糖链相关基因及其利用的制作方法

专利名称：糖链相关基因及其利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过阻碍糖链相关基因来抑制生物组织水平的纤维形成的抑制剂。
背景技术：
一直以来，对于核酸和蛋白质进行了深入细致的研究，已经清楚了很多情况。但是 相反地，这些研究也说明了人类的基因只不过仅有2万2千个左右，蛋白质的翻译后修饰在 生物体内是重要的，其还说明了以往的研究方式是有限的。近年来，在后基因组、后蛋白质 组学的潮流中再次认识到了糖链的重要性(Nature誌446号2007年4月26日发行(非 专利文献1 7)中也大量编入了糖链特辑)。对于糖链而言，由于结构解析困难等理由， 一直以来未被过多解析，虽然认为其有可能与癌症、炎症、免疫、病毒感染等有关，但在现阶 段，其作用等不清楚的部分还有很多，有待进一步阐明。作为构成糖链的糖(单糖)，目前已知有各种糖。例如已知葡萄糖(Glc)、半乳 糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖胺 (GlcN)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、木糖(Xyl)、唾液酸 (SA)等。另外，有报道指出构成糖链的糖受到了各种化学修饰。例如已知甲基化、乙酰基 化、甲酰化、肉豆蔻酰化、酰胺化、泛素化、酰化、磷酸化、差向异构化、硫酸化等。另外还可以 举出唾液酸化、去唾液酸化、岩藻糖基化、糖基化、半乳糖基化、乳糖化、甘露糖基化等化学 修饰。糖中存在多个接受这些化学修饰的部位。例如已知在GIcNAC中1位 6位的碳 全部受到化学修饰。其它的糖中也报道了在各种部位上受到了化学修饰。非专禾U 文献 1 :Danica P. Galonic and David Y. Gin, Nature 446 1000-1007(2007)# 专禾I」文 ^ 2 =Christopher J. Thibodeaux et. Al. , Nature 446 1008-1016(2007)非专利文献3 =Gerald W. Hart et. Al.，Nature 446 1017-1022 (2007)非专利文献4:Ajit Varki, Nature 446:1023-1029(2007)非专利文献5 Joseph R. Bishop et. Al. , Nature 446 1030-1037 (2007)非专利文献6 =Christopher N. et. Al.，Nature 446 1038-1045 (2007)非专利文献 7 :Peter H. Seeberger and Daniel B. Werz, Nature 446 1046-1051(2007)

发明内容
本发明基于通过对糖链相关基因的研究而新发现的事实。本发明的目的在于提供 糖链相关基因的新用途。具体地说，其目的在于提供通过阻碍糖链相关基因的功能来抑制 生物组织水平的纤维形成的药剂以及该药剂的筛选方法。
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虽然已知糖链在生物体内的作用非常重要，但对于糖链在生物体内的功能仍有很 多不清楚的部分。如上所述，构成糖链的糖已知有多个种类，认为糖通过在多个部位受到各种化学 修饰而在生物体内承担重要的生理作用。如上所述，存在大量构成糖链的糖的种类、以糖为靶标的化学修饰的种类以及其 被化学修饰的部位，因此认为糖链是由无数个变量构成的。因而，确定承担某作用的糖链的 结构是非常困难的，而且也极难发现某种疾病所引起的病态与糖链的具体作用之间的关联 性。本发明人深入研究的结果是首次成功地发现了通过阻碍构成糖链的糖之一的 GalNAc的4位或6位的硫酸化，可以抑制生物水平上的组织的纤维形成。进而，本发明人通 过利用各种疾病模型动物的研究，证实了 GalNAc的4位或6位的硫酸化抑制剂对组织的纤 维形成所引起的疾病(组织纤维形成性疾病)具有治疗效果。本发明涉及通过阻碍糖链相关基因的功能来抑制生物组织水平的纤维形成的药 剂以及该药剂的筛选方法，更具体地说，本发明提供(1) 一种组织纤维形成抑制剂，其以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑 制剂为成分。(2)上述(1)所述的药剂，其特征在于，对生物组织的纤维形成具有抑制效果。(3)上述(1)或⑵所述的药剂，其中，上述抑制剂具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的 4位或6位的硫酸基转移酶的功能的活性。(4)上述(3)所述的药剂，其中，上述抑制剂是抑制N-乙酰基半乳糖胺的4位或6 位的硫酸基转移酶基因的表达的siRNA。(5)上述(1)或(2)所述的药剂，其中，上述抑制剂是N-乙酰基半乳糖胺的4位或 6位的硫酸基的脱硫酸化酶。(6)上述(1) (5)任一项所述的药剂，其为纤维形成性疾病的治疗用或预防用的 药剂。(7) 一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含选择阻碍构成糖链的N-乙酰基 半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的化合物的工序。(8) 一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (C)(a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖链与受试化合物接触的 工序；(b)测定N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。(9) 一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (C)(a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶与受试化合物接触的工 序；(b)测定上述酶的硫酸基转移活性的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述活性降低的化合物的工序。(10) 一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (C)(a)使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞接触的工序；(b)测定上述细胞中基因的表达量的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述基因的表达量降低的化合物的工序。(11) 一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (C)(a)使受试化合物与含有下述DNA的细胞或细胞提取液接触的工序，所述DNA具有 编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因 功能性结合而成的结构；(b)测定上述报告基因的表达量的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述报告基因的表达量降低的化合物 的工序。(12)用于纤维形成性疾病的治疗或预防的药品组合物的制造方法，其包含以下的 工序(a)和(b)(a)利用上述(7) (11)任一项所述的方法从受试试样中选择组织纤维形成抑制 剂的工序；(b)将上述药剂和药学上可允许的载体混合的工序。另外，本发明还涉及(13) —种抑制组织纤维形成的方法，其包含向个体投予N-乙酰基半乳糖胺的4位 或6位的硫酸化抑制剂的工序。(14) N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂在制造组织纤维形成抑制剂 中的用途。(15)用于组织纤维形成抑制用途的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑 制剂。


图1是表示使用定量逆转录PCR法对通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小 鼠的基因表达进行研究的结果的图。研究项目是作为siRNA的靶基因的GalNAc4S-6ST、作 为纤维形成标记物的α -SMA和I型胶原。图中表示了目标基因与看家基因(核糖体18S) 的相对比值。*Ρ <0. 001 (t-检验)图2是表示对通过盐酸多柔比星(D0X 协和发酵公司制)腹腔内投予所诱发的心 肌病模型小鼠的心脏重量/体重比进行解析的结果的图。乍<0.05 (t-检验)图3是表示显示通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠的siRNA治疗组的 I型胶原沉积的抑制效果的组织所见的照片。倍率为100倍。图4是表示显示通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠的siRNA治疗组的 III型胶原沉积的抑制效果的组织所见的照片。倍率为100倍。图5是表示通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠siRNA治疗组的纤维芽 细胞(fibroblast，也称为成纤维细胞)的聚集抑制效果的照片。倍率为50倍。图6是表示通过DSS所诱发的小鼠肠道纤维形成模型的临床图像的图。通过 GalNAc 4S-6ST siRNA投予，临床评分(左)、大肠长度的短缩(右)均被显著抑制。
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图7是表示小鼠肠道纤维形成模型的纤维形成相关基因的表达的图。研究了大 肠组织中的GalNAc 4S-6ST以及作为纤维形成标记物的α-SMA和I型胶原。图中表示了 目标基因与看家基因(核糖体18S)的相对比值。通过GalNAc 4S-6ST siRNA的沉默效应 (上)，I型胶原(下左)、α -SMA (下右)的表达增强被显著抑制。图8是表示小鼠肠道纤维形成模型的胶原组织沉积的照片。大肠组织的马松染色 图像(蓝色)。X 100。GalNAc 4S-6ST siRNA减轻了胶原的组织沉积。图9是表示小鼠肠道纤维形成模型的纤维芽细胞浸润的照片。大肠组织的纤维芽 细胞染色图像(茶色)。XlOO0 GalNAc 4S-6ST siRNA抑制了纤维芽细胞的全层性的浸润。图10是表示小鼠肠道纤维形成模型的巨噬细胞浸润图像的照片。大肠组织的巨 噬细胞染色图像(茶色)。XlOO0 GalNAc 4S-6ST siRNA抑制了巨噬细胞的全层性的浸润。图11是表示小鼠肠道纤维形成模型的大肠长度的图。GalNAc 4STsiRNA显著地抑 制了大肠的短缩。图12是表示通过PPE所诱发的小鼠肺气肿模型的临床图像的照片。C6ST-1 siRNA 投予显著地抑制了组织学上的肺泡壁破坏。X100。图13是表示小鼠肺气肿模型的纤维形成相关基因的表达的图。研究了肺组织中 的C6ST-1以及作为纤维形成标记物的α -SMA和I型胶原。图中表示了目标基因与看家基 因(核糖体18S)的相对比值。通过C6ST-1 siRNA的沉默效应(左)，显著地抑制I型胶原 (中央)、α-SMA(右)的表达增强。图14是表示小鼠肺气肿模型的纤维芽细胞浸润的照片。肺组织的纤维芽细胞染 色图像(茶色)。Χ200。通过C6ST-1 siRNA抑制了纤维芽细胞在肺泡间质中的浸润。图15是表示小鼠肺气肿模型的巨噬细胞浸润图像的照片。肺组织的巨噬细胞染 色图像(茶色)。Χ200。C6ST-1 siRNA抑制了巨噬细胞在肺泡间质中的浸润。图16是表示小鼠肺气肿模型的静态肺顺应性(Cst)的图。通过C6ST_lsiRNA，Cst 显著降低。图17是表示小鼠肺气肿模型的右肺容量(μ 1)的图。通过C6ST-lsiRNA，肺容量 显著降低。图18是表示小鼠肺气肿模型的纤维形成相关基因的表达的图。研究了肺组织中 的作为纤维形成标记物的α-SMA、I型胶原以及TGF-β。图中表示了目标基因与看家基因 (核糖体18S)的相对比值。通过GalNACST siRNA的沉默，显著地抑制了各纤维形成标记物 的表达增强。图19是表示小鼠肺气肿模型的静态肺顺应性(Cst)的图。通过GalNAcST siRNA, Cst显著降低。图20是表示小鼠肺气肿模型的右肺容量(μ 1)的图。通过GalNAcST siRNA，肺容 量显著降低。图21是表示小鼠2型糖尿病模型的肥胖变化的图。C4ST-1 siRNA、C4ST_2 siRNA、 C4ST-3 siRNA显示出肥胖抑制倾向。C4ST-2 siRNA、C4ST_3 siRNA显示出显著的抗肥胖效^ ο图22是表示小鼠2型糖尿病模型的胰岛素抵抗性的图。通过C4ST-1 siRNA、 C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，胰岛素抵抗性显著地改善。
图23是表示小鼠2型糖尿病模型的胰腺组织的基因表达的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST_3 siRNA，抑制了胰腺组织的 C4ST-1、C4ST_2、C4ST_3 基因表达。图24是表示小鼠2型糖尿病模型中APP向胰腺胰岛沉积的照片。通过C4ST-2 siRNA，抑制了胰岛的APP(绿色)沉积。细胞核(红色)、X400。图25是表示小鼠2型糖尿病模型中纤维芽细胞向胰腺胰岛浸润的照片。通过 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)向胰岛的浸 润。X 200。图26是表示小鼠2型糖尿病模型中巨噬细胞向胰腺胰岛浸润的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了巨噬细胞(茶色)向胰岛的浸润。X200。图27是表示小鼠2型糖尿病模型的胰岛素抵抗性的图。通过GalNAcST siRNA投 予，胰岛素负荷后的血糖下降良好地进行，即胰岛素抵抗性有所改善。图28是表示小鼠糖尿病性肾病模型的纤维芽细胞的肾组织间质聚集的图及照 片。通过C4ST-1 siRNA，显著地抑制了纤维芽细胞(茶色)的聚集。X200。图29是表示小鼠糖尿病性肾病模型的巨噬细胞的肾组织间质聚集的图及照片。 通过C4ST-1 siRNA，显著地抑制了巨噬细胞(茶色)的聚集。X200。图30是表示小鼠糖尿病性肾病模型的α SMA阳性细胞的肾组织间质聚集的照片。 通过C4ST-1 siRNA，显著地抑制了 α SMA阳性细胞(茶色)的聚集。Χ200。图31是表示小鼠糖尿病性肾病模型的抗纤维形成效果的图。通过 GalNAc4S-6ST (G#l) siRNA 的投予，显著地抑制了肾组织中的 GalNAc4S_6ST (G#l)、α SMA, TGF β的表达增强。ARB 血管紧张素受体拮抗剂(缬沙坦)。图32是表示小鼠糖尿病性肾病模型的纤维芽细胞的肾组织间质聚集的照片及 图。通过GalNAc4S-6ST(G#l)siRNA，显著地抑制了纤维芽细胞(茶色)的聚集。X200。图33是表示小鼠糖尿病性肾病模型的巨噬细胞的肾组织间质聚集的照片及图。 通过GalNAc4S-6ST(G#l)siRNA，显著地抑制了巨噬细胞(茶色)的聚集。X 200。图34是表示小鼠糖尿病性肾病模型的IV型胶原的蓄积的照片及图。通过 GalNAc4S-6ST(G#l) siRNA，显著地抑制了可通过IV型胶原(茶色)阳性确认的肾小球基底 膜的肥厚。X 400。图35是表示小鼠糖尿病性肾病模型的肾保护作用的图。通过GalNAc4S_6ST(G#l) siRNA，显著地抑制了肾组织的血管紧张素原以及ACE的表达增强。图36是表示小鼠糖尿病性肾病模型的肾功能保护作用的图。通过 GalNAc4S-6ST(G#l)siRNA，抑制了血清肌酸酐的增加、即抑制了肾功能下降。图37是表示小鼠糖尿病性肾病模型的基因表达的图。通过GalNAcST siRNA，显著 地抑制了肾组织中的GalNAc4ST-l、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6ST的表达增强。图38是表示小鼠糖尿病性肾病模型的抗纤维形成效果的图。通过GalNAcST siRNA，显著地抑制了肾组织中的CTGF、α SMA, I型胶原、ACE的表达增强。图39是表示小鼠药源性间质性肾炎的基因表达的图。通过GalNAc4S_6ST(G#l) siRNA，显著地抑制了肾组织的GalNAc4S-6ST(G#l)的表达增强。图40是表示小鼠药源性间质性肾炎的胶原沉积的照片。通过GalNAc4S_6ST (G#l) siRNA，I型胶原(茶色)向肾间质的沉积明显减少。X200。
图41是表示小鼠UUO纤维形成模型的抗纤维形成效果的图。通过C6ST siRNA，显 著地抑制了肾组织中的C6ST-2 (G#10)、TGF β、α SMA, I型胶原、CTGF的表达增强。图42是表示小鼠UUO纤维形成模型的纤维芽细胞的间质聚集的图及照片。通过 C6ST siRNA，显著地抑制了纤维芽细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。X200。图43是表示小鼠UUO纤维形成模型中巨噬细胞的间质聚集的图及照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了巨噬细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。X200。图44是表示小鼠UUO纤维形成模型中胶原沉积的图及照片。通过C6ST siRNA,显 著地抑制了可以通过IV型胶原(茶色)确认的肾小球基底膜的肥厚。X400。图45是表示小鼠UUO纤维形成模型中组织聚集纤维芽细胞的活化的照片。通过 C6ST siRNA，显著地抑制了 α SMA阳性细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。Χ400。图46是表示小鼠UUO纤维形成模型中ACE产生细胞的间质聚集的照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了 ACE产生细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。X400。图47是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型的IV型胶原的组织蓄积的照片。通过 GalNac4S-6ST(G#l) siRNA，抑制了 IV型胶原(茶色)的聚集。X200。GCL 神经节细胞层、 INL:内颗粒层、0NL:外颗粒层。图48是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中CSPG的组织蓄积的照片。通过 GalNac4S-6ST(G#l) siRNA，抑制了 CSPG (茶色)的聚集。特别是从GCL、ONL向色素上皮细 胞层的抑制效果明显。X200。图49是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中GFAP阳性细胞的照片。通过 GalNac4S-6ST (G#l) siRNA, GFAP 阳性细胞(茶色)从 INL 向 GCL 显著增加。X 200。图50是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中神经节细胞数的图。GGL中神经节细 胞数的计数。通过GalNac4S-6ST(G#l) siRNA，可显著抑制神经节细胞数的减少。图51是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中视神经再生效果的图。通过 GalNac4S-6ST (G#l) siRNA,眼组织的GS表达显著上升。图52是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中基因表达的图。表示了 GalNAc4S_6ST在肝 脏组织的表达增强和GalNAcST siRNA带来的显著抑制。图53是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中纤维形成相关基因表达的图。表示了 I型 胶原、α SAM在肝脏组织的表达增强和GalNAcST siRNA带来的显著抑制。图54是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中纤维形成细胞浸润的照片。通过GalNAcST siRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)在肝脏组织的桥样聚集。X 100。图55是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中临床纤维形成评分的图。通过GalNAcST siRNA，显著地抑制了肝脏组织的纤维形成评分的上升。图56是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中巨噬细胞浸润的照片。通过GalNAcST siRNA，抑制了巨噬细胞(茶色)在肝脏组织的聚集。X 100。图57是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中脂质代谢相关基因表达的图。通过 GalNAcST siRNA，显著地抑制了肝脏组织中的ChREBP、ACC2的表达上升。图58是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中纤维形成细胞浸润的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)在肝脏组织的桥样聚 集。X 100。
图59是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中临床纤维形成评分的图。通过C4ST-1 siRNA, C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA,显著地抑制了肝脏组织的纤维形成评分的上升。图60是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中临床的肝功能障碍的图。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了作为肝细胞功能障碍指标的ALT的上升。图61是表示小鼠肝纤维症模型中纤维芽细胞浸润的照片。通过C6STsiRNA，抑制 了纤维芽细胞(茶色)在肝脏组织的聚集。X50。图62是表示小鼠肝纤维症模型中临床纤维形成评分的图。通过C6STsiRNA，显著 地抑制了肝脏组织的纤维形成评分的上升。图63是表示小鼠肝纤维症模型中抗纤维形成效果的图。通过C6STsiRNA，显著地 抑制了 α SMA, I型胶原、CTGF、TGF β的表达。图64是表示小鼠帕金森病模型中抗纤维形成效果的图。通过GalNAc4S_6ST siRNA，显著地抑制了脑组织的GalNAc4S-6ST、TGF0、I型胶原、α SMA的表达。图65是表示小鼠帕金森病模型中纤维芽细胞聚集的照片。通过GalNAc4S_6ST siRNA，纤维芽细胞(茶色)的脑组织聚集剧减。X200。图66是表示小鼠帕金森病模型中神经保护作用的图。通过GalNAc4S_6ST siRNA, ⑶NF、Nurrl的表达显著地增强。图67是表示小鼠帕金森病模型中多巴胺神经再生效果的照片。通过 GalNAc4S-6ST siRNA，抑制了 TH阳性多巴胺神经(绿色)的损失。X200。图68是表示小鼠帕金森病模型中的多巴胺神经再生效果的照片。通过GalNAc4ST siRNA，抑制了 TH阳性多巴胺神经(绿色)的损失。X200。图69是表示2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4-硫酸酯酶的CSPG减弱效果 的照片。表示了 2型糖尿病模型小鼠视网膜中的CSPG(CS56)染色图像(茶色、箭头)。图70是表示2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4-硫酸酯酶的血管增生抑制 效果的照片。表示了 2型糖尿病模型小鼠视网膜的血管内皮细胞(CD31)染色图像(茶色、
刖大“图71是表示2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4-硫酸酯酶的胶原增生抑制 效果的照片。表示了 2型糖尿病模型小鼠视网膜的IV型胶原染色图像(茶色、箭头)。图72是表示小鼠2型糖尿病模型的肝脏中的C4-硫酸酯酶的纤维芽细胞的聚集 抑制效果的照片。倍率为50倍和100倍。图73是表示小鼠2型糖尿病模型的肝脏中的巨噬细胞浸润抑制效果的照片。倍 率为50倍和100倍。图74是表示小鼠2型糖尿病模型的血清中的生化学检查(AST、ALT、TG)的结果的 图。图中，未治疗组标记为unt、对照组标记为nor、C4-硫酸酯酶标记为C4sul。图75是表示脑组织中的CSPG的局部存在的照片。该照片是使用酶抗体免疫染色 法对脑组织中的CSPG的表达动态进行解析的结果。一抗使用CS-56 (生化学工业公司制)、 小鼠染色试剂盒进行染色。图76是表示脑组织中的多巴胺能神经的局部存在的照片。是使用荧光免疫染色 法进行解析的结果。图77是表示利用实时PCR法的TNF-α的基因表达解析结果的图。图中表示了使
9用实时PCR对作为纤维化标记物的TGF- β、作为伴随巨噬细胞浸润的炎症指标的TNF- α的 表达进行研究的结果。图78是表示利用实时PCR法的Nurrl基因表达解析结果的图。图中表示了脑组 织中的Nurrl的基因表达，是使用Cyber premix kit(Takara Bio公司制)和实时PCR基 因扩增仪DICE (Takara Bio公司制)进行的。另外，图中表示了 Nurrl与看家基因(β-肌 动蛋白)的相对比值。
具体实施例方式以下详细地说明本发明。本发明涉及以阻碍构成糖链的糖之一的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸 化为机制的组织纤维形成抑制剂。S卩，本发明提供以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂(本说明书中 有时记为“本发明的抑制剂”或者仅记为“抑制剂”)为成分的组织纤维形成抑制剂。本发明的“N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc) ”是作为己糖胺一种的半乳糖胺的N-乙
酰基体。另外，已知N-乙酰基半乳糖胺的1 6位的部位受到化学修饰。本发明的特征在于阻碍了 N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的部位的硫酸化。被本发明的抑制剂阻碍的部位具体地为下述GalNAc化学式中用箭头表示的部位。对于本发明的抑制剂而言，硫酸化被阻碍的GalNAc上的部位为4位或6位，但4 位和6位两者的硫酸化都被阻碍的情况也包含在本发明内。另外，本发明的GalNAc优选是 含有在硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)中的糖。本发明中，硫酸化被阻碍是指阻碍硫酸基转移至GalNAc上的4位或6位的部位、 或者是从已经硫酸化的部位除去硫酸基、或者取代成其他的化学修饰等。本发明的组织纤维形成抑制剂(本说明书中有时记为“本发明的药剂”)的特征在 于，优选对生物组织(体内)的纤维形成具有抑制效果。作为通过本发明的药剂抑制了纤维形成的组织并无特别限定，例如可举出心脏组 织、消化道组织、肺组织、胰腺组织、肾脏组织、眼组织、肝脏组织、脑神经组织或皮肤组织寸。本发明中“纤维形成”还可表达为“纤维化”。另外，还可以使用“组织上的纤维形 成性病变”、“纤维形成性组织变化”、“组织纤维新生”等表达来表示。作为本发明的抑制剂，只要是具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化 的作用的物质，则无特别限定。
'tH2OH HO X-O
Joh VOH
NHCOCH3
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作为本发明的抑制剂的优选方式，例如可举出具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的4位 或6位的硫酸基转移酶的功能的活性的物质。上述物质的优选方式例如可举出选自以下(a) (C)的化合物(核酸)。(a)针对编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录产物 或其一部分的反义核酸(b)具有使编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录产 物特异性开裂的核酶活性的核酸(c)具有利用RNAi效应来阻碍编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转 移酶的基因的表达的作用的核酸(抑制硫酸基转移酶基因表达的siRNA)另外，作为“具有硫酸化阻碍作用的物质”，例如可以举出选自以下(a) (C)的化 合物。(a)与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶相结合的抗体(b)N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶突变体(c)与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶相结合的低分子化合物作为本发明的抑制剂的其他方式，例如可举出具有使N-乙酰基半乳糖胺的4位或 6位的硫酸基脱硫酸化的作用的物质。作为该物质，例如可举出使N-乙酰基半乳糖胺的4 位或6位的硫酸基脱硫酸化的酶(脱硫酸化酶)。N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基的“脱硫酸化”是指N-乙酰基半乳糖胺 的4位或6位的硫酸基被除去。作为脱硫酸化酶，例如可举出软骨素-4-硫酸酯酶(C4-硫酸酯酶)、软骨素-6-硫 酸酯酶等。作为本发明的硫酸基转移酶，只要是具有将硫酸基转移至GalNAc的4位或6位的 活性的酶，则无特别限定，例如可举出以下的酶。1) GalNAc4ST-l =N-乙酰基半乳糖胺4_磺基转移酶_1别名CHST8 碳水化合物(N-乙酰基半乳糖胺4_0)磺基转移酶82)GalNAc4ST-2别名CHST9 碳水化合物(N-乙酰基半乳糖胺4_0)磺基转移酶93)C4ST-1 软骨素-4-0-磺基转移酶_1别名CHSTll 碳水化合物(软骨素4)磺基转移酶114) C4ST-2别名CHST125) C4ST-3别名CHST136)C6ST-1 软骨素-6-0-磺基转移酶_1别名CHST3 碳水化合物(软骨素6)磺基转移酶37) GalNAc4S-6ST =N-乙酰基半乳糖胺4_硫酸酯6_0磺基转移酶8)D4ST-1 皮肤素4磺基转移酶19) C6ST-2 软骨素-6-0-磺基转移酶_2别名CHST7 碳水化合物(软骨素6)磺基转移酶7
另外，共有该特征的酶组并不一定对应于基因组DNA上的一个基因。例如软骨 素-4-硫酸酯酶、软骨素-6-硫酸酯酶均可以作为以基因组数据库上多个登录号来参照的 序列(例如Genbank登录号NT_039500 (其一部分以登录号CAAAOl098429 (序列号1)表 示)、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_00103081UNW_001030796, NW_000349)由 公共基因数据库Genbank获得。作为本发明的硫酸基转移酶在公共基因数据库Genbank中的登录号、碱基序列、 氨基酸序列，可以举出以下示例。GalNAc4ST-l (登录号NM_175140、碱基序列的序列号2、氨基酸序列的序列号3)GalNAc4ST_2 (登录号NM_199055、碱基序列的序列号4、氨基酸序列的序列号5)C4ST-1 (登录号NM_021439、碱基序列的序列号6、氨基酸序列的序列号7)C4ST_2(登录号NM_021528、碱基序列的序列号8、氨基酸序列的序列号9)C4ST_3(登录号XM_355798、碱基序列的序列号10、氨基酸序列的序列号11)D4ST(登录号NM_028117、碱基序列的序列号12、氨基酸序列的序列号13)C6ST-1 (登录号ΝΜ_016803、碱基序列的序列号14、氨基酸序列的序列号15)C6ST_2(登录号AB046929、碱基序列的序列号16、氨基酸序列的序列号17)GalNAc4S_6ST(登录号NM_015892、碱基序列的序列号18、氨基酸序列的序列号 19)除上述以外的蛋白质、例如与序列表所记载的序列具有高同源性(通常为70%以 上、优选为80%以上、更优选为90%以上、最优选为95%以上)且带有上述蛋白质所具有的 功能(例如与细胞内的构成成分相结合的功能等)的蛋白质也包含在本发明的上述蛋白质 中。上述蛋白质例如是由在序列号3、5、7、9、11、13、15、17的任一个氨基酸序列中添加、缺 失、取代、插入了 1个以上的氨基酸而得到的氨基酸序列所构成的蛋白质，通常变化的氨基 酸数为30个氨基酸以内、优选10个氨基酸以内、更优选5个氨基酸以内、最优选3个氨基 酸以内。本发明的上述基因中例如包含与由序列号2、4、6、8、10、12、14、16的任一个的碱 基序列所构成的DNA相对应的其他生物的内源性基因(人的上述基因的同源物等)。另外，与由序列号:2、4、6、8、10、12、14、16的任一个的碱基序列所构成的DNA相 对应的其他生物的内源性DNA —般来说与各个序列号2、4、6、8、10、12、14、16的任一个所 记载的DNA具有高的同源性。高同源性是指50%以上、优选70%以上、更优选80%以上、 进一步优选90%以上(例如95%以上、进一步为96%、97%、98%或99%以上)的同源 性。该同源性可以由 mBLAST 算法(Altschul et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8 ；KarIin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_7)来确定。另外， 该DNA在从生物体内分离时，在严格的条件下会与各个序列号2、4、6、8、10、12、14、16所记 载的DNA杂交。这里，“严格的条件”例如可举出“2XSSC、0. 1% SDS、50°C ”、“2XSSC、0. 1% SDS、42°C”、“1XSSC、0. 1% SDS、37°C ”，更严格的条件可举出 “2X SSC、0. 1% SDS、65°C”、 “0. 5XSSC、0. 1% SDS、42°C” 和 “0. 2XSSC、0. 1% SDS、65°C” 的条件。本领域技术人员通过使用N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的脱硫酸化作用或硫 酸化阻碍作用的活性测定方法，可以适当地从上述具有高同源性的蛋白质中获得与上述蛋 白质功能相同的蛋白质。
另外，本领域技术人员还可以根据上述基因的碱基序列来适当地获得其他生物的 相当于上述基因的内源性基因。另外，本说明书中，人以外的生物中相当于上述蛋白质和基 因的上述蛋白质和基因、或者与上述蛋白质和基因在功能上相同的上述蛋白质和基因有时 也仅以上述名称进行记载。本发明的上述蛋白质除了以天然的蛋白质的形式进行制备之外，还可以利用了基 因重组技术的重组蛋白质的形式来进行制备。天然的蛋白质例如可以通过对认为上述蛋白 质表达的细胞(组织)的提取液利用使用了针对上述蛋白质的抗体的亲和层析的方法来进 行制备。另一方面，重组蛋白质例如可以通过对利用编码上述蛋白质的DNA进行了转化的 细胞进行培养来制备。本发明的上述蛋白质例如优选用于后述的筛选方法。本发明的“核酸”是指RNA或DNA。另外，所谓PNA(肽核酸)等化学合成核酸类似 物也包括在本发明的核酸内。PNA是将作为核酸基本骨架结构的五单糖-磷酸骨架取代成 以甘氨酸为单元的聚酰胺骨架的物质，具有极其类似于核酸的3维结构。作为阻碍特定内源性基因的表达的方法，本领域技术人员熟知的是利用反义技术 的方法。作为反义核酸阻碍靶基因表达的作用，存在以下数个要因。即，通过形成三重链 来阻碍转录开始、通过与利用RNA聚合酶形成了局部开环结构的部位形成杂交体来阻碍转 录、通过与正处于合成过程的RNA形成杂交体来阻碍转录、通过形成内含子和外显子的接 合点处的杂交体来阻碍剪接、通过与剪接体形成部位形成杂交体来阻碍剪接、通过与mRNA 形成杂交体来阻碍从核向细胞质移动、通过与加帽部位或poly(A)添加部位形成杂交体来 阻碍剪接、通过与翻译起始因子结合部位形成杂交体来阻碍翻译开始、通过与起始密码子 附近的核糖体结合部位形成杂交体来阻碍翻译、通过与mRNA的翻译区域或多核糖体结合 部位形成杂交体来阻碍肽链的伸长、以及通过与核酸和蛋白质的相互作用部位形成杂交体 来阻碍基因表达等。这样，反义核酸通过阻碍转录、剪接或翻译等各种过程来阻碍靶基因的 表达(平島和井上，新生化学実験講座2核酸IV遗伝子O複製i発現，日本生化学会編，東 京化学同人，1993，319-347.)。本发明中使用的反义核酸还可以通过上述的任一个作用来阻碍编码上述任一种 硫酸基转移酶的基因的表达和/或功能。作为一个方式，认为当设计与编码上述硫酸基转移酶的基因的mRNA的5'端附近 的非翻译区域互补的反义序列时，对于阻碍基因的翻译是有效的。另外，还可以使用与密码 子区域或3'侧的非翻译区域互补的序列。这样，不仅含有编码上述硫酸基转移酶的基因的 翻译区域、而且还含有非翻译区域的序列的反义序列的核酸也包含在本发明中利用的反义 核酸内。所使用的反义核酸连接在适当的启动子的下游、优选在3'侧连接含有转录终止 信号的序列。如此制备的核酸可以通过使用公知的方法转化到所希望的动物(细胞)中。 反义核酸的序列优选是与编码转化的动物(细胞)所具有的内源性硫酸基转移酶的基因或 其一部分相互补的序列，但只要能够有效地抑制基因的表达，也可以不完全互补。被转录的 RNA相对于靶基因的转录产物优选具有90%以上、最优选具有95%以上的互补性。为了使 用反义核酸有效地阻碍靶基因的表达，优选反义核酸的长度至少为15个碱基以上且小于 25个碱基，但本发明的反义核酸并非必须限定于该长度，例如也可以是100个碱基以上或 500个碱基以上。本发明的反义核酸并无特别限定，例如可以基于C4ST-1 (GenBank的登录号NM_021439、序列号6)、C4ST_2 (GenBank 的登录号 NM_021528、序列号8)、C4ST_3 (GenBank 的登录号XM_355798、序列号10)等来制作。编码上述硫酸基转移酶的基因的表达的阻碍还可以利用核酶或编码核酶的DNA 来进行。核酶是指具有催化剂活性的RNA分子。核酶中存在具有多种活性的物质，其中通 过以作为剪切RNA的酶的核酶为焦点进行的研究，能够设计部位特异性地剪切RNA的核酶。 核酶中有如I型内含子型或Rnase P所含的MlRNA那样400个核苷酸以上大小的物质，也 有被称作锤头型或发夹型的具有40个核苷酸左右的活性结构域的物质(小泉誠和大塚栄 子，夕> 質核酸酵素，1990，35，2191.)。例如，锤头型核酶的自剪切结构域是剪切G13U14C15这一序列的C15的3'侧，但 对其活性而言U14和A9的碱基对形成是很重要的，还可以代替C15剪切A15或U15来获得 (Koizumi, Μ. et al.，FEBS Lett，1988，228，228.)。当设计底物结合部位与靶部位附近的 RNA序列相互补的核酶时，可以制作识别靶RNA中的序列UC、UU或UA的限制酶性RNA剪切 核酶(Koizumi，M. et al.，FEBS Lett，1988，239，285.、小泉誠和大塚栄子，夕》、°夂質核酸 酵素，1990，35，2191.、Koizumi，M. et al.，Nucl Acids Res，1989，17，7059.)。另外，发夹型核酶对于本发明的目的也有用。该核酶例如可在烟草环斑病毒的卫 星RNA的负链中发现(Buzayan, JM.，Nature, 1986，323，349.)。由发夹型核酶也可制作靶 特异性 RNA 剪切核酶(Kikuchi，Y. and Sasaki, N.，Nucl Acids Res, 1991，19,6751.、菊池 洋，化学i生物，1992,30,112.)。这样，通过使用核酶将编码上述硫酸基转移酶的基因的转 录产物特异性地剪切，可以阻碍该基因的表达。内源性基因的表达的抑制还可进一步通过使用了具有与靶基因序列相同或相近 序列的双链RNA的RNA干扰(RNA interference、以下简称为“RNAi” )来进行。由于近年的基因组计划的完成，在人类的全碱基序列被解读、数量众多的疾病相 关基因大量被确定的现在，正在大量进行以特定基因为靶标的治疗法、创新药物的开发。其 中，发挥特异性转录后抑制效果的small interfering RNA(siRNA，小干扰RNA)在基因治疗 中的应用备受关注。RNAi 是 1998 年由 Fire 等发现的现象(FireA，Nature (1998) 391, :806_811)，双 链RNA(d0Uble strand RNA)强烈地抑制相同靶基因的表达。由于与以往使用载体等的基 因导入法相比更为简单、对靶标的特异性更高、可用于基因治疗，因此最近备受关注。另外， 在哺乳类细胞中，通过使用短链dsRNA (siRNA)可以诱导RNAi，RNAi具有与敲除小鼠相比效 果更稳定、实验更容易、费用更便宜等多个优点。具有利用RNAi效应的阻碍作用的核酸一般也被称作siRNA或shRNA。RNAi是下 述的现象通过将由与靶基因的mRNA相同的序列构成的正义RNA和由与其互补的序列构成 的反义RNA所形成的短链双链RNA (以下简称作“dsRNA”)导入到细胞等中，从而特异性且 选择性地结合在靶基因mRNA上诱导破坏，将该靶基因剪切，由此高效地阻碍(抑制)靶基 因的表达。例如当将dsRNA导入至细胞内时，抑制了与其RNA相同序列的基因的表达(基 因抑制)。这样，RNAi由于能够抑制靶基因的表达，因此作为代替以往繁琐且低效的利用相 同重组的基因破坏方法的简单的基因敲除方法或者可应用于基因治疗的方法而备受关注。本发明中，RNAi所使用的RNA虽然没有必要与编码上述硫酸基转移酶的基因或该 基因的部分区域完全相同，但优选具有完全的同源性。另外，末端部还可以具有2个碱基左
在siRNA的设计中，作为靶标，只要是编码上述硫酸基转移酶的基因，则无特别限 定，可以将任意区域全部作为靶标候补。例如，可以基于C4ST-1基因的碱基序列(序列号6)、C4ST_2基因的碱基序列(序 列号8)、C4ST-3基因的碱基序列(序列号10)等来制作。更具体地说，可以将该序列的 一部分区域作为靶标候补，例如可以基于C4ST-1基因的碱基序列的一部分区域(序列号 20)、C4ST-2基因的碱基序列的一部分区域(序列号21)、C4ST-3基因的碱基序列的一部 分区域(序列号22)、C6ST-1基因的碱基序列的一部分区域(序列号23)、C6ST_2基因的 碱基序列的一部分区域(序列号24)等来制作。更具体地说，还可以举出以本说明书具体 示出的DNA序列(序列号25、26、35 50、55 65、82 88)为靶标的siRNA。为了将siRNA导入细胞，可以采用将体外合成的siRNA与质粒DNA连接以将其导 入细胞的方法、将双链RNA退火的方法等。另外，上述双链RNA分子也可以是一端封闭结构的分子、例如具有发夹结构的 siRNA(shRNA)。shRNA被称作短发夹RNA(short hairpin RNA)，由于一根链的一部分区域 与其它区域形成互补链，因此是具有茎环(stem-loop)结构的RNA分子。即，分子内可形成 双链RNA结构的分子也包含在本发明的siRNA中。另外，作为本发明的优选方式，能够利用RNAi效应抑制C4ST-1、C4ST-2、C4ST_3等 的表达的RNA(siRNA)、以本说明书具体示出的DNA序列(序列号25、26、35 50、55 65、 82 88)为靶标的siRNA中例如添加或缺失了 1个或少数RNA的结构的双链RNA，只要是 具有抑制编码上述硫酸基转移酶的基因的表达的功能，则都包含在本发明的siRNA中。用于RNAi (siRNA)RNA并不需要必须与编码上述蛋白质的基因或该基因的部分区 域完全同一(相同)，但优选具有完全的同一性(同源性)。RNAi机理的详细情况仍有不清楚的地方，但认为是被称作DICER的酶(Rnase III 核酸分解酶家族的一种)与双链RNA接触，双链RNA被分解为称作small interfering RNA 或siRNA的小片段。本发明的具有RNAi效应的双链RNA还包含如上所述被DICER分解前 的双链RNA。即，即便是原长且不具有RNAi效应的长链RNA，也可期待在细胞中分解为具有 RNAi效应的siRNA，因此本发明的双链RNA的长度并无特别限定。例如，可以预先用DICER将与编码上述硫酸基转移酶的基因的mRNA的全长或大致 全长的区域相对应的长链双链RNA分解，将其分解产物作为本发明的药剂利用。该分解产 物可以期待含有具有RNAi效应的双链RNA分子(siRNA)。根据该方法，可以不用特意选择 期待具有RNAi效应的mRNA上的区域。S卩，并不需要必须正确地规定具有RNAi效应的本发 明的上述基因的mRNA上的区域。本发明的上述“能够利用RNAi效应抑制的双链RNA”对于本领域技术人员而言，可 以基于编码成为该双链RNA的靶标的上述硫酸基转移酶的基因的碱基序列来适当制作。如 果举出一例的话，可以基于序列号25所记载的碱基序列来制作本发明的双链RNA。S卩，对 于本领域技术人员而言，在通常试行的范围内可以适当地基于序列号25所记载的碱基序 列来选择作为该序列转录产物的mRNA的任意连续的RNA区域以制作与该区域相对应的双 链RNA。另外，对于本领域技术人员而言，还可以通过公知的方法适当地从作为该序列转录 产物的mRNA序列中选择具有更强RNAi效应的siRNA序列。另外，只要清楚其中一条链，则
15本领域技术人员可容易地清楚另一条链(互补链)的碱基序列。SiRNA对于本领域技术人 员而言可以使用市售的核酸合成机来适当地制作。另外，对于所需RNA的合成，还可以利用 一般的合成委托服务。另外，本发明的SiRNA并不需要必须是针对靶序列的一组双链RNA，还可以是针 对含有靶序列的区域的多组双链RNA的混合物。这里，作为对应于靶序列的核酸混合物的 siRNA，本领域技术人员可以使用市售的核酸合成机和DICER酶来适当制作，另外，对于所 需RNA的合成，可以利用一般的合成委托服务。此外，本发明的siRNA包括所谓的“siRNA 鸡尾酒”。另外，本发明的siRNA并非全部的核苷酸都是核糖核苷酸(RNA)。即，本发明中，构 成siRNA的1个或多个核糖核苷酸也可以是对应的脱氧核糖核苷酸。该“对应”是指虽然 糖部分的结构不同，但是是相同的碱基种类(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶(尿嘧啶)。 例如，对应于具有腺嘌呤的核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸是指具有腺嘌呤的脱氧核糖核苷 酸。另外，上述“多个”并无特别限定，优选指2 5个左右的少数。进而，本发明的可表达上述RNA的DNA (载体)也包含在能够抑制编码本发明的 上述蛋白质的基因的表达的化合物的优选方式中。例如，本发明的可表达上述双链RNA的 DNA (载体)是具有编码该双链RNA的其中一个链的DNA和编码该双链RNA另一个链的DNA 按照能够分别表达的方式与启动子连接而成的结构的DNA。本发明的上述DNA对于本领域 技术人员而言可以利用一般的基因工程学技术来适当地制作。更具体地说，通过将编码本 发明RNA的DNA适当插入公知的各种表达载体中，可以制作本发明的表达载体。另外，本发明的表达阻碍物质中包括通过与编码上述硫酸基转移酶的基因的表达 调节区域(例如启动子区域)相结合来阻碍编码上述硫酸基转移酶的基因的表达的化合 物。该化合物例如可以通过使用编码上述硫酸基转移酶的基因的启动子DNA片断、以与该 DNA片断的结合活性为指标的筛选方法来获得。另外，对于本领域技术人员而言，还可以对 所希望的化合物利用公知的方法、例如报告基因分析法等来适当地判断是否阻碍了编码上 述硫酸基转移酶的基因的表达。另外，可表达本发明的上述RNA的DNA (载体)也包含在可阻碍编码本发明的上述 硫酸基转移酶的基因的表达的化合物的优选方式中。例如本发明的可表达上述双链RNA的 DNA (载体)是具有编码该双链RNA的其中一个链的DNA和编码该双链RNA另一个链的DNA 按照能够分别表达的方式与启动子连接而成的结构的DNA。本发明的上述DNA对于本领域 技术人员而言可以利用一般的基因工程学技术来适当地制作。更具体地说，通过将编码本 发明的RNA的DNA适当插入公知的各种表达载体中，可以制作本发明的表达载体。作为本发明的上述载体的优选方式，可以举出表达能够通过RNAi效应抑制 C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3 等的表达的 RNA (siRNA)的载体。本领域技术人员可以利用公知的方法来制备与上述硫酸基转移酶结合的抗体。如 果是多克隆抗体，例如可如下获得。使兔子等小动物免疫天然的上述蛋白质、或者作为与 GST的融合蛋白质而在微生物中有所表达的重组蛋白质或者其部分肽，获得血清。将其利用 例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换色谱、耦合了上述硫酸基转移酶或合成肽 的亲和层析柱等进行纯化，由此制备。另外，如果是单克隆抗体，例如可以如下制备使小鼠 等小动物免疫上述的硫酸基转移酶或其部分肽，从同一小鼠中取出脾脏将其磨碎，分离细胞，使用聚乙二醇等试剂使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从由此获得的融合细胞(杂交 瘤细胞)中选择产生与上述硫酸基转移酶结合的抗体的克隆。接着，将所得杂交瘤细胞移 植于小鼠腹腔内，从同一小鼠回收腹水，将所得单克隆抗体利用例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋 白G柱、DEAE离子交换色谱、耦合了上述硫酸基转移酶或合成肽的亲和层析柱等进行纯化， 由此制备。本发明的抗体只要是结合于本发明的上述硫酸基转移酶，则无特别限定，除了上 述多克隆抗体、单克隆抗体之外，还可以是人抗体、利用基因重组得到的人源化抗体及其抗 体片段或抗体修饰物。作为获得抗体的致敏抗原使用的本发明的蛋白质对于作为其来源的动物种类并 无特别限定，优选哺乳动物、例如小鼠或人来源的蛋白质，特别优选人来源的蛋白质。本领 域技术人员可以使用本说明书中公开的基因序列或氨基酸序列来适当获得人来源的蛋白 质。本发明中，作为致敏抗原使用的蛋白质可以是完整的蛋白质或者是蛋白质的部分 肽。作为蛋白质的部分肽，例如可举出蛋白质的氨基(N)末端片段或羧基(C)末端片断。本 说明书中的“抗体”是指与蛋白质的全长或片断发生反应的抗体。另外，除了使人以外的动物免疫抗原以获得上述杂交瘤细胞之外，例如还可以在 体外利用蛋白质、蛋白质表达细胞或其溶解物致敏人淋巴细胞、例如感染了 EB病毒的人淋 巴细胞，使致敏淋巴细胞与人来源的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266相融合， 从而获得产生具有与蛋白质的结合活性的所需的人抗体的杂交瘤。本发明的针对上述硫酸基转移酶的抗体通过与该蛋白质相结合，可期待阻碍该蛋 白质的表达或功能的效果。当以对人体投予所得抗体为目的(抗体治疗)来使用时，由于 会降低免疫原性，因此优选人抗体或人源化抗体。另外，本发明中作为可阻碍上述硫酸基转移酶的功能的物质还含有与上述硫酸基 转移酶结合的低分子量物质(低分子化合物)。该低分子量物质可以是天然或人工的化合 物。通常是本领域技术人员通过使用公知的方法可以制造或获得的化合物。此外，本发明 的化合物还可通过后述的筛选方法获得。另外，作为可阻碍本发明的上述硫酸基转移酶的表达或功能的物质，可以举出对 上述硫酸基转移酶具有显性失活性质的突变体(显性失活蛋白质)。对N-乙酰基半乳糖胺 的4位或6位的硫酸基转移酶具有显性失活性质的该蛋白质突变体是指具有下述功能的蛋 白质通过使编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因表达，使得内源 性的野生型蛋白质的活性消失或降低。作为本发明药剂的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂具有治疗或 预防纤维形成性疾病的效果。因此，作为本发明药剂的优选方式为纤维形成性疾病的治疗 用或预防用。这里，“治疗或预防”是指对呈现组织纤维形成的脏器、组织并非必须具有完全的 治疗效果或预防效果，也可以是具有部分效果的情况。本发明的组织纤维形成抑制剂具有通过阻碍作为纤维形成原因的N-乙酰基半乳 糖胺的4位或6位的硫酸化来抑制纤维形成的作用。因此，作为本发明的优选方式，例如提 供以本发明的组织纤维形成抑制剂为有效成分的组织纤维形成性疾病治疗剂或预防剂。
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另外，本发明的“组织纤维形成性疾病治疗剂”还可以表述为“组织纤维形成性疾 病改善剂”、“抗组织纤维形成剂”等。另外，本发明的药剂还可以表述为“药品”、“药品组合 物”、“治疗用药品”等。其中，本发明的“治疗”还包括可预先抑制纤维形成的发生的预防效果。另外，并 不限于对纤维形成性的脏器(组织)具有完全的治疗效果的情况，还可以是具有部分效果 的情况。本发明的药剂可以与生理学上允许的载体、赋形剂或稀释剂等混合，作为药品组 合物经口或非经口投予。作为经口制剂，可以制成颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶剂、乳剂或 悬浮剂等剂型。作为非经口制剂，可以选择注射剂、点滴剂、外用药剂、吸入剂(气雾剂)或 栓剂等剂型。注射剂可以示出皮下注射剂、肌肉注射剂、腹腔内注射剂、颅骨内投予注射剂、 或鼻腔内投予注射剂等。外用药剂可以示出经鼻投予剂或软膏剂等。按照含有作为主成分 的本发明药剂的方式制成上述剂型的制剂技术是公知的。例如，经口投予用的片剂可以通过在本发明的药剂中加入赋形剂、崩解剂、粘结剂 和润滑剂等并进行混合、压缩整形来制造。赋形剂一般使用乳糖、淀粉或甘露醇等。崩解剂 一般使用碳酸钙、羧甲基纤维素钙等。粘结剂使用阿拉伯胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷 酮。作为润滑剂，公知的有滑石、硬脂酸镁等。含有本发明药剂的片剂为了掩味或制成肠溶性制剂，可以实施公知的涂覆。涂覆
剂可以使用乙基纤维素或聚氧乙二醇等。另外，注射剂可以通过将作为主成分的本发明药剂与适当的分散剂一起溶解、使 其溶解或分散于分散介质中来获得。通过分散介质的选择，还可以制成水性溶剂或油性溶 剂的任一种剂型。制成水性溶剂时，以蒸馏水、生理盐水或林格氏液等为分散介质。制成油 性溶剂时，分散介质利用各种植物油或丙二醇等。此时，还可根据需要添加对羟基苯甲酸酯 等防腐剂。另外，注射剂中还可添加氯化钠或葡萄糖等公知的等渗剂。而且，还可添加苯扎 氯铵或盐酸普鲁卡因等无痛化剂。另外，通过将本发明的药剂制成固态、液态或半固态形状的组合物，可以制成外用 剂。对于固态或液态的组合物，可以通过制成与上述相同的组合物来制成外用剂。对于半 固态形状的组合物，可以在适当溶剂中根据需要添加增粘剂来制备。溶剂可以使用水、乙醇 或聚乙二醇等。增粘剂一般使用膨润土、聚乙烯醇、丙烯酸、甲基丙烯酸或聚乙烯吡咯烷酮 等。该组合物中可以添加苯扎氯铵等防腐剂。另外，通过组合可可脂等油性基材或纤维素 衍生物等水性凝胶基材作为载体，还可以制成栓剂。将本发明的药剂作为基因治疗剂使用时，除了通过注射直接投予本发明药剂的方 法之外，还可举出投予带有核酸的载体的方法。作为上述载体，可以举出腺病毒载体、腺伴 随病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等，通过使用这些 病毒载体，可以高效地进行投予。另外，还可将本发明的药剂导入脂质体等磷脂囊泡中并投予该囊泡。利用脂质体 转染法将保持有siRNA或shRNA的囊泡导入至规定细胞内。然后将所得细胞全身投予至例 如静脉内、动脉内等。还可以局部投予至纤维形成组织等。siRNA在体外显示非常优异的 特异性转录后抑制效果，但在体内由于血清中的核酸酶活性而被迅速地分解，因此持续时 间有所限制，因而需要开发更优化且有效的传递系统。作为其一例，Ochiya, T等的Nature
18Med.，5 :707-710，1999、Curr. Gene Ther.，1 :31_52，2001 报道了当作为生物亲和性材料的 去端肽胶原与核酸混合而形成复合体时，具有保护核酸免受生物体中分解酶分解的作用， 是作为siRNA的载体非常适用的载体，但本发明的药剂导入方法并不限定于此。本发明的药剂在安全的投予量范围内对包含人在内的哺乳动物投予必要量(有 效量)。本发明药剂的投予量可以考虑剂型的种类、投予方法、患者的年龄或体重、患者的 症状等，最终根据医生或兽医的判断来适当决定。如果举出一例的话，虽然根据年龄、性别、 症状、投予路径、投予次数、剂型的不同而不同，但在为腺病毒时的投予量为1天1次，每次 IO6 IO13个左右，以1周 8周的间隔投予。另外，为了将siRNA或shRNA导入至目标组织或器官内，可以使用市售的基因导入 试齐U盒(例如 AdenoExpress =Clontech 公司)。成为本发明药剂的治疗或预防对象的疾病只要是组织的纤维形成所引起的疾病， 则无特别限定，优选可举出心脏疾病、消化道疾病、肝脏疾病、肺疾病、肾脏疾病、脑神经疾 病、眼疾病、胰腺疾病等。作为本发明的“纤维形成所引起的疾病”的具体例子并无特别限定，可举出以皮 肤为代表的外皮和上皮组织中的弹性组织增生症、硬皮症、慢性腹膜炎、腹膜后纤维化等； 结缔组织等支持组织、肌肉中的多发性肌炎、皮肌炎、结节性多发动脉炎、软组织纤维症、慢 性类风湿性关节炎、手掌纤维瘤、腱炎、腱鞘炎、跟腱炎、足菌肿等；骨髓、心脏等血液组织、 脉管系统中的骨髓纤维症、脾功能亢进症、脉管炎、心律不齐、动脉硬化、阻塞性血栓性血管 炎、结节性纤维症、心绞痛、扩张性充血性心肌病、心衰竭、限制型心肌病、弥散性非梗阻性 心肌病、阻塞性心肌病、肺源性心脏病、二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、慢性心包炎、心内膜纤 维症、心内膜心肌纤维症等；肝脏等消化器官系统中的慢性胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠 炎、酒精性肝炎、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、威尔森氏病、肝硬化、病毒性肝炎、高雪氏病、 糖原贮积病、α抗胰蛋白酶缺乏、血色病、酪氨酸血症、果糖血症、半乳糖血症、Zellweger 氏症候群、先天性肝纤维症、门静脉高压症、肝肉芽肿症、布加氏综合征、原发性硬化性胆管 炎、脂肪肝、非酒精性肝炎、肝纤维症、先天性肝纤维症、酒精性肝硬化、病毒性肝硬化、寄生 虫性肝硬化、中毒性肝硬化、营养不良性肝硬化、充血性肝硬化、肝硬化症、夏科氏肝硬变、 托德氏肝硬变、继发性胆汁性肝硬化、单叶性肝硬变、由慢性非化脓性破坏性胆炎转移的肝 硬化、阻塞性肝硬化、细胆管炎性肝硬化、胆汁性肝硬化、萎缩性肝硬变、坏死后性肝硬化、 肝炎后肝硬化、结节性肝硬化、混合型肝硬变、小结节性肝硬化、代偿性肝硬化、非代偿性肝 硬化、大结节性肝硬化、中隔性肝硬化、隐源性肝硬化、门脉周围性肝硬化、门脉性肝硬化、 原发性胆汁性肝硬化等；肺等呼吸系统中的球孢子菌病、芽生菌病、过敏性支气管肺曲霉 病、肺出血肾炎综合征、成人呼吸窘迫综合征中的肺纤维症、慢性阻塞性肺病、肺不张、肺 炎、石末肺、石棉肺、过敏性肺炎、特发性肺纤维症、淋巴细胞性间质性肺炎、郎格汉斯细胞 肉芽肿症、囊性纤维症、脓疱性纤维症、肺纤维症、特发性肺纤维症、纤维化性肺泡炎、间质 性纤维症、弥漫性肺纤维症、慢性间质性肺炎、支气管扩张症、细支气管纤维症、支气管周纤 维症、胸膜纤维症等；肾脏等泌尿器官、生殖器官系统中的男性性腺功能降低症、肌强直性 营养不良、佩洛尼氏病等所导致的纤维症、慢性肾小管间质性肾炎、常染色体隐性囊肾、骨 髓瘤肾、肾盂积水、快速进行性肾小球肾炎、肾毒性疾病、黄色肉芽肿性肾盂肾炎、镰状细胞 肾病、肾性尿崩症、常染色体显性多囊性肾病、慢性肾小球性肾炎、IgA肾病、肾硬化症、局灶性肾小球硬化、膜性肾炎、膜增生性肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、肾淀粉样变性、多囊性肾 病、腹膜后纤维症、伴随狼疮肾炎等结缔组织病的肾病变、糖尿病性肾病、慢性前列腺炎、血 吸虫病所导致的膀胱炎；乳腺纤维症、乳腺纤维腺痛等；脊椎等神经系统中的先天性斜颈、 強直性脊柱炎、神经纤维瘤或脊髓损伤后的神经功能缺失等脊髓疾病、帕金森病或阿尔茨 海默病等脑神经疾病；眼球中的眼晶状体后纤维化症、增殖性视网膜病变等；以及在全身 产生病变的结节病、系统性红斑狼疮所导致的纤维症或全身性硬皮症、多发性肌炎、皮肌炎 等，但本发明的“纤维形成所引起的疾病”并不限定于这些，其也包括由于皮肤或脏器等各 生物组织中的纤维形成所产生的疾病。另外，本发明涉及以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度为指标的组织 纤维形成抑制剂的筛选方法(本说明书中有时记为“本发明的方法”)。作为本发明方法的优选方式，为包含选择阻碍构成糖链的N-乙酰基半乳糖胺的4 位或6位的硫酸化的化合物的工序的方法。通过本发明的筛选方法，可以有效地获得用于组织纤维形成抑制剂或纤维形成性 疾病治疗或预防剂的候补化合物。本发明的筛选方法的优选方式为包含以下(a) (C)的组织纤维形成抑制剂的筛 选方法。(a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖链与受试化合物接触的 工序；(b)测定N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度的工序；(c)选择与不接触受试化合物的情况相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。以下举出本发明的筛选方法的方式。其中，以下所记载的方式中，作为所使用的 N-乙酰基半乳糖胺、硫酸基转移酶、脱硫酸化酶等的来源，可举出人、小鼠、大鼠等来源，但 并不限定于这些。另外，作为以下所述方式所用的受试化合物，并无特别限定，例如可举出天然化合 物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物、以及化合物文库、基因文库的表达 产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物等。另外，本发明的方法中与受试化合物的“接触”通常通过将N-乙酰基半乳糖胺、硫 酸基转移酶或脱硫酸化酶与受试化合物相混合来进行，但并不限定于该方法。例如，通过使 表达这些蛋白质或其一部分的细胞与受试化合物接触，可以进行上述“接触”。另外，作为以下所述方式中的“细胞”的来源，可举出人、小鼠、大鼠等来源的细胞， 但并不特别限定为这些来源的细胞，还可利用按照表达在各个方式中所用的蛋白质的方式 进行了转化的大肠杆菌、酵母等微生物细胞。例如，作为“表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4 位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞”，可以利用表达内源性的编码N-乙酰基半乳糖胺 的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞；或导入外源性的编码N-乙酰基半乳糖胺的 4位或6位的硫酸基转移酶的基因、对该基因有所表达的细胞。对外源性的编码N-乙酰基 半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因有所表达的细胞通常可以通过将插入了编码 N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的表达载体导入宿主细胞来制作。 该表达载体可以利用一般的基因工程学技术来制作。另外，本领域技术人员可以利用公知的方法进行本发明方法中的硫酸化程度的测定。例如，使用与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位或其一部分硫酸化结构结合的经标记的 化合物或抗体等测定标记量，从而可以进行检测。另外，还可以使用色谱法或质谱分析法等 进行检测。本领域技术人员例如可以通过以下的公知方法来适当评价N-乙酰基半乳糖胺的 4位或6位的硫酸化程度。(1)利用使用了标记色素(1-9-二甲基亚甲基蓝)的定量色素结合的方法 (Nature. 1998 Feb 26 ；391 (6670) :908_11)(2)利用使用(32P) 3 ‘，5 ‘ -ABP的光亲和性标记的方法(Mandon, E. C.， Milla, Μ. E. ， Kempner, E. ， and Hirschberg, C. B. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10707-10711)(3)利用使用3' -(32P)-^methyleneb PAPS的光亲和性标记的方法(Ozeran， J. D. , Wesley, J. , and Schwarz, N. B. (1996)Biochemistry,35,3695-3703)(4)利用阴离子交换树脂(硫酸化糖蛋白质的分离法)的方法(Vol. 16， No. 2 (19860430) pp. 69-72、北里大学 ISSN 03855449)(5)利用阿尔新蓝的 sGAG 比色染色(Anal Biochem. 1998 Feb 15 ；256 (2) :229_37)另外，本领域技术人员可以通过上述方法等容易地评价任意的物质是否是本发明 的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂。作为本发明的筛选方法的其他方式，可以举出包含选择使N-乙酰基半乳糖胺的4 位或6位的硫酸基转移活性降低的物质(化合物)的工序的方法。本发明的上述方法例如由以下的工序构成。(a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶与受试化合物接触的工 序；(b)测定上述酶的硫酸基转移活性的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述活性降低的化合物的工序。上述方法中，首先使受试化合物与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移 酶接触。本方法中，接着测定上述酶的硫酸基转移活性。然后选择与未接触受试化合物的 情况(对照)相比使上述活性降低的化合物。使活性降低的化合物即成为纤维形成抑制剂 或用于纤维形成性疾病治疗的药剂。作为能够评价(测定)受试化合物是否具有上述硫酸基转移活性的方法，例如可 举出以下方法。在对促进N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的细胞、细胞株培养一定时 间的过程中混合各种受试化合物，利用例如检测4位硫酸化的抗体(克隆LY111，2H6)或 检测6位硫酸化的抗体(克隆MC21C，M0225，CS-56、均为生化学工业公司制)可以简单地 确认培养前后的硫酸化程度。还可以使用荧光标记抗体来比较培养前后的荧光数值，还可 以在培养前后进行使用2-B-6或3-B-3抗体的检测方法。抑制细胞培养后的硫酸化增加 (LY111或MC21C的荧光数值增加)的化合物或者促进细胞培养后的脱硫酸化进行(2-B-6 或3-B-3的荧光数值增加)的化合物作为本发明的方法中的目标候补化合物被选择。另外，还可以进一步选择性地利用公知的方法将例如C4ST-1或C6ST-1等硫酸基转移酶的基因导入至CHO细胞或L细胞等中来制作稳定表达的细胞株。通过使用这种稳定 地添加了硫酸基的细胞株，可以更加清楚地判定治疗候补化合物。本发明的其他优选方式为选择使本发明N-乙酰基半乳糖胺的硫酸基转移酶的基 因表达量降低的化合物的包含以下工序(a) (c)的组织纤维形成抑制剂的筛选方法。(a)使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的 基因的细胞接触的工序；(b)测定上述细胞中的基因表达量的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述基因表达量降低的化合物工序。上述方法中，首先使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫 酸基转移酶的基因的细胞接触。本方法中，接着测定编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因 的表达量。这里，“基因的表达”包括转录和翻译两者。本领域技术人员可以通过公知的方 法进行基因表达量的测定。例如，根据常规方法从表达上述任一种蛋白质的细胞中提取mRNA，实施以该mRNA 为模板的Northern杂交法、RT-PCR法、DNA阵列法等，从而可以测定该基因的转录量。另 外，从表达编码上述任一种蛋白质的基因的细胞中回收蛋白质级分，利用SDS-PAGE等电泳 法检测上述任一种蛋白质的表达，从而可进行基因翻译量的测定。进而，通过使用针对上述 任一种蛋白质的抗体实施western-blotting法来检测该蛋白质的表达，从而可测定基因 的翻译量。作为该蛋白质的检测中所使用的抗体，只要是能够检测的抗体，则无特别限定， 例如可以利用单克隆抗体或多克隆抗体这两者。本方法中，然后将该基因的表达量与未接触受试化合物的情况(对照)进行比较。本方法中，接着选择与未接触受试化合物的情况相比使上述基因的表达量降低 (抑制)的化合物。使其降低(抑制)的化合物即成为组织纤维形成抑制剂或用于纤维形 成性疾病治疗的候补化合物。另外，作为本发明筛选方法的一个方式，是以报告基因的表达量(水平)为指标来 选择使编码本发明的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的表达量(水 平)降低的化合物的方法。本发明的上述方法例如包含以下工序(a) (C)。(a)使受试化合物与含有下述DNA的细胞或细胞提取液接触的工序，所述DNA具有 编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因 功能性结合而成的结构；(b)测定上述报告基因的表达量(水平)的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述报告基因表达量(水平)降低的 化合物的工序。本方法中，首先使受试化合物与含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的 硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞或 细胞提取液接触。这里，“功能性结合”是指按照通过转录因子与编码N-乙酰基半乳糖胺的4位 或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域结合来诱导报告基因的表达的方式，使编码 N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因相结
22合。因此，即便是报告基因与其它基因结合而形成与其它基因产物的融合蛋白质，只要通过 转录因子与编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域 结合而诱导了该融合蛋白质的表达，则其也包含在上述“功能性结合”的意义中。本领域技 术人员可以通过公知的方法，根据编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的 基因的cDNA碱基序列来获得存在于基因组中的编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫 酸基转移酶的基因的转录调节区域。作为本方法中所使用的报告基因，只要是能够检测其表达，则无特别限定，例如可 举出CAT基因、IacZ基因、荧光素酶基因和GFP基因等。作为“含有具有编码N-乙酰基半 乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的 结构的DNA的细胞”，例如可举出导入了插入有这种结构的载体的细胞。本领域技术人员可 以通过公知的方法制作这种载体。载体向细胞内的导入可以通过一般的方法、例如磷酸钙 沉淀法、电脉冲穿孔法、脂质体转染法、微注射法等实施。“含有具有编码N-乙酰基半乳糖 胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构 的DNA的细胞”还包括在染色体中插入有该结构的细胞。DNA结构在染色体中的插入可以 利用本领域技术人员通常使用的方法、例如利用同源重组的基因导入法来进行。“含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录 调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞提取液”例如可举出在市售的试 管内转录翻译试剂盒中所含的细胞提取液中添加了具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或 6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA而得 到的细胞提取液。这里，“接触”可以通过在“含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸 基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞”的培养 液中添加受试化合物、或者在含有该DNA的上述市售的细胞提取液中添加受试化合物来进 行。受试化合物为蛋白质时，例如也可以通过将表达该蛋白质的DNA载体导入至该细胞中 来进行。本方法中，接着测定该报告基因的表达水平。本领域技术人员可以根据报告基因 的种类利用公知的方法来测定该报告基因的表达水平。例如，当报告基因为CAT基因时，通 过检测该基因产物导致的氯霉素的乙酰基化，可以测定报告基因的表达量。当报告基因为 IacZ基因时，通过检测该基因表达产物的催化作用所导致的色素化合物的显色，可以测定 报告基因的表达量；当报告基因为荧光素酶基因时，通过检测该基因表达产物的催化作用 所导致的荧光化合物的荧光，可以测定报告基因的表达量；当报告基因为GFP基因时，通过 检测GFP蛋白质所产生的荧光，可以测定报告基因的表达量。本方法中，接着将所测定的报告基因表达量(水平)与不存在受试化合物时测定 的情况(对照)进行比较。选择在上述报告基因与编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的 硫酸基转移酶的基因功能性结合时，与对照相比使上述报告基因的表达水平降低(抑制) 的化合物。使其降低(抑制)的化合物成即成为用于组织纤维形成抑制的药剂或用于纤维 形成性疾病治疗的候补化合物。本发明的筛选方法所发现的组织纤维形成抑制剂优选用于纤维形成性疾病的治 疗用或预防用。
另外，本发明提供用于治疗或预防纤维形成性疾病的药品组合物的制造方法。本 发明的上述制造方法例如包含以下的工序(a)和(b)。(a)利用上述组织纤维形成抑制剂的筛选方法从受试试样中选择组织纤维形成抑 制剂的工序；(b)将上述药剂和药学上可允许的载体进行混合的工序。本方法中，首先利用上述组织纤维形成抑制剂的筛选方法从受试试样中选择组织 纤维形成抑制剂。本方法中，接着将上述所选择的药剂和药学上可允许的载体混合。药学上可允许 的载体例如可使用上述的载体。另外，本发明提供用于实施本发明的筛选方法的含有各种药剂、试剂等的试剂盒。本发明的试剂盒例如可以对应着所实施的筛选方法从本发明的上述各种试剂中 适当选择。例如，本发明的试剂盒可以以本发明的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸 基转移酶作为构成要素。本发明的试剂盒中还可以进一步含有本发明的方法中所使用的各 种试剂、容器等。例如，可以适当含有抗体、探针、各种反应试剂、细胞、培养液、对照样品、缓 冲液、记载使用方法的说明书等。另外，本发明还提供包含向个体(例如患者等)投予本发明的药剂的工序的纤维 形成性疾病的治疗或预防方法。成为本发明的预防或治疗方法的对象的个体只要是可以罹患纤维形成性疾病的 生物，则无特别限定，优选为人。关于向个体的投予，一般来说本领域技术人员可通过公知的方法进行，例如动脉 内注射、静脉内注射、皮下注射等。投予量根据患者的体重或年龄、投予方法等变化，只要是 本领域技术人员(医生、兽医、药剂师等)，可适当选择适合的投予量。另外，本发明还涉及本发明的药剂在组织纤维形成抑制剂的制造中的用途。此外，本说明书中所引用的所有现有技术文献作为参照编入本说明书中。实施例以下，使用实施例进一步具体地说明本发明。但本发明的技术范围并不限定于这 些实施例。此外，本说明书中有时通过记载成为靶标的基因的DNA区域来表现SiRNA的结构 (序列)。对于本领域技术人员来说，根据作为靶序列记载的DNA序列的信息，可以容易地 识别由对应于该DNA序列的双链RNA构成的siRNA的结构。〔心脏组织〕实施例1 小鼠心肌病模型的靶糖链基因的SiRNA基因抑制效果的探讨和基因水 平的抗纤维形成效果的探讨在该实施例及以下的实施例中，使用作为小鼠心肌病模型标准化了的盐酸多 柔比星(D0X:协和发酵公司制)腹腔内投予模型。该小鼠模型虽然是传统的，但重现性 优异且简单，因此作为心肌病模型广泛用于病理阐明或新型治疗实验等中(Longhu Li， Circulation.2006 ；113 535-543>Xiaoming Yi,Am J Physiol Heart Circ Physiol 290 H1098-H1102，2006、Kang YJ, J Biol Chem. 2000 May 5 ;275 (18) 13690-8、Nozaki N, Circulation. 2004 ；110 :2869_2874、Fisher Pff, Circulation. 2005 ；111 :1601_1610)。
由于组织学上呈现心肌间质的纤维形成，因此是除了扩张型心肌病、限制型心 肌病、肥大型心肌病、致心律失常型右室心肌病(ARVC)之外，在急性心肌梗塞、稳定型心 绞痛、不稳定型心绞痛、心肌炎、瓣膜性心脏病、心律不齐、高血压症所续发的左心室重构 中也常见的现象，是成为基于上述疾病的慢性心衰竭的心肌功能障害的原因的病理现象 (Jugdutt Bi, Circulation. 108 1395-1403，2003)。首先制作小鼠模型，对C57BL6/J小鼠(雄性、8周龄、日本CLEA公司制)腹腔内投 予D0X(15mg/kg;协和发酵公司制)。投予后饲养1周，采集心脏组织。对照组使用同样的 小鼠但不投予D0X，使用同时期购买和饲养的小鼠。GalNAc 4S-6ST siRNA药剂在DOX投予的24小时之前，对每只小鼠腹腔内投予混 合有GalNac 4S-6ST siRNA 1 μ g(北海道System Science公司制)和作为介质的1 %去端 肽胶原(高研公司制)200 μ L的物质。以下示出本实施例所使用的GalNac 4S-6ST siRNA 药剂的碱基序列。序列并非仅限定于本例。[人 GalNac4-6STsiRNA] (GeneBank 登录号 NM_015892)(北海道 System Science 公司制)5，_ggagcagagcaagaugaauacaauc_ag_3，(Ιψ^]^ 25)3 ‘ -ua-ccucgucucguucuacuuauguuag-5 ‘ ( ·歹Ij 号26)对由心肌病模型小鼠摘出的脏器(心脏)每50mg加入RNA iso (Takara Bio 公司制)lmL，使用电动均质机(DIGITAL HOMOGENIZER、AS ONE公司制)将其粉碎后，加 入氯仿200 μ L(Sigma Aldrich Japan公司制)并稳定地混合后冰冷约5分钟，使用离 心分离机(Centrifuge 5417R、印pendorf公司制)在12，000rpm、4 °C下离心分离15分 钟。将离心分离后的上清液500 μ L移至另外的埃彭道夫管中，添加与上清液等量的异丙 醇500 μ L (Sigma Aldrich Japan公司制)并混合后，添加1 μ L的肝糖(Invitrogen公司 制)并冰冷15分钟。冰冷15分钟后，在12，000rpm、4°C下离心15分钟，之后用75%乙醇 1000 μ L (Sigma Aldrich Japan公司制)洗涤3次，将所得RNA沉淀物自然干燥30分钟 1小时后，溶解于大塚蒸馏水50yL(大塚制药公司制)中，然后用大塚蒸馏水(大塚制药 公司制)稀释100倍，在UV板(Corning Costar公司制)上利用读板器(POWER Wave XS、 BIO-TEK公司制)计算所提取的样品中的RNA浓度。接着，为了进行逆转录反应(cDNA合成)，进行以下工序。进行计算将所得RNA样 品调整为500ng/20 μ L的浓度，使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC制)在68°C下加热 3分钟，然后冰冷10分钟。冰冷后，添加80 μ L的预先制备的RT Pre Mix液(组成25mM MgCl2 18. 64 μ L(Invitrogen 公司制)、5 XBuffer 20 μ L (Invitrogen 公司制)、0· IM DTT 6.6 μ L(Invitrogen 公司制)、10mM dNTP mix 10 μ L(Invitrogen 公司制)、Rnase 抑制 剂2μ L(Invitrogen公司制)、MMLV逆向转录酶1. 2 μ L (Invitrogen公司制)、随机引物 2 μ L(Invitrogen公司制)、灭菌蒸馏水19. 56 μ L(大塚蒸馏水大塚制药公司制))，使用 BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC公司制)在42°C下加热反应1小时，1小时后使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC公司制)在99°C下加热5分钟后进行冰冷，制作所需要的cDNA 100 μ L，使用合成所得的cDNA，按以下组成进行定量PCR反应。对于定量PCR，使用SYBR premix试剂盒(Takara Bio公司制)和实时PCR基因扩增仪DICE (Takara Bio公司制)进 行。PCR反应的条件为95°C下10秒、95°C下5秒和60°C下30秒的40个循环，最后进行熔解曲线分析。以下示出定量PCR中所使用的引物的碱基序列。[定量PCR引物序列]* 小鼠 GalNac4S_6ST (Takara Bio 公司制)正向5，-GTGAGTTCTGCTGCGGTCCA-3‘(序列号27)反向5，-AGTCCATGCTGATGCCCAGAG-3，(序列号28)$ 小鼠前胶原 Type 1 alpha2 (Takara Bio 公司制)正向5，-ACCCGATGGCAACAATGGA-3，(序列号29)反向5，-ACCAGCAGGGCCTTGTTCAC-3，(序列号30)* 小鼠 α -SMA (Takara Bio 公司制)正向5，-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3，(序列号31)反向5，-ATGGAGCCACCGATCCACA-3‘(序列号32)g小鼠r核糖体18S(Takara Biο公司制)正向5，-TTCTGGCCAACGGTCTAGACAAC-3，(序列号33)反向5，-CCAGTGGTCTTGGTGTGCTGA-3‘(序列号34)如图2所示，对GalNac4S-6ST、I型胶原、α -SMA的基因表达进行研究的结果是， 在GalNac 4S-6ST siRNA治疗组中，与未治疗组相比，可见显著地(P < 0. 001、vs未治疗 组)抑制了 GalNac4S-6ST的表达。另外，作为心肌病病症很重要的纤维形成的指标，分别 研究α-SMA、I型胶原的基因表达，结果可确认GalNac 4S-6ST siRNA治疗组与未治疗组相 比，表达显著地降低(P <0. 001，vs未治疗组)。考察这些结果可知，伴随着GalNAc4S-6ST siRNA的靶标基因抑制效应，在基因表达水平上抑制了心肌的纤维形成的发展。本发明的药剂例如作为心肌纤维形成抑制剂是有用的。实施例2 小鼠心肌病模型中GalNAc4S_6ST siRNA的心肌肥大的抑制效果该实施例中，测定心肌病模型小鼠的心脏重量(mg)和体重(g)，计算作为心肌肥 大指标的心脏重量_体重比，对GalNAc4S-6ST (GalNac) siRNA心肌肥大抑制效果进行比较 研究。心肌肥大也是显示组织的纤维性变化的指标。图1表示对siRNA治疗组(η = 4)及未治疗组(η = 4)的心脏重量(mg) -体重 (g)比进行计算的结果。其结果是未治疗组的比值为6.376士0.484、^1 ^治疗组的值为 5. 442士0. 203。该结果可见，与未治疗组相比，siRNA治疗组中可见值显著减少(ρ < 0. 05 t检验)。这是表示GalNAc 4S-6ST siRNA具有抑制病态心肌肥大的效果的结果。本发明的药剂例如作为心肌肥大抑制剂(心肌肥大治疗剂)是有用的。实施例3 小鼠心肌病模型中GalNAc 4S-6ST siRNA的I型胶原沉积抑制效果的 探讨本实施例中，使用心肌病模型小鼠的心脏样品对GalNAc 4S-6ST siRNA的I型胶 原沉积(纤维形成的指标)的抑制效果进行比较研究。将从与实施例1相同的小鼠采集的 心脏的组织样品包埋于冷冻用包埋剂0CTC0MP0UND (Miles公司制)，利用低温恒温器(Carl Zeiss公司制)切薄片，用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)将所得切片固定10分钟 后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的抗I型胶原兔抗血清(兔多克隆抗体、 1 2000稀释；LSL公司制)，并在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标 记的山羊来源抗兔IgG(l 200稀释；cappel公司制)，并在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标 本。组织所见示于图3。对于未治疗组，在心肌纤维间可确认非常强的I型胶原的阳性 信号。与此相对，对于siRNA治疗组，I型胶原的阳性信号远远弱于未治疗组。考察以上的 I型胶原的免疫染色的结果时可知，GalNAc4S-6ST siRNA对于心肌组织中的I型胶原的过 剩沉积具有抑制效果。此结果与实施例1所示的定量PCR的结果相关联。本发明的药剂例如作为心肌组织的I型胶原沉积抑制剂是有用的。实施例4 小鼠心肌病樽型中GalNAc 4S-6ST siRNA的III型胶原沉积抑制效果 的探讨本实施例中，使用心肌病模型小鼠的心脏样品对GalNAc 4S-6ST siRNA的III型 胶原沉积(纤维形成的活性的指标)的抑制效果进行比较研究。将利用与实施例3相同的 方法获得的组织切片用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓 冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的抗III型胶原兔抗血清(兔多克隆抗体、1 2000稀 释；LSL公司制)，并在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记的山羊来源 抗兔IgG(l 200稀释；cappel公司制)，并在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添 加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标本。组织所见示于图4。对于未治疗组，在心肌纤维间可确认稍强的III型胶原的阳性 信号。与此相对，对于siRNA治疗组，III型胶原的阳性信号与对照组为相同程度。考察以 上的III型胶原的免疫染色的结果时可知，GalNAc 4S-6ST siRNA具有抑制心肌组织中的 III型胶原的沉积的效果、即对于活性的胶原的沉积也具有有效的抑制效果。本发明的药剂例如作为心肌组织的III型胶原沉积抑制剂是有用的。实施例5 小鼠心肌病樽型中GalNAc 4S-6ST siRNA的纤维芽细胞浸润抑制效果 的探讨本实施例中，通过DOX投予对GalNAc 4S-6ST siRNA对于浸润至心肌病模型小鼠 的心肌组织内的纤维芽细胞动态的药理效果进行探讨。将利用与实施例3相同的方法获得 的组织切片用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行 洗涤，然后添加作为一抗的抗小鼠纤维芽细胞抗体(ER-TR7 大鼠单克隆抗体、1 400稀 释；BMA Biomedicals公司制)，并在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标 记的山羊来源抗大鼠免疫球蛋白抗体(1 200稀释；Biosource公司制)，并在室温下反应 30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica 公司制)观察该标本。组织所见示于图5。照片为聚焦于心室间隔部分的照片。对于未治疗组，与对照组 相比可见大量纤维芽细胞的浸润。与此相对，对于siRNA治疗组而言，与未治疗组相比，减 小了纤维芽细胞的浸润程度。此结果表示GalNAc4S-6ST siRNA具有抑制心肌组织中的纤 维芽细胞的浸润的药理效果，此效果为抗纤维形成作用之一。本发明的药剂例如作为心肌组织的纤维芽细胞浸润抑制剂是有用的。〔消化道组织〕实施例6 小鼠肠道纤维形成模型的GalNAc4S_6ST的临床纤维形成抑制效果使C57BL/6J小鼠(雌性、6周龄、日本CLEA公司制)自由饮用含有3%葡聚糖硫
27酸钠(DSS ；和光公司制)的高氯水8天，从而制作结肠炎模型。该DSS诱发性结肠炎模型的 重现性优异，作为小鼠溃疡性结肠炎或称作克罗恩病的炎症性肠疾病的标准实验模型而广 泛使用，另外还是显示作为肠道狭窄的组织学特征的全层性炎症_纤维性变化以及肌肉层 肥厚的模型(Sasaki N, J Inflamm. 2005 2 :13、总说Pucilowska JB et al. Am J Physiol Gastroenterol Liver Physiol. 279 :G653_G659，2000)。因此，除了炎症性肠疾病之外，是 在呈现组织上的肠道狭窄的病态，即肠道白塞病(单纯性溃疡)、肠易激综合征、缺血性肠 炎、药源性肠炎、放射性肠炎、贲门失迟缓症、伴随硬皮病的食道狭窄、伴随SLE(系统性红 斑狼疮systemic lupuserythematosus)的肠道狭窄、先天性巨结肠、肠道摘除后的狭窄 (术后狭窄)、对消化道系统的癌(舌癌、上咽头癌、咽喉癌、食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、 直肠癌)进行内窥镜粘膜切除手术后的肠道狭窄、肠梗阻等疾病中广泛共通的组织学所 见。在给予3% DSS水的同时，将与实施例1相同的GalNAc 4S-6ST siRNA(l μ g/只) 混合在预先使用PBS稀释了 10倍的去端肽胶原(Koken公司制)中，对小鼠腹腔内注射 200 μ 1。将进行了此处置的小鼠组分为GalNAc 4S-6ST siRNA组、未混合GalNAc 4S-6ST siRNA而仅进行了去端肽胶原处置的组和对照组，一边使其饮用3% DSS水，一边记录7天 的体重和疾病的活性指数(DAI)评分(Kihara M, Gut. 200352 :713_9)。DAI的评价标准如 下所述。表 权利要求
一种组织纤维形成抑制剂，其以N 乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂为成分。
2.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于，对生物组织的纤维形成具有抑制效果。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于，所述抑制剂具有阻碍N-乙酰基半乳 糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶功能的活性。
4.根据权利要求3所述的药剂，其特征在于，所述抑制剂是抑制N-乙酰基半乳糖胺的 4位或6位的硫酸基转移酶基因的表达的siRNA。
5.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于，所述抑制剂是N-乙酰基半乳糖胺的 4位或6位的硫酸基的脱硫酸化酶。
6.根据权利要求1 5任一项所述的药剂，其用于治疗或预防纤维形成性疾病。
7.—种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含选择阻碍构成糖链的N-乙酰基半乳 糖胺的4位或6位的硫酸化的化合物的工序。
8.—种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (c)(a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖链与受试化合物接触的工序；(b)测定N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。
9.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (c)(a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶与受试化合物接触的工序；(b)测定所述酶的硫酸基转移活性的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使所述活性降低的化合物的工序。
10.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (c)(a)使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因 的细胞接触的工序；(b)测定所述细胞中的基因表达量的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使所述基因表达量降低的化合物的工序。
11.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a) (c)(a)使受试化合物与含有下述DNA的细胞或细胞提取液接触的工序，所述DNA具有编 码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功 能性结合而成的结构；(b)测定所述报告基因的表达量的工序；(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使所述报告基因的表达量降低的化合物的工序。
12.用于治疗或预防纤维形成性疾病的药品组合物的制造方法，其包含以下的工序 (a)和(b)(a)利用权利要求7 11任一项所述的方法从受试试样中选择组织纤维形成抑制剂的工序；(b)将所述药剂和药学上可允许的载体进行混合的工序。
全文摘要
本发明人深入研究的结果成功地首次发现通过阻碍作为构成糖链的糖之一的GalNAc的4位或6位的硫酸化，可以在生物水平上抑制组织的纤维形成。而且，本发明人通过利用各种疾病模型动物的研究，成功地证实了GalNAc的4位或6位的硫酸化抑制剂对组织的纤维形成所引起的疾病(组织纤维形成性疾病)具有治疗效果。
文档编号A61K45/00GK101965196SQ200880127570
公开日2011年2月2日 申请日期2008年12月26日 优先权日2007年12月27日
发明者小山纯, 米山博之, 藤井庄人 申请人:斯特里克再生医学学院,斯特里克学院事务所