专利名称：改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途的制作方法
改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途相关信息本申请要求2007年12月27日递交的美国临时申请号61/009，361的优选权。本 说明书通篇引述的任何专利、专利申请和参考文献的内容在此全文并入作为参考。
背景技术：
能够与期望的靶表位特异性结合的分子作为治疗剂和医学诊断工具均具有极大 意义。此类分子的实例是单克隆抗体。对于几乎任何结构表位，都可以选择出特异性地并 以高亲和力与之结合的抗体。所以，抗体常规地用作为研究工具和FDA批准的治疗剂，从而 治疗性和诊断性单克隆抗体的全球市场目前价值约$300亿。然而，单克隆抗体具有许多缺点。例如，经典抗体是大而复杂的分子。它们具有杂 四聚体结构，含有通过分子间二硫键和分子内二硫键连接在一起的两条轻链和两条重链。 这种结构复杂性使得不能容易地表达抗体或多特异性抗体，例如含有对两个不同分子治疗 靶标的结合特异性的分子。大分子抗体也限制了其治疗效力，因为它们往往不能够有效穿 透某些组织间隙。另外，治疗性抗体因为拥有Fc区，偶尔会触发不期望的效应子细胞功能 和/或凝血级联反应。从而本领域需要能够以高亲和力和特异性与期望靶标特异性结合的可选结合分 子。发明概述本发明通过提供基于纤连蛋白的结合分子以及将供体CDR引入到基于纤连蛋白 的结合支架尤其是FN3中的方法，而解决了前述问题。本发明基于纤连蛋白的结合分子可 以进一步工程化或缀合其他部分例如PEG、Fe、HSA、抗HSA，以提高半衰期和稳定性。本发 明还提供了筛选与靶抗原结合的此类分子以及制备和纯化候选结合剂的方法。此外，本发 明首次证实，Fn3基结合分子可以成功地体内表达，尤其是在哺乳动物细胞，例如大鼠、小 鼠、仓鼠、人细胞或源于其的细胞系中表达。再者，本发明证实，工程化或缀合其它部分例如 PEG、Fc、HSA、抗HSA的Fn3基结合分子也可以成功地在哺乳动物细胞中表达并显示出增加 该分子的半衰期的期望生理学效应。从而本发明具有多个优点，包括但不限于如下-提供了基于纤连蛋白的结合分子，例如修饰的基于纤连蛋白的结合分子，所述结 合分子由于分子小而且没有免疫原性而适于作为治疗剂；-提供了基于纤连蛋白的结合分子，所述结合分子具有延长的半衰期；-提供了基于纤连蛋白的结合分子，同时还提供了用于与期望的功能部分例如阻 断部分、可检测部分、诊断部分或治疗部分相连的位点；和-以基于纤连蛋白的结合分子处理有需要的受试者用于诊断或治疗的方法。一方面，本发明提供了基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，包含至少两个 Fn3i3链结构域序列以及连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其中环区序列 包含与特异性靶标结合的非Fn3结合序列(即外源结合序列)。一般与野生型III型纤连 蛋白(Fn3)分子(SEQ ID NO!)相比，所述结合分子还包含至少一个修饰的氨基酸残基用于连接功能部分。在特别的实施方案中，在基于Fn3的结合分子中该非Fn3结合序列包含互补决定 区(CDR)的全部或部分，例如抗体、特别是单链抗体、单域抗体或驼类(camelid)纳米抗体 的⑶R。⑶R可选自⑶R1、⑶R2、⑶R3区及其组合。可选择此类非Fn3结合序列以结合各种 靶标，包括但不限于细胞受体、细胞受体配体、生长因子、白介素、细菌或病毒。基于Fn3的结合分子内的该修饰氨基酸残基可包括，例如，添加和/或将至少一个 Fn3氨基酸残基取代为至少一个半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基。在一个实施方案中， 半胱氨酸或非天然氨基酸残基位于环区、β链区、β样链、C-末端区域、位于C-末端和最 C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、和/或N-末端和最N-末端的β链或β样链 之间。在特别的实施方案中，修饰的氨基酸残基包括一个或多个如下残基的取代Ser 17、 Ser 21、Ser 43、Ser 60、Ser 89、Val 11、Leu 19、Thr 58 和 Thr 71。另一方面，本发明提 供了缀合物，其包括与非Fn3多肽相连的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中基于 Fn3的结合分子包含至少两个Fn3i3链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间 的环区序列，其中环区序列结合特定的靶标。在另一实施方案中，环区包含与特定靶标结合 的外源结合序列。一般而言，非Fn3多肽能够结合第二靶标，和/或增加基于Fn3的结合分子在体内 给药时的稳定性(即，半衰期)。适宜的非Fn3多肽包括但不限于抗体Fc区、人血清白蛋 白(HSA)(或其部分)和/或与HSA结合的多肽、或其他具有增加的半衰期的血清蛋白质例 如转铁蛋白。非Fn3部分增加缀合物的半衰期，使得缀合物的半衰期大于未缀合的Fn3基结合 分子的半衰期。缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少2-5小时、 5-10 小时、10-15 小时、15-20 小时、20-25 小时、25-30 小时、35-40 小时、45-50 小时、50-55 小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、85-90小时、90-95小 时、95-100 小时、100-150 小时、150-200 小时、200-250 小时、250-300 小时、350-400 小 时、400-450 小时、450-500 小时、500-550 小时、550-600 小时、600-650 小时、650-700 小 时、700-750 小时、750-800 小时、800-850 小时、850-900 小时、900-950 小时、950-1000 小 时、1000-1050 小时、1050-1100 小时、1100-1150 小时、1150-1200 小时、1200-1250 小时、 1250-1300 小时、1300-1350 小时、1350-1400 小时、1400-1450 小时、1450-1500 小时。缀合 物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30 倍、35 倍、40 倍、45 倍、50 倍、55 倍、60 倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。一个实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子融合的抗体Fc区。该缀合物的 半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大至少5-30倍，且该缀合物的体内半衰期为至少9. 4 小时。另一实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子连接的血清白蛋白或转铁蛋白、或 其部分。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大至少20-25倍，且该缀合物的 体内半衰期为至少19. 6小时。另一实施方案中，非Fn3部分是与Fn3基结合分子连接的抗 血清白蛋白或抗转铁蛋白、或其部分。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的大 至少10-35倍，且该缀合物的体内半衰期为至少7. 7小时。另一实施方案中，非Fn3部分是
8与Fn3基结合分子连接的聚乙二醇(PEG)。该缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子 的大至少5-25倍，且该缀合物的体内半衰期为至少3. 6小时。一个实施方案中，非Fn3部分包含融合在Fn3基结合分子的N末端区或C末端区的 抗体Fc区。抗体Fc区也可以在选自如下的区域与Fn3基结合分子融合环区、β链区、β 样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、和/或N-末 端和最N-末端的β链或β样链之间。Fc缀合物的体内半衰期增加至少大约9. 4小时。另一实施方案中，非Fn3部分包含血清白蛋白(SA)，例如人血清白蛋白(HSA)、或 其部分、或结合SA的多肽，例如抗HSA。SA缀合物的体内半衰期为至少大约19.6小时，而 抗SA缀合物的体内半衰期为至少大约7. 7小时。再一实施方案中，非Fn3部分包含聚乙二醇(PEG)。PEG部分可以结合至巯基基团 或胺基团。PEG部分可以通过定点PEG化连接到Fn3基结合分子上，例如Cys残基或非天 然氨基酸残基上。PEG部分可以连接在Fn3基结合分子中的选自如下的区域上环区、β 链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、和 N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。PEG部分具有大约2kDa至大约IOOkDa之间 的分子量。PEG缀合物的体内半衰期增加至少大约3. 6小时。另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物 包含与结合抗体Fc区的多肽连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基 结合分子包含至少两个Fn3 β链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区 序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少9. 4小时的血清半衰期。另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物 包含与血清白蛋白(SA)部分连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基 结合分子包含至少两个Fn3 β链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区 序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少19. 6小时的血清半衰期。另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物 包含与结合血清白蛋白(SA)部分的多肽连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子， 其中Fn3基结合分子包含至少两个Fn3i3链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列 之间的环区序列，其中缀合物结合特定的靶标，具有至少7. 7小时的血清半衰期。另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物 包含与PEG部分连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子包 含至少两个Fn3i3链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其中 缀合物结合特定的靶标，具有至少3. 6小时的血清半衰期。另一实施方案中，本发明涉及具有改善的药代动力学性质的缀合物，所述缀合物 包含与抗FcRn部分连接的、基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子，其中Fn3基结合分子 包含至少两个Fn3i3链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其 中缀合物在酸性PH以高亲和性而在中性ρΗ以低亲和性结合新生儿FcR受体(FcRn)。酸性 PH可以为大约1至大约7，中性ρΗ可以为大约7.0至大约8.0。一个实施方案中，酸性ρΗ 为大约PH 6. 0，中性ρΗ为大约ρΗ 7. 4。Fn3基结合分子或缀合物可以具有源自至少两个相同或不同纤连蛋白组件的Fn3 结构域，其中所述纤连蛋白组件来自IFn至17-Fn组件之任一，并可以以任何组合方式组合，例如，10Fn3-10Fn3 ； 10Fn3-9Fn3，10Fn3-8Fn3，9Fn3_8Fn3。缀合物，例如 wFnS-wFnS-HSA 或 抗-HSA 或 Fc 或 PEG ； 10Fn3-9Fn3-HSA 或抗 HSA 或 Fc 或 PEG ； 10Fn3-8Fn3-HSA 或抗-HSA 或 Fc 或PEG ；9Fn3-8Fn3-HSA或抗-HSA或Fc或PEG，也考虑落入本发明范围。Fn3基结合分子或缀合物可以具有源自至少三个或三个以上相同或不同纤连 蛋白组件的Fn3结构域，例如，10Fn3-10Fn3-10Fn3 (-10Fn3)n,其中η是2-10中任意个数 的1QFn3结构域；1QFn3-9Fn3-8Fn3 (-Fn3)n,其中η是2_10中任意个数的Fn3结构域； 9Fn3-8Fn3-7Fn3(-Fn3)n，其中η是2_10中任意个数的Fn3结构域。这些分子的缀合物也在 本发明范围内。本发明还涉及包含编码Fn3基结合分子或缀合物的序列的核酸、包含与启动子可 操作连接的该核酸的表达载体、包含该核酸的细胞、和通过在细胞中，尤其是在体内细胞 中，表达包含编码Fn基结合分子或缀合物的序列的核酸，生产结合靶标的Fn3基结合分子 或缀合物的方法。在一个特定实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠、人 细胞或源自其的细胞系。本发明基于Fn3的结合分子可以基于(例如人)野生型Fn3序列，以及该序列的 修饰形式，如本文所讨论的那样。例如，基于Fn3的结合分子可以是嵌合体，其具有来自至 少两个不同纤连蛋白组件的Fn3 β链。可能的嵌合体的实例示于图6。本发明还提供了组合物，包含本发明基于Fn3的结合分子和缀合物，用适宜的载 体配制。本发明基于Fn3的结合分子和缀合物可用在多种治疗和诊断应用中，包括但不限 于任何可以使用抗体的应用。例如，此类应用包括治疗和诊断疾病或病症，包括但不限于， 自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢疾病、肌 肉骨骼疾病、神经变性疾病、精神性疾病、眼科疾病和移植物排斥。本发明的其他特征和优点将会因如下详细说明和权利要求书而变得显而易见。发明详述为了确保清楚地理解说明书和权利要求书，下文便利地提供了如下定义。定义如本文所用，术语“III型纤连蛋白结构域”或“Fn3结构域”是指，来自任何生 物体的野生型Fn3结构域、以及从两种或两种以上不同的Fn3结构域的β链构建的嵌合 Fn3结构域。本领域已知，天然Fn3结构域具有β夹心结构，该结构由7个称作A、B、C、 D、Ε、F和G的β链组成，其中这7个β链通过称作AB、BC、⑶、DE、EF和TO环的6个环 连接(见例如，Bork 和 Doolittle，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89 :8990，1992 ；Bork 等， Nature Biotech. 15 553,1997 ；Meinke 等，J. Bacteriol. 175 1910,1993 ；Watanabe 等， J. Biol. Chem. 265 :15659，1990 ；Main 等，1992 ；Leahy 等，1992 ；Dickinson 等，1994 ；美国专 利6，673，901 ；专利协作条约公布W0/03104418 ；以及美国专利申请2007/0082365，上述文 献的所有教导特此并入此处作为参考)。三个环(BC、DE和re环)位于结构域的顶部，而 三个环(AB、CD和EF环)位于结构域的底部(见
图1)。在一个特定实施方案中，Fn3结构 域来自人纤连蛋白的第10个Fn3结构域(10Fn3) (SEQ IDNO 1)。本文中，术语“Fn3基结合分子”或“基于III型纤连蛋白的结合分子”是指已经经 过改变而包含了一个或多个非Fn3结合序列的Fn3结构域。
术语“非Fn3结合序列”是指不存在于天然(例如，野生型)Fn3结构域中的氨基酸 序列，其与特定靶标结合。非Fn3结合序列典型地可以通过修饰野生型Fn3结构域(例如， 通过替代和/或添加)而引入。这可以例如通过随机突变或预先确定的突变野生型Fn3结 构域中的氨基酸残基来实现。此外或者备选地，非Fn3结合序列可以是部分地或者完全地 外源的，即，源自不同遗传或氨基酸来源。例如，该外源序列可以源自对于已知靶抗原具有 已知结合特异性的抗体的高变区，例如一个或多个CDR区。该CDR可以来自单抗体链(例 如，轻链或重链的可变区)或来自不同抗体链的组合。CDR还可以来自两种不同抗体(例 如，具有不同特异性)。在一个特定实施方案中，CDR来自纳米抗体，例如，驼样重链。术语“互补决定区(⑶R)”是指来自抗体可变结构域或T细胞受体的高变环。⑶R 在抗体可变区中的定位已有精确定义(参见Kabat，Ε. A.等Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242，1991，和 Chothia，C.等，J. Mol. Biol. 196 :901_917，1987，其并 入本文作为参考)。术语“单域抗体”是指任何天然存在的单可变结构域抗体或相应的工程化结合片 段，包括如 Domantis (Domantis/GSK (Cambridge, UK)所述(see, e. g. ，Ward et al. ，1989， Nature 341(6242) 484-5 ；W004058820)的人结构域抗体、或如下文所定义的驼类纳米抗体。术语“单链抗体”是指由(例如利用重组方法)通过合成接头连接在一起的轻链 可变区抗原结合部分和重链可变区抗原结合部分组成的抗体，其中所述接头使得所述链形 成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(ScFv)；参见例如Bird 等(1988) Science 242:423-426;和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85: 5879-5883)。术语“驼类纳米抗体”(camelid nanobody)是指这样的驼类抗体区域，该区域为 缺乏轻链的小单可变结构域，其可以通过遗传工程化产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质 而获得，从而导致小分子量的抗体衍生蛋白质。参见例如W007042289和1998年6月2日 授权的美国专利 No. 5，759，808 ；还请参见 Stijlemans，B.等，2004，J Biol. Chem. 279(2) 1256-61。工程化的驼类抗体及抗体片段文库可商购获得，例如来自Ablynx，Ghent,比利 时。同其他非人源抗体一样，驼类抗体的氨基酸序列可以重组改变，以获得与人序列更密切 类似的序列，即，该纳米抗体可以“人源化”。因而能够进一步降低驼类抗体施用于人时已经 天然低的抗原性。术语“靶标”是指本发明Fn3基结合分子所识别(即，结合)的抗原或表位。靶标 包括，但不限于，蛋白质、肽、糖和/或脂质上存在的表位。术语“缀合物”是指化学或遗传连接一个或多个非Fn3部分的Fn3基结合分子。术语“非Fn3部分”是指赋予与之结合的分子额外的功能性的生物或化学实体。在 一个特定实施方案中，非Fn3部分是多肽，例如血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或其 变体或突变体、抗HSA或其片段或突变体、抗体Fc或其片段或突变体、或化学实体，例如聚 乙二醇(PEG)，其可以增加Fn3基结合分子的体内半衰期。术语“非天然氨基酸残基”是指不存在于天然(野生型)Fn3结构域中的氨基酸残 基，包括例如化学修饰的氨基酸。此类非天然氨基酸残基可以通过取代天然氨基酸和/或通过插入到天然Fn3氨基酸序列中而引入(见例如，Sakamoto et al.，2002，Nucleic Acids Research, 30 (21) 4692-4699)。还可以掺入非天然氨基酸残基，以赋予Fn3基结合分子期望 的功能，例如连接功能性部分(例如PEG)的能力。术语“聚乙二醇”或“PEG”指聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，有或无偶联剂、或 以偶联或活化部分衍生。术语“特异性结合”或“与……特异性地结合”是指，按照表面等离子体共振测量， 在标准生理盐和pH条件下于室温，Fn3基结合分子以至少1 X 10-6M的亲和力与靶标结合、 和/或以比其对非特异性抗原的亲和力高至少2倍、优选至少10倍的亲和力与靶标结合的 能力。附图的简短说明图IA显示野生型纤连蛋白分子III型的第10组件，其中枝权表示丝氨酸残基；图 IB于二级结构背景中显示Fn3的氨基酸序列。β链中的残基以白圈显示。侧链形成疏水 核的那些残基以加粗线圈起来。环残基以阴影显示。箭头标示环中的位置，在所述位置处 Fn3被分开以产生互补片段。图2显示了野生型纤连蛋白分子III型的第10组件以及提出的可用来修饰的丝 氨酸残基(Serl7-Ser 21-Ser 43-Ser 60-Ser 89)。图3显示了野生型纤连蛋白分子III型第10组件的三链片层(链A-B-E)。候选 残基Ser 17和Ser 60在片层底部。候选残基Ser 21位于顶部。排除了 Ser 55，因为其靠 近结合表面。显示了其他潜在的候选残基，即Val 11、Leu 19和Thr 58。图4显示了野生型纤连蛋白分子III型第10组件的四链片层(支架的另一侧)。 Thr 71靠近Ser 89，也是潜在的修饰候选物。图5显示了野生型纤连蛋白分子III型第10组件的re和⑶环。图6A-B显示了野生型纤连蛋白分子III型第7、8、9和10组件的β链的多种组 合，以产生基于纤连蛋白的结合分子嵌合体(β链交换)。图7A-C提供了关于示例性靶标的信息。图8显示野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型10Fn3 (RGD至RGA) cys (无还原剂 (图8A))、以及野生型10Fn3 (RGD至RGA) 30kDaPEG (有还原剂(图8B))的SDS PAGE分析结果。图9显示使用大肠杆菌(E. coli)表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)在Lewis 大鼠中的PK(药代动力学)。图10显示使用大肠杆菌表达系统，野生型10Fn3(RGD至RGA)-PEG在Lewis大鼠 中的PK。图11显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA) -PEG的计算半衰期。图12显示野生型10Fn3 (RGD至RGA) -RSA (有还原剂(图12a))和野生型 10Fn3 (RGD至RGA)-HSA (有还原剂(图12b))的SDS PAGE分析结果。图13显示使用哺乳动物表达系统，野生型10Fn3 (RGD至RGA) -RSA在Lewis大鼠 中的PK。图14显示使用哺乳动物表达系统，野生型10Fn3 (RGD至RGA) -HSA在Lewis大鼠中的PK。图15显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA) -RSA和HSA的计算半衰期。图16显示VEGFR 10Fn3结合剂-RSA(有还原剂(图16a))和VEGFR10Fn3结合 剂-HSA (有还原剂(图16b))的SDS PAGE分析结果。图 17 显示 VEGFR 10Fn3 结合剂-HSA 和 RSA 的 ELISA 结果。图18显示使用哺乳动物表达系统，VEGFR结合性Fn3_HSA在Lewis大鼠中的PK。图19显示使用哺乳动物表达系统，VEGFR结合性Fn3_RSA在Lewis大鼠中的PK。
图20显示使用WinNonLin软件分析，VEGFR结合性Fn3_HSA和VEGFR结合性 Fn3-RSA的计算半衰期。图21显示有还原剂时野生型10Fn3 (RGD至RGA)-抗RSA的SDSPAGE分析结果。图22显示使用大肠杆菌表达系统，野生型10Fn3 (RGD至RGA)-抗RSA在Lewis大 鼠中的PK。图23显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA)-抗RSA的计算半衰期。图24显示有还原剂时野生型10Fn3 (RGD至RGA) -Fc的SDS PAGE分析结果。图25显示使用哺乳动物表达系统，野生型10Fn3 (RGD至RGA) -Fc在Lewis大鼠中 的PK。图26显示使用WinNonLin软件分析，野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型 10Fn3 (RGD至RGA) -Fc的计算半衰期。MM本发明提供了基于纤连蛋白的结合分子，以及将供体CDR引入到基于纤连蛋白的 结合支架，特别是Fn3中的方法。如下文进一步讨论的那样，本发明还提供了向基于纤连蛋 白的结合分子或支架中引入适于与部分缀合的氨基酸残基的方法。此优点允许本发明基于 纤连蛋白的结合分子进一步与其他此类分子缀合，以构建双和多特异性结合分子，和/或 允许连接诸如PEG等部分以提高半衰期和稳定性。本发明还提供了筛选与靶标(一般是蛋白质抗原)特异性结合的此类结合分子以 及在例如原核或真核系统中制备所述分子的方法。 另外，本发明提供了纯化候选结合分子及其配制的方法。另外，本发明提供了在多种诊断和治疗应用中使用此类配制的结合分子的方法， 尤其是用于诊断或治疗人类疾病。m^mm&m^^Mmmm一方面，本发明提供了用于制备结合分子的改良的支架。适合于在本发明中使用 的支架包括但不限于锚蛋白重复支架或免疫球蛋白超家族的一个或多个成员，例如抗体 或纤连蛋白结构域。在一个实施方案中，纤连蛋白III型结构域(Fn3)作为支架分子(美国专利 No. 6，673，901，PCT公开W0/03104418以及美国专利申请20070082365)。此结构域在蛋白 质序列数据库中出现过400次以上，并且据估计存在于迄今测序的2%蛋白质中，包括纤 连蛋白、生腱蛋白、细胞内细胞骨架蛋白以及原核细胞酶(Bork和Doolittle，Proc. Natl.
13Acad. Sci. U. S. A 89 8990,1992 ；Bork 等，Nature Biotech. 15 553,1997 ；Meinke 等， J. Bacteriol. 175 :1910，1993 ；Watanabe 等，J. Biol. Chem. 265 :15659，1990)。Fn3 的三维 结构已经通过NMR(Main等，1992)和X射线结晶学(Leahy等，1992 ；Dickinson等，1994) 确定。所述结构描述为类似于抗体VH结构域的β夹心，除了 Fn3具有7个β链而不是9 个。每个Fn3结构域的每一端有3个环；BC、DE和TO环的位置分别大致对应于抗体VH结 构域的CDRU2和3的位置(美国专利6，673，901,PCT公开W0/03104418)。来自任何物种 的任何Fn3结构域均适合于在本发明中使用。在另一实施方案中，Fn3支架是人类Fn3的第10组件(kiFI^)，其含有94个氨 基酸残基。kiFM中对应于IgG重链的抗原结合环的3个环，位于如下氨基酸残基之间 21-31 (BC)、51-56 (DE)和 76-88 (FG)(美国专利申请号 20070082365)。这些 BC、DE 和 FG 环 可以分别直接被抗体可变区的CDR1、2和3环，尤其是单域抗体的CDR，所取代。尽管wFM是用于产生Fn3基结合分子的Fn3支架的一个实施方案，但是在本文描 述的分子中可以用其它分子替代"^113。这些分子包括但不限于，人纤连蛋白组件1FnS-9Fr^ 和11FnS-17Fr^以及来自非人动物和原核生物的相关Fn3组件。此外，来自具有与kiFM同源 的序列的其它蛋白质，例如，生腱蛋白和undulins，的Fn3组件也可以使用。来自不同生物 和亲本蛋白的组件可能最适用于不同的应用；例如，在设计抗体模拟物时，可能最期望从治 疗性或诊断性分子预期使用的生物所天生的纤连蛋白或纤连蛋白样分子出发来产生该蛋 白质。在另一实施方案中，Fn3来自非人物种。如果向人类患者给药非人Fn3，可能会引 起有害的免疫反应。为预防之，非人Fn3可以遗传工程化，以除去抗原性氨基酸或表位。鉴 定非人Fn3抗原性区域的方法包括但不限于美国专利No. 6，673，580中所述的方法。在另一实施方案中，Fn3支架是从一个或多个Fn3(例如至少两个不同Fn3，例如 1QFn3和9Fn3)的部分构建的嵌合体。利用Fn3结构域已知的氨基酸序列和三维结构，技术 人员能够容易地鉴定不同Fn3分子中能够组合起来以产生功能性嵌合Fn3分子的区域。此 类嵌合Fn3结构域可以以多种方法构建，包括但不限于基于PCR的或酶介导的基因工程 化，从头开始DNA或RNA合成，或者盒诱变。上述基于纤连蛋白的结合支架可以从头构建，或者通过应用芯片(insilico)分 子建模而获得信息。芯片或计算机辅助建模可以包括简单的核酸或氨基酸序列比对或应用 例如Ras-Mol进行三维建模。就支架的哪些区域或环能够选择用来呈递高变区而言，支架 建模造就一种理性方法。建模还使得可以最好地修饰支架以最佳地呈递一个或多个高变 区。一方面，本发明描述了将高变区从其他Ig超家族分子上移植到本发明基于纤连 蛋白的结合支架上的改进方法。在一个实施方案中，来自抗体可变区(例如重链可变区、轻链可变区或两者)的一 个或多个CDR被移植到一种上述结合支架的一个或多个环中。任何抗体可变区的CDR区或 其抗原结合片段均适合于移植。CDR可从任何动物的抗体谱(repertoire)中获得，包括但 不限于啮齿类动物、灵长类动物、驼类动物或鲨鱼。在特别的实施方案中，CDR从单域抗体 例如纳米抗体的CDR1、CDR2和CDR3获得。在更具体的实施方案中，单域抗体例如纳米抗体的⑶Rl、2和3移植到Fn3结构域的BC、DE和TO环中，由此向基于纤连蛋白的结合分子提供 原纳米抗体的靶结合特异性。驼类抗体和抗体片段的工程化文库可商购获得，例如Ablynx， Ghent,比利时。抗体谱可来自用一种或多种抗原刺激的动物，或来自未用抗原刺激过的幼 稚动物。另外或者可选地，CDR可从通过体外或体内文库筛选方法所产生的抗体或其抗原 结合片段获得，所述方法包括但不限于体外多聚核糖体或核糖体展示、噬菌体展示或酵母 展示技术。这包括非由体外或体内文库筛选方法最初产生的、而是利用体外或体内筛选方 法随后经历了诱变或一个或多个亲和力成熟步骤而获得的抗体。此类体外或体内文库筛 选方法或亲和力成熟方法的实例描述在美国专利No. 7，195，880 ；6, 951，725 ；7, 078，197 ； 7，022，479 ；5，922，545 ；5，830，721 ；5，605，793,5，830，650 ；6，194，550 ；6，699，658 ； 7，063，943 ；5866344 以及 PCT 公开 W006023144 中鉴定抗体CDR的方法在本领域公知(参见Kabat等，U. S. Dept. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest " (1983)； Chothia 等,J. Mol. Biol. 196 901-917 (1987) ；MacCallum 等,J. Mol. Biol. 262 732-745(1996))。可以分离和测序编码特定抗体的核酸，并通过相对于确立的抗体序列命 名法来检查所编码的蛋白质而推出CDR序列。例如，将高变区或CDR移植到本发明基于纤 连蛋白的结合支架中的方法包括基因工程化法、从头核酸合成或基于PCR的基因组装(参 见例如美国专利No. 5，225. 539)。鉴定某于乡千连g白的结合支奥Φ 舌合于{I条tfeP对是高CDR旱递/结合的残基的方法上述技术允许鉴定适宜的支架环，用来选择和呈递高变区或⑶R。不过，可以调用 其他法则，基于Fn3结构域和供体抗体的结构建模，进一步改进高变区的合身性以及呈递。一方面，可以突变Fn3支架上任一 β链中的特定氨基酸残基，以允许⑶R环采取 保留或提高抗原结合的构象。这种方法可应用结构建模和序列比较的组合，通过类似于将 CDR移植到异源抗体构架中的方式进行。在一个实施方案中，邻近CDR的Fn3残基以类似 于Queen 等(参见美国专利No. 6，180，370 ；5，693，762 ；5，693，761 ；5，585，089 ；7，022，500) 实施的方式进行突变。在另一实施方案中，落在CDR残基一个范德华半径范围内的Fn3残 基以类似于Winter等(参见美国专利No. 6，548，640 ；6, 982，321)实施的方式进行突变。 在另一实施方案中，不靠近CDR残基、但根据Fn3结构域和供体抗体的结构建模预测将调 节⑶R残基构象的Fn3残基，以类似于Carter等或Adair等(见美国专利No. 6，407，213 ； 6，639，055 ；5, 859，205 ；6, 632，927)实施的方式进行突变。另一方面，对含有一个或多个移植的抗体CDR的Fn3支架进行一个或多个体外或 体内亲和力成熟步骤。可采用任何亲和力成熟方法，引起Fn3支架或CDR中的氨基酸变化， 提高Fn3/CDR与期望抗原的结合。这些氨基酸变化可以例如，借助于随机诱变、“巡视式诱 变(walk throughmutagenesis)，，禾口 "浏览式诱变(look through mutagenesis)，，而实现。 例如，monobody的此类诱变可利用易错PCR，利用酵母或细菌“增突”株，在从头合成所有 或部分monobody期间掺入随机或确定的核酸变化而实现。实施亲和力成熟和/或诱变的 方法描述在例如，美国专利 No. 7，195，880 ；6, 951，725 ；7, 078，197 ；7, 022，479 ；5, 922，545 ； 5，830，721 ；5, 605，793，5，830，650 ；6，194，550 ；6，699，658 ；7，063，943 ；5866344 和 PCT 公 开TO06023144中。包含最小必需结合决定簇的新CDR序列还可以利用如US20050255552 中所述的Kalobios技术来筛选。
工靴禾口·_摊连屈另一方面，本发明描述了基于纤连蛋白的结合分子，与原始基于纤连蛋白的分子相比，其已经被修饰而具有改变的性能。修饰包括该分子与其他分子缀合或融合、以及化学 修饰该分子或改变分子结构的氨基酸残基或核苷酸。纤连蛋白融合物本发明基于纤连蛋白的结合分子可以与其他分子融合或缀合。此类缀合物在本文 称为“Fn融合物”。例如，Fn融合物包括与增加结合分子的稳定性或半衰期的分子融合的 基于纤连蛋白的结合分子(例如，Fc区、HSA或抗HSA结合分子)。例如，可以通过IgG恒定区(Fe)与kiFM组件(优选地通过kiFM的C末端)融 合，而使Fn融合物与人免疫应答结合。在该kiFM-Fc融合分子中Fc激活免疫应答的补体 成分，并增加该抗体模拟物的治疗价值。类似地，kiFM与补体蛋白如Clq的融合可以用于 靶向细胞，kiFM与毒素的融合可以用于特异地破坏带有特定抗原的细胞。此外，任何形式 的kiFM都可以与白蛋白融合以增加在血流中的半衰期和其组织穿透性。这些融合物均可 以通过标准技术产生，例如使用公众可得的基因序列构建重组融合基因，从该融合基因表 达融合蛋白。Fn融合物还可以使用新生儿Fc受体(FcRn)(也称作“Brambell受体”)产生，所 述受体参与延长白蛋白在循环中的寿命(见Chaudhury等(2003) J. Exp. Med. 3 :315_322 ； Vaccarao 等，(2005)Nature Biotech. 23 1283-1288)。FcRn 受体是整合膜糖蛋白，由 β 2 微球蛋白可溶性轻链与43kDa链非共价结合组成，所述α链具有三个胞外结构域、一个跨 膜区和一个大约50个氨基酸的胞质尾。胞质尾含有涉及受体内在化的、基于二核苷酸基序 的胞吞信号。该α链是非经典MHC I蛋白家族的成员。i32m与α链的结合对于FcRn正 确折叠和退出内质网以运送至内体(endosome)和细胞表面是关键的。FcRn的整体结构类似于I类分子的整体结构。α-1和α-2区类似于一个平台， 由8个反平行β链组成，这些β链形成顶部为两个反平行α螺旋的单个β折叠，极为类 似于MHC I分子中的肽裂隙。天然地，FcRn结合IgG并跨胎盘合胞体滋养层自母体循环转 运IgG至胎儿循环并在成体中保护IgG免遭降解。除了体内稳态，FcRn还控制IgG在组织 中的胞转。FcRn定位在上皮细胞、内皮细胞和肝细胞中。研究显示，白蛋白结合FcRn，和IgG形成三分子复合物。白蛋白和IgG两者非协 同地结合在FcRn的不同部位。人FcRn与S印harose_HSA和S印harose-hlgG的结合是pH 依赖性的，在pH5. 0最大，在pH7. 0-pH8为零。观察到FcRn结合白蛋白与FcRn结合IgG具 有相同的PH依赖方式，这提示白蛋白与FcRn相互作用以及由此受保护而免遭降解的机制 与IgG的相同，由类似地与FcRn的pH敏感性相互作用介导。FcRn和白蛋白通过白蛋白的 D-III结构域在不同于IgG结合位点的位点以pH依赖性方式相互作用。本发明的Fn融合物也包括Fn-FcRn融合蛋白或Fn-抗-FcRn融合分子。一个实 施方案中，Fn融合物是Fn-抗-FcRn融合分子，其中抗FcRn融合分子可以在酸性pH(例如 PH6. 0)以高亲和力而在中性pH(例如，ρΗ7·4)以低亲和力结合新生儿FcR受体(FcRn)，类 似于IgG与FcRn的结合。Fn-抗-FcRn融合物的体内半衰期增加，由此提供改良的治疗应 用。使分子与Fc结构域(例如IgGl的Fc结构域)融合的方法在本领域已知(参见例如U. S. 5，428，130)。此类融合物由于Fc结合FcRn的能力而具有增加的循环半衰期，该 能力在IgG稳态中起着关键作用，防止与之结合的分子代谢(参见例如US20070269422)。其他融合物包括与人血清白蛋白(HSA或HA)融合的基于纤连蛋白的结合分子。人 血清白蛋白成熟形式为585个氨基酸的蛋白质，负责重大比例的血清渗透压，而且也可以 作为内源和外源配体的载体起作用。白蛋白作为载体分子的作用及其惰性性质对于作为体 内多肽载体和转运蛋白的用途而言是期望的性能。作为白蛋白融合蛋白组分的白蛋白用作 多种蛋白质的载体的用途已经在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413622中提出。此夕卜， 也已经提出(EP 399666)使用HSA的N-末端片段与多肽融合。因此，可以通过将本发明的 分子与白蛋白、或白蛋白的片段(部分)或变体、或能够结合HSA、足以稳定所述蛋白质和/ 或其活性的分子(“抗HSA结合剂”)基因或化学融合或缀合，使得本发明分子得以稳定以 延长保质期，和/或使得分子的活性在溶液中、在体外、和/或在体内得以保留延长的时间。白蛋白与其他蛋白质的融合可以通过基因操纵实现，将编码HSA的DNA或其片段 与编码蛋白质的DNA相连。然后用融合的核苷酸序列转化或转染适宜的宿主，其中所述融 合的核苷酸序列在适宜的质粒上的排列使得可以表达融合的多肽。表达可以由例如原核或 真核细胞在体外实现，或由例如转基因生物在体内实现。与HSA融合相关的其他方法可见 于例如WO 2001077137和WO 200306007，并入本文作为参考。在一个具体实施方案中，融合 蛋白质的表达在哺乳动物细胞系中进行。哺乳动物细胞系的实例包括但不限于，人胚胎肾 细胞(例如HEK Freestyle, HEK293，HEK293T)；中国仓鼠卵巢细胞(例如CH0)；仓鼠肾细 胞(例如BHK)；人胚胎视网膜细胞(例如PERC6)；小鼠骨髓瘤(Sp/20) ；HEK293和人B细 胞系的杂种(例如HKB11)；宫颈癌细胞(例如HeLa)；和猴肾细胞(例如COS).本发明的其他融合物包括使基于纤连蛋白的结合分子与其他功能分子例如其 他肽或蛋白质(例如抗体或受体的配体)相连以生成“双特异性分子”。双特异性分子 结合至少两个不同的结合位点或至少两个不同的靶分子，例如纤连蛋白分子靶向的结 合位点和抗HSA结合剂，所述抗HSA结合剂来自基于纤连蛋白的分子(如上文所述)或 来自其他非纤连蛋白支架，例如来自单域抗体(参见例如W02004041865 (Ablynx)和 EP1517921 (Domantis) )0本发明基于纤连蛋白的结合分子还可以衍生或连接不止一个其 他功能分子，以生成结合同一靶分子上两个以上不同的结合位点和/或两个不同靶分子上 的两个分开的结合位点、或其各种排列组合的多特异性分子。一个实施方案中，Fn3基多特 异性结合分子可以包含例如连接在一起并缀合了半衰期延长结构部分例如HSA的至少两 个Fn3结构域，其中每个Fn3结构域分别结合相同治疗靶标的不同位点，例如，TNF上的不 同位点。另一实施方案中，Fn3基多特异性结合分子可以包含例如连接在一起并缀合了半 衰期延长结构部分例如HSA的至少两个Fn3结构域，其中每个Fn3结构域分别结合不同的 治疗靶标，例如第一 Fn3结构域结合Her3而第二 Fn3结构域结合Her2。再一实施方案中， Fn3基多特异性结合分子可以包含例如连接在一起并缀合了半衰期延长结构部分例如HSA 的至少两个Fn3结构域，其中每个Fn3结构域分别结合不同治疗靶标上的不同位点，例如， 第一 Fn3结构域结合Her3的位点1，第二 Fn3结构域结合Her3的位点2，第三Fn3结构域 结合Her2的位点1，而第四Fn3结构域结合Her2的位点2，及其各种排列组合。此类多特 异性分子也旨在为如本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。本发明的双特异性分子可利用本领域已知的方法通过缀合组分结合特异性而制
17备。例如，双特异性分子的每个结合特异性可分开生成，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋 白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化 二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基_3-(2_吡啶二硫代)_丙酸酯(SPDP) 和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(参见例如 Karpovsky 等(1984) J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu, MA 等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82 8648)。其他方法包括 Paulus (1985) Behringlns. Mitt. No. 78，118-132 ；Brennan 等 (1985) Science 229 81-83)和 Glennie 等(1987) J. Immunol. 139 2367-2375)中所述的那 些。优选的缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，两者均可购自Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)。如果结合特异性包括一个以上抗体(例如，在多特异性构建体中)，缀合可以借助 于两个重链C-末端铰链区的巯基键合而实现。在尤其优选的实施方案中，在缀合之前修饰 铰链区，以含有奇数个巯基残基，优选1个。可选地，两种结合特异性均可在同一载体上编码并在同一宿主细胞中表 达和组装。制备双特异性分子的方法描述在例如美国专利No.5，260，203;美国 专利No. 5，455，030 ；美国专利No. 4，881，175 ；美国专利No. 5，132，405 ；美国专利 No. 5，091，513 ；美国专利 No. 5，476，786 ；美国专利 No. 5，013，653 ；美国专利 No. 5，258，498 和美国专利No. 5，482，858中。双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过多种测定法来确认，例如，可以放射 性标记融合物并用在放射性免疫测定法(RIA)中(参见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays, Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society，March，1986，并入本文作为参考)。放射性同位素可通过诸如应 用Y _计数器或闪烁计数器或者通过放射自显影法等方法来检测。本发明的其他融合物包括使基于纤连蛋白的结合分子与标签(例如生物素)或化 学品(例如免疫毒素或化疗剂)相连。此类化学品包括细胞毒性剂，即，任何对细胞有害 (例如杀伤)的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉 素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、 米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、 普萘洛尔和嘌呤霉素，以及它们的类似物或同源物。治疗剂还包括例如抗代谢物(例如， 氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)，烷化剂(例如， 氮芥、thio印a苯丁酸氮芥、美法仑、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、 二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二氨钼(II) (DDP)顺钼)，蒽环类药物(例 如，柔红霉素(以前称作道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，放线菌素D (以前称作放 线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和 长春碱)。能够与本发明基于纤连蛋白的结合分子缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括 duocarmycins、刺孢霉素、美登素和auristatins，以及它们的衍生物。细胞毒素可以利用本领域可用的接头技术与本发明基于纤连蛋白的结合分子缀 合。已经用来与细胞毒素缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含 肽接头。例如，接头可以选择为易被溶酶体区室内的低PH断裂、或者易被蛋白酶(例如优
18选在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))断裂的接头。有关细胞毒素、接头类型以及治疗剂缀合方法的更多讨论还参见Saito，G.等 (2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55 199-215 ；Trail, P. Α.等(2003)CancerImmunol. Immunother. 52 328-337 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell3 :207_212 ；Allen, Τ. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2 :750_763 ；Pastan, I.禾口 Kreitman, R. J. (2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3 1089-1091 ；Senter, P. D.禾口 Springer. C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53 247-264。本发明基于纤连蛋白的结合分子还可以与放射性同位素缀合以生成细胞毒性放 射性药物，也称为放射性免疫缀合物。能够与基于纤连蛋白的结合分子缀合用于诊断或治 疗用途的放射性同位素的实例包括但不限于碘m、铟钇％和镥177。制备放射性免疫缀 合物的方法在本领域已经确立。基于抗体的放射性免疫缀合物的实例可商购获得，包括替 伊莫单抗、tiuxetan和托西莫单抗，且类似的方法可用来应用本发明的分子制备放射性免 疫缀合物。本发明的Fn融合物可用来调节给定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限 于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有期望生物学活性的蛋白质或多肽。例如， 此类蛋白质可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌 内毒素或白喉毒素；诸如肿瘤坏死因子或干扰素-Y等蛋白质；或生物学反应调节剂，例 如，淋巴因子、白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒细胞巨 噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。缀合此类治疗性部分的技术公知，并且可应用于本发明的分子，参见例如Arnon 等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(编辑)，243-56 页(Alan R. Liss,Inc.1985) ；Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery" ,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson φ ( H车t)，623—53 M (Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review", in Monoclonal Antibodies ' 84 :Biological And Clinical Applications, Pinchera φ ( 'ΦΜ ) ,475-506 M (1985) ； “ Analysis, Results, And FutureProspective Of Th e Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy" , in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等(编 辑)，303-16 页 (Academic Press 1985),禾口 Thorpe 等，“ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates" , Immunol. Rev. , 62 :119-58(1982)。化学修饰另一方面，本发明提供了通过聚乙二醇化修饰的基于纤连蛋白的结合分子，以例 如增加分子的生物学(例如血清)半衰期。为使分子聚乙二醇化，所述分子或其片段一般 与聚乙二醇(PEG)部分，例如PEG的活性酯或醛衍生物，在一个或多个PEG基团可以与所述 分子连接起来的条件下反应。术语“聚乙二醇化部分”、“聚乙二醇部分”或“PEG部分”包括 聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，有或无偶联剂或以偶联或活化部分衍生(例如，以硫醇、 三氟甲磺酸(triflate)、tresylate、氮杂环丙烷(azirdine)、环氧乙烷(oxirane)，或优选 以马来酰亚胺部分衍生，例如PEG-马来酰亚胺)。其他适当的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于马来酰亚胺基单甲氧基聚乙二醇、活化的聚乙二醇聚丙二醇，而且还包括如下类型 的荷电或中性聚合物葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸、或其他基于糖的聚合物、氨基酸聚合物、 和生物素衍生物。选择适宜官能团用于PEG衍生物可以以该分子上或将与PEG偶联的分子上可利用 的反应基团的类型为基础来进行。对于蛋白质而言，典型的反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱 氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。还可以利用N-末端氨基 基团和C-末端羧酸。优选，聚乙二醇化借助于与活性PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰 化反应或烷化反应而进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用来衍生其他蛋 白质的任何形式的PEG，例如单(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇，或聚乙二醇-马 来酰亚胺。聚乙二醇化蛋白质的方法在本领域已知，并且可应用于本发明。参见例如WO 2005056764,U. S. 7，045，337,U. S. 7，083，970,U. S. 6，927，042,Nishimura 等的 EP 0154316 和Ishikawa等的EP 0401384。基于纤连蛋白的结合分子可以工程化以纳入至少一个半胱 氨酸氨基酸或至少一个非天然氨基酸以促进聚乙二醇化。本发明基于纤连蛋白的结合分子还可以通过羟乙基淀粉化修饰，其利用与药物相 连的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物以修饰药物特征。HES是可以被机体酶代谢的、衍生自蜡 质玉米淀粉的、修饰的天然聚合物。这种修饰通过增加分子的稳定性以及减小肾脏清除而 使循环半衰期延长，导致增加的生物学活性。此外，HES化潜在地改变免疫原性或变应原性。 通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制范围广泛的HES药物缀合物。DE 19628705和DE 10129369描述了在无水二甲基亚砜(DMSO)中借助于羟乙基 淀粉的相应醛糖内酯使羟乙基淀粉分别与血红蛋白和两性霉素B的游离氨基偶联的可行 方法。由于因为溶解度的原因或者是蛋白质变性的原因使用无水非质子溶剂往往是不可行 的(特别是在蛋白质的情况下)，故也可利用HES在水性介质中偶联的方法。例如，通过水 溶性碳化二亚胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺)的介导，可以偶联已 在链还原端选择性氧化为醛糖酸的羟乙基淀粉(PCT/EP 02/02928)。可应用于本发明的其 他羟乙基淀粉化方法描述在例如 U. S. 20070134197、U. S. 20060258607、U. S. 20060217293、 U. S. 20060100176 和 U. S. 20060052342 中。本发明基于纤连蛋白的结合分子还可利用糖残基来修饰。修饰蛋白质的糖残基或 使蛋白质糖基化的方法在本领域已知(参见例如Borman(2006)Chem. &Eng. News 84(36) 13-22和Borman (2007) Chem. &Eng. News85 19-20)，并且可应用于本发明的分子。此类糖修 饰还可通过例如改变纤连蛋白基结合分子序列内部的一个或多个糖基化位点来实现。例 如，可进行一个或多个氨基酸取代，以消除一个或多个可变区构架糖基化位点，由此消除在 该位点的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法在Co等的 美国专利No. 5，714，350和6，350，861中有更详细的说明。另外地或可选地，可制备本发明基于纤连蛋白的结合分子，其具有改变的糖基化 类型，例如岩藻糖残基量减小的低岩藻糖基化模式，或平分型GlcNac结构增加的基于纤连 蛋白的结合分子。此类糖修饰可通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达基 于纤连蛋白的结合分子来实现。具有改变的糖基化机器的细胞在本领域已有描述，并且可 用作为宿主细胞表达本发明重组的基于纤连蛋白的结合分子，由此产生糖基化改变的本发明基于纤连蛋白的结合分子。例如，Hang等的EP 1，176，195描述了编码岩藻糖基转移 酶的FUT8基因被功能性破坏了的细胞系，从而在这样的细胞系中表达的抗体呈现低岩藻 糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其使岩藻 糖与Asn(297)连接的糖相连的能力下降，也导致该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化 (还请参见 Shields，R. L.等，2002J. Biol. Chem. 277 :26733_26740)。Umana 等的 PCT 公 开TO 99/54342描述了经工程化表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)_Ν_乙酰 葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而该工程化细胞系中表达的抗体呈现出增加的 平分型GlcNac结构，导致抗体ADCC活性增加(还请参见Umana等，1999Nat. Biotech. 17 176-180)。产生具有人样糖基化模式的多肽的方法也已经由EP1297172B1以及源于 Glycofi的其他同族专利描述过。氨基酸/核苷酸修饰本发明具有一个或多个氨基酸或核苷酸修饰(例如，改变)的基于纤连蛋白的结 合分子可通过多种已知方法生成。例如，此类修饰分子可通过重组方法产生。而且，由于遗 传密码的简并性，可利用多种核酸序列来编码每个期望的分子。例示性的本领域公认的制备编码起始分子的氨基酸序列变体的核酸分子的方法 包括但不限于，通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变以及盒诱变早先制备的编码 分子的DNA来制备。定点诱变是制备取代变体的优选方法。此技术在本领域公知(参见例如Carter等 Nucleic Acids Res. 13 4431-4443 (1985)和 Kunkel 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 82 488(1987))。简言之，在进行DNA定点诱变时，亲本DNA通过如下方式改变首先使编码期 望突变的寡核苷酸与此类亲本DNA的单链杂交。杂交后，利用杂交的寡核苷酸作为引物，而 利用该亲本DNA单链作为模板，利用DNA聚合酶合成完整的第二链。从而，编码期望突变的 寡核苷酸被掺入到所得的双链DNA中。PCR诱变也适合于制备起始分子的氨基酸序列变体。参见Higuchi，inPCR Protocols,177-183 页(Academic Press,1990)；禾口 Vallette 等，Nuc. Acids Res. 17 723-733 (1989)。简言之，当小量模板DNA在PCR中用作为起始材料时，可利用在序列上与 模板DNA相应区域稍有差异的引物来生成相对大量的特异性DNA片段，其仅在引物有别于 模板的位置上与模板序列存在差异。另一种制备变体的方法，即盒诱变，是以Wells等Gene 34 :315_323 (1985)描述的 技术为基础的。起始材料是含有待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定亲本 DNA中待突变的密码子。所鉴定的突变位点的每一侧必需有独特的限制性内切酶位点。如 果不存在这样的限制性位点，则可以利用上述寡核苷酸介导的诱变方法将其引入在起始多 肽DNA的适当位置上。在这些位点切割质粒DNA以使之线性化。利用标准方法合成编码两 限制性位点之间的DNA序列但含有期望突变的双链寡核苷酸，其中两条寡核苷酸链分开合 成，然后利用标准技术杂交在一起。这种双链寡核苷酸称为盒。此盒设计为具有与线性化 质粒末端适配的5’和3’端，从而能够直接连接到质粒中。这样该质粒含有突变的DNA序 列了。可选地，或另外地，可确定编码分子的多肽变体的期望氨基酸序列，并合成产生编 码此氨基酸序列变体的核酸序列。
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本领域普通技术人员将会理解，可以进一步修饰本发明基于纤连蛋白的结合分 子，从而其氨基酸序列改变(例如与野生型不同)，但期望的活性不变。例如，可对蛋白质进 行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的其他核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨 基酸残基可以替换为相同侧链家族的其他氨基酸残基。在另一实施方案中，一段氨基酸链 可以替换为结构上类似的、仅在侧链家族成员的顺序和/或组成方面有别的链，即可进行 保守取代，其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已经定义，包括碱性侧链(例如，赖氨 酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如， 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。除了氨基酸取代，本发明还考虑起始分子氨基酸序列的其他修饰，以生成功能上 等同的分子。例如，可以缺失一个或多个氨基酸残基。一般而言，根据本发明的此实施方案， 将会缺失不超过1个至约10个残基。本文包含一个或多个氨基酸缺失的纤连蛋白分子将 优选保留起始多肽分子的至少约80%、优选至少约90%、最优选至少约95%。还可以制备氨基酸插入变体，其保留原始纤连蛋白分子的功能。例如，可以将至少 一个氨基酸残基(例如，1个至2个氨基酸残基，一般不超过10个残基)引入到分子中，在 另一实施方案中，可以在单个纤连蛋白分子中组合种种氨基酸修饰。在一个实施方案中，对3型纤连蛋白结构域进行氨基酸取代，以包括半胱氨酸或 其他非天然氨基酸，从而适合于通过公知的缀合方法使部分与该基于纤连蛋白的结合分子 缀合。尤其是，本发明涉及具Fn3支架的基于纤连蛋白的结合分子的特定氨基酸变体，其中 一个或多个丝氨酸残基被半胱氨酸或非天然氨基酸取代。能够取代的丝氨酸残基包括但不 限于Ser 17, Ser 21, Ser 43, Ser 60，和Ser 89。能够取代的Fn3支架的其他氨基酸位置 包括但不限于Valll，Leul9，Thr58和Thr71。非天然存在的氨基酸可利用例如Ambrex技 术(参见例如US 7，045，337 ；7, 083，970)取代到Fn3支架中。m^m^mm^^M&m^^mmMmi可采用多种筛选测定法来鉴定本发明改进的基于纤连蛋白的结合分子。在一个实 施方案中，筛选基于纤连蛋白的结合分子对期望抗原提高的结合亲和力。可以考虑能够选 择对期望抗原的提高结合性的任何体外或体内筛选方法。在另一实施方案中，在细胞、病毒或噬菌体表面展示基于纤连蛋白的结合分 子，并利用固定化抗原对其进行选择。适宜的筛选方法描述在美国专利No. 7，063，943 ； 6，699，658 ；7, 063，943和5866344中。此类表面展示可能要求创建基于纤连蛋白的结合分 子和正常存在于细胞、病毒或噬菌体外表面上的适宜蛋白质之间的融合蛋白质。适宜制备 此类融合物的蛋白质在本领域公知。在另一实施方案中，利用体外表型-基因型关联展示例如核糖体或多核糖体展示 来筛选基于纤连蛋白的结合分子。此类“分子进化”方法为本领域公知(参见例如美国专 利 No. 6，194，550 和 7，195，880)。本发明采用的筛选方法可能需要在基于纤连蛋白的结合分子中引入一个或多个 氨基酸突变。可以考虑任何本领域公认的突变方法。在一个实施方案中，创建基于纤连蛋
22白的结合分子的文库，其中随机突变Fn3支架或移植CDR中的一个或多个氨基酸。在另一 实施方案中，创建基于纤连蛋白的结合分子的文库，其中Fn3支架或移植CDR中的一个或多 个氨基酸被突变为一个或多个预定的氨基酸。本发明采用的筛选方法可能还需要增加抗原结合筛选测定法的严谨度，以选择抗 原亲和力提高的基于纤连蛋白的结合分子。此处可使用本领域公认的增加蛋白质-蛋白质 相互作用测定法的严谨度的方法。在一个实施方案中，改变一种或多种测定条件(例如，测 定缓冲液的盐浓度)以降低基于纤连蛋白的结合分子对期望抗原的亲和力。在另一实施方 案中，缩短允许基于纤连蛋白的结合分子与期望抗原结合的时间长度。在另一实施方案中， 在蛋白质-蛋白质相互作用测定法中增添竞争性结合步骤。例如，首先使基于纤连蛋白的 结合分子与期望的固定化抗原结合。然后添加特定浓度的非固定化抗原，其起与固定化抗 原竞争结合的作用，从而抗原亲和力最低的基于纤连蛋白的结合分子从固定化抗原上洗脱 掉，导致选择出抗原结合亲和力提高的基于纤连蛋白的结合分子。测定条件的严谨度可进 一步通过增加添加到测定中的非固定化抗原的浓度来增加。本发明的筛选方法还可能需要多轮选择，以富集抗原结合性提高的一种或多种基 于纤连蛋白的结合分子。在一个实施方案中，在每一轮选择中，向基于纤连蛋白的结合分子 中引入进一步的氨基酸突变。在另一实施方案中，在每一轮选择中，增加与期望抗原结合的 严谨度，以选择抗原亲和力增加的基于纤连蛋白的结合分子。制备方法本发明基于纤连蛋白的结合分子一般通过重组表达产生。编码所述分子的核酸插 入到表达载体中。编码所述分子的DNA区段于表达载体中有效连接确保其表达的控制序 列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如天然相伴或异源的启动子)、信号序列、增 强子元件和转录终止序列。优选表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的 真核启动子系统。一旦载体已经掺入到适当的宿主中，则宿主在适合于高水平表达所述核 苷酸序列、以及收集和纯化交叉反应的基于纤连蛋白的结合分子的条件下维持。这些表达载体一般可作为游离体或者宿主染色DNA的整合部分而在宿主生物体 中复制。通常表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或 新霉素抗性)，以允许检测转化了期望的DNA序列的那些细胞(参见例如Itakura等，美国 专利 4，704，362)。大肠杆菌是一种尤其可用于克隆本发明多核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。 其他适合于应用的微生物宿主包括芽孢杆菌属(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),以及其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌属(Salmonella)、沙 雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)菌种。其他微生物例如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤氏酵母属 (Pichia)为例示性的酵母宿主，适宜载体按期望具有表达控制序列(例如启动子)、复制起 点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动 子包括例如来自醇脱氢酶、异细胞色素CGsocytochrome C)以及负责甲醇、麦芽糖和半乳 糖利用的酶的启动子。除了微生物，哺乳动物组织培养也可以用来表达和生产本发明的多肽(例如 编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker，From Genesto Clones, VCHPublishers, N. Y.，N. Y. (1987)。实际上优选真核细胞，因为本领域已经研发了许多能够 分泌异源蛋白质(例如完整免疫球蛋白)的适宜宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、多种 COS细胞系、HeLa细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞以及杂交瘤。这些细胞的表 达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol. Rev. 89 49(1986))，以及必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化 位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列为来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛 乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等，J. Immunol. 148 =1149(1992)。
可选地，编码序列可掺入到转基因中，以引入到转基因动物的基因组中，随后在 转基因动物乳汁中表达(参见例如Deboer等，U. S. 5，741，957，Rosen, U. S. 5，304，489和 Meade等，U. S. 5，849，992)。适宜的转基因包括轻链和/或重链编码序列，有效连接于来自 乳腺特异性基因例如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子。含目的多核苷酸序列和表达控制序列的载体可通过公知的方法转移到宿主细胞 中，所用方法取决于细胞宿主的类型。例如，可以短暂热击化学感受态原核细胞，而磷酸钙 处理、电穿孔、脂转染(lipofection)、生物轰击(biolistics)或基于病毒的转染可用于 其它细胞宿主(一般参见 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press，第二版，1989)。其他用来转化哺乳动物细胞的方法包括应用 polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等，同前)。为 产生转基因动物，转基因可显微注射到受精卵中，或者可掺入到胚胎干细胞的基因组中，并 将此类细胞的细胞核转移到去核卵细胞中。本发明基于纤连蛋白的结合分子一经表达，则可按照本领域的标准方法纯化， 包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(一般参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag, N. Y.，(1982))。对于制药用途，优选基本上纯的、至少约 90-95%均质的分子，最优选98-99%或更高均质性。组合物本发明基于纤连蛋白的结合分子(及其变体、融合物和缀合物)具有体外和体内 诊断和治疗用途。从而，本发明还提供了组合物，例如药物组合物，含有与可药用载体配制 在一起的一种或组合的基于纤连蛋白的结合分子(或其变体、融合物和缀合物)。本发明的 药物组合物还可以在组合治疗中给药，即与其他药剂组合。例如，组合治疗可包括本发明的 组合物连同至少一种或多种其他治疗剂，例如抗炎药、抗癌药和化疗剂。本发明的药物组合物还可联合放射治疗给药。与其他基于纤连蛋白的分子共给药 也涵盖在本发明中。如本文所用，“可药用载体”包括任何及所有生理上相容的溶剂、分散介质、衣料、 抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠 外、脊髓或表皮给药(例如，通过注射或输注)。取决于给药路径，活性化合物，即抗体、双特 异性和多特异性分子，可用保护化合物免受酸及其他可能使化合物失活的天然条件作用的 材料进行包衣。“可药用盐”是指保留亲本化合物的期望生物学活性而不带来任何不期望的毒性 效应的盐(参见例如Berge，S. Μ.，等(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1_19)。此类盐的实例包括 酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及无毒有机酸(例如脂肪族单羧酸和脂肪族二羧酸、苯基取代的 链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族磺酸和芳族磺酸等)的那些盐。碱加成盐包括衍生自 碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)以及无毒有机胺(例如N，N’ _ 二苄基乙二胺、N-甲基葡 糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些盐。本发明的组合物可通过多种本领域公知的方法给药。如技术人员将会理解的那 样，给药路径和/或给药方式将取决于期望的结果。活性化合物可与防止化合物快速释 放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可利用生物 可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和 聚乳酸。许多制备此类制剂的方法被授予专利或是本领域技术人员普遍已知。参见例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson编辑,Marcel Dekker, Inc. , New York,1978。为通过某些给药路径给药本发明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料包 衣化合物，或与该材料共给药化合物。例如，化合物可以在适当的载体例如脂质体或稀释剂 中施用于受试者。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF 乳化剂以及常规脂质体(Strejan 等(1984) J. Neuroimmunol. 7 27)。可药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于即时制备无菌注射液或分散液 的无菌粉剂。此类介质和试剂用作药物活性物质的用途在本领域已知。除非与活性化合物 不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑在本发明药物组合物中使用。增补活性化合 物也可掺入到组合物中。治疗性组合物一般必需是无菌的，并在生产和储存条件下稳定。组合物可以配制 为溶液、微乳、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质， 含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)，及其适宜的混合物。 恰当的流动性可例如通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大 小，以及通过应用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、 多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可注射组合物的延时吸收可通过在组合物中纳入延 迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸盐和明胶。无菌可注射溶液可通过按需要将处于适当溶剂中的所需量的活性化合物与一种 或组合的上文列举的成分掺在一起、接着微滤除菌来制备。一般而言，分散体通过将活性 化合物掺入到含有基本分散介质和上文列举的那些所需其他成分的无菌媒介物中来制备。 在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥 (冻干)，从之前的无菌过滤溶液得到活性成分外加任何其他期望成分的粉剂。调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个大 剂量(bolus)，可以在一段时间给药几个分剂量，或者可以按照治疗情形的紧急情况所指示 的那样成比例地降低或增加剂量。例如，本发明基于纤连蛋白的结合分子可以每周一次或 两次皮下注射给药，或者每月一次或两次皮下注射。特别有利的是以剂量单位形式配制胃 肠外组合物，以易于给药和统一剂量。如本文所用的剂量单位形式是指适于作为单个剂量 用于待治疗受试者的、物理上离散的单位；每个单位含有经计算可以产生期望治疗效果的 预定量的活性化合物以及所需药物载体。本发明剂量单位形式的规格受制于并直接取决 于(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对配制此类活
25性化合物用于治疗造成的本领域固有限制。可药用抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸 盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、 丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3) 金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。对于治疗组合物，本发明的制剂包括适合于口服、鼻腔、局部(包括颊和舌下)、直 肠、阴道和/或胃肠外给药的那些。制剂可以便利地以单位剂量形式存在，并且可以通过药 学领域公知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分量将取决 于待治疗的受试者和具体的给药方式。可与载体材料组合以产生单个剂量形式的活性成分 量一般是产生治疗效果的组合物的量。一般而言，在100%当中，该量范围将是约0.001% 至约90%的活性成分，优选约0. 005%至约70%，最优选约0. 01%至约30%。本发明适合于阴道给药的制剂还包括含有本领域已知适当的此类载体的栓剂、棉 塞剂、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。用于局部或透皮给药本发明组合物的剂型包括 粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴片和吸入剂。活性化合物可以在无菌 条件下与可药用的载体、与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。如本文所用的短语“胃肠外给药”和“经胃肠外给药”表示除消化道和局部给药之 外的给药方式，通常通过注射，并且包括，但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、包膜内、 眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜 外和胸骨内注射和输注。本发明的药物组合物中可采用的适宜水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多 元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射 的有机酯，例如油酸乙酯。恰当的流动性例如，可通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况 下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂来维持。这些组合物还可以含有助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止存在微 生物既可以通过同前的灭菌方法、又可以通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂来确保，例如 对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可能期望在组合物中纳入等渗剂，例如糖、氯 化钠等。另外，可注射药物形式的延时吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂来实现，例如单硬 脂酸铝和明胶。当本发明的化合物作为药物对人和动物给药时，它们可以单独地或作为含有例如 0. 001-90% (更优选0. 005-70%，例如0. 01-30% )活性成分连同可药用载体的药物组合
物给予。不管选择的给药路径如何，本发明的化合物(其可以以适宜的水合形式应用)和/ 或本发明的药物组合物均可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用的剂型。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于具体的患 者、组合物和给药方式而言能有效实现期望治疗反应、而对该患者无毒的活性成分量。选择 的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明具体组合物或其酯、盐或 酰胺的活性，给药路径，给药时间，所采用具体化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采 用的具体组合物组合应用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、 病情、总体健康和既往病史，以及医学领域公知的类似因素。具有本领域普通技术水平的医师或兽医能够容易地确定和开处有效量的所需药物组合物。例如，医师或兽医可以以比为 实现期望治疗效果所需低的剂量开始给予用于药物组合物中的本发明化合物，并逐渐增加 剂量，直至实现期望的效果。一般而言，本发明组合物适宜的日剂量将是有效产生治疗效果 的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量一般将取决于上文所述的因素。优选给药是静脉 内、肌肉内、腹膜内或皮下，优选在靠近靶部位处给药。如果期望，治疗组合物的有效日剂量 可以在一整天以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量来给 药，任选以单位剂量的形式。虽说可以单独给药本发明的化合物，但是优选以药物制剂(组 合物)形式给药所述化合物。治疗组合物可用本领域已知的医疗装置给药。例如，在优选的实施方案中，本发 明的治疗组合物可用无针头皮下注射装置给药，例如美国专利No. 5，399，163,5, 383，851、 5，312，335,5, 064，413,4, 941，880,4, 790，824 或 4，596，556 中所述的装置。公知的可 用于本发明的植入物和器件的实例包括美国专利No. 4，487，603，其公开了以可控速 率分配药物的可植入微输注泵；美国专利No. 4，486，194，其公开了通过皮肤给药药物 的治疗装置；美国专利No. 4，447，233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输 注泵；美国专利No. 4，447，224，其公开了用于连续药物递送的可变流可植入输注装置； 美国专利No. 4，439，196，其公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统；以及美国专利 No. 4，475，196，其公开了渗透药物递送系统。许多其他此类植入物、递送系统和器件为本领 域技术人员已知。在某些实施方案中，可配制本发明的分子以确保体内恰当的分布。例如，血脑屏障 (BBB)排除许多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗性化合物穿过BBB (如果期望的 话)，可例如在脂质体中配制之。有关制备脂质体的方法，参见例如U. S.专利4，522，811; 5，374，548和5，399，331。脂质体可以含有选择性运输到特定细胞或器官中的一个或多个 部分，从而增强靶向药物递送(参见例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 685)。 例示性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如授予Low等的美国专利5，416，016)；甘露 糖苷(Umezawa 等，(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)；抗体(P. G. Bloeman 等(1995)FEBS Lett. 357 140 ;Μ· Owais 等(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39 180)；表面活性剂蛋白 A 受体(Briscoe 等(1995)Am. J. Physiol. 1233 134)，其不同类 型以及所发明分子的组分可以含有在本发明制剂中；pl20 (Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269 9090)；还请参见 K. Keinanen ；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346 123 ； J. J. Killion ；I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4 :273。在本发明的一个实施方案中，本 发明的治疗化合物配制在脂质体中；在更优选的实施方案中，脂质体包括靶向部分。在最优 选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过在靠近肿瘤或感染的部位快速浓注来递送。 组合物必须具有达到易于注射程度的流动性。其在制备和储存条件下必需稳定，并且必需 防止其遭到微生物如细菌和真菌的污染。在另一实施方案中，可配制本发明的分子以防止或减小跨胎盘运输。这可通 过本领域已知的方法进行，例如通过聚乙二醇化基于纤连蛋白的结合分子。更多参 考可见 Cunningham-Rundles C， Zhuo Z， Griffith B， Keenan J. (1992)Biological activities of polyethylene-glycolimmunoglobulin conjugates.Resistance to enzymatic degradation. JImmunol Methods. 152 :177_190 ； 以 及 Landor Μ. (1995)
27Maternal-fetaltransfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74 279-283。这在基于纤连蛋白的结合分子用于治疗或预防复发性自然流产时尤其相关。化合物抑制癌症的能力可在能预测人肿瘤中的功效的动物模型系统中进行评价。 可选地，组合物的这种特性可通过利用技术人员已知测定法研究化合物抑制的能力、例如 体外抑制作用来评价。治疗有效量的治疗化合物能够降低肿瘤大小，或以其他方式缓解受 试者症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的个头、受试者症状的严重程度以 及所选择的具体组合物或给药路径等因素来确定这样的量。就组合物可通过注射器递送而言，组合物必需是无菌流动的。除了水，载体可以是 等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适宜的混合 物。例如，可通过应用衣料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通 过应用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如 糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、和氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物纳入 延迟吸收的药剂来实现，例如单硬脂酸铝或明胶。当活性化合物如上文所述进行了适当的保护时，化合物可以口服给药，例如，用惰 性稀释剂或可同化可食用的载体。治疗和诊断应用可以构建本文所述的基于纤连蛋白的结合分子以结合任何目的抗原，并且可以修 饰之以具有增加的稳定性和半衰期以及其他功能部分。相应地，这些分子可在使用抗体的 所有领域中，包括研究、治疗和诊断领域，采用以替代抗体。另外，由于这些分子拥有比抗体 优越的溶解性和稳定性特性，本文所述的抗体模拟物还可以在将破坏或失活抗体分子的条 件下应用。例如，可向培养中(例如体外或离体)或受试者(例如体内)中的细胞施用这些分 子，以治疗、预防或诊断多种紊乱。如本文所用的术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非 人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、 牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。当纤连蛋白分子与其他药剂一起给药时，两者可以按任何 次序或同时给药。在一个实施方案中，本发明基于纤连蛋白的结合分子(及其变体、融合物和缀合 物)可用来检测该分子所结合的靶标和/或双特异性/多特异性纤连蛋白基结合分子所结 合的靶标的水平。例如，这可通过使样品(例如体外样品)和对照样品与所述分子在允许分 子和靶标之间形成复合物的条件下接触来实现。检测分子和靶标之间形成的任何复合物， 并在样品和对照之间进行比较。例如，可利用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测 方法，如ELISA、FACS和流式细胞计测定法。同样落在本发明范围内的是试剂盒，其含有本发明的组合物(例如，基于纤连蛋 白的结合分子、其变体、融合物和缀合物)和使用说明。试剂盒可进一步含有至少一种其他 试剂，或一种或多种本发明的其他纤连蛋白分子(例如，具有互补活性、与区别于第一分子 的靶抗原上的表位结合的抗体)。试剂盒一般包括表明试剂盒内含物的目的用途的标签。 术语标签包括试剂盒上或与之附随提供的、或以其他方式与试剂盒相伴的任何书面或记录 材料。如上文所述，本发明的分子可以在研究、治疗和诊断领域的所有方面采用。可利用
28本发明基于纤连蛋白的结合分子(及其变体、融合物和缀合物)治疗的例示性疾病/紊乱 包括，但不限于，自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾 病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精神性疾病、眼科疾病、增生、糖尿病性视网膜病、 黄斑变性、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、糖尿病、结节病、哮喘、 水肿、肺高压、银屑病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、Osler-Webber氏综合症、心肌血 管新生、斑块内新生血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病性关 节病、血管纤维瘤、纤维化伴慢性炎症、肺纤维化、淀粉样变、阿尔茨海默氏病、器官移植排 斥、深静脉血栓、或创面肉芽(wound granulation)。一个实施方案中，本发明分子可以用于治疗自身免疫病，例如，急性特发性血小板 减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、Sydenham舞蹈病、重症肌无力、系统性 红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、过敏性紫癜 (Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu关节炎、Addison 氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多 动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture氏综合症、血栓闭塞性脉管炎、Sjogren氏综合症、原 发性胆汁性肝硬化、Hashimoto甲状腺炎、甲状腺毒症(即Graves病)、硬皮病、慢性活动性 肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索 硬化症、脊髓痨(tabes dorsalis)、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、 银屑病、或致纤维性肺泡炎。另一实施方案中，本发明分子可以用于治疗癌症。可以靶向的示例性癌症类型包 括急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、胆囊癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血 病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、 甲状腺髓样癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、前 列腺癌、神经胶质和其它脑和脊髓肿瘤、和膀胱癌。另一实施方案中，本发明分子可以用于治疗病原性生物例如细菌、病毒、真菌 或单细胞寄生虫感染。可以治疗的示例性真菌包括小孢霉属(Microsporum)、发藓菌属 (Trichophyton)、表皮藓菌属(Epidermophyton)、申克抱子丝菌(Sporothrix schenckii)、 新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组 织胞菜菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色 念珠菌(Candida albican) 0示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病 毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、Sendai病毒、猫白血病病 毒、呼肠弧病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小病毒样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、 小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞 白血病病毒、EB病毒、小鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水疱性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴 细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病毒。示例性细菌包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis), 无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、月市炎军团菌(Legionella pneumophilia)、 化脓性链球菌(Sti^ptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟 菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌属 ^J禾中(Pneumococcus spp. )、胃口f H干胃 B (Hemophilis influenzae B) > ^ S WilM # (Treponema pallidum)、！ξ _ _ 旋 # (Lyme diseasespirochetes)、tM M fx Ifi胃(Pseudomonas aeruginosa) > M ^ fe If lif (Mycobacterium leprae)、 ，$ I 氏 菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或支原体属 (Mycoplasma)。示例性寄生虫包括兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、贾第虫属物种(Giardia spp.)、卡氏月市孢子虫(Pneumocystis carinii)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫 属物种(Cryptospordium spp.)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba spp.)、耐格里原虫属物 种(Naegleria spp.)、利什曼原虫属物种(Leishmania spp.)、结肠小袋虫(Balantidium coli)、伊氏维虫(Trypanosoma evansi)、维虫属物种(Trypanosoma spp.)、脆弱双核阿 米巴(Dientamoeba fragilis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛滴虫属物种 (Trichmonas spp.)、内阿米巴属物种(Entamoeba spp.)、双核阿米巴属物种(Dientamoeba spp.)、巴贝虫属物种(Babesia spp.)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、等孢子 球虫属(Isospora spp.)、弓形体属物种(Toxoplasma spp.)、肠上皮细胞微孢子虫属 物种(Enterocytozoon spp.)、月市囊虫属物种(Pneumocystis spp.)禾口小袋虫属物种 (Balantidium spp.)。治疗和诊断应用可以构建本文所述的基于纤连蛋白的结合分子，以结合任何目的抗原或靶标。此 类靶标包括但不限于簇结构域、细胞受体、细胞受体配体、生长因子、白介素、蛋白质变应 原、细菌或病毒(参见例如图7A-C)。还可以修饰本文所述的基于纤连蛋白的结合分子，以 具有增加的稳定性和半衰期，以及其他功能部分。相应地，这些分子可在使用抗体的所有 领域中采用以替代抗体，包括研究、治疗和诊断领域。另外，由于这些分子拥有比抗体优越 的溶解性和稳定性特性，本文所述的抗体模拟物还可以在破坏或失活抗体分子的条件下应 用。本发明进一步通过如下实施例举例说明，其不应阐释为进一步的限制。本申请通 篇引述的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容明确并入本文作为参考。
实施例所有实施例中使用如下材料和方法，除非另有说明。材料和方法一般而言，除非另有说明，本发明的实施采用化学、分子生物学、重组DNA技 术、免疫学(特别是例如抗体技术)的常规技术、和多肽制备的标准技术。参见例如 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis，Molecular Cloning ；Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Antibody EngineeringProtocoIs(Methods in Molecular Biology)，510， Paul，S. , Humana Pr (1996) ；Antibody Engineering :A Practical Approach (Practical Approach Series，169)， McCafferty 编 辑，Irl Pr(1996) ；Antibodise :A Laboratory Manual，Harlow 等，C. S. H. L. Press, Pub. (1999)； 禾口 Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel 等编辑，John Wiley&Sons (1992) 0 适合用来实施本发明的 其他方法、技术和序列见 U. S.专利 No. 7，153，661 ；7，119，171 ；7，078，490 ；6，703，199 ； 6，673，901 和 6，462，189。序列
30
通篇使用如下序列野牛型Fn3序列VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)野牛型Fn3序列(RGD至RGA)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 2)结合TNF的Fn3序列VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 3)结合TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 4)结合VEGFR 的 Fn3GEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ ID NO 76)dsbA信号序列MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQID NO 5)CD33信号序列土结合TNF的Fn3序列MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT (SEQ ID NO 6)CD33 信号序列 + 结合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPffASTATIS GLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT (SEQ ID NO 7)⑶33信号序列+野生型Fn3MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 8)CD33信号序列+野生型Fn3 (RGD变成RGA)MPLLLLLPLLWAGALAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 9)CD33信号序列+结合VEGFR的Fn3MPLLLLLPLLWAGALAGEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT(SEQ IDNO 77)结合TNF的纳米抗体QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEIN
TNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS(SEQ ID NO: 10)结合TNF的单域抗体DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO: 11)抗HSA结合剂EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDEY匪SWVRQAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSS_(SEQ ID NO: 12)抗MSA结合剂DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSIIKHLKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGARWPQTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO: 13)抗RSA结合剂DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 78)人血清白蛋白(HSA)DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLLAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶KLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR
YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO: 14)大鼠血清白蛋白(RSA)EAHKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCPYEEHIKLVQEVTDFAKTCVADENAENCDKSIHTLF⑶KLCAIPKLRDNYGELADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPPFQRPEAEAMCTSFQENPTSFLGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEKYNEVLTQCCTESDKAACLTPKLDAVKEKALVAAVRQRMKCSSMQRFGERAFKAWAVARMS QRFPNAEFAEITKLATDVTKINKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQACCDKPVLQKSQCLAEIEHDNIPADLPSIAADFVEDKEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAE⑶PPACYGTVL
32
AEFQPLVEEPKNLVKTNCELYEKLGEYGFQNAVLVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEAQRLPCVEDYLSAILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHS DICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATEDQLKTVMGDFAQFVDKCCKAADKDNCFATEGPNLVARSKEALA(SEQID NO 79)hlgGlFcKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 15)引物(1)5' gggcggaccgatgctcataaatctgaagtcgc3' (F)(SEQ ID NO 16)(2)5' gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgcaaaccaagtgcggcctgactggc cgc3，(R)(SEQID NO 17)(3)5，cagact agatct gtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F)(SEQ ID NO 18)(4)5' cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagtta atgctgatcgg3，(R)(SEQ ID NO 19)(5)5' cagactggatccgccaccgccgctgccaccaccgccagaaccgccaccaccggtgcgatagtta atgctaatcggtttg3，(R)(SEQ ID NO 20)(6)5，cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F) (S EQ ID NO 21)(7)5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatag ttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 22)(8)5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcgatag ttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 23)(9)5，cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F) (SEQ ID NO 24)(10)5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcg atagttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 25)(11) 5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcacaagctgcagcggtgcg atagttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 26)(12)5，cagactcatatggtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F) (SEQ ID NO 27)(13) 5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgata gttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 28)(14)5' ctgactggatccttaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcgata gttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 29)(15)5，cagactggatccgtgagcgatgtgccgcgtgatc3，(F)(SEQ ID NO 30)(16) 5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcg atagttaatgctgatc3，(R)(SEQ ID NO 31)(17) 5' ctgactaagctttcattaatggtgatgatgatgatgtgccgcagcctaagctgcagcggtgcg atagttaatgctaatc3，(R)(SEQ ID NO 32)
33
(18) 5，gggcggaccggcaaatcttgtgacaaaactcacacatgc3，(F)(SEQ ID NO 33)(19)5' gggtttaaactctagatcatcaatgatgatgatgatggtgtttacccggagacagggagaggc 3，(R) (SEQ IDNO 34)(20)5， cgtgcgagccagagcattagctcttacctgaactggtatcagcagaaaccg 3， (F)(SEQ ID NO 80)(21)5，cggtttctgctgataccagttcaggtaagagctaatgctctggctcgcacg 3，(R) (SEQ ID NO 81)(22) 5，cgaaactgctgatttatcgcaacagcccgctgcagagcggtgtgcc 3，(F)(SEQ ID NO: 82)(23) 5，ggcacaccgctctgcagcgggctgttgcgataaatcagcagtttcg 3，(R)(SEQ ID NO: 83)(24) 5，cctattattgccagcagacttaccgtgttccgccgacctttggccagggcacc 3，(F) (SEQ ID NO 84)(25) 5，ggtgccctggccaaaggtcggcggaacacggtaagtctgctggcaataatagg 3，(R)(SEQ IDNO 85)(26)5' gggcggaccgaagcacacaagagtgagatcgc 3，(F) (SEQ ID NO 86)(27)5' gggtttaaacgggccctctagatcatcaatgatgatgatgatggtgggctaaggcttctttgc ttctagc 3，(R)(SEQ ID NO 87)(28)5，atggattccaaaacgccgttctggttcgatacacc 3，(F)(SEQ ID NO 88)(29)5，ggtgtatcgaaccagaacggcgttttggaatccat 3，(R) (SEQ ID NO 89)(30)5，accaaattggcaacagacgtcaccaaaatcaacaagg 3，(F) (SEQ ID NO :90)(31)5，ccttgttgattttggtgacgtctgttgccaatttggt 3，(R)(SEQ ID NO 91)实施例实施例1CDR 移植利用计算模建，将来自结合TNF的纳米抗体(SEQ ID NO 10)的⑶R环 1 (SGFTFSDYWM-SEQ ID NO 35)和环 3 (RSPSGFNR-SEQ ID NO 36)移植到野生型人纤连蛋白 III型组件第10结构域(“"^113”或“野生型Fn3”)的构架上。结合TNF的纳米抗体和野 生型Fn3分子的氨基酸序列如下结合TNF的纳米抗体(SEQ ID NO 10)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS野生型Fn3(SEQ ID NO 1)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT 利用相同的方法，将来自结合TNF的单域抗体(SEQ ID NO 40)的⑶R环 1 (SQAIDSY-SEQ ID NO 38)和环 3 (QVVWRPFT-SEQ ID NO 39)移植到野生型 Fn3 上。结合 TNF的单域抗体的氨基酸序列如下
结合TNF的单域抗体(SEQ ID NO 40)Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lieThr Cys Arg Ala Ser Gln Ala lie Asp SerTyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly LysAla Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Leu Pro Glu Asp Phe AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro PheThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys ValGlu lie Lys Arg然后优化下文所示形式的DNA序列以在大肠杆菌中表达，并在德国Geneart AG公 司制备。所得的DNA片段用Ndel/BamHI消化，并连接至pET9a的相应位点(适当的侧翼 DNA序列被添加到如下形式中)。形式 1)具有来自结合TNF的纳米抗体的⑶Rl和⑶R3环的野生型Fn3-His标签 (pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO 41)2)具有来自结合TNF的纳米抗体的⑶Rl和⑶R3环的野生型Fn3_Hi s标签 (pET9a)，其中从该序列中去除了头8个氨基酸EVVAATPTSLLISWDASGFTFSDYWMRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYRSPSGFNRISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO 42)3)具有来自结合TNF的单域抗体的⑶Rl和⑶R3环的野生型Fn3_Hi s标签 (pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLL1SWDASQA1DSYYR1TYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYQVVffRPFTPISINYRTHHHHHH(S EQ ID NO 43)4)具有来自结合TNF的单域抗体的⑶Rl和⑶R3环的野生型Fn3_Hi s标签 (pET9a)，其中从该序列中去除了头8个氨基酸EVVAATPTSLLISWDASQAIDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYQVVffRPFTPISINYRTHHHHHH(SEQ ID NO 44)利用连接混合物转化XLl-Blue或DH5 α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测序来验 证。构建体在包括BL21(DE3)在内的若干大肠杆菌菌株中表达。在诱导和表达之后，细胞 沉淀冷冻在_20°C，然后重悬于裂解缓冲液(20mM NaH2PO4、IOmM咪唑、500mM NaCl、每50ml 缓冲液 1 片无EDTA 的 Complete (Roche)、2mM MgCl2、10U/ml Benzonase (Merck) [pH7. 4]中。 细胞在冰上超声破碎并离心。上清液过滤，并上样到M-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(同 裂解缓冲液，但具有20mM咪唑)洗涤，然后用洗脱缓冲液(同裂解缓冲液，但高达500mM咪 唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分析，然后在Amicon Ultra_15管中浓
35缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用IOmM Tris或PBS洗脱。样品再次在 Bis-Tris凝胶上分析。实施例2#封千连屈S好ffl槐細_基于对野生型Fn3序列的检查，鉴定了作为进行氨基酸修饰的潜在位点的位置， 所述修饰为例如用半胱氨酸或非天然氨基酸残基进行取代以促进聚乙二醇化。例如，如下 所述分析了丝氨酸残基。总共11个丝氨酸残基，在下面的序列中以下划线标出；还参见图 1，其显示了野生型Fn3分子，其中丝氨酸残基以枝杈表示。野生型Fn3VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)分析中排除了靠近结合表面的丝氨酸残基，例如属于N-末端区域并还与TO和BC 环接触的Ser 2 (在下面的序列中以下划线标出的Ser残基)。 VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)Ser 53-Ser 55——这些残基属于DE环(在下面以下划线标出)。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)Ser 81-Ser 84-Ser 85——这些残基属于!7G环(在下面以下划线标出)。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)进行修饰的候选丝氨酸包括Ser 17-Ser 21-Ser 43-Ser 60_Ser89。这些丝氨酸 残基均暴露于溶剂，并且除Ser 43之外，它们都是β链的一部分(见图2)。Ser 17和Ser21分别位于B链的起点和末端。Ser 60位于E链的末端。Ser 21和Ser 60位于两个相邻的链上，所述两链形成纤连蛋白的三链片层。Ser 89位于G链的中部，G链也是形成4链片层的最后一条链。相应地，Ser 89 也暴露于溶剂，并且是外部分子可及的。Ser 43位于分子底部，属于CD环，处于朝向溶剂弯曲的环末端(见图2)。用于潜在修饰位点的其他残基包括位于β链上并暴露于溶剂的如下残基 V11-L19-T58-T71 (在下面的序列中以下划线标出)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISffDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 1)参照图3，显示了三链片层(链A-B-E)。片层底部分布着候选残基Serl7和Ser 60。候选残基Ser 21位于顶部。Ser 55已经排除，因其靠近结合表面。位于靠近A链起点的缬氨酸11似乎在纤连蛋白组件序列中并不保守。位于B链中部的亮氨酸19也不是保守位置。苏氨酸58位于E链末端。参照图4(支架另一侧；4链片层)，苏氨酸71的定位靠近Ser 89。此位置也不保 守。需要注意的是，纤连蛋白分子的这部分形成一种“C”结构。re环和CD环彼此相望(见图5)。视与分子相连的PEG分子的大小而定，分子该侧可能不易于聚乙二醇化。实施例3Fn3序列的聚乙二醇化结合TNF 的 Fn3 (SEQ ID NO :3)、结合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T) (SEQ ID NO :4)、野生 型Fn3(SEQ ID NO 1)和野生型Fn3 (RGD至RGA) (SEQ ID NO 2)的聚乙二醇化利用(1)半 胱氨酸和⑵非天然氨基酸如下进行，以增加Fn的半衰期。结合TNF 的 Fn3VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 3)结合TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRT(SEQ ID NO 4)野牛型Fn3VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO !)野牛型Fn3序列(RGD至RGA)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRT(SEQ ID NO 2)利用半胱氨酸聚乙二醇化优化对应于前述结合TNF的Fn3和野生型Fn3序列的DNA序列，以在大肠杆菌中 表达，并在德国Geneart AG公司制备。为插入C-末端半胱氨酸残基，结合TNF的序列利用 引物6(SEQ ID NO 21)和7 (SEQ IDNO :22)扩增，而野生型序列利用引物6 (SEQ ID NO 21) 和8 (SEQ IDNO 23)扩增(参见上文材料和方法章节所述的引物)。PCR产物用Ndel/BamHI 消化，并克隆至pET9a的相应位点。另夕卜，结合TNF的序列还利用引物9 (SEQ ID NO 24)和 10 (SEQ ID NO :25)扩增，而野生型序列利用引物 9 (SEQ ID NO 24) ^P 11 (SEQ ID NO 26) 扩增。PCR产物用BamHI/Hindlll消化，并克隆至带有dsbA信号序列的pQE_80L的相应位 点ο形式 1)结合 TNF 的 Fn3 序列 _3xA 接头 _C_3xA 接头-His 标签(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASIATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 48)2)结合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)序列-3xA 接头 _C_3xA 接头-His 标签(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 49)3)野生型Fn3序列_3xA接头_C_3xA接头-His标签(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSK
37
STATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 50)4)野生型 Fn3 (RGD 至 RGA)序列 _3xA 接头 _C_3xA 接头-His 标签(pET9a)VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO:51)4) dsbA信号序列-结合TNF的Fn3序列_3xA接头-C_3xA接头-His标签 (PQE-80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSRLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPffASLATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 52)5) dsbA 信号序列-结合 TNF 的 Fn3 (R18L&I56T)序列-3xA 接头 _C_3xA 接头-His 标签(PQE-80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNRSGLQSRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPWASTATISGLKPGVDYTITVYAVTDKSDTYKYDDPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 53)6) dsbA信号序列_野生型Fn3序列_3xA接头_C_3xA接头-His标签(pQE_80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQIDNO 54)7) dsbA信号序列_野生型Fn3 (RGD至RGA)序列_3xA接头_C_3xA接头-Hi s标签 (PQE-80L)MKKIWLALAGLVLAFSASAGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY
RITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTAAACAAAHHHHHH(SEQ ID NO 55)8)野生型 Fn 序列-(RGD 至 RGA) His 标签(pETOa)
MVS DVPRDLEVVAATPTS LLlSffDAPAVTVRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGASPASSKPISINYRTHHHHHH(SEQ IDNO 37)利用连接混合物转化XLl-Blue或DH5 α感受态细胞。阳性克隆通过DNA测 序来验证。构建体在包括KS474、TGl(-)和BL21(DE3)在内的若干大肠杆菌菌株中表 达。在诱导和表达之后，细胞沉淀冷冻在_20°C，然后重悬于裂解缓冲液(20mM NaH2PO4, IOmM 咪唑、500mM NaCl、每 50ml 缓冲液 1 片无 EDTA 的 Complete(Roche)、2mM MgCl2UOU/ ml Benzonase(Merck) [pH7. 4]中。细胞在冰上超声破碎并离心。上清液过滤，并上样到 Ni-NTA柱上。柱用洗涤缓冲液(同裂解缓冲液，但具有20mM咪唑)洗涤，然后用洗脱缓 冲液(同裂解缓冲液，但高达500mM咪唑)洗脱。样品在Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上 分析，然后在Amicon Ultra_15管中浓缩，上样到Superdex制备级柱(Amersham)上，并用 PBS [pH6. 5-7. 2]洗脱(有时在凝胶过滤之前应用温和还原)。样品再次在Bis-Tris凝胶 上分析。纯化的蛋白质补充DTT (终浓度10 μ M)，然后通过Amicon Ultra_4管，IOOk过滤 以除去内毒素。使用HiTrap脱盐柱去除DTT。样品于pH 5. 5的50mM 缓冲液中，在室温与5-10摩尔过量的PEG-马来酰亚胺偶联约4小时，通过SDS-PAGE和MS分析聚乙二醇 化的效率。通过HiTrap-SP-FF柱、接着用PBS或Tris透析而除去过量的PEG。与相应抗原 的结合通过ELISA来验证。PEG化位点通过还原、烷基化和胰蛋白酶消化来确定。IOOyg 样品干燥，于100 μ 1终体积中与6. 4Μ尿素、0. 32Μ NH4CO3及0. OlM DTT在50°C于氩气下温 育30分钟，然后加入IAA (0. 03M)，室温暗中温育15分钟。样品脱盐、干燥、然后于50 μ 1终 体积中与0. 8Μ尿素、0. 04Μ NH4C03、0. 02M Tris, pHIO及1 μ g胰蛋白酶温育，并通过LC-MS 分析。在体内测定这些构建体的半衰期。每种化合物10mg/kg通过静脉内施用给Lewis 大鼠(η = 3)，于给药前、1、2、4、8、24、48、96、192和384小时取样。使用CM5芯片和标准胺 偶联进行Biacore分析。流室(flow cell) 1为空白(用EDC/NHS进行表面活化，随后用乙 醇胺失活)，用于参照扣除。流室2用THE抗HIS mAb (GenScript Corp)包被，用于PK读出。 流室3和4用施用给动物的化合物包被(表面饱和)，用于免疫原性读出。大鼠血清样品 用HBS-EP和NBS还原剂(Biacore ；终浓度lmg/ml) 1 8稀释。制备标准曲线用于化合物 定量，在大鼠血清(GeneTex)中制备施用给动物的相应化合物的1 2稀释系列，从20mg/ 1向下至0. 078mg/l。大鼠血清用HBS-EP和lmg/ml NSB还原剂1 8稀释。使用XLfit 4. 2拟合标准曲线数据，用于计算血清样品中的化合物浓度(PK)。使用WinNonlin软件计 算了化合物半衰期。使用非房室模型拟合PK数据。野生型10Fn3 (RGD至RGA)和野生型10Fn3 (RGD至RGA) cys在大肠杆菌中表达、纯 化并用SDS PAGE分析(图8a)。除了单体外，还观察到该半胱氨酸变体的二聚体。LC-MS 显示了未修饰物的质量为10. 85kDa，而半胱氨酸变体的质量为11.38kDa，这些分子量相应 于预期的蛋白质(数据未显示)。野生型10Fn3 (RGD至RGA) cys用30kDa PEG-马来酰亚胺修饰。图8b通过SDS-PAGE 显示存在PEG化蛋白质，这进一步通过MALDI-TOF MS得到证实。该PEG化样品显示出 42. 8kDa的丽，由于PEG导致了宽峰。PEG化位点通过对还原、烷基化和胰蛋白酶消化的PEG 化和非PEG化样品进行LC-MS分析而确定(数据未显示)。比较肽图谱显示，在PEG化样品 中缺了在RT 10. 89min的峰。该肽具有1527. 7Da的单种同位素丽，相应于预期蛋白质的 T [95-108]H(于位置99含有半胱氨酸的肽)(数据未显示)。体内数据显示，PEG化野生型10Fn3(图10)与未修饰的10Fn3(图9)比较具有 显著半衰期改善。未修饰的10Fn3的平均半衰期为0. 52h，而对于PEG化10Fn3这增加至 3. 6h(图11)。使用动物EV3不能检测到信号。该大鼠研究的结果说明，当制备为PEG化缀合物时，纤连蛋白(10Fn3)的体内血清 半衰期可以显著地延长。可以使用以下公式，将来自此大鼠研究的体内半衰期结果外推至人公式权利要求
包含与非Fn3部分连接的基于III型纤连蛋白(Fn3)的结合分子的缀合物，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3β链结构域序列和连接在每一Fn3β链结构域序列之间的环区序列，其中环区序列结合特异性靶标。
2.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分能够结合第二靶标。
3.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分增加Fn3基结合分子体内施用时的半衰期。
4.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分包含抗体Fc区。
5.权利要求4的缀合物，其中抗体Fc区与Fn3基结合分子融合于选自N末端区和C端 末区的区域。
6.权利要求4的缀合物，其中抗体Fc区与Fn3基结合分子融合于选自如下的区域环 区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区 域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
7.权利要求4的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大 至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
8.权利要求4的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期大 至少5-30倍。
9.权利要求4的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小 时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、 85-90 小时、90-95 小时、95-100 小时、100-150 小时、150-200 小时、200-250 小时、250-300 小时、350-400 小时、400-450 小时、450-500 小时、500-550 小时、550-600 小时、600-650 小时、650-700 小时、700-750 小时、750-800 小时、800-850 小时、850-900 小时、900-950 小时、950-1000 小时、1000-1050 小时、1050-1100 小时、1100-1150 小时、1150-1200 小 时、1200-1250 小时、1250-1300 小时、1300-1350 小时、1350-1400 小时、1400-1450 小时、 1450-1500 小时。
10.权利要求4的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少9.4小时。
11.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分包括血清白蛋白(SA)、或转铁蛋白、或其部分。
12.权利要求11的缀合物，其中血清白蛋白(SA)或其部分是人血清白蛋白(HSA)。
13.权利要求12的缀合物，其中HSA与Fn3基结合分子缀合于选自如下的区域环区、 β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端区域、 及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
14.权利要求12的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
15.权利要求12的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 大至少25-50倍。
16.权利要求12的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰 期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小 时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、 85-90 小时、90-95 小时、95-100 小时、100-150 小时、150-200 小时、200-250 小时、250-300 小时、350-400 小时、400-450 小时、450-500 小时、500-550 小时、550-600 小时、600-650 小时、650-700 小时、700-750 小时、750-800 小时、800-850 小时、850-900 小时、900-950 小时、950-1000 小时、1000-1050 小时、1050-1100 小时、1100-1150 小时、1150-1200 小 时、1200-1250 小时、1250-1300 小时、1300-1350 小时、1350-1400 小时、1400-1450 小时、 1450-1500 小时。
17.权利要求12的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少19.6小时。
18.权利要求12的缀合物，其中结合血清白蛋白(SA)、或转铁蛋白、或其部分的多肽是 抗人血清白蛋白(HSA)多肽或抗转铁蛋白多肽。
19.权利要求18的缀合物，其中抗人血清白蛋白(HSA)多肽或抗转铁蛋白多肽与Fn3 基结合分子缀合于选自如下的区域环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末 端的β链或β样链之间、N-末端区域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
20.权利要求18的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
21.权利要求18的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 大至少10-35倍。
22.权利要求18的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰 期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小 时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、 85-90 小时、90-95 小时、95-100 小时、100-150 小时、150-200 小时、200-250 小时、250-300 小时、350-400 小时、400-450 小时、450-500 小时、500-550 小时、550-600 小时、600-650 小时、650-700 小时、700-750 小时、750-800 小时、800-850 小时、850-900 小时、900-950 小时、950-1000 小时、1000-1050 小时、1050-1100 小时、1100-1150 小时、1150-1200 小 时、1200-1250 小时、1250-1300 小时、1300-1350 小时、1350-1400 小时、1400-1450 小时、 1450-1500 小时。
23.权利要求18的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少7.7小时。
24.权利要求1的缀合物，其中非Fn3部分包含聚乙二醇(PEG)。
25.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于巯基基团或胺基团。
26.权利要求24的缀合物，其中PEG部分通过定点聚乙二醇化与Fn3基结合分子连接。
27.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于Cys残基。
28.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于非天然氨基酸残基。
29.权利要求24的缀合物，其中PEG部分连接于Fn3基结合分子中选自如下的区域上 环区、β链区、β样链、C-末端区域、C-末端和最C-末端的β链或β样链之间、N-末端 区域、及N-末端和最N-末端的β链或β样链之间。
30.权利要求24的缀合物，其中PEG部分具有大约2kDa至大约IOOkDa的分子量。
31.权利要求24的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 大至少5倍、10倍、15倍、20倍、至少25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、150 倍、200 倍、250 倍、300 倍、350 倍、400 倍、450 倍、500 倍、550 倍、600 倍、650 倍、700 倍、750 倍、800 倍、850 倍、900 倍、950 倍、或 1000 倍。
32.权利要求24的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰期 大至少5-25倍。
33.权利要求24的缀合物，其中缀合物的半衰期比未缀合的Fn3基结合分子的半衰 期长至少2-5小时、5-10小时、10-15小时、15-20小时、20-25小时、25-30小时、35-40小 时、45-50小时、50-55小时、55-60小时、60-65小时、65-70小时、75-80小时、80-85小时、 85-90 小时、90-95 小时、95-100 小时、100-150 小时、150-200 小时、200-250 小时、250-300 小时、350-400 小时、400-450 小时、450-500 小时、500-550 小时、550-600 小时、600-650 小时、650-700 小时、700-750 小时、750-800 小时、800-850 小时、850-900 小时、900-950 小时、950-1000 小时、1000-1050 小时、1050-1100 小时、1100-1150 小时、1150-1200 小 时、1200-1250 小时、1250-1300 小时、1300-1350 小时、1350-1400 小时、1400-1450 小时、 1450-1500 小时。
34.权利要求24的缀合物，其中缀合物的体内半衰期为至少3.6小时。
35.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含与结合抗体Fc区的多肽连 接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3 β 链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性 靶标并具有至少9. 4小时的血清半衰期。
36.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含与人血清白蛋白(HSA)部分 连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3 β 链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性 靶标并具有至少19. 6小时的血清半衰期。
37.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含与结合人血清白蛋白(HSA) 部分的多肽连接的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至 少两个Fn3i3链结构域序列和连接在每一 Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合 物结合特异性靶标并具有至少7. 7小时的血清半衰期。
38.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含与PEG部分连接的基于纤连 蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3 β链结构域序列 和连接在每一 Fn3i3链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物结合特异性靶标并具有至 少3. 6小时的血清半衰期。
39.具有改善的药代动力学性质的缀合物，该缀合物包含与抗FcRn部分连接的基于 纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子，其中该Fn3基结合分子包含至少两个Fn3 β链结构域序列和连接在每一Fn3 β链结构域序列之间的环区序列，其中缀合物在酸性ρΗ以高亲和性 而在中性PH以低亲和性与新生儿FcR受体(FcRn)结合。
40.权利要求39的缀合物，其中酸性ρΗ为大约1至大约7。
41.权利要求39的缀合物，其中酸性ρΗ为大约6。
42.权利要求39的缀合物，其中中性ρΗ为大约7至大约8。
43.权利要求39的缀合物，其中中性ρΗ为大约7.4。
44.任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物，其中Fn3结构域来源于至少两种纤 连蛋白组件。
45.任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物，其中Fn3结构域来源于至少三种或 三种以上纤连蛋白组件。
46.包含编码任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物的序列的核酸。
47.包含与启动子有效连接的权利要求46的核酸的表达载体。
48.包含权利要求47的核酸的细胞。
49.权利要求48的细胞，其中细胞是哺乳动物细胞。
50.权利要求49的细胞，其中哺乳动物细胞是人哺乳动物细胞。
51.权利要求49的细胞，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
52.产生与靶标结合的任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物的方法，包括表 达包含编码任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物的序列的核酸。
53.权利要求52的方法，还包括在哺乳动物细胞中表达该核酸。
54.权利要求53的方法，其中哺乳动物细胞是人哺乳动物细胞。
55.权利要求53的细胞，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
56.包含任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀合物以及载体的组合物。
57.治疗受试者疾病的方法，所述疾病选自自身免疫病、炎症、癌症、感染性疾病、心血 管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精神性疾病、眼科疾 病、和移植排斥，该方法包括给受试者施用任何前述权利要求的结合分子、缀合物或组合 物。
58.在样品中检测蛋白质的方法，包括标记任何前述权利要求的Fn3基结合分子或缀 合物，使标记的结合分子或缀合物与样品接触，和检测结合分子或缀合物与蛋白质之间的 复合物形成。
59.包含缀合物的组合物用于治疗疾病的用途，所述疾病选自自身免疫病、炎症、癌症、 感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经变性病、精 神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，其中该缀合物包含与非Fn3部分连接的基于纤连蛋白 III型(Fn3)的结合分子，且其中该缀合物结合特异性靶标，并具有比未缀合的Fn基结合分 子大至少3. 6倍的半衰期。
60.权利要求59的用途，其中非Fn3部分选自PEG、HSA、抗HSA、和抗体Fc区。
61.组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自自身免疫病、炎 症、癌症、感染性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、呼吸道疾病、代谢病、肌肉骨骼疾病、神经 变性病、精神性疾病、眼科疾病、和移植排斥，其中所述组合物包含含有与非Fn3部分连接 的基于纤连蛋白III型(Fn3)的结合分子的缀合物，其中该缀合物结合特异性靶标，并具有比未缀合的Fn基结合分子大至少3. 6倍的半衰期。
62.权利要求61的用途，其中非Fn3部分选自PEG、HSA、抗HSA、和抗体Fc区。
全文摘要
本发明提供了基于纤连蛋白的结合分子，以及将供体CDR引入到基于纤连蛋白的结合支架尤其是Fn3中的方法。本发明基于纤连蛋白的结合分子可以进一步与其他部分例如Fc、抗FcRn、HSA、抗HSA、和PEG缀合，以，尤其是在哺乳动物细胞中，提高半衰期和稳定性。本发明还提供了筛选此类分子与靶抗原的结合以及制备和纯化候选结合剂的方法。
文档编号A61K47/48GK101965198SQ200880127516
公开日2011年2月2日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月27日
发明者B·布拉尼迪, F·科尔宾格, K·J·维森特, S·埃韦特 申请人:诺瓦提斯公司