))。所述吸入器可包含 分离的隔室用于在适宜储藏的PH下的活性化合物，和另一个用于中和缓冲液的隔室，以及 将所述化合物与中和缓冲液在喷雾之前即刻合并的机理。在一个实施方案中，所述吸入器 为定量吸入器(metered dose inhaler)。三种用于局部递送药物至肺部气道的常见系统包括干粉吸入器(DPI)，定量吸入 器(MDI)与喷雾器(nebulizer)。MDI，用于最流行的吸入施用方法，可用于将药物以溶解形 式或作为分散剂递送。通常MDI包含Freon或其它相对高蒸汽压的推进剂，其在启动装置 后迫使雾化的药物进入呼吸道。与MDI不同，DPI通常完全依赖于患者的呼吸动作将药物 以干粉的形式导入肺中。喷雾器通过对液体溶液赋予能量而形成待吸入的药物气雾剂。亦 探索过使用荧光化学介质在液体通气或肺部灌洗过程中直接肺部递送药物。这些和其它方 法可用于递送干燥细胞形式。示例性的吸入装置描述于美国专利No. 6732732和6766799。所述组合物可方便地以气雾剂喷雾呈递的形式自加压包或喷雾器递送，使用合适 的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。 在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀门以定量递送来确定。用于吸入器或吹入 器的胶囊或药筒可配制为含有干燥细胞形式。尽管非必不可缺，可使用递送增强剂，例如表面活性剂以进一步增强向肺部的递 送。如本文所使用的“表面活性剂”指具有亲水和亲脂部分的化合物，其通过与两个不混溶相之间的界面相互作用来促进药物吸收。表面活性剂因数种原因而与干颗粒一同使用是 有用的，例如，减少颗粒团聚，减少巨噬细胞吞噬，等等。当与肺部表面活性剂偶联时，可达 成对所述化合物更加有效的吸收，这是因为表面活性剂，例如DPPC，会极大地促进所述化合 物的扩散。表面活性剂在本领域为众所周知的，并包括但不限于，磷酸甘油酸，例如，磷脂 酰胆碱，二棕榈酰 L- α -磷脂酰胆碱(L-alpha-phosphatidylcholine dipalmitoyl，DPPC) 和二磷酯酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9 ；月桂基醚(auryl ether)；棕榈酸；油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)；甘氨胆酸盐；表面活性蛋白 (surfactin)；泊洛沙姆(poloxomer)；山梨醇月旨肪酸酉旨(sorbitan fatty acid ester)；脱 水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙泊；以及磷脂。在另一方面，所述干燥细胞形式可与药学上可接受的载体一同配制，所述载体所 具有的颗粒大小使其无法吸入(not respirable)，即，是使其不能以任何显著的量摄入肺 部的这样的尺寸。该配制剂可为所述干燥细胞形式的较小颗粒(例如，小于10 μ m)与所述 载体的较大颗粒(例如，约15到ΙΟΟμπι)的均一混合物。在分散时，较小的颗粒则吸入肺 中而较大的颗粒通常留存于口中。适于混合的载体包括结晶或无定形的赋形剂，其具有可 接受的味道，并无论是吸入还是口服，在毒理学上是无害的，例如，糖类，二糖和多糖。代表 性的示例包括乳糖，甘露醇，蔗糖，木糖醇等。对经口施用，所述药物粉末可配制为，例如，用常规方法与药学上可接受的赋形剂 一起制备的片剂或胶囊，所述赋形剂可举出结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯 烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例 如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠(sodium starch glycolate)或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠)为例。所述片剂可通过本领域众所周知的方 法包被。经口施 用的液体制备物可采取下列形式，例如，溶液，糖浆或悬浮液，或其可表现为 干产品而在使用前用水或者其它合适的溶剂载体(vehicle)构建。这些液体制备物可通过 常规方法与药学上可接受的添加剂一起制备，所述添加剂可举出助悬剂(例如，山梨醇糖 浆，纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水溶剂载体 (例如，杏仁油，油性酯，乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基-P-羟基苯甲 酸，或山梨酸)。如适合，该制备物亦可包含缓冲液，盐，调味料，着色剂以及甜味剂。所述组合物可配制用于通过注射的胃肠外施用，例如，推注(bolusinjection)或 连续输注。活性成分可以粉末形式提供以供在使用前用合适的溶剂载体(例如，无菌的无 热原水)构建。供注射的配制剂可以单位剂量形式呈现，例如，在安瓿(ampule)中或在多 剂量容器中，其中添加有防腐剂。所述组合物可选用下述形式，例如，悬浮液，溶液或在油性 或水性溶剂载体中的乳液，并可包含例如助悬剂，稳定剂和/或分散剂等的试剂。佐剂本发明的疫苗可与其它免疫调节剂一同配制。具体而言，疫苗组合物可包含一种 或多种佐剂。可用于本文所描述的疫苗组合物的佐剂但不限于A.含无机物的组合物本文所描述的适用于佐剂的含无机物的组合物包含无机盐，例如铝盐和钙 盐。亦包括下述无机盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)，磷酸盐(例如，羟基磷酸盐 (hydroxyphosphates)，正磷酸盐)，硫酸盐，等等(例如，参见 Vaccine Design (1995) eds.Powell&Newman. ISBN :030644867X. Plenum的8和9)，或者不同无机化合物的混合物(例 如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地磷酸盐为过量)，所述化合物可采取任何合适 的形式(例如，凝胶，晶体，无定形，等等)，并且优选吸附于盐。所述含无机物的组合物亦可 配制为金属盐的颗粒(PCT公开No. W000/23105)。铝盐可包含于本文所描述的组合物中，从而使得Al3+的剂量在每剂0.2-1. Omg。在 一个实施方案中，用于本组合物的基于铝的佐剂为明矾(硫酸铝钾(AlK(SO4)2)),或明矾衍 生物，例如，用下述方法在原位(in situ)制成的将磷酸缓冲液中的抗原与明矾混合，继 以用碱滴定并沉淀，所述碱如氢氧化铵或氢氧化钠。另一种用于本发明疫苗配制剂的基于铝的佐剂为氢氧化铝佐剂(Al (OH)3)或晶状 羟基氧化铝(AlOOH)，其为优异的吸附剂，具有大约500m2/g的表面积。或者，提供磷酸铝佐 剂(AlPO4)或羟基磷酸铝，其含有磷酸根取代氢氧化铝佐剂中一些或全部氢氧根。本文所 提供的优选磷酸铝佐剂为无定形的，并可溶于酸性，碱性和中性介质。在另一个实施方案中，用于本组合物的佐剂包括磷酸铝和氢氧化铝两者。在其更 加特定的实施方案中，所述佐剂具有较之氢氧化铝更大量的磷酸铝，例如按磷酸铝对氢氧 化铝的重量比，为 2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 1 或大于 9 1 的 比例。更具体而言，铝盐可以每疫苗剂量0. 4到1. Omg存在，或每疫苗剂量0. 4到0. 8mg,或 每疫苗剂量0. 5到0. 7mg,或每疫苗剂量约0. 6mg。通常，优选的基于铝的佐剂，或多种基于铝的佐剂的比例，例如磷酸铝对氢氧化铝 的比例通过优化分子间的静电吸引，从而使得抗原在所期望的PH携带与所述佐剂相反的 电荷来选择。举例而言，在PH7. 4，磷酸铝佐剂(等电点=4)吸附溶菌酶，但非白蛋白。若 以白蛋白为靶，则应选择氢氧化铝佐剂(等电点=11.4)。或者，用磷酸预处理氢氧化铝降 低其等电点，使其对更多碱性抗原成为优选佐剂。B.油乳胶适于在组合物中用作佐剂的油乳胶组合物包括角鲨烯-水乳剂。特别优选的佐 剂为亚微米的水包油乳剂。本文所用的优选的亚微米水包油乳剂为角鲨烯/水乳剂任选 含有不同量的MTP-PE，例如包含4-5% w/v角鲨烯，0. 25-1.0% w/v Tween 80(聚氧乙烯 失水山梨糖醇单油酸酯(polyoxyelthylenesorbitan monooleate))，和 / 或 0. 25-1. 0% Span 85 (脱水山梨糖醇三油酸酯)，和任选地，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺 酰-L-丙氨酸_2-(1，-2，- 二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟磷酰基氧)_乙醇胺(N-acetylmur amy1-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanine-2-(l‘ -2‘ -dipalmitoyl-s-n-glycero-3-h uydroxyphosphophoryloxy)-ethylamine) (MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如，以”MF59” 为人所知的亚微米水包油乳剂(国际公开NO.W090/14837 ；美国专利Nos. 6，299，884和 6，451，325，以及 Ott 等，"MF59__Design andEvaluation of a Safeand Potent Adjuvant for Human Vaccines，，in VaccineDesign :The Subunit and Adjuvant Approach(Powell, M. F. and Newman,M. J. eds.) Plenum Press, New York, 1995，pp. 277—296)。MF59 包含 4—5% w/v 角鲨烯(例如，4.3% )，0·25-0·5% w/v Tween 80 和 0.5%w/v Span 85，并任选 地含有不同量的MTP-PE，使用微流化器(microfluidizer)，例如Model 110Y微流化器 (Microfluidics,Newton,Mass.)配制成亚微米颗粒。举例而言，MTP-PE可以约0-500 μ g/ 剂，更优选0-250 μ g/剂以及最优选0-100 μ g/剂的量存在。举例而言，“MF59-100”含有每剂100 μ g MTP-PE，依此类推。MF69，另一种本文所使用的亚微米水包油乳剂，包含4. 3% w/v 角鲨烯，0. 25% w/vTween 80 和 0. 75%w/v Span 85，和任选地 MTP-PE。又另一种亚 微米水包油乳剂为MF75，亦称作SAF，包含10%角鲨烯，0. 4%w/v Tween 80, 5% Pluronic 封闭的聚合物L121，和thr-MDP，亦经微流化成为亚微米乳剂。MF75-MTP指包含MTP，如每 剂从 100-400 μ g MTP-PE 的 MF75 配制剂。亚微米水包油乳剂，及其制造方法与供在所述组合物中使用的免疫刺激剂，例如 胞壁酰肽，详细描述于国际公开No. W090/14837以及美国专利Nos. 6299884和6451325。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)亦可在题述组合物中用作佐剂。C.皂苷配制剂皂苷配制剂亦可作为佐剂用于所述组合物中。皂苷为留醇苷和三萜苷的异源组， 其见于广泛的植物物种的树皮，叶，茎/干，根和甚至是花中。自皂树(Quillaia saponaria Molina tree)树皮分离的皂苷作为佐剂得到广泛研究。皂苷亦可从棕菝契(Smilax ornata(sarsaprilla))、圆维石头花(Gypsophillapaniculata(brides veil))禾口月巴阜草 (Saponaria officianalis (soap root))商购获得。皂苷佐剂配制剂包括纯化的配制剂，例 如QS21，以及液体配制剂，例如免疫刺激复合物(ISCOM)。阜昔复合物己使用 High Performance Thin Layer Chromatography (HP-TLC ；^ 效薄层层析)与 Reversed Phase High Performance LiquidChromatography (RP-HPLC ；反 相高效液相层析)纯化。使用这些技术的具体纯化级分已经鉴定，包括QS7，QS17，QS18， QS21，QH-A，QH-B和QH-C。通常，所述皂苷为QS21。产生QS21的方法公开于美国专利 No. 5，057，540。皂苷配制剂亦可包含留醇，例如胆固醇(参见PCT公开No. W096/33739)。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为Immunostimulating Complexes (ISCOMs ；免 疫刺激复合物)的独特颗粒。ISCOM通常亦包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任 何已知的皂苷可用于ISC0M。所述ISCOM优选含有一种或多种Quil A、QHA和QHC。ISCOM 进一步描述于EP0109942，W096/11711和W096/33739。任选地，所述ISCOM可缺乏额外的 洗涤剂。参见W000/07621。关于基于皂苷的佐剂的开发的综述可见于Barr，等，Advanced DrugDelivery Reviews(1998)32 :247_271。 # 参 B sjolander, φ, Advanced DrugDelivery Reviews(1998)32 :321_338。D.病毒体和病毒样颗粒(VLPs)病毒体和病毒样颗粒(VLP)亦可在本发明的组合物中用作佐剂。这些结构通 常含有一种或多种来自病毒的蛋白质，其任选地与磷脂组合或一起配制。其通常为非病 原性的、非复制的并通常不含有任何天然病毒基因组。病毒蛋白可重组产生或分离自全 病毒。这些适用于病毒体和VLP的病毒蛋白包括源自以下病毒的蛋白质流感病毒(例 如HA或NA)，乙型肝炎病毒(例如核心蛋白和衣壳蛋白)，戊型肝炎病毒，麻疹病毒，辛 德比斯病毒(Sindbisvirus)，轮状病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，诺沃克病毒(Norwalk virus)，人乳头状瘤病毒，HIV, RNA噬菌体，Qi3-噬菌体(例如外壳蛋白)，GA-噬菌 体，fr-噬菌体，AP205噬菌体，和Ty (例如逆转座子Ty蛋白pi)。VLP进一步讨论于 W003/024480.W003/024481 和 Niikura 等，Virology (2002) 293 :273_280 ；Lenz 等，Journal of Immunology(2001)5246-5355 ;Pinto，等，Journal of Infectious Diseases(2003)188 327-338 ；以及 Gerber 等，JournalofVirology (2001) 75 (10) :4752_4760。病毒体进一步讨 论于，例如，Gluck等，Vaccine (2002) 20 :B10_B16。将经免疫增强的重构流感病毒体(IRIV) 在鼻内三价体 NFLEXAL 产品(Mischler&Metcalfe (2002) Vaccine 20Suppl5 :B 17-23)和 INFLUVAC PLUS 产品中用作亚基抗原递送系统。E.细菌或微生物衍生物适用于本组合物的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物这些衍生物包括单磷酰基脂肪A(MPL)与3-0-脱乙酰基MPL(3dMPL)。3dMPL为 3-脱-0-乙酰基单磷酰脂质A与4，5或6位乙酰化链的混合物。在EP 0689454中公开了 3-脱-0-酰化单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式。这种3dMPL的“小颗粒”小到足以穿 过0. 22微米膜进行过滤除菌(参见EP 0689454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰脂 质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如，RC-529。参见Johnson等(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.，9 :2273_2278。⑵脂质A衍生物脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，例如0M-174。0M-174描述于，例 如，Meraldi 等，Vaccine (2003) 21 :2485_2491 ；以及 Pajak,等，Vaccine (2003) 21 :836_842中。(3)免疫刺激性寡核苷酸适用作佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(包含未甲基化的胞嘧啶继以 鸟苷且两者以磷酸键连接的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的寡核苷酸或 细菌双链RNA亦被显示为免疫刺激性的。所述CpG可包含核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰，且可为双链或 单链的。任选地，所述鸟苷可由例如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷的类似物所取代。参见， Kandimalla,等，Nucleic Acids Research(2003)31(9) :2393_2400 ;W002/26757 和 W099/62923中可能的类似物取代的示例。CpG寡核苷酸的佐剂作用进一步讨论于Krieg， Nature Medicine(2003)9(7) 831-835 ；McCluskie, φ, FEMS Immunology and Medical Microbiology(2002) 32 :179-185 ；W098/40100 ；美国专利 No. 6，207，646 ；美国专利 No. 6，239，116 和美国专利 No. 6，429，199。所述CpG序列可定向于TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见，Kandimal la，等， Biochemical Society Transactions (2003) 31 (第 3 部分)654_658。所述 CpG 序列可针 对诱导Thl免疫应答具有特异性，例如CpG-AODN，或可针对诱导B细胞应答具有更高特异 性，例如 CpG-B ODN0 CpG-A和 CpG-B ODN讨论于Blackwell，等，J. Immunol. (2003) 170(8) 4061-4068 ；Krieg,TRENDS in Immunology (2002) 23 (2) :64_65 和 W001/95935。通常，所述 CpG 为 CpG-A ODN。通常，所述CpG寡核苷酸的构建使得其5’端便利于受体识别。任选地，两个CpG 寡核苷酸序列可附接在其3’端以形成“免疫聚体(immunomer) ”。参见，例如，Kandimalla， 等，BBRC (2003) 306 948-953 ；Kandimalla, BiochemicalSocietyTransactions (2003) 3 1 (part 3) :664_658 ；Bhagat 等，BBRC (2003) 300 :853_861 和 W003/035836。(4) ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可在所述组合物中用作佐剂。通常，所 述蛋白质源自大肠杆菌(亦即，大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)，霍乱(“CT”)或百日咳 (“PT”)。使用脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂描述于W095/17211，而作为胃肠外佐剂 描述于W098/42375。所述佐剂优选为脱毒的LT突变体，例如，LT-K63，LT-R72和LTR192G。 使用ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物(尤其是LT-K63与LT-R72)作为佐剂，可见于 下述参考文献Beignon，等，Infection and Immunity (2002) 70 (6) 3012-3019 ；Pizza, 等，Vaccine (2001) 19 :2534_2541 ；Pizza,等，Int. J. Med. Microbiol. (2000)290(4-5) 455-461 ;Scharton-Kersten 等，Infection and Immunity(2000)68(9) 5306-5313 ；Ryan 等，Infection and Immunity (1999) 67 (12) 6270-6280 ；Partidos 等，Immunol. Lett. (1999)67(3) 209-216 ；Peppoloni 等，Vaccines (2003) 2 (2) :285_293 ；以及 Pine 等， J. Control Release (2002) 85 (1-3) :263_270。许多关于氨基酸取代的参考文献通常基于在 Domenighini 等，Mol. Microbiol (1995) 15 (6) 1165-1167 中列出的 ADP-核糖基化毒素的 A 和B亚基的排列。F.生物粘附剂和粘膜粘附剂(Bioadhesives and Mucoadhesives)生物粘附剂和粘膜粘附剂亦可在题述组合物中用作佐剂。合适的生物粘附剂包括 脂化的透明质酸微球(Singh等(2001) J. Cont. Rele. 70 :267_276)，或粘膜粘附剂例如聚丙 烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物 亦可在所述组合物中用作佐剂。参见，例如，W099/27960。G.颗粒微粒和纳米颗粒(例如，多聚纳米颗粒)亦可在所述组合物中用作佐剂。微 粒(通常直径为 IOOnm到 150 μ m的颗粒，例如，直径 200nm到 30 μ m或直 径 500nm到 ΙΟμπι)和纳米颗粒(通常 IOnm到 IOOOnm的颗粒，例如，直径 IOnm到 lOOnm，直径 20nm到 500nm，或直径 50nm到 300nm)可自下述材料形 成，即所述材料为可生物降解并无毒的(例如，聚(α -羟酸)，聚羟基丁酸，聚原酸酯 (polyorthoester)，聚酐，聚已内酯(polycaprolactone)等等，以及聚(丙交酯-共-乙 交酯)(polydactide-co-glycolide))。任选地，可处理颗粒以使其具有带负电荷的表面 (例如，用SDS处理)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，例如CTAB处理)。颗粒 可就其特异性进行改造，从而使得其可将增加浓度的试剂递送到所期望的位置。参见，例 如，Matsumoto 等，Intl. J. Pharmaceutics, 185 :93_101，1999 ；Williams 等，J. Controlled Release,91 167-172，2003 ；Leroux 等，J.Controlled Release, 39 :339_350，1996 ； Soppimath 等，J. Controlled Release, 70 :1_20,2001 ；Chawla 等，Intl. J. Pharmaceutics, 249 127-138,2002 ；Brannon-Peppas, Intl. J. Pharmaceutics, 116,1-9,1995 ；Bodmeier 等，Intl. J. Pharmaceutics,43 :179-186,1988 ；Labhasetwar 等，Adv. Drug Delivery Reviews,24 :63_85,1997 ；Pinto-Alphandary 等，Intl.J.AntimicrobialAgents, 13 155-168，2000 ；Potineni 等，J. Controlled Release, 86 -.223-234,2003 ；Kost 等，Adv. Drug Delivery Reviews,46 :125_148，2001 ；以及 Saltzman 等，DrugDiscovery，1 :177-186， 2002。颗粒，优选纳米颗粒，可装配为在微米大小尺度有结构的聚集体，具有由亲脂性和 /或亲水性分子的混合物构成的壳或基质(通常为药物“赋形剂”)。所述纳米颗粒可在前述方法中形成，并掺入细胞材料作为颗粒的主体，在颗粒表面上或包埋于颗粒内。聚集的颗 粒壳或基质可包括药物赋形剂，例如脂质，氨基酸，糖，聚合物并亦可掺入核酸和/或肽和/ 或蛋白质和/或小分子抗原。亦可使用抗原性材料的组合。这些聚集颗粒可在下述方法中 形成。美国专利申请流水号2004/0062718描述了制造多孔纳米颗粒聚集颗粒(PNAP)以 供作为疫苗使用的方法。抗原可通过下述方法与纳米颗粒相关联，即通过装配(make up) 所述纳米颗粒，结合于所述纳米颗粒表面或包埋于所述纳米颗粒内或其可掺入微米颗粒的 壳中，并随即引发体液和细胞免疫两者。其它制造PNAP方法的示例描述于Johnson and PrucT homme，Austral. J. Chem. ,56 :1021-1024，2003。这些颗粒，如Edwards，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19 :12001-12005，2002 所描 述，聚集产生较小亚基颗粒的较大颗粒(称为特洛伊颗粒，因为其保持其较小亚基的独特 性质，同时亦保持较大颗粒的关键特征)。试剂可包埋于所述亚基颗粒内或由所述较小颗粒 的聚集物形成的较大颗粒内。所述颗粒可以是适于吸入的干粉形式。在特定实施方案中，所述颗粒可具有小于 约0. 4g/cm3的夯实密度(tap density)。具有小于约0. 4g/cm3夯实密度的颗粒在本文中 称为“空气动力学轻颗粒(aerodynamically light particle)”。更优选具有夯实密度小 于约0. lg/cm3的颗粒。空气动力学轻颗粒具有优选的尺寸，例如，至少约为5微米的体积 中值几何直径(volume median geometricdiameter，VMGD)。在一个实施方案中，所述VMGD 为约5微米到约30微米。在另一个实施方案中，所述颗粒具有自约9微米到约30微米范 围的VMGD。在其它实施方案中，所述颗粒具有至少5微米的中值直径(mediandiameter)， 质量中值直径(mass median diameter, MMD),质量中值包膜直径(mass median envelope diameter, MMED)或质量中值几何直径(mass mediangeometric diameter, MMGD)，例如自 约5微米到30微米。空气动力学轻颗粒优选具有约1微米到约5微米的“质量中值空气动 力学直径(mass medianaerodynamic diameter (MMAD) ”，在本文中亦称为“空气动力学直径 (aerodynamic diameter) ”。在一个实施方案中，所述MMAD为约1微米到约3微米。在另 一个实施方案中，所述MMAD为约3微米到约5微米。在另一个实施方案中，所述颗粒具有小于约0. 4g/cm3的包膜质量密度(envelope mass density)，本文中亦称为“质量密度”。各向同性颗粒的包络质量密度定义为所述颗粒 的质量除以可将其包埋在内的最小球状包膜体积(minimum sphere envelope volume)。夯实密度可通过使用本领域技术人员已知的装置，例如Dual PlatformMicroprocessor Controlled Tap Density Tester(Vankel,N. C.)或Geopyc 装 g (Micrometrics Instrument Corp. ， Norcross, Ga. 30093) HlJ胃。It^fiS^jl^ii^& 膜质量密度的标准量度。夯实密度可使用USP Bulk Density and TappedDensity,United States Pharmacopia convention,Rockville,Md. , IOthSupplement,4950-4951,1999 的方 法来确定。可促成低夯实密度的特征包括不规则的表面纹理和多孔结构。所述颗粒的直径，例如，其VMGD，可使用电子区域感知装置(electricalzone sensing instrument), 例 如 Multisizer lie, (Coulter Electronic, Luton, Beds, England),或激光衍身寸装置(laser diffraction instrument)(例如，Helos,由 Sympatec, Princet0n，N. J制造)测定。其它供测定颗粒直径的装置在本领域中为众所周知的。样品中颗粒的直径的范围会取决于例如颗粒组成和合成方法这样的因素。在样品中颗粒大小的 分布可经选择以允许在呼吸道内目标部位内的最佳沉积。所述颗粒可以合适的材料，表面糙度，直径和夯实密度制造以供局部递送至呼吸 道的选定区域，例如肺深部或上或中呼吸道。举例而言，较高密度或较大的颗粒可用于上呼 吸道递送，或在样品中混合不同大小的颗粒，配以同样或不同的治疗剂，可于一次施用中施 用以靶向肺的不同区域。具有空气动力学直径范围自约3到约5微米的颗粒优选用于向中 或上呼吸道递送。具有空气动力学直径范围自约1到约3微米的颗粒优选用于向肺深部递 送。气雾齐[J 的惰性碰撞(inertial impaction)禾口重力沉降(gravitational settling)为正常呼吸情况下在气道和肺泡(acini of lung)中的主要沉积机理 (Edwards, J. Aerosol Sci. ,26 =293-317,1995) 两个沉积机理的重要性均与气雾剂的质 量，而非颗粒(或包膜)体积，成正比增加。因为气雾剂在肺中的沉积位点由所述气雾剂的 质量确定(至少对平均空气动力学直径大于大约1微米的颗粒为如此)，若其余物理参数均 相同，通过增加颗粒表面的凹凸不平(irregularity)和微粒多孔性以减少夯实密度允许 将较大微粒包膜体积递送入肺部。可计算所述空气动力学直径以提供肺内的最大沉积，之前是通过使用非常小的颗 粒实现的，所述颗粒的直径小于约5微米，优选为约1到约3微米，其继而遭受吞噬作用 (phagocytosis)。选择具有较大直径，但足够轻(因此其特征为“空气动力学轻”)的颗粒 导致相同的向肺的递送，但较大尺寸的颗粒不会被吞噬。改善的递送可通过使用相对于具 有平滑表面的颗粒，具有粗糙或不平表面的颗粒来获取。可制造或分离合适的颗粒，例如，通过过滤或离心，以提供具有预先选定的大小分 布的颗粒样品。举例而言，样品中多于约30%，50%，70%或80%的颗粒可具有在选定范围 内，即至少约5微米的直径。在选定的范围内一定百分比的颗粒必然沉降，该范围可为，例 如，约5到约30微米，或最好在约5到约15微米。在一个优选的实施方案中，至少所述颗粒 的部分具有约9到约11微米的直径。任选地，亦可制造下述的颗粒样品，即在所述样品中 至少约90%或任选地约95%或约99%的直径在选定的范围内。在颗粒样品中较高比例的 空气动力学轻、较大直径的颗粒的存在增强其中掺入的治疗或诊断剂向肺深部的递送。大 直径颗粒通常意指具有至少约5微米的中值几何直径的颗粒。靶向抗原递呈细胞(APC)的优选颗粒具有400nm的最小直径，其为APC吞噬的限 值。在组织间穿过并靶向细胞以供摄取的优选颗粒具有IOnm的最小直径。最终配制剂可 形成下述干粉，即所述干粉适用于肺部递送并在室温下稳定。H.脂质体作为佐剂适用的脂质体配制剂示例描述于美国专利No. 6090406，美国专利 No.5916588 和 EP 0626169。I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配制剂适用于所述组合物中的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。参见，例如， W099/52549。这种配制剂可进一步包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇 (octoxynol)的组合(W001/21207)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种额外 的非离子型表面活性剂，例如辛苯聚醇的组合(W001/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自下组聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)，聚氧乙烯_9_硬脂酰醚(polyoxyethylene-9-steoryl ether)，聚氧乙烯 _8_ 硬脂酰醚(polyoxyethylene-8-steoryl ether)，聚氧乙烯 _4_ 月桂 基醚，聚氧乙烯-35-月桂基醚，以及聚氧乙烯-23-月桂基醚。J.聚磷腈(Polyphosphazene) (PCPP)PCPP 配制剂描述于，例如，Andrianov 等，Biomaterials (1998) 19 (1-3) 109-115 和 Payne 等，Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31 (3) :185_196。K.胞壁酰肽作为佐剂适用的胞壁酰肽的示例包括N-乙酰_胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰 胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - 二棕榈酰-s-n-甘油_3_羟磷酰 基氧)-乙醇胺(MTP-PE)。L.咪唑喹啉(Imidazoguinoline)化合物作为佐剂适用于所述组合物中的咪唑喹啉化合物的示例包括咪喹莫特 (Imiquimod)及其类似物，进一步描述于 Stanley，Clin. Exp. Dermatol. (2002)27(7) 571-577 Jones, Curr. Opin. Investig. Drugs(2003)4(2) :214_218 ；以及美国专利 Nos.4689338，5389640，5268376，4929624，5266575，5352784，5494916，5482936，5346905， 5395937，5238944 和 5525612。Μ.缩氨基硫脲(Thiosemicarbazone)化合物缩氨基硫脲化合物的示例，以及配制、生产和筛选所有作为佐剂适用于所述组合 物中的化合物的方法包括描述于W004/60308的那些。所述缩氨基硫脲在刺激人外周血单 核细胞用于产生细胞因子(例如TNF-α)中特别有效。N.色胺酮(Tryptanthrin)化合物色胺酮化合物的示例，以及配制、生成和筛选所有作为佐剂适用于所述组合物中 的化合物的方法包括描述于W004/64759的那些。所述色胺酮化合物在刺激人外周血单核 细胞用于产生细胞因子(例如TNF-α)中特别有效。0.人类免疫调节剂作为佐剂适于使用在所述组合物中的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素 (例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-12 等等)，干扰素(例如，干扰素-Y)，巨 噬细胞集落刺激因子以及肿瘤坏死因子。所述组合物亦可包含上面所述佐剂中一种或多种的组合。举例而言，可在本发明 中使用下述佐剂组合物(1)皂苷和水包油乳剂(TO"/11241)；(2)皂苷(例如，QS21) +无毒的LPS衍生物(例如，3dMPL)(参见W094/00153)；(3)皂苷(例如，QS21) +无毒的LPS衍生物(例如，3dMPL) +胆固醇；(4)皂苷(例如，QS21) +3dMPL+IL_12 (任选地 + 甾醇)(W098/57659)；(5) 3dMPL与，例如，QS21和/或水包油乳剂的组合(参见欧洲专利申请0835318， 0735898 和 0761231)；(6)SAF，包含 10% 角鲨烷，0. 4% Tween 80,5% Pluronic -封闭聚合物 L121 和 thr-MDP，或者微流化为亚微米乳剂或涡旋振荡(vortex)以产生较大颗粒尺寸的乳剂；
(7)Ribi 佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)包含 2%角鲨烯，0. 2% Tween 80 和一种或多种选自下组的细菌细胞壁组分单磷脂A (MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细 胞壁骨架(CWS)，优选 MPL+CWS (Detox )；(8) 一种或多种无机盐(例如铝盐)+LPS无毒衍生物(例如3dPML)；和(9) 一种或多种无机盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的 核苷酸序列)。铝盐和MF59为用于可注射疫苗的典型佐剂。细菌毒素和生物粘附剂为用于粘 膜递送疫苗，例如鼻或吸入疫苗的典型佐剂。附加的在粘膜疫苗中有用的佐剂在例如， Stevceva and Ferrari, Curr. Pharm. Des. ,11 :801_11, 2005, and Cox 等，Vet. Res. ,37 511-39，2006 中讨论。供施用粉末的装置在另一方面，本方面包括用于向患者，例如婴儿与初学走路的孩子(toddler)递 送干粉(例如，药物，疫苗，本文所述的干粉，或由本文所述方法产生的干粉)的干粉递送 装置。通常而言，所述装置包括安慰器，其与干粉递送系统，例如常规的基于主动旋转胶囊 (active spinning capsule-based)的系统一同使用。空气流过所述干粉递送系统，在其 中使空气充满粉末的药物或疫苗。被充满的空气通过进入口腔的乳头装置(参见图18和 24)或通过具有进入鼻腔的导气管的乳头装置(参见图25)而排出安慰器。较之喷雾溶液，干粉气雾剂的优势为，其可更易于储藏，经常以更高的效率递送至 肺部，并允许递送化学上更加复杂的物质。图18显示了低成本的、基于主动选择胶囊的干粉吸入器10以供婴儿疫苗递送应 用。所述吸入器装置10包括安慰器12，主体14和小气球(air-bulb)型泵18。安慰器12 除用于将安慰器12与主体14相连接的肘部外，具有常规构型。使用时，气球型泵18由护 理提供者挤压以提供足够的空气流以使储存在所述主动旋转胶囊16中的粉末状的疫苗雾 化，并通过安慰器12将其递送给婴儿。所述装置亦在主体14中包含整合的胶囊穿刺装置， 以及常规构型的单向流动控制阀。图24显示用于将干粉递送至患者口腔的安慰器型装置30。所述装置30在罩33 内包含主动或被动的干粉递送系统32。所述安慰器的乳头34与其它标准安慰器乳头(例 如，塑料或橡胶材料的)以相似方式构建，但包含导管36，其与递送系统32流体联通。当婴 儿吮吸安慰器时，空气流经干粉递送系统，在此使其变得充满粉末状的药物或疫苗。被充满 的空气通过导管36离开安慰器进入口腔。图25显示另一种安慰器型装置40，以供将干粉递送至患者的鼻腔。所述装置40 在罩43内包含主动或被动的干粉递送系统42。所述安慰器的乳头44与其它标准安慰器乳 头(例如，塑料或橡胶材料的)以相似方式构建。该安慰器装置40的独特之处，在于所述 装置包含由，例如，塑料或橡胶材料，例如，硅胶，制成的两个导气管46a和46b，其与所述递 送系统42流体联通。将这两个导气管配制成在婴儿吮吸安慰器时，插入(例如，自动地) 婴儿的鼻孔。当婴儿呼吸时，空气流经所述干粉递送系统，在此其变得充满粉末状的药物或 疫苗。被充满的空气随即通过所述导气管46a和46b进入鼻腔。在另一方面，所述发明包括针对组合物的经口递送装置，其包含安慰器，所述安慰 器有组合物(例如，药物，疫苗，本文所描述的干粉，或由本文所描述方法生成的干粉)涂覆于口相容性带之上或浸于口相容性带之中，所述口相容性带置于所述安慰器的乳头之上。 当婴儿吮吸所述安慰器时，来自他或她口中的唾液导致所述组合物溶解并经口摄入。在一 些实施方案中，所述组合物可作为可生物降解的聚合物配制剂或具有长效作用性质的药物 前体制备。在一些实施方案中，所述带可移除并丢弃，而将新的带置于其位置。
实施例实施例1 喷雾干燥耻垢分枝杆菌的悬浮液为说明喷雾干燥无赋形剂的细胞形式 导致过于潮湿而不适于生产或加工的粉末，使用耻垢分枝杆菌作为模式微生物。干粉通过 ^fflBilchisMiniSpray Dryer B-290 (Brinkmann Instruments,ffestbury, NY)喷雾干燥来 形成，进气温度、流速和赋形剂浓度均受控制。将所述微生物在无赋形剂存在的情况下喷雾干燥。将纯耻垢分枝杆菌的溶液在 PBS-Tween 80中洗涤，并重新悬浮于90mL水中使细菌浓度为3xl08CFU/mL。在19. 50C 与48%湿度的环境条件下，对所述耻垢分枝杆菌溶液以进气温度130°C，出气温度50°C以 及流速22mL/min进行喷雾干燥。所述细菌团块聚集在喷雾干燥器圆筒内，无法自旋风分离 器中作为粉末排出。在所述喷雾干燥器中收集到的材料为潮湿的，几乎无法进行加工。实施例2 用亮氨酸喷雾干燥耻垢分枝杆菌为说明用相对少量的赋形剂不会产生成功干燥的粉末，使用亮氨酸作为模式赋形 剂对耻垢分枝杆菌进行喷雾干燥。干燥溶液由对于400mL溶液(按重量计)80%的4mg/mL 亮氨酸溶液和20%的3xl09CFU/mL的耻垢分枝杆菌悬浮液组成。将所述溶液在即将到达喷 雾喷嘴之前在管线内混合(mixin-line)。在20°C与69%湿度的环境条件下，对所述溶液以 进气温度150°C，出气温度60°C和流速SmL/min进行喷雾干燥。平均小滴尺寸估计为50-60 微米。该过程通过所述喷雾干燥器的旋风分离器产生了产物，但产物过于潮湿，收率也低。 获得了含活细菌的淡黄色粉末(图3)。然而，该粉末形成团块，并且显示不良的流动性能。^MM 3 用较高浓It的亮,MiIX寸耳止垢分fefflf讲行Pty干燥较高浓度的赋形剂，例如亮氨酸，可导致良好喷雾干燥的粉末，而更加高浓度的赋 形剂增加生物体的存活力。同上，通过将90%和95%的4mg/mL亮氨酸溶液与10%和5% 的3xl09CFU/mL的耻垢分枝杆菌悬浮液混合制备400mL的溶液。同上，所述溶液在即将到 达喷雾喷嘴之前在管线内混合。在20°C和69%湿度的环境条件下，对所述溶液以进气温度 1500C，出气温度55°C和流速SmL/min进行喷雾干燥。平均小滴尺寸估计为50-60微米。表1提供了喷雾干燥的运行结果。在所有情况下，喷雾干燥得到了精细的、白色的 活的粉末，适于气雾剂分散，具有高产物收率。存活力以在含潮霉素的7H9琼脂板上的菌落 形成单位进行测定。对于95 5 (亮氨酸耻垢分枝杆菌)粉末(图4)，较之90 10粉 末，观察到了显著较高的生物存活力(大约20-80倍)，说明添加的赋形剂对在喷雾干燥过 程中保护所述微生物的重要性。含水量基于所述粉末的总体外观(gross appearance)来 估计。热重量分析(TGA)用于定量分析含水量。图5为描述表达绿色荧光蛋白(GFP)的耻 垢分枝杆菌的荧光显微照片，其使用90 10亮氨酸耻垢分枝杆菌喷雾干燥。该显微照 片显示所述粉末的颗粒仅部分(subset)含有具荧光的耻垢分枝杆菌(绿色)。表1.用亮氨酸喷雾干燥耻垢分枝杆菌 表1中的产物收率以终产物的质量与喷雾溶液中溶质的质量比例进行测定。终产 物质量包括任何粉末中的残余水分。通常，所述质量的一部分粘附于干燥装置而无法回收。实施例4用甘露醇对耻垢分枝杆菌进行喷雾干燥
为证明可用其它赋形剂对微生物进行喷雾干燥，使用糖甘露醇进行了进一步的实 验。赋形剂溶液由200mL溶液中95%的10mg/mL甘露醇溶液和5%的3xl09CFU/mL耻垢分 枝杆菌悬浮液组成，所述赋形剂溶液通过在即将到达喷雾喷嘴之前在管线内混合来产生。 在21. 9°C与63%湿度的环境条件下，对所述溶液以进气温度145°C，出气温度55°C和流速 12mL/min进行喷雾干燥。平均小滴尺寸估计为50-60微米。喷雾干燥产生了精细的、白色 的活的粉末，适于气雾剂分散，具有50%的产物收率，其中包含活细菌。棚列5 肝燥_抄后乂遍干態·其胴讓舌力为确定经喷雾干燥的耻垢分枝杆菌在储藏期间的存活il，喷雾干燥如实施例3中 进行，并将所得粉末在密封的容器中在4°C，25°C和40°C下储藏一到两周。以在板上的菌落 形成单位测定存活il。95 5亮氨酸耻垢分枝杆菌粉末在4°C或25°C下储藏一周后保留 了相当的存活il，但在40°C下储藏后没有明显的存活。90 10亮氨酸耻垢分枝杆菌粉 末在4°C下储藏一周后保持存活il，但在较高温度下无法存活。95 5亮氨酸耻垢分枝 杆菌粉末在25°C下储藏一周后的电镜显微照片示于图6。实施例6 对使用冷冻保护剂的喷雾干燥津模为显示在喷雾干燥过程中导入赋形剂的方式在保持存活力方面起重要因素的作 用，使用方程36对在喷雾干燥过程中下述三种不同条件下细胞材料的体积进行建模无冷 冻保护剂，胞内与胞外具有相同浓度的冷冻保护剂，以及较之胞外在胞内具有更高浓度的 冷冻保护剂(图7)。目的为显示下述范例，即根据该范例可通过将冷冻保护剂(赋形剂) 导入胞内和/或胞外以使对膜的应力最小化。所述建模使用Mathematica 程序(Wolfram，Inc., Champaign, IL)完成。对所有 三个图，将起始细胞半径(Re(O))设为Ιμπι，起始小滴半径(RdQ)设为25μπι，并将相对细胞 体积针对时间绘图。将 Lp 设为 1. 0ym/(atm min) ；Rgas 设为 0. 08205745867258821 (atm L)/ (K mol) ；T 设为 295. 15K。在所有三种情况下，k= (Kd LMTD) / ( λ P1) (Eq，33)。LMTD 通过 将进气温度设为500°C，出气温度设为200°C，起始小滴温度设为20°C而最终小滴温度设为 65°C来测定。将这些数值输入方程30以得到LMTD = ((500°C -20V )-(200°C -65V ))/ (2. 303*log10 ((500°C -20°C ) / (200°C _65°C )))。将 Kd 设为 0. 02kcal/(m hr°C ) ； λ 设为 530kcal/kg ； P i 设为 1000kg/m3。细胞数(ncells)设为 100，排除体积(Vexcluded)设为 0. 46 倍
初始体积。万；设为ιο_6。对于图7中的迹线(a)，其中胞外冷冻保护剂浓度较之胞内为低，胞外盐量(Xes)设 为0. 26M乘以初始小滴体积(Vdtl = 4/3 π (Rdtl)3)，胞内盐量(Xis)设为0. 26M乘以初始小滴 体积，胞外冷冻保护剂量(x\p)设为Omol，而胞内冷冻保护剂浓度(Cici(O))设为1M。使用 这些条件在时间0到0. 105秒对方程36进行计算以给出迹线(a)。对图7中的迹线(b)，其中胞外或胞内没有冷冻保护剂，胞外和胞内盐的量0^和 Xis)各自设为0. 26M乘以初始小滴体积。胞内冷冻保护剂的量(χ:)和浓度(Ciep(O))分别 设定为Omol和0M。使用这些条件在时间0到0. 105秒对方程36进行计算以给出迹线(b)。对图7中的迹线(C)，其中胞内冷冻保护剂浓度与胞外冷冻保护剂的浓度相等，胞 外和胞内盐的量(必和Xis)设为0.26M乘以初始小滴体积。胞内(Cici(O))和胞外冷冻保 护剂浓度设为1M，使得胞外冷冻保护剂浓度(χ:)为IM乘以初始小滴体积。使用这些条件 在时间0到0. 105秒对方程36进行计算以给出迹线(c)。
这些结果显示取决于导入冷冻保护性赋形剂的方法，得到非常不同的体积偏移 (或膜应力)概略(volume excursion (or membrane stress) profile)。该认识可弓|导出 使细胞活性损失最小化的喷雾干燥细胞形式的方法。7 诵i寸#^草豸胃&力jl/MtlUX寸耳Ib后胃优,HM胞舌力为了说明使膜应力最小化可以如何改善干燥细胞的存活力，如实施例3中所示 通过将95 %的4mg/mL亮氨酸溶液与5 %的3xl09CFU/mL的耻垢分枝杆菌悬浮液混合制备 400ml溶液。然而，在此情况下，不向耻垢分枝杆菌悬浮液中添加甘油。这些同样的溶液亦 在不含甘油的情况下进行喷雾干燥，并使用等渗盐水(0.9%氯化钠)替代所有之前实施例 中使用的蒸馏水。同上，所述溶液在即将到达喷雾喷嘴之前在管线内混合。在20°C与69% 湿度的环境条件下，对所述溶液以进气温度150°C，出气温度55°C和流速SmL/min进行喷雾 干燥。平均小滴尺寸估计为50-60微米。表2.在有或无甘油的情况下喷雾干燥95 5 (耻垢分枝杆菌/亮氨酸) 表2提供了从在有或无甘油存在下对95 5亮氨酸/耻垢分枝杆菌混合物运行喷 雾干燥获得的结果。在所有情况下，喷雾干燥得到了精细的、白色的活的粉末，适用于气雾 剂分散，具有高产物收率。存活力以在含潮霉素的7H9琼脂板上的菌落形成单位来测定。对 于无甘油的95 5 (亮氨酸耻垢分枝杆菌)粉末，较之有甘油的那些观察到明显较高的 生物存活力。当95 5 (亮氨酸耻垢分枝杆菌)混合物在无甘油而有0.9%等渗盐水条 件下喷雾干燥时，相对于无甘油且无0.9%等渗盐水的95 5(亮氨酸耻垢分枝杆菌)， 观察到了低细胞存活力(图8)，说明从所述喷雾干燥溶液中移除渗透活性物质对于在喷雾 干燥期间保护微生物的重要性。这些结果证认了实施例6的预测，即在细胞材料悬浮液的干燥过程中存在冷冻保 护剂或盐可导致对细胞膜的显著应力，导致存活力降低，推测这是因为喷雾干燥期间细胞 死亡的缘故。棚列8甚肺飾舌爐i后碰__軒'燥力口为说明喷雾干燥细胞保留高存活力可导致在喷雾干燥粉末中较低的游离水量并 且因而导致较高的细胞含量，如实施例7中，通过将90%，50%，40%，30%，20%和10%的 4mg/mL亮氨酸溶液与10%，50%，60 %，70%，80 %和90%的3xl09CFU/mL耻垢分枝杆菌悬 浮液混合，制备了 400mL溶液，不含甘油并不含盐。再次，所述溶液在即将到达喷雾喷嘴之 前在管线内混合。在20°C与69%湿度的环境条件下，对所述溶液以进气温度150°C，出气温 度55°C和流速SmL/min进行喷雾干燥。平均小滴尺寸估计为50-60微米。图9显示了自喷雾干燥运行所得的存活力结果。如之前实施例中，存活力随较低 赋形剂浓度而下降，说明高水平的赋形剂是良好细胞存活力所必需的。然而，与之前的实施 例不同，以低至50%的赋形剂浓度获得了具有良好存活力的精细干粉。这似乎指明低浓度赋形剂(低于90%)可提供良好结果，如若细胞完整性得到保持，和/或如若未使用下述添 加剂，即所述添加剂在室温下保持液态，如甘油的情况。存活力以在含潮霉素的7H9琼脂板 上的菌落形成单位来测量，且显示的是每个比例四次重复的结果。这些结果说明消除冷冻保护剂导致在赋形剂浓度降低的情况下细胞存活力增加。t施例9 含Slb后分fe杆菌的Bfg干燥粉末的彳诸藏期(shelf-life)稳定十牛为说明在干燥后且无冻结的情况下，细胞的存活力可保持一定时间，将在实施例8 中制备的具有50 50和95 5亮氨酸耻垢分枝杆菌的粉末置于4°C、25°C和40°C下的 大量储藏环境中，且存活力以在含潮霉素的7H9琼脂板上的菌落形成单位来测量。图10与11显示了所述两种粉末存活力作为时间函数的结果。存活力在几个月内 得到保持，其中最严重的存活力损失发生于前三个月，而在更长的期间内则存活力稳定。在 4°C条件下储藏的粉末在三个月期间内保持了大于十分之一的原始活性。在25°C条件下储 藏的粉末保持其存活力高于最适于递送的IO6阈值，而在40°C条件下储藏的粉末保持了 2 个月的存活力。50 50和95 5粉末的存活力随时间变化的差异似乎是由于细菌浓度的 差异，其影响粉末内的含水量。实施例10 使用单磷脂A对稳定件的作用测定了亲脂性物质，单磷脂A(MpLA)对喷雾干燥的耻垢分枝杆菌的作用。进行实 验以探明油性外被(oily coat)能否用作将内部的水保留在细菌内以增加其在较长时点的 存活力的方法。将耻垢分枝杆菌如上所述用95% 4g/ml亮氨酸溶液和5%耻垢分枝杆菌悬 浮液，以及0.25% MpLA—起进行喷雾干燥。所述溶液以124°C的进气温度和45°C的出气 温度进行喷雾干燥。周围环境为31. 6°C与34%的相对湿度。从这些条件得到质量收率为 66%。如图12A和12B所示，经MpLA处理的细菌较之未经MpLA处理的细菌相对而言在 16周的时间段内更具有保持存活力的能力。存活力在储藏直至一年后测定。实施例11 多种表面活性剂的作用为说明前述结果可用多种分散剂获得且对存活力无影响，所述95 5和50 50 耻垢分枝杆菌配制剂使用0. 05%泰洛沙泊(在前述实施例中使用的分散剂)与0. 05%和 0. Pluronic -F68制备。这些实验的结果示于图13。使用这些Pluronic -F68较之使 用泰洛沙泊产生的粉末，不显著影响所得粉末的存活力。^MM 12的喷雾干'燥私制诸藏J厢I定个牛为说明我们的结论对疫苗生物的适用性，我们用牛分枝杆菌BCG实施了相似的实 验。我们使用与实施例3相同的过程制备了 95 5亮氨酸牛分枝杆菌BCG的粉末，其不 含盐或冷冻保护剂，并将经干燥的材料在4°C、25°C和40°C下置于大量储藏环境中，且以在 7H9琼脂板上的菌落形成单位测定存活力。图14显示直至三个月时两种粉末的存活力作为 时间函数的结果。储藏在4°C条件下的粉末大部分在三个月的储藏过程中保持了其原始存 活力。储藏在25°C条件下的粉末在三个月时保持了类似的存活力，但有部分损失。这些存 活力结果与图9和图10中所示的细菌耻垢分枝杆菌的结果类似。实施例13 喷雾干燥哺乳动物细胞为显示具有最小膜渗透应力的高亮氨酸浓度配制剂可进一步适用于非细菌细胞， 我们使用培养的NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞与原代收获的大鼠心肌成纤维细胞实施了实验。我们制备了三种配制剂我们将每毫升一百万成纤维细胞用每毫升蒸馏水4毫克 亮氨酸以30/70，50/50和70/30的亮氨酸溶液/细胞溶液的体积/体积比悬浮。我们使用 类似于实施例3对耻垢分枝杆菌所用的条件对这些配制剂进行了喷雾干燥。所有的实验指明原代收获的大鼠心肌成纤维细胞和OTH 3T3胚胎小鼠成纤维细 胞具有大致等同的自所述喷雾干燥过程存活的能力。较高的亮氨酸浓度似乎导致在喷雾干 燥时较好的存活力；然而，考虑到所述成纤维细胞细胞膜不如细菌细胞膜刚硬(rigid)，且 对于由胞内具有渗透活性的物质产生的渗透应力更敏感，通过在PBS(表3)或“Tyrode”溶 液(表4)中喷雾干燥细胞获得了较高的存活力与较低的净渗透应力。细胞和亮氨酸两者 均悬浮于PBS或Tyrode中，并如上以亮氨酸溶液/细胞溶液的体积/体积比30/70，50/50 和70/30进行喷雾干燥。在后者情况下，活NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞在喷雾干燥后回 收，并于喷雾干燥后一个月进行观察，如图15中所示。表3.磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制剂 表4. Tyrode氏哺乳动物胞外电解质溶液配制剂 在喷雾干燥后，活的OTH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞和原代收获的大鼠成纤维细胞 从所述70/30，50/50和30/70配制剂中回收并铺板。图16和17显示在喷雾干燥后第3天和第8天的铺板的细胞。这些图显示较高的赋形剂浓度(亮氨酸浓度)在干燥时产生较高 的活细胞数。实施例14 动物的吸入免疫材料L-亮氨酸(MW = 131. 2，^ 98. 5 % 纯度)，甘油(1，2，3_ 丙三醇，丽 =92. 10)，和泰洛沙泊(4-(1，1，3，3，-四甲基丁基)苯酚，丽=1066)购自 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)。Deionized Sterile Milli-Q Biocel AlOFiltered Water过滤器购自Millipore (Billerica，ΜΑ)。磷酸盐缓冲盐水(ρΗ = 7. 4)购自 InvitrogenCorporation(Grand Island, NY)。细菌培养耻垢分枝杆菌mc2155培养于标准基本液体培养基，即含10% 0ADC(油酸，白蛋白， 葡萄糖和过氧化氢酶；BD diagnostics)，0· 2%甘油(SIGMA) ,0.05% Tween 80 (SIGMA)以 及适当时补充以SOyg/ml潮霉素(Roche)的Middlebrook 7H9。对荧光成像，将耻垢分 枝杆菌 mc2155 (Harris and Timbrell, 1977, InInhaled Particles, ed. W. H. Walton. Vol. IV. 1977,Oxford =PergamonPress,pp. 75-89)用潮霉素-标记的附加体质粒转化，所述质粒 携带组成性表达的绿色荧光蛋白(gfp)基因，并将其命名为耻垢分枝杆菌mc2155:gfp。对 所有其它研究，将耻垢分枝杆菌mc2155用pSS3 (携带潮霉素抗性盒的附加体质粒)转化，将 其命名为耻垢分枝杆菌mc2155:pSS3。将耻垢分枝杆菌培养2 3日直至OD为0. 8-1. O。 将细胞沉淀，用PBS-0. 05% Tween 80洗涤，并随即重新悬浮于同样体积的H2O-O. 05%泰 洛沙泊中以供喷雾干燥。泰洛沙泊的作用为在喷雾干燥前保持所述细菌的分散。通常，供 喷雾干燥用的悬浮液包含大约109CFU/ml。^^feff ^ BCG Pasteur JA Aeras Global TB Vaccine Foundation (Rockville, MD)获得。在使用前，将细胞解冻，用PBS-0. 05% Tween 80洗涤，并随即重新悬浮于同样 体积的H2O-O. 05%泰洛沙泊中以供喷雾干燥。通常，供喷雾干燥用的悬浮液为108CFU/ml。细菌计数通过在含10% 0ADC，0. 5%甘油的Middlebrook 7H10琼脂糖(对耻垢分 枝杆菌mc2155:pSS3补充以50 μ g/ml潮霉素)上铺板连续稀释来确定。喷雾干燥喷雾干燥溶液通过将L-亮氨酸(Sigma)溶液与之前制备的耻垢分枝杆菌或牛分 枝杆菌BCG悬浮液以不同的期望比例(wt/wt)混合来制备。使用亮氨酸是因为其为FDA接 受的粘合剂，且不在所用的浓度下对细菌细胞膜施加伤害性的渗透应力作用。搅拌所述亮 氨酸细菌悬浮液并在制备后立即使用。溶液用Buchi Mini Spray Dryer B-290 (Flawil，Switzerland)喷雾干燥，使用 位于喷雾干燥圆筒上方的0. 7mm压力喷嘴头，干燥空气流速为35L/小时。将经喷雾干燥的 颗粒自高效旋风分离器收集在6英寸收集容器中。进气温度在100与125°C间变动以保持 40°C的恒定出气温度，以及7ml/分钟的溶液进样速率。立即收集粉末以供表征，或如下所 述储藏。亮氨酸和耻垢分枝杆菌以按重量计99 1,95 5,70 30和50 50的比例喷雾 干燥。对本实施例中的大部分实验，使用95 5亮氨酸耻垢分枝杆菌(或亮氨酸BCG) 单独一种比例。喷雾干燥粉末的表在
连续稀释铺板用于评估耻垢分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG细菌在喷雾干燥前的细 胞悬浮液中与喷雾干燥后的粉末中的活菌落形成单位(CFU)数。将粉末分散于PBS-0. 05% Tween 80以溶解赋形剂，并涡旋振荡以均勻地重悬细菌。为了用CFU评估细菌存活力的稳 定性，将粉末在不同温度下储藏限定的时间。将粉末在-20°C，10%相对湿度(RH)(冷冻柜 条件)，4°C，25% RH(冷藏柜条件)，25°C，60% RH(环境室温条件)，以及40°C，75% RH(加 速条件(accelerated condition))下储藏于单独小瓶中，并按月间隔铺板(1,2,3,4,6,9, 12个月)。为确定每种粉末的活细菌中精细颗粒分数(颗粒尺寸小于5.8μπι的质量的比 例)以供填充目的，我们使用了六阶段(six-stage)Anderson Cascade Impactor (ACI-6, Thermo Andersen, Smyrna, GA) 0将含有10士2. 5mg粉末的胶囊置于手持干粉吸入装置 (Plastiape,Osnago Lecco, Italy)中。对所述吸入器中的胶囊进行穿刺，而激发吸气(4.2 秒期间28. 3L/分)的泵将所述经干燥的细菌粉末在不同阶段沉积，取决于所述颗粒的空气 动力学直径。在每阶段收集粉末，并铺板于7H10琼脂糖板以确定在每个阶段的每种粉末的 CFU数。质量中值空气动力学直径(MMAD)通过测量粉末各阶段的质量分布使用各阶段的空 气动力学直径校准来确定。空气动力学直径D，其相对于几何直径d定义为 D= (ρ/ξ)1/2 d
(37) 其中随即通过重量分析方法确定颗粒密度P和针对完美球体具有值统一性 (value unity)的无维(dimensionless)形状系数ξ。可测定该值并将其与质量中值几何 直径d相比较以确定每幂(per power)的形状系数ξ。对具有长度D1和直径D2的圆柱形 颗粒，所述形状系数可表示为
and Shape of Aerosol Particles, in Mechanics of Aerosols. 1964, Oxford, England Pergamon Press, pp. 1-20)。牛分枝杆菌BCG的尺寸范围为大约1-4 μ m的长度和0. 2-0. 4 μ m的轴直径(D2) (Flynn, Tuberculosis,84 =93-101,2004)；假定为圆柱形则据此得到近似的形状系数为 0. 6。体积-中值几何直径通过激光衍射光学定径系统(optical sizing system) (Sympatec HELOS-SystemHiISn该装置允许使用激光衍射光学和光敏阵列(laser diffraction optics and photosensor array)测量固体、悬浮液和喷雾的颗粒尺寸分布。 基于每个颗粒均具有均一密度的假定，可采用确定质量中值几何直径的算法。颗粒大小可 在多种压力(0.5，1.0，2.0和4. Obar)处测定以评估颗粒聚集的作用。x5(1的值报道为体积 中值几何直径值dg，而X16和X84用于指示颗粒尺寸分布以根据下式获取GSD 在我们的喷雾干燥粉末中耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG细菌的总数使用Auramine/Rhodamine荧光染色确定。将BCG粉末涡旋振荡10分钟以移除团块。将所述细 菌溶解于？83/0.05%1 6611"180，并将2(^1^ BCG溶液置于具有0. 2mm χ 0. 2mm网格的载玻 片上。将BCG通过在80°C下加热2小时的方法固定于载玻片上，并在37°C下用Auramine/ Rhodamine荧光染料染色15分钟。随即用缓冲液洗涤载玻片，并在所述载玻片网格的10个 方块上对细菌数进行计数，并乘以相应的稀释系数以确定每mL溶液中BCG细菌的总数。cells材料的冻干冻干使用Virtis Freezemobile Freeze Dryer (Gardiner, NY)进行。溶液制备 遵循用于喷雾干燥材料的相同方法。将样品用干冰冻结于灭菌玻璃瓶侧面上，并置于冻干 器中。在50psig的压力下，将温度降至-20°C持续28小时直至所述粉末因升华而干燥。干燥cells 材料的装瓶(vial filling)喷雾干燥的安慰剂粉末(不含细菌)在Eratech (Italy)配制并产生，其具有与 BCG粉末相似的气雾剂分散特征。这种粉末的组合物按重量计为20%异亮氨酸和80%乳 糖，经选择以符合粉末的生产规模(production scale)生产的需要，并且还获取与小规模 产生的细菌粉末具有相似气雾剂分散(反映于，例如，装填中)性质的粉末。所选供喷雾干 燥用的溶剂混合物为70/30水/乙醇。所述喷雾干燥过程用Labplant SD-06喷雾干燥器 使用Imm喷嘴在160°C的进气温度和67°C的出气温度以进样速率7ml/min和29. 4psig的 喷雾压力进行。在相对较短的时间段内获取了两千克的安慰剂粉末，其MMAD为4.43 μ m， 亦即，在对细菌粉末观察到的范围内。将所述粉末用于使用由IMA(Italy)生产的、设计用 来以最大速率每小时4200-6000装瓶的模块无菌设备(modular aseptic equipment,MAC) 的装填部件实施模拟装瓶。该设备以“真空/压力(vacuum/pressure)”机理运作，使用真 空以填充容量室(volumetricchamber)并压实(compact)粉末片，其随即由瓶中的加压空 气排出。在我们的实验中，将2kg安慰剂粉末置于所述填充设备的计量器(hopper)中，并 分别将所述填充室的体积和真空调整为30和45mg的填充目标。独立计算填充的粉末的净 重。经干燥材料的包装为调查水分和温度对干粉稳定性的作用，将所述喷雾干燥粉末置于两种包装中。 “低水分保护包装(Low moisture protection packaging) ”允许水分在稳定性测试起始 两周内进入所述包装从而使得所述包装围住的空间与包装外60或75% RH的大气相平衡。 “高水分保护包装(High-moisture protectionpackaging) ”在整个稳定性测试中保持干燥 状态。新生儿吸入器装置开发了低成本的、基于主动旋转胶囊的吸入器以供婴儿疫苗递送应用。所述吸入 器装置包含小的气球型泵，其当受到看护提供者的挤压时，提供足够的空气流以使位于所 述胶囊内的粉末状疫苗雾化，并将其递送给婴儿(图18)。所述装置亦包含整合的胶囊穿刺 装置以及单向气流控制阀。为测试自所述吸入器的排出剂量(emitted dose)，构建了机电挤压固定装置 (electro-mechanical squeeze fixture mechanism) 20以允许在测试过禾呈中连贯且可重 复的启动所述吸入器装置(图19)。对每种粉末配制剂的N = 5的胶囊实施测试。胶囊填充 以大约IOmg安慰剂粉末。评估了亮氨酸和耻垢分枝杆菌按重量计比例为99 1,95 5，70 30和50 50的粉末。胶囊填充以大约IOmg安慰剂粉末。对每个测试的胶囊，对所 述机电固定装置进行编程以进行5个循环的启动，每个循环由0. 25秒挤压期(用球泵28) 继以2秒的间歇期组成。排出剂量自在挤压测试之前和之后的重量分析数据确定。动物和处理将重量为479. 4士46. 7g的雄性豚鼠圈养于12小时光照/12小时黑暗的循环中和 22°C恒温环境下。无限制(ad libitum)提供标准的饮食和水。将动物随机指定到8个不同 组(每组η = 6)中，并用BCG溶液或颗粒如下免疫皮下2 X IO5CFU和2 X IO6CFU溶液；皮 内 2Χ IO6CFU溶液；皮下 2Χ IO6CFU 95 5 颗粒；和肺部 2X 105CFU、2X IO6CFU和 2X IO7CFU 95 5颗粒(将颗粒递送至肺)。通过吹入将BCG颗粒施用给经麻醉的动物(Perm Century, Philadelphia, PA)。将未处理的动物用作对照。结核菌素皮试在免疫六周后，评估动物中的延迟型超敏反应，其通过皮内注射纯化蛋白衍生物 溶液(PPD，100TU)来进行，并在24小时后测定硬结直径。细菌攻击(Bacterial Challenge)紧接着对延迟型超敏反应进行评定后，通过呼吸途径用结核分枝杆菌菌株H37Rv 的悬浮液，使用气雾剂暴露室(aerosol exposure chamber)对动物进行攻击。感染过程的 参数经调整致使每只动物吸入并保留大约10-15个活的烈性生物体。尸体剖检在细菌攻击四周后，通过腹膜内注射致死量的戊巴比妥钠处死动物。检查其胸腔 与腹膜腔，并移除肺和脾以评估感染的程度。保护水平依据细菌学、组织病理学和湿组织 重量确定。对于细菌学，将肺右下叶和部分脾脏分别在无菌盐水溶液中勻浆化，并接种于 M7H10琼脂板上。活细菌数在37°C下培育三周后计数。对于组织病理学，将组织保存于福 尔马林溶液中，包埋于石蜡中，并以5μπι切片。将所述切片装载于玻璃载玻片上并用苏木 精-曙红染色。显微镜检由病理学家进行，其对任何动物所接受的处理都为盲的(blind)。统计学将对PPD的结核菌素反应的尺度与肺和脾中经对数变换的细菌数假定为正态 分布的，并通过ANOVA分析。处理间的差异通过最小二乘法显著性差异多重比较方法 (least-squares significant difference multiple comparisonmethod)石角定。白勺才既 率水平(probability level) (P < 0. 05)视为统计学上显著的。结果为说明受益于纳米和微米尺寸细菌形态的有效气雾剂疫苗的可行性，用耻垢分枝 杆菌制备了干细菌粉。以相对大的比例添加氨基酸亮氨酸以减少干粉状态下的细菌-细 菌物理相互作用。对不同粉末的视觉评定(图20)确认存在独立的干燥细菌，其形成大约 1-4 μ m长度和大约200-400nm直径的棒状结构，而所述亮氨酸颗粒形成球状颗粒，其平均 几何直径为2. 3士 1. 2 μ m，如对100%亮氨酸粉末通过光散射定径所确定的。所述球状亮氨 酸颗粒充当物理缓冲物以防止细菌-细菌相互作用。所述棒状细菌似乎充当最小的亮氨酸 颗粒的“清除剂(scavenger) ”(图20)，而它们似乎不频繁与接近平均几何大小，亦即，大于 Iym的亮氨酸颗粒相关联。评估了所述不同的干细菌粉末的气雾剂性质，如图21所示。95 5亮氨酸耻垢 分枝杆菌粉末的MMAD相对于更大或更小的亮氨酸耻垢分枝杆菌比例而言为最小。进一步地，如该图中水平虚线所表示的(纯亮氨酸粉末的平均几何直径)，该MMAD与95 5(和 70 30)粉末的几何直径在统计学上相同，而在更大或更小的亮氨酸耻垢分枝杆菌比例 时则超过了亮氨酸的几何直径。该差异反映了空气传播的聚集物趋向于相对于几何直径增 加空气动力学直径，所述趋势常见于大多数干颗粒气雾剂形式(参见Fuchs，N.A. ,Sizeand Shape of Aerosol Particles，in Mechanics of Aerosols，1964，Oxford, England Pergamon Press，pp.1-20)。为评估自适用于低收入环境下的新生儿的吸入器装置递送干细菌形式的能力，排 出剂量性能使用四种不同的安慰剂粉末配制剂自图18中所示的婴儿吸入器测试。结果揭 示了对于除最低亮氨酸耻垢分枝杆菌比例的所有比例，自所述婴儿吸入器的排出剂量较 大，对于99%亮氨酸为99. 05士6. 01%，对95%亮氨酸为92. 59士 16. 73%，对70%亮氨酸为 85. 17士9. 23%，而对 50%亮氨酸仅为 68. 02士6. 43%。已知这些结果，设计了用BCG替代耻垢分枝杆菌的TB疫苗干粉(95 5亮氨 酸BCG)。在密封容器(sealed enclosure)中在冷藏(4°C )条件下九个月的稳定性 研究后，对所述TB气雾剂疫苗的物理和生物活性性质进行经时评估。在冷藏条件下， 所述疫苗MMAD保持恒定，在第一天以2. 1 士 1.2μπι起始，而在第九个月以1.9 士 1. Iym 结束。类似地，所述细菌的存活力，以CFU测定，在统计学上保持不变，从第一天的 4.8X105±8.8X104CFU/mg 到第九个月结束时的 4. 5 X IO4士 1. 2X104CFU/mg。在用2X IO6CFU的BCG通过皮下、皮内或肺部途径免疫的豚鼠中，结核菌素反应的 尺寸是相当的(表5)。在此剂量下，动物产生延迟型超敏反应的能力不受免疫途径的影响。 然而，用2X IO5CFU的BCG经肺部途径免疫的动物较之通过皮下途径接受同样剂量的动物 而言显示皮肤反应尺寸的减小。如所期待一般，在未经处理的对照动物中未在PPD注射的 位点观察到皮肤反应。图5.在使用BCG的不同配制剂通过不同途径免疫后六周豚鼠中对100结核菌素 单位的PPD的延迟超敏反应(平均值士标准偏差，η = 6) *P < 0. 05在免疫十周后和感染攻击四周后，经BCG溶液免疫的动物肺中的细菌负荷 (bacterial burden)显著小于未经处理的对照，与剂量(2X IO5或2X IO6CFU)或施用途径 (皮下或皮内)无关(图22)。此外，在接受BCG的胃肠外免疫的动物肺中的细菌负荷是相 当的，与剂量(2X IO5或2X IO6CFU)、施用途径(皮下或皮内)或者剂型(颗粒或溶液的皮 下施用)无关。值得注意的是，通过肺部途径用2X105CFU的BCG颗粒免疫的动物肺中的 细菌负荷显著低于通过胃肠外途径(无论溶液或颗粒)免疫的动物。此外，通过肺部途径 用2 X IO6CFU的BCG颗粒免疫的动物的肺细菌负荷显著低于用2 X IO5CFU的BCG颗粒免疫 的动物或通过胃肠外途径(无论溶液或颗粒)免疫的动物的细菌负荷。这说明用此种稳定 粉末疫苗的肺部免疫在预防结核感染方面具有很大潜力。在用不同剂型的BCG免疫的动物 间，脾的细菌负荷无显著差异(图22)。肺部细菌学的结果得到了肺部组织病理学结果的印证。在对肺部组织进行组织病 理学分析后的发现在通过胃肠外途径用2 X IO6CFU的BCG免疫(无论用皮内或皮下，溶液或 颗粒)的动物之间是相当的。在这些动物中少于5%的肺组织受小到中等肉芽肿影响，而少 于25%受极小到轻度坏死影响。与之相对，未经处理的动物中至少20%的肺组织受中等大 小的肉芽肿影响，其绝大部分展示轻度坏死。组织病理学分析亦揭示了在通过肺部途径用 2 X IO6CFU的BCG颗粒免疫的动物中少于1 %的肺组织受小肉芽肿影响，且其完全不展示干 酪样(cascous)坏死(图23A-23D)。类似地，在用2 X IO5CFU的BCG免疫的动物中，与通过 皮下途径免疫的不同，通过肺部途径免疫的动物的肺中的肉芽肿不展示干酪样坏死。与之相当的趋势亦见于脾组织中。当未经处理的动物几乎90%的脾白髓受中等到 大肉芽肿影响展示轻度干酪样坏死，而在经胃肠外免疫的动物中少于10%的脾白髓受小到 中等肉芽肿影响，展示极小的干酪样坏死。此外，在用2 X IO6CFU的BCG颗粒通过肺部途径 免疫的动物中，少于的脾白髓受小肉芽肿影响，其没有坏死，从而确认了细菌学的结果， 即证明本方法对预防结核有效。其它实施方案已描述了本发明的多种实施方案。尽管如此，应理解可在不背离本发明的宗旨和 范围的前提下进行多种修饰。相应的，其它实施方案亦包含于权利要求的范围内。
权利要求
一种干粉，其包含含有球状颗粒的赋形剂和含有棒状颗粒的细胞材料，其中按重量计70％或更多的粉末包含所述球状颗粒，且按重量计30％或更少的粉末包含所述棒状颗粒。
2.权利要求1的干粉，其中所述细胞材料包含细菌。
3.权利要求2的干粉，其中所述细菌为结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis) 或耳止柜分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)细菌。
4.权利要求2的干粉，其中所述细菌为卡介苗(BacillusCalmette-Guerin(BCG))细菌。
5.权利要求1-4中任一项的干粉，其中所述赋形剂包括亮氨酸、甘露醇、海藻糖、葡聚 糖、乳糖、蔗糖、山梨醇、白蛋白、甘油、乙醇或其混合物。
6.权利要求1-5中任一项的干粉，其中所述棒状颗粒具有约1_4μπι的长度与约 200-400nm 的直径。
7.权利要求1-6中任一项的干粉，其中所述球状颗粒具有约1_4μπι的平均几何直径。
8.权利要求1-7中任一项的干粉，其中所述粉末具有约2-3μ m的质量中值空气动力学直径。
9.权利要求1-8中任一项的干粉，其中所述粉末按重量计包含少于10%的水。
10.一种施用细胞材料的方法，所述方法包括通过吸入对受试者施用包含权利要求 1-9中任一项的干粉的组合物。
11.一种刺激针对细胞材料的免疫应答的方法，所述方法包括对受试者施用包含权利 要求1-9中任一项的干粉的组合物。
12.权利要求1-9中任一项的干粉作为疫苗的用途。
13.一种包含权利要求1-9中任一项的干粉的药物组合物。
14.一种方法，包括(a)测定要向患者施用的包含细胞材料的干粉的颗粒的几何性状；并(b)若所述粉末包含按重量计70%或更多的球状颗粒和按重量计30%或更少的棒状 颗粒，则选择所述干粉作为用于通过吸入施用的组合物。
15.权利要求14的方法，其中所述棒状颗粒包含所述细胞材料。
16.权利要求14的方法，其中所述细胞材料包含细菌。
17.权利要求16的方法，其中所述细菌为结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌细菌。
18.权利要求16的方法，其中所述细菌为卡介苗(BCG)细菌。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中若所述干粉包含具有约1-4μ m的长度和约 200-400nm的直径的棒状颗粒，则选择所述干粉。
20.权利要求14-19中任一项的方法，其中若所述干粉包含具有约1-4μ m的平均几何 直径的球状颗粒，则选择所述干粉。
21.权利要求14-20中任一项的方法，其中若所述干粉具有约2-3μ m的质量中值空气 动力学直径，则选择所述干粉。
22.权利要求14-21中任一项的方法，进一步包括将所述干粉配制为药物组合物用于 通过吸入施用。
23.一种通过权利要求14的方法制备的药物组合物。
全文摘要
提供喷雾干燥的细胞材料的方法和组合物从而允许保存所述细胞材料。在一方面，所述细胞材料与一些赋形剂一同喷雾干燥。在另一方面，所述细胞材料使用冷冻保护剂进行喷雾干燥。
文档编号A61K9/14GK101888831SQ200880119524
公开日2010年11月17日 申请日期2008年10月6日 优先权日2007年10月5日
发明者凯文·K·帕克, 布赖恩·普利亚姆, 戴维·A·爱德华兹, 肖恩·希伊, 黄韻铃 申请人:哈佛大学的校长及成员们