专利名称：疟疾疫苗的制作方法
疟疾疫苗本发明涉及新颖的脂蛋白颗粒，制备和纯化它的方法，它在医学中(特别是预防 疟疾感染)中的用途，包含该该颗粒或针对该蛋白颗粒的抗体(例如单克隆或多克隆抗体) 的组合物/疫苗及其用途，特别是在治疗中的用途。疟疾是全球最主要的健康问题之一，每年有超过2至4百万人死于该疾病。该疾 病最流行的形式之一是由原生动物寄生虫间日疟原虫(P.vivax)引起的，后者可发现于热 带和亚热带地区。令人惊奇的是这种寄生虫能够在低于15摄氏度的温度下完成其蚊体内 生环，从而允许该疾病在温带气候中传播。该疾病最急性的形式之一是由原生动物寄生虫恶性疟原虫(P. falciparum)引起 的，大部分由疟疾导致的死亡均由其引起。疟原虫属(Plasmodium)的生命周期较为复杂，需要两个宿主(人和蚊子)来完 成。对人的感染起始于由被感染蚊子叮咬后孢子体进入血流。该孢子体迁移至肝脏并感染 肝细胞并在此分化，由红细胞外的胞内阶段进入裂殖子阶段，在该阶段感染红细胞(RBC)， 以启动无性血液阶段的周期性复制。该周期可通过RBC内一定量裂殖子分化成为有性阶 段配子母细胞，其被蚊子摄取，在中肠中经过一系列阶段的发育生成孢子体，其向唾液腺迁 移。由于间日疟原虫引起的疾病很少致死，有关疟疾防治的工作集中在由恶性疟原虫 引起的更为致命的疾病形式上。尽管由间日疟原虫引起的疾病通常不导致患者死亡，由于病案量的增加，对患者 的生活质量的显著影响，对导致贫血和死亡的逐渐增多的该疾病的严重发病率的报道以及 经济影响，仍然需要针对该疾病的有效疫苗。此外，能够同时对该疾病的两种原因提供保护 的单一疫苗将是有利的。间日疟原虫的一个特征在于一些菌株能够通过在出现在外周循环以表现临床症 状之前潜伏在肝脏中而引起迟发感染。因此，个体可在例如经过感染区域时被感染，并在数 月内仍不显示症状。可潜在导致疾病的传播，出于该种原因，经过感染区域的人员在经过该 感染区域后一定时间内不得献血以供输血。间日疟原虫疟疾感染在肝脏内保持潜伏，而该寄生虫经历了红细胞前裂体生殖。 如果该寄生虫在从肝脏脱离前的该阶段受到控制，则患者不会表现出该疾病的临床症状。疟原虫属的孢子体阶段已被确认为是疟疾疫苗的潜在靶标。以灭活(辐射) 孢子体进行疫苗接种已显示可带来对实验性人类疟疾的保护(Am.J，Trop. Med. Hyg 24: 297-402，1975)。然而，从时间上和逻辑上都还无法根据该方法采用辐射孢子体来制造针对 一般人群的疟疾疫苗。孢子体的主要表面蛋白已知为环子孢子蛋白(CS蛋白)。它被认为在其由蚊子注 入循环的初始部位(其在此迁移进入肝脏)的传代过程中涉及孢子体的运动和侵染。疟原虫种的CS蛋白的特征在于以非重复氨基(N-末端)和羧基(C-末端)片段 为侧翼的中央重复结构域(重复区)。间日疟原虫中央结构域由通常为九个串联氨基酸的 重复单元的多个嵌段组成。
在某些亚洲菌株中，在中央重复区之后，存在约12个氨基酸的额外序列。后者的 功能未知。然而，一些人假定所述氨基酸与该疾病的临床症状迟发有关，尽管这还未得到考 察。据认为N末端的特征在于已知为区域I的5个氨基酸的序列。还认为C末端的特征在 于包含已知为区域II的12个氨基酸的序列。后者包含了细胞吸附基序，其在所有疟疾CS 蛋白之间高度保守。WO 93/10152和WO 98/05355描述了来自恶性疟原虫的CS蛋白的疫苗，且在采 用所述方法制备针对恶性疟原虫的疫苗上取得了一些进展，还可参见H印pner等人2005， Vaccine 23，2243—50。在恶性疟原虫中的CS蛋白具有保守的中央重复区。与之不同，间日疟原虫的CS 蛋白已知具有至少两种形式(命名为VK210或I型以及VK247或II型)。这使鉴定具有所 有所需性能如免疫原性(提供对间日疟原虫与CS蛋白的特定类型无关的一般保护)的CS 蛋白的构建体变得更难，因为针对I型中央重复区的抗体不一定识别在II型相应区域的表 位，反之亦然。重组间日疟原虫CS蛋白在1980-1990年代被表达并作为疫苗进行测试，但取得了 有限的成功(Collins等人，1989. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40，455-64)。在采用交联的一个或 多个表位来开发基于多抗原肽(MAP)的疫苗方面已经开展了一些工作(Nardelli和Tam， 1995，Pharm. Biotechnol. 6，803-19)。本发明提供了用于疟疾疫苗的抗原性颗粒，其被认为生成至少体液应答，还可能 生成细胞免疫应答。该抗原还可诱导T辅助细胞，例如Thl和/或Th2细胞。相应地，本发明提供了包含如下单体的免疫原性蛋白颗粒a.包含来自间日疟原虫的CS蛋白和乙型肝炎的S抗原(CSV-S)的序列的融合蛋 白，和b.来自乙型肝炎病毒的S抗原，且其特征在于S与CSV-S的比例在0. 1至1的范围内。合适地，S与CSV-S的比例在0. 19至0. 30范围内，例如0. 2至0. 25范围内，例如 大约或基本为0. 24，或在0. 68至0. 80范围内，例如大约或基本为0. 73。b)部分的S抗原通常为未融合S抗原。
序列表
SEQ.ID.No.1杂合蛋白CSV的核苷藤!序列(针对大肠杆菌表达优化)
SEQ.ID.No.2杂合蛋白CSV的氨基藤!序列
SEQ.ID.No.3杂合蛋白CSV的核苷藤!序列(针对酵母表达优化)
SEQ.ID.No.4杂合融合蛋白CSV-S的核苷酸序列
SEQ.ID.No.5杂合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列
SEQ.IDNo.6&7针对RTS表达盒的核苷酸序列以及预测的RTS蛋白
SEQID.No.8CSV-S融合基因的核苷!睃序列(克隆进入PHIL-D2整合的巴斯德毕赤
酵母(Pichia pastoris)表达载体)SEQ ID. No. 9在巴斯德毕赤酵母中表达的CSV-S融合蛋白的氨基酸序列SEQ ID. No. IOS基因的核苷酸序列(克隆进入pPICZ_A整合的巴斯德毕赤酵母载 体)
SEQ ID. No. IlSEQ ID No 10 编码的氨基酸序列附1酵母游离型载体pRIT15546的质粒图谱。图2通过在所需抗原与来自乙型肝炎的S抗原“融合”中采用的GSK制备的质粒 PGF1-S2的质粒图谱。在SmaI位点(在切除12bp SmaI DNA片段之后)之间克隆异源性 DNA序列与S基因生成框内融合。图3pRIT15582的质粒图谱。以XhoI消化得到携带了 CSV-S表达盒以及LEU2选 择性标记的8. 5kb线性DNA片段，其被用于插入酵母染色体。图4用于整合CSV-S盒的线性XhoI片段的限制图谱。图5在菌株Y1835中表达的重组蛋白的Western印迹。A组以抗S抗体显示的WB样本载量(100 μ g总蛋白/微孔)1 :Y1631 (RTS, S生成菌株，作为比较)2 :Υ18353 :Υ18354 :Υ1834B组以抗-CSV抗体显示的WB样本载量(100 μ g总蛋白/微孔):1 :Y1631 (RTS, S生成菌株，作为比较)2 :Υ12953 :Υ18354 :Υ18345 :nr (另一构建体 CSVS)6 :nr (另一构建体-仅S抗原)图6在菌株Y1835中生成的CSV_S，S混合颗粒的电子显微照相CSV_S，S颗粒由可 溶性细胞提取物纯化(基于RTS，S纯化过程)并进行电子显微镜分析。颗粒在用磷钨酸负 染色后显示。该刻度等于lOOnm。图7CSV-特异性Ab应答(抗-CSV血清学(总Ig))图8HBs-特异性Ab应答图9CSV-特异性 Ab 应答(14pII)(Elisa 小鼠总 Ig 抗-CSV 14PII)图IOCSV-特异性 Ab 应答(14pIII)(Elisa 小鼠总 Ig 抗-CSV 14PIII)图IlHBs-特异性 Ab 应答(14pII)
图12HBs-特异性 Ab 应答(14pIII)图13CSV-特异性 Ab 应答(14pII)(Elisa 小鼠总 Ig 抗-CSV 14PII)图14CSV-特异性 Ab 应答(14pIII)(Elisa 小鼠总 Ig 抗-CSV 14PIII)
图15HBs-特异性 Ab 应答(14pII)图16HBs-特异性 Ab 应答(14pIII)图17显示用于计算S =CSVS比例的凝胶。S/CSVS比例0. 73 (Y1835CSV-S，S纯化 颗粒s/csv-s比例的确定)图18含CSV-S基因的pRIT15607质粒图谱。图19在菌株Y1840中表达的重组蛋白的Western印迹。以抗S抗体显示的WB。括号内为加载总蛋白量1 :GS115(巴斯德毕赤酵母宿主细胞)2 :Υ1840(100μ g)3 :Υ1840(50μ g)4 :Υ1840(25μ g)5 :Υ1840(12. 5μ g)6 :Υ1833 (100 μ g,表达 CSV-S 的 S. c.菌株)7 :Υ1833 (100 μ g,共表达 CSVS 和 S 的 S. c.菌株)图20pRIT15607的质粒图谱。图21在菌株Y1847中表达的重组蛋白的Western印迹。以抗-S抗体显示的WB。样本载量(20 μ g总蛋白/孔)1 :Υ18352 :Υ18403 :Υ1847图22由菌株Υ1847制备的无细胞提取物的氯化铯梯度图23菌株Υ1847中生成的由可溶性细胞提取物纯化的CSV_S，S颗粒并进行电子 显微镜分析的电子显微照相。颗粒在用磷钨酸负染色后显示。该刻度等于lOOnm。图24用于确定S与CSV-S比例的Y1847CSV-S，S纯化颗粒。S/CSVS比例0. 24。在测得的应答具有CSV特异性的图中，随后对CSV元件在每个实体中的应答进行 测量，其为融合蛋白CSV-S或是颗粒CSV-S，S。在本发明的一个实施方式中认为对每个CSV-S分子具有约7. 5S抗原分子，例如基 于每个组分的相对密度。出人意料的是，在小鼠中体内测试时本发明的颗粒似乎比相应地所谓简单颗粒至 少在某些方面更具抗原性。后者是病毒样颗粒，其主要由融合蛋白成分CSV-S组成，且不包 含任何未融合的S抗原。不希望受限于任何理论，据认为在包含根据本发明的CSV-S和未 融合S的混合颗粒中，该CSV-S成分以有利的方式排列或定向，以优化免疫应答。根据本发明的颗粒的进一步优点在于能够以更低的剂量使用这些颗粒，同时引发 与不包含未融合S抗原的简单CSV-S颗粒相同或相近的免疫应答水平。在某些宿主如酵母细胞中，该融合蛋白(包含S抗原)一旦表达便自发装配进入 由所述融合蛋白的多个单体构成的蛋白结构/颗粒中。当选定的受体酵母菌株已经在其基 因组中携带一个或多个乙型肝炎S表达盒的整合拷贝时，所装配的颗粒也可包含未融合S 抗原的单体。此外，具有特定比例的颗粒可通过采用酵母，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)如ATCC数据库中的DC5进行制备(登录号20820)，名称为RITDC5 cir(o). 保藏者Smith Kline-RIT)。有利的是，该种酵母适于商业化生产根据本发明的颗粒。此外，具有本文特定比例的颗粒可通过采用酵母，巴斯德毕赤酵母进行制备。有利 的是，该种酵母适于商业化生产根据本发明的颗粒。此外，可获得高产率的颗粒，特别是在 采用特定的启动子时。在巴斯德毕赤酵母中的产率高于相应DNA在酿酒酵母中表达的产 率。在一些情况下，该产率比采用酿酒酵母时获得的高10倍或更多。该酵母可在其基因组中包含1、2、3、4或5个(例如4个)CSV-S的拷贝。在一个方面，该酵母为重组酵母菌株Y1835。在一个方面，该酵母为重组酵母菌株Y1847。该比例在此表示平均值，例如基于在合适的凝胶中S抗原带和CSV-S带的密度的 计算(例如参见图17和24)。各种方法可被用于对酵母进行工程改造以制备所述颗粒，例如用于该融合蛋白的 表达盒可被插入已包含至少一个用于S抗原的表达盒的酵母的基因组。本领域技术人员能 为制备根据本发明的颗粒来制备合适的宿主。其它细节在下文中提供。不希望受限于理论，据认为用于从酵母细胞释放该颗粒的表面活性剂(例如 Tween如Tween 20或80)可以帮助该脂蛋白颗粒的稳定化。CSV-S在本发明中采用的融合蛋白CSV-S包含来自间日疟原虫的CS蛋白(CSV)的部 分。该CSV抗原可以是例如在间日疟原虫的I型CS蛋白和/或间日疟原虫的II型蛋白中 发现的天然蛋白。替代性地，该CSV蛋白可以是包含来自所述I型和II型CS蛋白的元件 的杂合蛋白或嵌合蛋白。当后者被融合至S抗原时，其在此被称为杂合融合蛋白。CSV-S在此用作一般术语，其涵盖包含来自间日疟原虫的CS蛋白的序列/片段和 来自乙型肝炎的S抗原的序列/片段的融合蛋白。具有I型CS蛋白的间日疟原虫比具有II型CS蛋白的间日疟原虫更为普遍。因 此，在本发明的一个方面采用来自I型的CS蛋白。在一个替代性的方面，本发明提供包含 来自I型的重复单元和来自II型的重复单元的杂合蛋白，例如其中该杂合蛋白中包含的来 自I型的重复单元多于来自II型的重复单元。该杂合/嵌合蛋白通常包含至少一个来自间日疟原虫的I型环子孢子蛋白的中央重复区的重复单元，和至少一个来自间日疟原虫的II型环子孢子蛋白的中央重复区的重复单元。可用于本发明的间日疟原虫的任何合适菌株包括拉丁、美洲(即Sal LBelem)、 韩国、中国、泰国、印度尼西亚、印度和越南的菌株。SEQ ID No2中的构建体基于韩国菌株 (更具体而言为南韩菌株)。据相信来自乙型肝炎的表面抗原的存在加强了该CS蛋白部分的免疫原性，有助 于该蛋白的稳定性和/或可复制性。在一个实施方式中，该杂合融合蛋白(CSV-S)具有SEQ ID No. 5中所示的氨基酸 序列。在该序列中，氨基酸6-262来自CSV，269-494来自S。剩余的氨基酸通过遗传构建引入 (具体而言，其可适当变化)。四个氨基酸Met、Met、Ala、Pr0特别地来自于质粒pGFl_S2 (参 见图4)。
SEQ ID No 5蛋白的核苷酸序列在SEQ ID No 4中给出。在一个实施方式中，根据本发明的颗粒提供为包含抗氧化剂的液体制剂，该抗氧 化剂为例如包含硫醇官能团的抗氧化剂，例如单硫代甘油、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、谷 胱甘肽或其混合物。该液体制剂可以一个或两个剂量提供，从而与合适的佐剂复原。该制 剂可在例如玻璃小瓶(如3mL玻璃小瓶，视情况而定)中提供。在一个方面该小瓶为安瓿。 在替代性的或附加的方面，从该制剂中排除氧。在一个实施方式中，根据本发明的颗粒提供为任选地与合适的抗氧化剂联合/组 合的冻干形式，该抗氧化剂为例如包含硫醇官能团的抗氧化剂，例如单硫代甘油、N-乙酰半 胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽或其混合物。在替代性的方面，本发明的杂合融合蛋白包含了来自突变体S蛋白的部分，例如 参见公布的美国申请2006/194196中的(还公布为WO 2004/113369)描述。该文献描述了 突变体标记的HDB05。具体而言，它在图1和6中描述了突变体和野生型蛋白的比较，并在 图4和5中描述了突变体的基因。其中的序列12-22特别描述了该突变体S蛋白的多肽。 上述每一篇文献在此弓I入作为参考。该CSV-S融合蛋白可通过例如质粒PGF1-S2进行制备(进一步的细节参见图2和 实施例)，当对应于CSV的合适序列被插入SmaI克隆位点时可在合适的条件下生成该融合 蛋白CSV-S。载体PRIT15546为携带CSV-S表达盒的酵母游离型表达载体(基于2 μ载体)。 重组表达可通过来自酵母TDH3基因(组成性表达)的启动子驱动。PRIT15546载体的构建 在下文中具体描述。pRIT15546 载体的构建。构建具有用于酵母表达的合适密码子的CSV合成基因，并亚克隆进入pUC57载体 (GenBank/EMBL登录号Y14837)。所得的质粒pUC57/CSV和酵母表达载体pGfl_S2均以合 适的酶限制。载体PGf 1-S2可通过多步骤克隆过程构建(在GSK)。已经携带S表达盒的该 种载体允许构建融合基因，其在N末端与乙型肝炎病毒的S基因框内融合。在序列验证后， 最终的表达载体被命名为pRIT15546(图8)。在一个实施方式中，编码本发明的蛋白的DNA序列侧翼有转录控制元件，例如来 自于酵母基因并进入表达载体。酿酒酵母用于本发明的杂合蛋白的表达盒可以，例如，被构建为包含如下特征 启动子序列，其来自于，例如，酿酒酵母TDH3基因。 编码合适融合蛋白的序列。 包含在该序列内的转录终止序列，其来自例如酿酒酵母ARG3基因。合适的启动子的范例为来自于酿酒酵母TDH3的启动子(Musti等人)。合适的质粒可用于将编码该杂合融合蛋白的序列插入合适的宿主以供合成。合适 质粒的范例为携带合适表达盒的？1 1115546(基于2 4载体)，进一步的细节参见图1和实 施例。该质粒通常包含内置标记物以协助选择，例如编码抗生素抗性或LEU2或HIS营养 缺陷型的基因。
如上文讨论，具有编码CSV-S的盒和至少一个编码来自乙型肝炎的S抗原的盒的 酿酒酵母可用于提供根据本发明的颗粒。通常该宿主具有针对该颗粒中每个融合蛋白的表达盒，还具有整合在其基因组中 的S抗原的一个或多个表达盒。在一个实施方式中，该酵母具有1、2、3、4、5或6个(例如4或5个)整合的S抗原。因此，本发明还涉及包含多聚核苷酸(例如编码根据本发明的颗粒的两个或更多 个成分的DNA)的宿主。本发明涉及包含编码CSV-S的盒和至少一个编码S抗原的盒的酿酒酵母。本文所用的核苷酸序列或其部分(例如编码CS/杂合蛋白部分，但任选地不编码 蛋白S的部分)可针对在宿主(例如酵母)中的表达进行密码子优化。本发明还涉及酿酒酵母(特别是Y1835)在制备根据本发明的颗粒中的用途。本发明进一步的方面提供了制备本发明的颗粒的方法，该方法包括在酿酒酵母 (例如重组酵母Y1835)中表达编码该蛋白的DNA序列，并任选地进一步回收该产物。本发明还涉及可从编码CSV-S (特别是本文所述的杂合融合蛋白)的DNA以及编 码来自乙型肝炎的S抗原的DNA在酵母(例如酿酒酵母)中的表达方法获得的产物。巴斯德毕赤酵母用于本发明的杂合蛋白的表达盒可以，例如，被构建为包含如下特征 启动子序列，其来自于，例如，巴斯德毕赤酵母AOXl基因。
编码合适融合蛋白的序列。 包含在该序列内的转录终止序列，其来自于例如巴斯德毕赤酵母AOXl基因调 节元件。合适的启动子的范例为来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因的启动子。AOX启动子是极 强的和严格调节的启动子，其通常提供重组蛋白的高产率。当该启动子被用于制备本发明 的颗粒时，通常可获得比酿酒酵母中高10倍的产率。可用于巴斯德毕赤酵母的替代性启动子为GAP启动子。合适的质粒可用于将编码该杂合融合蛋白的序列插入合适的宿主以供合成。合适 质粒的范例为用于携带合适表达盒的PRIT15546 (基于2 μ的载体)。该质粒通常包含内置标记物以协助选择，例如编码抗生素抗性或LEU2或HIS营养 缺陷型的基因。如上文讨论，具有编码CSV-S的盒和至少一个编码来自乙型肝炎的S抗原的盒的 巴斯德毕赤酵母可用于提供根据本发明的颗粒。通常该宿主具有针对该颗粒中每个融合蛋白的表达盒，还具有整合在其基因组中 的S抗原的一个或多个表达盒。在一个实施方式中，该酵母具有1、2、3、4、5或6个(例如4或5个)整合的S抗原。本发明还涉及包含多聚核苷酸(例如编码根据本发明的颗粒的两个或更多个成 分的DNA)的宿主。本发明涉及包含编码CSV-S的盒和至少一个编码S抗原的盒的巴斯德毕赤酵母。
本文所用的核苷酸序列或其部分(例如编码CS/杂合蛋白部分，但任选地不编码 蛋白S的部分)可针对在宿主(例如酵母)中的表达进行密码子优化。本发明还涉及巴斯德毕赤酵母(特别是Y1847)在制备根据本发明的颗粒中的用 途。本发明进一步的方面提供了制备本发明的颗粒的方法，该方法包括在巴斯德毕赤 酵母(例如重组酵母Y1847)中表达编码该蛋白的DNA序列，并回收该产物。本发明还涉及根据本发明的颗粒的纯化方法，其包括沉淀步骤、离子交换和凝胶 渗透层析以及氯化铯超速离心。本发明还涉及包含根据本发明的蛋白颗粒的组合物或疫苗，其用于与其它活性成 分联用，特别地用于治疗或预防疟疾，例如与该活性成分混合。本发明还涉及用于疫苗的组合物或成分，其包含本文所述的颗粒，还涉及包含根 据本发明的蛋白颗粒以及合适的赋形剂的疫苗。本文所用的疫苗的成分涉及包含本发明的颗粒的实体以及至少一种适于包含在 疫苗中的赋形剂。疫苗的成分中通常不包含佐剂成分。在本说明书上下文中的疫苗涉及包含颗粒和稳定剂、赋形剂和所有佐剂成分的制 剂，其中该制剂适于向人体注射。制剂在本说明书的上下文中，赋形剂指药物制剂中本身不具有治疗效果的成分。稀释 剂或液体载体落入赋形剂的定义。佐剂也落入赋形剂的定义，因为尽管佐剂能够刺激免疫 应答，当治疗成分缺失时该免疫应答是非特异性的。在本说明书上下文中的免疫原性意在表示引发针对疟疾成分或S抗原成分的特 异性免疫应答的能力。该应答可以，例如是在该脂蛋白颗粒以合适剂量和合适制剂(可包 含/需要合适的佐剂)施用时得到。可能需要包含与原始剂量相当或更低的剂量加强剂量 以获得所需免疫原性应答。根据本发明的组合物/药物制剂还可在混合物中包含一种或多种其它抗原，例如 来自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的抗原，例如其中所述抗原选自DBP，例如DBP的受体结 合结构域 Pv RII、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMA 1 和RBP或其片段。来自恶性疟原虫的抗原的其它范例包括PfEMP-1、Pfs 16抗原、MSP-1、MSP-3、 LSA-I、LSA-3、AMA-I和TRAP。其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳 合蛋白、Pf332、STARP, SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230 和其它 疟原虫属中的类似物。根据本发明的组合物/药物制剂还可包括与本发明的颗粒混合的RTS，S颗粒(如 WO 93/10152 所述)。在本发明的疫苗中，可直接采用该颗粒的水溶液。替代性地，事先冻干或未经事先 冻干的该颗粒可与任意已知佐剂混合或被其吸收。佐剂在一个实施方式中，该佐剂为Toll样受体(TLR)4配体，例如激动剂，例如脂质A 衍生物，特别是单磷酰脂质A，更特别的是3-脱酰化单磷酰脂质A (3D-MPL)。
由美国专利4，912，094和英国专利申请2，220，211 (Ribi)已知3_脱酰化单磷酰 脂质A，其可从美国Montana的Ribi Immunochem获得，并由Corixa公司以商标MPL 进行销售。3D-MPL主要促进对IFN-g(Thl)表型的⑶4+T细胞应答。它可参照GB 2 220 211A中披露的方法生产。它从化学上为3-脱酰化单磷酰脂质A与3、4、5或6酰化链的混 合物。在本发明的组合物中可以适当地采用细小颗粒3D-MPL。细小颗粒3D-MPL具有可通 过0.22 μ m过滤器进行无菌过滤的粒径。该种制备描述于WO 94/21292。已知脂质A的合 成衍生物，其被认为是TLR 4激动剂。可用于本发明的制剂的另一免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。Quil A是一 种从南美树种Quilaja Saponaria Molina中分离的皂甙制备物，并由Dalsgaard等人 在 1974 年首次描述为具有佐剂活性(“saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung,Vol. 44, Springer Verlag，Berlin，p243_254)。通过 HPLC 分离了 Quil A 的纯化片段，其保留了佐剂活性，而不具有与Quil A有关的毒性(EP O 362 278)，例如QS7 和 QS21 (也被称为 QA7 和 QA21)。QS-21 是一种来自的 Quillaja saponaria Molina 树皮 的天然皂甙，其诱导⑶8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Thl细胞和主要的IgG2a抗体应答。QS21的特定制剂已被描述，其进一步包含留醇(W0 96/33739)。QS21 留醇的 比例通常为重量比1 100至1 1。通常存在过量的甾醇，QS21 甾醇的比例至少为 1 2w/w。通常在人用疫苗中存在的QS21和甾醇在每剂量约Iyg至约IOOyg范围内，例 如约10 μ g至约50 μ g。脂质体通常包含中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其通常在室温下为非晶体，例如卵黄 磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱或二月桂基磷脂酰胆碱。脂质体还可包含带电脂质，其 在QS21存在时可提高由饱和脂质构成的脂质体的脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情 况下，带电脂质的量通常为1-20% w/w，例如5-10%。甾醇与磷脂的比例为1-50% (mol/ mol)，例如 20-25%。皂甙可以微团、混合微团(通常，但不限于，胆盐)或者可以ISCOM基质形式(EP 0 109 942 Bi)、脂质体或相关胶体结构例如蠕虫状或环状多聚体复合物或油脂/分层结构以 及与胆固醇和脂质配制形成的薄片、或以水包油乳液(例如在WO 95/17210)的形式分离。在一个方面，佐剂包含3D-MPL。在一个方面，佐剂包含QS21。在一个方面，佐剂包含CpG。在一个方面，该佐剂配制为水包油乳液。在一个方面，该佐剂配制为脂质体。佐剂组合包括3D-MPL和QS21(EP 0 671 948 Bi)，水包油乳液包含3D-MPL和 QS21(W0 95/17210, WO 98/56414)，在脂质体制剂中 3D-MPL 与其它载体(EP 0 689 454 Bi)或者3D-MPL和QS21配制。其它合适的佐剂系统包括US 6558670和US 6544518中所 述的3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合。本发明的一个实施方式提供 药物组合物，例如作为整体组合物或作为单独剂量如在相同容器中的一个或两 个剂量，或者 疫苗组合物，
其包含本文定义的颗粒，且其中该疫苗组合物进一步包含佐剂。一方面，本发明提 供了组合物，其包含 本发明的颗粒，例如其数量相当于每剂量10-100 μ g， 碱金属盐，例如氯化钠，其在每剂量I-IOmg范围内， 磷脂如D0PC，例如其数量相当于每剂量100-100 μ g的范围，以及 任选地胆固醇，例如其数量相当于每剂量10-250 μ g的范围。在一个方面，该组合物进一步包含抗氧化剂，例如具有硫醇官能团的抗氧化剂，如 单硫代甘油、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽或其混合物。在一个方面，每个剂量或双剂量(bidose)被冻干。疫苗的单剂量可在500 μ L液体中被提供至患者。疫苗可需要在使用前用注射用 水补充至终体积。贞齐New Trends and Developments in Vaccines, Voller ^A 编辑，University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. , 19780 在脂质体中胶囊化描 述于，例如，Fullerton的美国专利4，235，877。数量存在于每个疫苗剂量中的本发明的蛋白颗粒的量被选择为诱导合适的免疫应答 或免疫保护应答而没有明显的通常疫苗中的副作用的量。该量将取决于所用的具体免疫 原和该疫苗是否使用佐剂而变化。通常预期每个剂量包含1-1000 μ g，例如1-200 μ g，如 10-100 μ g的蛋白。特定疫苗的最佳量可通过标准研究确定，该研究包括观察抗体效价和对 象中的其它应答。在最初的接种后，对象可在约4周内接受加强剂量，然后为例如在感染风 险存在的情况下每六至十二个月接受重复的加强剂量。对本发明颗粒的免疫应答被认为可 通过采用佐剂或免疫刺激剂得到增强。3D-MPL的用量通常较小，但根据疫苗制剂可在每剂量1_1000 μ g范围内，例如为 每剂量1-500μ g，如介于每剂量1-100μ g之间，特别是每剂量10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85 或90μ g。在本发明的佐剂或疫苗中的CpG或免疫刺激寡核苷酸的量通常较小，但根据疫苗 制剂可在每剂量1-1000 μ g范围内，例如为每剂量1-500 μ g。在本发明的佐剂中使用的皂甙的量可在每剂量I-IOOOyg范围内，特别是每剂量 1-500 μ g,例如每剂量1-250 μ g,且例如在每剂量1-100 μ g范围内，特别是每剂量10、15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 或 90μ g。本发明的制剂可用于预防和/或治疗目的，特别是用于预防目的。因此，本发明提 供了在药物中使用，例如，用于治疗和/或预防疟疾(包括严重疟疾)的本文提供的疫苗组 合物。本发明的另一方面在于通过使用有效量的前述药物组合物或疫苗来治疗疟原虫 属感染的易感患者的方法。在本说明书的上下文中包含应理解为包括。包含特定元素的本发明的方面也意在延伸至由该相关元素组成或主要由其组成 的单独实施方式。本说明书的背景部分提供的目的在于介绍本发明的背景。它不应视为承认相关信息为已知或者相关信息构成公知常识。下文的实施例用于说明制备本发明颗粒的方法。该实施例可以构成或不构成本发 明的方面。
实施例实施例1菌株Y1834的描述酵母重组菌株Y1834可用于表达该融合蛋白。它由用重组表达载体PRIT15546转 化的酿酒酵母宿主菌株DC5组成。DC5是具有如下基因型的实验室酵母菌株(ATCC No 20820) :leu2_3、leu2_112、 his3、canl-11。该双leu_2突变允许选择携带功能LEU-2基因拷贝的pRIT15546载体的 摄取和维持。仅有那些携带了具有LEU-2基因的载体的细胞才能在培养基缺失亮氨酸时生长。载体pRIT15546为携带表达盒的酵母游离型表达载体(基于2 μ的载体)。重组 表达可通过来自酵母TDH3基因(组成性表达)的启动子驱动。PRIT15546载体的构建在下 文中具体描述。pRIT15546 载体的构建。构建具有用于酵母表达的合适密码子的合成基因，并亚克隆进入pUC57载体。所 得的质粒PUC57/CSV和酵母表达载体pGf 1-S2均以合适的酶限制。载体pGf 1-S2可通 过多步骤克隆过程构建(在GSK)。已经携带S表达盒的该种载体允许构建融合基因，其 在N末端与乙型肝炎病毒的S基因框内融合。在序列验证后，最终的表达载体被命名为 pRIT15546(图 1)。菌株DC5的转化。该Ieu-和his-营养缺陷型DC5菌株可采用酵母标准方法以重组质粒pRIT15546 转化。将转化的细胞涂布在琼脂选择性平板上。选择一种转化体，其正式代号为Y1834。重组蛋白的表达在30°C下 Y1834 在添加了 8μ g/ml 组氨酸的 YNB (可从 Kracker Scientific Inc 获得的酵母氮基)基本培养基中生长至O.D. (620nm)为0.5。然后收获细胞，制备细胞提取 物。提取物制备将细胞重新悬浮于破碎缓冲液中，并机械破碎(玻璃珠)。将提取物在5000rpm下 离心15分钟。上清液部分在SDS-PAGE 4-20%上进行电泳。破碎缓冲液50mM磷酸钠缓冲液(PH -J. 5)4mM EDTATween-200. 5%+蛋白酶抑制剂混合物(完全/ROCHE)细胞浓度IOOml培养物(0D 0. 5)在5ml破碎缓冲液中=100D单位/ml的浓度。粗制提取物的澄清将提取物在5000rpm下离心15分钟重组蛋白的检测
澄清提取物进行SDS-PAGE 4_20%电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素薄膜，并进行免 疫染色。Western 印迹分析试剂=小鼠单克隆抗体抗-S(由GSK Biologicals制备)_(稀释1/500)已有市售的抗-S抗体可以取代本方法中采用的那些。替代性地，可采用抗-CSV 抗体，例如可由NIH获得的已知为MR4的抗体。实施例2 菌株Y1835的描述酵母重组菌株Y1835同时表达CSV-S融合蛋白和S抗原。为了获得共表达CSV-S 和S蛋白的菌株，已经携带了 S表达盒的五种整合拷贝的酿酒酵母菌株Y1295可用重组整 合表达载体PRIT15582转化(图3)。菌株Y1295通过多步骤转化法在GSK构建。Y1295菌株的构建描述于WO 93/10152。菌株Y1295具有如下基因型leu2-3、leu2-112、gall。leu_2突变允许选择携 带了该CSV-S表达盒和该功能LEU2基因的pRIT15582-衍生线性DNA片段的摄取。载体PRIT15582为携带CSV-S表达盒的酵母整合表达载体(基于Ty的载体)。重 组表达可通过来自酵母TDH3基因(组成性表达)的启动子驱动。PRIT15582载体的构建在 下文中具体描述。pRIT15582整合载体的构建。用于构建pRIT15582载体的起始原料为表达质粒pRIT15546 (图1)。该质粒的构 建描述于实施例1中。用HindIII核酸内切酶消化pRIT 15546释放3706bp长的DNA片段， 该DNA片段对应于完整CSV-S表达盒(pTDH3+CSV-S+tARG3)。该HindIII DNA片段(在添 加T4DNA聚合酶后)在基于Ty的整合载体pRIT13144的独特SalI克隆位点上(Sail限制 /T4处理)被插入。所得的质粒PRIT15582除了表达盒外包含作为选择性标记的酵母LEU2 基因(图3)。用XhoI核酸内切酶消化pRIT15582释放图4所示的8500bp线性片段，其可 通过游离端与固有Ty元件(resident Ty elements)的同源重组整合进入酵母基因组。菌株Y1295的转化。为获得表达S和CSV-S蛋白的菌株，用选择Leu+菌株的8500bp线性XhoI片段 (图4)转化菌株Y1295。可获得多组两种表达盒以不同比例存在于基因组的整合体。选择 一种携带四个CSV-S盒拷贝的转化体并给予正式代号Y1835。重组蛋白的表达在30°C下Y1835于YNB (可从Kracker Scientific Inc获得的酵母氮基)基本培 养基中生长至O.D. (620nm)约为0.5 (0.8)。然后收获细胞，制备细胞提取物。通过免疫印记分析表达产物提取物制备将细胞重新悬浮于破碎缓冲液中，并机械破碎(玻璃珠)。将提取物在5000rpm下 离心5-10分钟。上清液部分在SDS-PAGE 12. 5%上进行电泳。破碎缓冲液50mM磷酸钠缓冲液(PH -J. 5)4mM EDTATween-200. 5%
+蛋白酶抑制剂混合物(完全/ROCHE)细胞浓度:100ml培养物(0D 0. 5)在2. 5ml破碎缓冲液中=200D单位/ml的浓度。粗制提取物的澄清将提取物在5000rpm下离心5_10分钟重组蛋白的检测澄清提取物进行SDS-PAGE 12. 5%电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素薄膜，并进行免 疫染色。Western 印迹分析(图 5)试剂1/小鼠单克隆抗体抗-S(由GSK Biologicals制备)_(稀释1/250)2/兔多克隆抗体抗-CSV(由WRAIR提供)_稀释1/20,000。已有市售的抗-S抗体以及抗间日疟原虫/CSP抗体可以取代本方法中采用的那些 抗体。实施例3 评估了如下抗原1. CSV-S，S 在酿酒酵母中制备的混合颗粒，且由融合至来自乙型肝炎病毒的S抗 原的CSV构建体(CSV-S)组成(即，指向了重复区中多态性并包含了 CSV蛋白的N-和C-末 端部分的杂交CSV分子，此外，它包含已知的T和B表位)。此外，在这些颗粒中具有游离S 抗原。2. CSV-S 由上述CSV-S构建体唯一组成的简单颗粒。这些疫苗候选物的免疫原性在ASOlB中复原并在小鼠中评估。实验按下文具体描 述进行。小鼠以如下物质注射 在0天、14天和28天注射简单颗粒(CSV-S)和包含QS21和MPL的脂质体佐剂 制剂，或者 在0天、14天和28天注射混合颗粒(CSV-S，S)和包含QS21和MPL的脂质体佐 剂制剂。所测试的实体的剂量如下
权利要求
包含如下单体的免疫原性蛋白颗粒a.包含来自间日疟原虫的CS蛋白和乙型肝炎的S抗原的序列的融合蛋白(CSV S)，和b.来自乙型肝炎病毒的S抗原，且特征在于S与CSV S的比例在0.1至1的范围内。
2.如权利要求1所述的颗粒，其中S与CSVS-S的比例在0.19-0. 30范围内。
3.如权利要求2所述的颗粒，其中该比例在0.2-0. 25范围内。
4.如权利要求1-3任意一项所述的颗粒，其中该比例约为0.24。
5.如权利要求1所述的颗粒，其中S与CSV-S的比例在0.68-0. 80范围内。
6.如权利要求1或权利要求5所述的颗粒，其中该比例约为0.73。
7.如前述任意一项权利要求所述的颗粒，其中该乙型肝炎抗原源自adw血清型。
8.如前述任意一项权利要求所述的颗粒，其中该CSV-S成分具有SeqIDNo 5中所示 的序列。
9.如权利要求1-8任意一项所述的颗粒，其中该颗粒在巴斯德毕赤酵母中制备。
10.如权利要求1-8任意一项所述的颗粒，其中该颗粒在酿酒酵母中制备。
11.如权利要求1-10任意一项所述的颗粒，其中该颗粒具有免疫原性。
12.包含如权利要求1-11任意一项所述的颗粒和赋形剂的药物组合物。
13.如权利要求12所述的组合物，其中该赋形剂为佐剂。
14.如权利要求13所述的组合物，其中该佐剂包含皂甙。
15.如权利要求14所述的组合物，其中该皂甙为QS21。
16.如权利要求13-15所述的组合物，其中该佐剂包含3D-MPL。
17.如权利要求16所述的组合物，其中该3D-MPL作为小颗粒MPL存在。
18.如权利要求13-17所述的组合物，其中该佐剂为脂质体制剂。
19.如权利要求13-17所述的组合物，其中该佐剂为水包油乳液。
20.如权利要求12-19任意一项所述的组合物，其包含 每剂量10-100 μ g的如权利要求1-11任意一项定义的颗粒， 每剂量I-IOmg的碱金属盐，例如氯化钠， 每剂量100-1000 μ g的磷脂如D0PC，以及 任选地每剂量10-250 μ g的胆固醇。
21.如权利要求12-20任意一项所述的组合物，其进一步在混合物中包含一种或多种 来自恶性疟原虫和/或间日疟原虫的其它抗原。
22.如权利要求21所述的组合物，其中混合物中的该其它抗原为RTS，S。
23.如权利要求12-22任意一项所述的组合物，其中该组合物为肠胃外使用的疫苗。
24.用于治疗的如权利要求1-11任意一项所定义的颗粒或如权利要求12-23任意一项 所定义的组合物。
25.如权利要求1-11任意一项所定义的颗粒或如权利要求12-23任意一项所定义的组 合物在制造用于治疗或预防疟疾的药物中的用途。
26.治疗易患疟原虫感染的患者的方法，其包括施用有效量的如权利要求1-11任意一 项所定义的蛋白或如权利要求12-23任意一项所定义的组合物，特别是作为疫苗施用。
27.编码针对CSV-S的DNA序列和至少一个编码S抗原的DNA序列的巴斯德毕赤酵母2宿主。
28.编码针对CSV-S的DNA序列和至少一个编码S抗原的DNA序列的酿酒酵母宿主。
29.如权利要求27或权利要求28所述的宿主在制备如权利要求1-11任意一项所定义 的颗粒中的用途。
30.生产如权利要求1-11任意一项所定义的颗粒的方法，该方法包括在巴斯德毕赤酵 母或酿酒酵母中表达编码所述蛋白的核苷酸序列并回收产物。
31.如权利要求30所述的方法，其中该酵母为重组菌株Y1847。
32.如权利要求30所述的方法，其中该酵母为重组菌株Y1835。
33.如权利要求30-32任意一项所述的方法，其中通过以合适的包含表面活性剂的组 合物处理来溶解该宿主细胞，从而回收产物。
34.如权利要求33所述的方法，其中该表面活性剂选自=Tween(例如Tween 20和/或80)。
35.可通过权利要求30-34任意一项所述的方法获得的产物。
全文摘要
本发明涉及新颖的蛋白颗粒，制备和纯化它的方法，它在医学中(特别是预防疟疾感染)中的用途，包含该颗粒或针对该蛋白颗粒的抗体(例如单克隆或多克隆抗体)的组合物/疫苗及其用途，特别是在治疗中的用途。此外，具有特定比例的颗粒可通过采用酿酒酵母或菌者巴斯德毕赤酵母菌进行制备。具体而言，它涉及包含如下单体的免疫原性蛋白颗粒a.包含来自间日疟原虫的CS蛋白和乙型肝炎的S抗原(CSV-S)的序列的融合蛋白，和b.来自乙型肝炎病毒的S抗原，且其特征在于S与CSV-S的比例在0.1-1的范围内。合适地，S与CSV-S的比例在0.19-0.30范围内或0.68-0.80范围内。
文档编号A61K39/015GK101951947SQ200880127550
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月24日
发明者J·D·科亨, M·马尚 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司