专利名称：广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及广东海风藤多糖在制药中的应用，具体涉及广东海风藤多糖在 制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。
背景技术：
广东海风藤为五味子科南五味子属植物异型南五味子/zeterac/z'to (Roxb.)Cmib的干燥藤茎，临床用于风湿痹痛、关节不利、筋脉拘挛等症的治 疗。化学成分研究表明，广东海风藤含有木脂素、三萜酸、多糖、挥发油等多 种有效成分，其中对于广东海风藤多糖的药物用途未见报道。
目前，全世界老年痴呆(即阿尔茨海默病)患者已达到1800万人，预计 未来25年内老年痴呆患者将达到3400万人，其中66%来自发展中国家。在 我国，60岁以上人群已超过总人口的10。％，并且仍在继续快速增长。流行病 学调査显示，60岁以上增长率为3.2%， 80岁以上增长率为5.4%。为此，中 国老龄委员会将"老年期痴呆早期诊断研究"列入了 1996—2000年国家"九 五"攻关课题；2000年"九七三"课题中有"衰老"的基础研究；2001年开 始的"十五"攻关课题中确立了老年期痴呆的课题。国家"九五"攻关课题 研究发现，中国老年期痴呆的患病率与其他国家相近，60岁组约占5.22%， 且随年龄增高而增高，每长5岁，发病率就增l倍。据此计算，我国60岁以 上老年痴呆患者应超过500万，相当于世界总老年痴呆患者的四分之一。
老年痴呆患者已给家庭和社会造成沉重负担。由于其病程5-10年，从记 忆减退、认知障碍，到人格改变、生活不能自理，整个过程均耗资不菲。在美 国，治疗老年痴呆所需的社会费用已达到IOOO亿美元，并且随着患者认知功 能的下降，看护费用还在不断增长。在我国，据北京市老龄协会的一份调査报 告， 一个家庭用于患重度老年痴呆症、生活不能自理的老人的护理费用， 一年 约为2万元。因此，我国用于治疗老年痴呆的费用每年将不低于数百亿元人民 币。
但现有老年痴呆症治疗药物的中远期效果不理想、毒副作用强、价格昂贵。而从中药和天然药物中寻找预防和/或治疗老年痴呆症的有效成分制备药物已 越来越成为精神神经系统医学家和药物学家的共识。
发明内容
本发明的目的在于提供广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆 症药物中的应用。
为实现上述目的，本发明对广东海风藤多糖预防和/或治疗老年性痴呆症 的作用及机理方面进行了全面而深入地研究，结果发现广东海风藤多糖具有神
经细胞保护作用、对抗P-淀粉样蛋白作用、胆碱酯酶抑制作用；即广东海风藤
多糖可在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中应用。
上述应用具体可以是提供一种具有预防和/或治疗老年性痴呆症的药物，
该药物的活性成分包括广东海风藤多糖。
上述药物的活性成分中还可包括治疗和/或预防老年痴呆症的公知药物。 上述药物可包括药学上可接受的载体，如淀粉、糊精、氯化钠、微晶纤
维素、山梨酸和/或甘露醇等。还可以按需选择可药用的辅剂、助剂等。
上述任何一种药物的剂型可以是适合临床使用的任何一种剂型，例如可 以是口服给药的剂型，如片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等；也可以是非口服给 药的剂型，如注射剂、粉针剂等；还可以是局部给药的剂型，如软膏剂、栓剂等。
在本发明提供的应用中，所述的广东海风藤多糖应该是通过任何可行方法 从广东海风藤中获得的一类多糖类物质。其形式可以是一种水提取物或其他形 式的提取物；也可以是将广东海风藤多糖提取物经任何方法降解制得的不同分 子量的产物。
优选地，上述广东海风藤多糖提取物的分子组成中包括D-葡萄糖、D-阿 拉伯糖和D-半乳糖中的任一种或任意几种。 本发明与现有技术相比，具有如下优点
1、 安全性高，可长期服用。本发明经过急性毒性和长期毒性试验，结果 表明广东海风藤多糖毒性低、有效剂量低，用量小，可长期服用。适用于老年 性痴呆症患者的临床用药特点和要求。
2、 针对病因发挥作用。目前老年痴呆症治疗药物效果不理想，其主要原 因为没有针对发病的根本原因发挥作用。研究表明与老年性痴呆发病有关的毒性蛋白——P-淀粉样蛋白(amyloid-P protein, A|3)引起突触、突起溃变，甚 至神经元死亡，使神经网络遭到破坏，导致大脑整合机能异常，其中包括多种 神经递质系统的改变，是引发老年痴呆症的"源头"，本发明将广东海风藤多 糖用于制备预防和/或治疗老年痴呆症的药物，可以在"源头"上阻止Ap的过 度产生，达到"治本效果"。同时还具有神经营养作用，保护神经细胞不受损 伤，从而达到预防老年痴呆症发病的效果。
图1是PBS对照组、ApL42组和A(3^+实施例1广东海风藤多糖组(终浓
度0.3125、 0.625、 1.25ng'mL'1)中存活细胞数量的变化； 与PBS组相比，*: P < 0.05, **:P< 0.01;
图2是PBS对照组、ApL42组和APM2+实施例2广东海风藤多糖组(终浓
度0.3125、 0.625、 L25(ig'mL'1)中存活细胞数量的变化； 与PBS组相比，*: P < 0.05, **:P< 0.01;
图3是PBS对照组、A卩M2+实施例2广东海风藤多糖组(终浓度0.3125、 0.625、 L25iig'mL"中)A卩M2的浓度变化； 与PBS组相比，*: P < 0.05， **:P< 0.01;
图4是假手术组、AD模型组+蒸馏水、AD模型+石杉碱甲组、^模型+ 低剂量广东海风藤多糖组、AD模型+中剂量广东海风藤多糖组、AD模型+高 剂量广东海风藤多糖组中小鼠在定位航行实验中的逃避潜伏期； 与模型组相比，*:P<0.05;
图5是如图4所述各实验组中小鼠在空间探索实验中在平台所在象限的停 留时间；
与模型组相比，*:P<0.05;
图6是如图4所述各实验组中小鼠在空间探索实验中跨越原平台位置的次
数；
与模型组相比，*:P<0.05;
图7是如图4所述各实验组中小鼠的皮质AchE活性； 与模型组相比，*:P<0.05;
图8是是如图4所述各实验组中小鼠的皮质ChAT活性；与模型组相比，*:P<0.05。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，本发明的实施方式并不限于此。 实施例l
广东海风藤总多糖的制备取海风藤药材干燥，粉碎成细粉，95%乙醇回
流脱脂。脱脂后药渣挥干溶剂，加水回流提取二次，合并提取液，浓縮。浓縮
液加入95%乙醇至终浓度为40%除淀粉，离心，上清液回收乙醇，浓縮液80% 醇沉，抽滤，沉淀以无水乙醇、丙酮、石油醚分次洗涤，低温干燥得海风藤粗 多糖。
实施例2
广东海风藤多糖P1的制备:将广东海风藤总多糖加蒸馏水溶解后以Sevag 法除蛋白，80°/。醇沉二次，沉淀用Sephadex G-IOO、 Sephadex G-80和S印hadex G-25凝胶柱分别洗脱，按峰收集流分，合并，冻干。得到广东海风藤多糖P1。
实施例3
广东海风藤多糖P2的制备将广东海风藤总多糖加蒸馏水溶解后用
100Kd超滤膜过滤，收集滤液，再以10Kd超滤离心管离心，收集上层液，冻 干，制得广东海风藤多糖P2。 实施例4
广东海风藤多糖胶囊的制备将广东海风藤多糖P2加水溶解后以糊精、 微晶纤维素为辅料制成颗粒，干燥，整粒后以胶囊填充剂填充，制成广东海风 藤多糖胶囊。
实施例5
广东海风藤多糖注射剂的制备将广东海风藤多糖P1加注射用水溶解后 以NaCl调节渗透压，灌装，溶封，灭菌，制成广东海风藤多糖注射剂。
通过以下试验实施例来说明广东海风藤多糖的药理活性。 试验实施例1
广东海风藤多糖对Ap (p-amyloidp印tide,Ap)损伤嗜铬细胞瘤株PC12 的保护作用
本实施例研究了广东海风藤多糖对AP损伤PC12细胞的神经保护作用。材料PC12细胞购自中科院上海细胞库；胎牛血清购自TBD公司； DMEM为Gibco公司产品；A卩l42购自Sigma公司，用0.0lmol'L" PBS(pH7.2) 配成溶液，浓度为lmg/ml，密封后置于37C。,孵育7天使之聚集。MTT (3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)购自Sigma 公司，取MTT250mg溶解于O.Olmol丄-1 PBS(pH7.2)50mL中，制备成浓度为 5g-L"的MTT，用0.22(im微孔过滤器过滤除菌，4'C保存。
广东海风藤多糖样品的配制:称取广东海风藤多糖(如实施例1制备)0.5g， 溶于40mL的O.Olmol七-1 PBS,配成U.Smg'mL-1广东海风藤多糖母液。取 12.5mgTnU1的广东海风藤多糖100pL，加入PBS至终体积10mL，配制成高 剂量浓度0.125mg，mL/1的广东海风藤多糖原液。取0.125mg'mL'1的广东海风 藤多糖2mL，加入PBS至终体积4mL，配制成中剂量浓度0.625mg-mL—1的广 东海风藤多糖原液。取0.625mg，mL'1的广东海风藤多糖2mL，加入PBS到终 体积4mL，配制成低剂量浓度0. 3125mg，mL'1广东海风藤多糖原液，过滤除菌， (C保存。
细胞培养及给药方法取对数生长期的PC12细胞，接种于96孔板中， 每孔细胞为8000个细胞，每孔加入含10%胎年DMEM培养液200)JL。分别设 PBS对照组、A卩m2组和A卩m2+广东海风藤多糖组(终浓度0.3125、 0.625、 1.25ng.mL—1)，每组设8个复孔。
MTT领!l定给药后24小时后，进行MTT测定。每孔加入5g， L—i]V[TT溶 液20ji1。继续培养4h。吸出培养液，加入DMSO200nL，混匀，振荡10min， 使黑色结晶充分溶解。在酶标仪(Biorad公司680型)上490nm波长测A490nm
值，以A49。^反映存活细胞数量及其功能状态。
结果如图1所示，广东海风藤多糖在三个浓度均能显著对抗10^iMA(3m2 神经毒性作用，提高PC12细胞的存活率。而且呈现剂量依赖性，即随着广东 海风藤多糖浓度的增加，其存活率越高。PC12细胞为一种神经源性细胞株， 与正常神经元形态和生理功能相似，能较好的代表正常神经元。而AP的神经 毒性被公认为阿尔茨海默病(Alzheimer s disease, AD)的发病原因。以上实验表 明广东海风藤多糖对AP损伤的PC12有明显的神经保护作用，广东海风藤多 糖可用于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease， AD)的治疗。试验实施例2
广东海风藤多糖转AD痴呆基因细胞M146L分泌的Ap生成的抑制作用
本发明研究广东海风藤多糖转AD痴呆基因细胞M146L分泌的Ap生成 的抑制作用。
材料M146L细胞株美国哈佛大学医学院张冀民教授赠送。药物及试 剂DMEM为Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物制品公司产品； 0.25%胰酶购自Hydone公司。抗生素G418、 Puromycin均为Sigma公司产品； 人类Ap42测试试剂盒为IBL公司产品；MTT购自Sigma公司，取MTT250mg 溶解于O.Olmol丄'1 PBS(pH7.2)50mL中，制备成浓度为5g' U1的MTT，过滤 除菌，4"C保存。
广东海风藤多糖样品的配制称取广东海风藤多糖0.5g，溶于40mL的 0.01mol丄"PBS，配成12.5mg'mL"广东海风藤多糖母液。取12.5mg'mL"的广 东海风藤多糖100pL，加入PBS至终体积10mL，配制成高剂量浓度 0.125mg-mU1的广东海风藤多糖原液。取0.125mgTriL'1的广东海风藤多糖 2mL,加入PBS至终体积4mL，配制成中剂量浓度0.625mg'mL"的广东海风 藤多糖原液。取0.625mg，mL—1的广东海风藤多糖2mL，加入PBS到终体积4mL， 配制成低剂量浓度0.3125mg'mL"广东海风藤多糖原液，过滤除菌，4"C保存。
细胞培养及给药方法取对数生长期的M146L细胞株，接种于96孔板中， 每孔细胞为8000个细胞，含15r。胎年DMEM培养。分别设PBS对照组、低、 中、高剂量(终浓度0.3125、 0.625、 1.25吗'mL")广东海风藤多糖组，每组 设8个复孔。
MTT测定给药后24小时后，进行MTT测定。每孔加入L"MTT溶 液20nl。继续培养4h。吸出培养液，加入DMSO200pL，混匀，振荡10min， 使黑色结晶充分溶解。在酶标仪(Biorad公司680型)上490nm波长测A490nm
值，以A49(to反映存活细胞数量及其功能状态。
ELISA方法定量检测A|342的含量给药后24小时后，进行ELISA测定。 每孔取lOOpL培养液，按ELISA试剂盒上所要求的方法测定A卩42含量。
结果MTT结果如图2所示，低、中、高剂量的广东海风藤多糖对细 胞活性没有影响，表明在此剂量下，广东海风藤多糖不具有细胞毒作用。ELISA 结果如图3所示，低，中、高剂量的广东海风藤多糖可以明显降低八|342的产量，特别是高剂量组抑制率超过50%,呈现一定的量效关系。AD重要的病 理标志物为神经元胞外的老年斑，而老年斑的核心成份为AP。现代研究证明 其与AD的发病有着密切关系，多数学者认为Ap的沉积是AD病理的始发因 素和中心环节。A卩的过度产生并聚集产生神经毒性被公认为阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD)的发病原因。本研究所用的M146L细胞株为人类阿尔 茨海默病APP及突变型PS1基因双重转染的CHO细胞。以该细胞株能含有阿 尔茨海默病病人的突变型基因，在体外培养条件下能过度表达Ap42，因此， M146L细胞为一理想的AD治疗药细胞筛选模型。MTT结果表明低、中、高 剂量的广东海风藤多糖对细胞的生长代谢没有影响，排除了广东海风藤多糖的 细胞毒作用。而ELISA结果则表明广东海风藤多糖能抑制M146L分泌的A卩， 可用于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的治疗。
试验实施例3
广东海风藤多糖对AP损伤致痴呆鼠预防保护作用
材料实验动物成年昆明种小鼠，清洁级，体重18~22g，雄雌各半，
广东省医学实验动物中心提供，合格证号2007A006。标准鼠饲料饲养。药 物及试剂A(3m2胸自Sigma公司，用O.Olmol七-1 PBS(pH7.2)配成溶液，浓度 为lmg/ml，密封后置于37C。,孵育7天使之聚集。阳性对照药石杉碱甲片购自 上海复旦复华药业有限公司。
广东海风藤多糖样品的配制称取广东海风藤多糖10g，溶于100mL的 0.9%的生理盐水，配成100mgTiiL'1高剂量浓度广东海风藤多糖。取100mg'mL'1 的高剂量浓度广东海风藤多糖50mL，加入生理盐水至终体积100mL，配制成 中剂量浓度50mg，mL—1的广东海风藤多糖原液。取50mg'mL'1的广东海风藤多 糖50mL，加入生理盐水至终体积100mL，配制成低剂量浓度25mg'mU1的广 东海风藤多糖，过滤除菌，4'C保存。
AP损伤致痴呆鼠的制备及给药方法成年昆明种小鼠适应性饲养一周后， 按体重随机分成6组，每组20只，分为假手术组、AD模型组+蒸馏水、AD 模型+石杉碱甲组、AD模型+低剂量广东海风藤多糖组、AD模型+中剂量广东 海风藤多糖组、AD模型+高剂量广东海风藤多糖组。除对照假手术组外，其 它各组均侧脑室注射ApM2以制作AD痴呆鼠模型。小鼠戊巴比妥钠麻醉小鼠(40mg/kg)，将小鼠固定在定位仪上，剪开头顶部皮肤，酒精棉擦拭，暴露出前囟。采用右侧脑室定位，自前囟向后1.8mm，矢状缝旁开1.5mm处，即为侧脑室的体表部位。用微量注射器在此位置穿一小孔，深度为颅骨表面向下3mm处，毎只小鼠注射4^i1APl42，注射时间5min，留针5min。假手术组为注射等体积的无菌生理盐水。所有操作均在无菌条件下进行，拔针后用沾有75%酒精棉球消毒手术部位，缝合头皮。造模手术完成后后1周开始给药组小鼠分别灌胃相应剂量的广东海风藤多糖或石杉碱甲，连续4周。
小鼠学习记忆力检测采用Morris水迷宫方法。Morris水迷宫实验共测试5d。前5d进行定位航行实验，5d下午撤去平台，进行空间探索实验。定位航行实验(place navigation): Morris水迷宫为直径100cm，高50cm的圆形黑
色水池，水深30cm，池水中加入适量墨汁染黑。水温维持24t:士rc。池壁标
记4个入水点(E、 S、 W、 N )，在ES象限中央、距池壁30cm处放置一平台，高29cm (低于水平面lcm)，直径8cm。小鼠分别从E、 S、 W、 N4个入水点面向池壁放入水中，记录小鼠从入水至找到并爬上平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency)。小鼠被允许在平台停留15s。 60s未找到平台的动物，实验者将其引上平台，潜伏期记录为60s，在平台上停留15s。测试过程保持室内安静，周围实验人员及物体位置固定不变。空间探索实验(spatialprobe):定位航行实验结束后撤除平台，选择一入水点将小鼠放入水中，测定60s内小鼠平台所在象限停留时间和跨越原平台位置的次数。
小鼠皮质乙酰胆碱酯酶(AchE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性的测定学习记忆力测试结束后，小鼠断头取脑，于冰浴中迅速剥离海马，分离得到皮质，以预冷的生理盐水制成10%的组织匀浆。按照试剂盒说明书方法，测定皮质中乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶的活性。
结果小鼠学习记忆力检测结果如图4、 5、 6所示，模型组与假手术组
相比，小鼠找到平台的潜伏期明显延长(尸<0.05)，平台所在象限停留时间及穿台次数明显减少，说明APM2侧脑室注射致小鼠学习记忆力减退，痴呆模型建立成功。低、中、高剂量的广东海风藤多糖组与模型组相比，潜伏期縮短(尸<0.05)，平台所在象限停留时间及穿台次数增加(尸<0.05)，说明广东海风藤多糖能改善痴呆鼠的学习记忆力。小鼠皮质AcliE和ChAT活性的测定结果如图7、 8所示，在皮质中，与模型组相比，低、中、高剂量的广东海风藤多糖组，能明显提高痴呆鼠中乙酰胆碱转移酶的活性，抑制痴呆鼠中乙酰胆碱酯酶的活性，达到减少乙酰胆碱的分解，从而提高皮质内乙酰胆碱的含量。乙酰胆碱酯酶及乙酰胆碱转移酶分别是乙酰胆碱的分解酶和合成酶，两者共同调节
脑内乙酰胆碱的含量。而乙酰胆碱的浓度与学习记忆力密切相关，AD患者脑
的乙酰胆碱含量减低。这是广东海风藤多糖提高痴呆鼠学习记忆能力的机制之
一，表明广东海风藤多糖能用于AD的预防和/或治疗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。
2、 根据权利要求1所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆 症药物中的应用，其特征在于所述的药物的活性成分包括所述广东海风藤多 糖。
3、 根据权利要求2所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用，其特征在于所述的药物的活性成分还包括公知的预防和/或 治疗老年性痴呆症的药物。
4、 根据权利要求2或3中所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年 性痴呆症药物中的应用，其特征在于所述的药物还包括药学上可接受的载体。
5、 根据权利要求1所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用，其特征在于所述的广东海风藤多糖是从广东海风藤中提取 分离得到的。
6、 根据权利要求5所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用，其特征在于所述的广东海风藤多糖提取物的组份中包括D-葡萄糖、D-阿拉伯糖和D-半乳糖中的任一种或任意几种。
7、 根据权利要求1所述的广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆 症药物中的应用，其特征在于所述的药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。
全文摘要
本发明涉及广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。本发明公开了广东海风藤多糖在制备预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的应用。广东海风藤多糖是从植物广东海风藤Kadsura heteroclita(Roxb.)Craib中提取分离得到的。本发明的优点在于发掘了广东海风藤多糖在预防和/或治疗老年性痴呆症药物中的用途，安全性高，疗效显著，可长期限服用；原料来源丰富、价廉并可制成各种剂型。
文档编号A61K31/715GK101642465SQ20091004156
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者李晓光, 罗焕敏, 飞 肖 申请人:暨南大学