专利名称：甲脒修饰的二环碱核苷类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及核苷类似物及其使用方法的领域。
背景技术：
哺乳动物免疫系统包含两个主要的淋巴细胞类型B淋巴细胞(B细胞)，来源于骨髓；和来源于胸腺的T淋巴细胞(T细胞)。B细胞主要负责体液免疫(即产生抗体)，而T细胞主要负责细胞介导的免疫。
一般认为T细胞分为两个亚类，辅助T细胞和细胞毒性T细胞。辅助T细胞通过释放参与细胞介导的免疫的称作细胞因子的可溶性蛋白介质来活化其它淋巴细胞，包括B细胞和细胞毒性T细胞，和巨噬细胞。这里使用的淋巴因子是细胞因子的一类。
一般也认为辅助T细胞分为两个亚类1型和2型。1型细胞产生白介素2(IL-2)，肿瘤坏死因子(TNFα)和干扰素伽马(IFNγ)，主要负责细胞介导的免疫，如迟发型过敏反应和抗病毒免疫。相比之下，2型细胞产生白介素，IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，主要参与协助体液免疫反应，如对变应原的反应中看到的，例如IgE和IgG4抗体同型转换(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7145-173)。
这里使用的术语1型和2型“反应”分别是指包括1型和2型淋巴细胞诱导产生的完整范围的作用。除了别的之外，这种反应包括通过转录、翻译、分泌和其它可能机制使相应细胞因子的产生发生变异，相应淋巴细胞增生增加，和其它与细胞因子产生增加相伴的其它作用，包括运动性作用。
以前的申请(09/462714，09/291097，09/291093，09/471513，60/164365，60/164366，60/172097，60/175111)，每篇都引入此处作为参考，它们与我们最近的发现的方面相关，包括各种核苷(这里定义包括天然核苷的衍生物和类似物)对选择性调节淋巴细胞反应彼此相关的作用。除了别的之外，我们指出1型和2型反应任一个可被选择性抑制，而另一个被诱导或保留相对不受影响，1型或2型反应任一个可被选择性诱导，而另一个被抑制或保留相对不受影响。我们也发现令人惊奇的事实，一些能有效选择性调节1型和2型彼此相关的反应的核苷倾向于具有双峰作用。除了别的之外，一般倾向于在相对高剂量时抑制或诱导1型和2型活性的一些核苷，倾向于在相对低剂量时选择性调节彼此相关的1型和2型。
以前没有研究或证明过其它核苷类似物化合物对选择性调节淋巴细胞彼此相关的反应的作用。我们发现在给予其它核苷类似物化合物，如该化合物的前体药物形式后，也发生双峰作用，或1型和2型反应彼此相关的选择性调节。
在生物活性化合物发展到临床上有效的试剂的过程中，需要克服很多障碍。许多有效的生物活性化合物从来没有变为临床上有效的试剂，是由于它们不受欢迎的生物药学性能，包括由于通过生物屏障，如血脑屏障(BBB)和肠道屏障的渗透性低造成的生物可利用率低。尽管许多因素影响药物的生物可利用率，很多药物不受欢迎的生物药学性能(如电荷、亲脂性、氢键电势、大小)可能是最常碰到的阻碍药物渗透通过屏障的因素之一。因此，药物物理化学特性(电荷、亲脂性、氢键电势、大小)的优化可能是利于药物转运通过这种膜屏障的最可能的一般策略。
为了优化药物物理化学性能，一个可能的策略是优化前体药物的物理化学性能。(H.Bundgaard，Desigzl of Prodrugs，Elsevier，Amsterdam，1985；N.Bodor，L.Prokai，W.M.Wu，H.Farag，S.Jonalagadda，M.Kawamura，J.Simpkins，Science，257，1698-1700，1992；H.E.Taylor，K.B.Sloan，J.Pharm.Sci，87，5-20，1998)。术语前体药物用于描述一种试剂，它在给药后，应经化学或酶转化变为活性或母体药物，以使代谢产物或母体药物随后能显示出期望的药理学反应。通过在小有机分子中短暂且生物可逆地衍生某些极性功能基团，“隐蔽”了这些机体的不受欢迎的物理化学特性(电荷、亲脂性、氢键电势、大小)，但没有永久改变该分子的药理学性能。这个策略已非常成功地用于药物衍生化的情况，包括将羧基或羟基转化为酯，能够用化学或酶学方法在体内容易水解。有希望的前体药物观念，我们期望其它部分导入母体药物，能增加生物可利用率、吸收和抗病毒作用。
这些发现特别有意义，因为对于很多上列疾病的现代治疗策略的有效性有限，具有明显的副作用，或二者兼有。例如，自身免疫疾病的治疗常常限于缓解措施，去除毒性抗体(如在重症肌无力)，和给予危险药物包括皮质类固醇，氯喹衍生物，和抗代谢或抗肿瘤药物，和如对准免疫系统细胞的环孢菌素的药物。
尽管本领域已知大量免疫调节化合物，它们所有都具有一种或多种缺点。因此，仍需要提供改进的方法和免疫调节化合物的组合物。
发明概述本发明涉及新的核苷类似物化合物和相关化合物，如前体药物、其治疗用途和合成。
本发明的一个方面中，核苷酸类似物化合物具有根据分子式1的一般结构，其中化学构象可以是L-构型或D-构型 分子式1ICN-10776本发明的另一个方面中，药物组合物包含与至少一种药物可接受载体混合的治疗有效量的根据分子式1的化合物，或其药物可接受酯或盐。
本发明的另一个方面中，药物组合物包含与至少一种药物可接受载体混合的根据分子式化合物的前体药物形式，或其药物可接受酯或盐。
本发明的进一步方面中，根据分子式1或分子式2的化合物，通过能获得积极反应的配方和方案，用于治疗对该化合物给药后发生积极反应的任何病症。除了别的之外，预期分子式1或分子式2的化合物可以用于治疗感染、侵染、癌症、肿瘤或其它瘤、巨细胞动脉炎或自身免疫疾病。
图1A-1F是考虑的化合物对活化人T细胞的细胞因子和增生反应的剂量效应的描述图。
图2是显示考虑的化合物治疗反应中，各种RNA在细胞内表达的放射自显影图。
图3是考虑的化合物治疗反应中，产生特异性细胞因子的细胞数量的描述图。
图4A-4F是考虑的化合物对活化的人T细胞的活力、细胞因子反应和增生的暂时作用的描述图。
图5A-5B是考虑的化合物对来自正常供体和类风湿性关节炎患者的活化外周T细胞产生细胞因子的对比作用的描述图。
图6是显示考虑的化合物治疗反应中，各种RNA在细胞中的表达的放射自显影图。
图7是考虑的化合物对CD4+和CD8+T细胞亚型的活化细胞因子反应的影响的描述图。
图8是考虑的化合物对鼠Th1细胞产生影响的描述图。
图9A是耳朵肿胀测定的描述图。
图9B是显示考虑的化合物治疗反应中，各种RNA在细胞中的表达的放射自显影图。
图10A是另一个耳朵肿胀测定的描述图。
图10B是显示对考虑的化合物治疗反应中，各种RNA在细胞中的表达的另一个放射自显影图。
详细描述在本说明书中使用下列术语的地方，它们定义如下。
术语“核苷”和“核苷类似物化合物”可互换，涉及由任何戊糖或修饰的戊糖部分与杂环、芳香杂环的特定位点，或嘌呤(9位)或嘧啶(1位)的天然位点，或类似物的等同位点连接组成的化合物。
术语“核苷酸”是指在核苷5’位点被磷酸酯取代。
术语“杂环”是指在具有至少一个杂原子如N、O或S的单价饱和或不饱和碳环根，环内每个可利用的位点都能独立地分别被如羟基、氧、氨基、亚氨基、低链烷基、溴基、氯基和/或氰基选择性取代。包括在这种取代基类中的是嘌呤、嘧啶。
术语“嘌呤”是指含氮两个环的杂环。
术语“嘧啶”是指含氮单环的杂环。
术语“D核苷”是指具有D核糖糖部分的核苷化合物。
术语“L核苷”是指具有L核糖糖部分的核苷化合物。
贯穿本发明的术语“L构型”和“D构型”用来描述与该分子吡咯并-嘧啶酮部分连接的化合物的呋喃核糖部分的化学构型。
贯穿本发明的术语“C核苷”用来描述核糖糖部分和杂环基之间形成的键的类型。在C核苷中，该键在核糖糖部分的C-1位点产生并与杂环基的碳连接。形成C核苷的键是碳-碳型。
贯穿本发明的术语“N核苷”用来描述核糖糖部分和杂环基之间形成的键的类型。在N核苷中，该键在核糖糖部分的C-1位点产生并与杂环基的氮连接。形成N核苷的键是碳-氮型。
术语“保护性基团”是指加入的化学基团氧或氮原子，以防止它在具有氧或氮的分子中的其它部分衍生化过程中进一步反应。氧和氮保护性基团的广泛种类是有机合成领域的技术人员已知的。
术语“低链烷基”是指甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、t-丁基、异丁基或正己基。这个术语进一步示例是环状、支链或支链的一到六个碳原子。
术语“芳香基”是指具有单环(如苯基)或两个稠合环(如萘基)单价不饱和芳香碳环基。可选择性被羟基、低链烷基和/或氰基取代。
术语“杂环”是指在具有至少一个杂原子如N、O、S、Se或P的单价饱和或不饱和碳环根，环内每个可利用的位点都能独立地分别被如羟基、氧合、氨基、亚氨基、低链烷基、溴基、氯基和/或氰基选择性取代。
术语“单环”是指具有至少一个杂原子，如O，N，S，Se或P的单价饱和碳环基，在环内每个可利用的位点可独立地被糖部分或其它任何如溴基、氯基和/或氰基的基团选择性取代，以使单环的环系统最终被芳香化[如胸腺嘧啶核苷]。
术语“免疫调节剂”和“调节剂”可互换使用，是指能够通过刺激或抑制改变正常或异常免疫系统的天然或合成产物。
术语“有效量”是指为了消除感染能使免疫功能恢复至正常水平，或使免疫功能增加超过正常水平的分子式(1)的化合物的量。
分子式1的化合物可以具有多个不对称的中心。因此，它们可以以旋光活性形式或作为外消旋混合物而制备。描述和要求保护的本发明的范围包括分子式1化合物的独立的旋光异构体和非外消旋混合物，和外消旋形式。
术语“α”和“β”指所画化学结构中在不对称碳原子的取代基的特殊立体化学构型。
术语“旋光对映体”是指彼此为不可叠加的镜像的一对立体异构体。1∶1比例的一对旋光对映体的混合物是“外消旋”混合物。
术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅原子在空间排列的方式不同的异构体。
“药物可接受盐”可以是无机和有机酸或碱衍生的任何盐。
化合物本发明的核苷类似物化合物一般用分子式1描述 分子式1ICN-10776其中化学构型可以是L构型或D构型，其中考虑的化合物可以是任何合适的盐形式(如HCl盐)。应该进一步特别指出的是考虑的化合物也包括根据分子式1的化合物的前体药物形式。特别考虑的前体药物形式能有益达到趋向靶器官或靶细胞的特异性增加，除了靶细胞或器官的腔室的代谢稳定性增加，降低毒性，延长血清半衰期时间，增加特定细胞和/或腔室的吸收，和增强物理化学性能(增加溶解度、中和或导入带电电荷、增加/降低极性和/或疏水性)等的至少一种。而且，应该理解考虑的化合物的所有酯和盐也认为是合适的。
本领域已知的核苷药物的前体药物形式有很多，考虑的前体药物形式可以包括糖部分和/或碱基的修饰。根据特殊的化合物和目标，特别考虑的修饰可以包括形成考虑的化合物的三-O-乙酰衍生物，5’OH基的酯化而形成5’-retinoyl衍生物或可替换的酸的衍生物(如C.Sergheraert，C.Pierlot，A.Tartar，Y.Henin，M.Lemaitre，J.Med.Chem.，36，826-830，1993中描述的合成)。可供选择地，可以由考虑的化合物制备香豆素或氨基酸酯。对于药物特定传送到肝和胆道系统，内源性胆酸转运系统是有吸引力的候选。因此，可以由考虑的化合物制备胆酸酯。
考虑的化合物是核苷酸(即包括5’磷酸基)时，可以制备保护性的5’单磷酸衍生物(如环和非环单、二和三酯)，特别包括亲脂性化合物的氨基酸氨基磷酸酯、水杨酸磷酸酯和磷酸酯(烷基、烯基、单甾醇等修饰和未修饰的)。其它可能的前体药物包括PCT专利申请WO 98/39342，WO98/39343，WO 98/39344和WO 99/45016中所示基团的可能组合。考虑的化合物的前体药物也可以由脒官能团衍生得到，并特别优选的衍生物包括与考虑的化合物的carboxamide基团偶合的取代酰胺。进一步考虑的核苷及其类似物的前体药物形式在2002年6月16日申请的美国专利申请号09/594,410中描述，这里引入作为参考。
用途预期根据分子式1的化合物用于治疗种类多样的病症，和事实上对考虑的化合物给药后产生积极反应的任何病症。除了别的之外，特别预期本发明的化合物可以用于治疗感染、侵染、癌症或肿瘤或自身免疫疾病。进一步预期本发明的化合物可以用于靶向患者特定器官，如肝脏或心脏的病症或病变。
预期用本发明化合物治疗的感染包括呼吸道合孢病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹1和2型、生殖器疱疹、角膜炎疱疹、脑炎疱疹、带状疱疹、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感A病毒、hantann病毒(出血热)、人乳头瘤病毒(HPV)、麻疹和真菌。
预期用本发明化合物治疗的侵染包括原生动物感染，和蠕虫和其它寄生虫感染。
预期治疗的癌症或肿瘤包括由病毒引起的，效果可以包括抑制感染病毒的细胞转化为瘤状态，抑制病毒从转化细胞传播到其它正常细胞和/或阻止病毒转化细胞的生长。
预期治疗的自身免疫疾病和其它疾病包括关节炎、银屑病、肠病、少年糖尿病、狼疮、多发性硬化、痛风和痛风性关节炎、类风湿性关节炎、移植排斥、巨细胞动脉炎、过敏和哮喘。
仍预期的根据本发明的化合物的其它用途包括可作为其他核苷或核苷类似物化学合成的中间体，后者又可作为治疗试剂或用于其它目的。
仍在另一个方面中，治疗哺乳动物的方法包括给予治疗和/或预防有效量的含有本发明化合物的药剂。在这个方面，作用可以涉及调节哺乳动物免疫系统的一些部分，特别是1型和2型淋巴因子谱彼此相关的调节。当对1型和2型淋巴因子进行调节时，特别预期这种调节包括抑制1型和2型，或抑制1型和刺激2型。
例如，已经表明许多自身免疫疾病(如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病)与极化1型细胞因子的表达相关。考虑的化合物显示出能有效促进2型细胞因子表达，降低1型细胞因子表达，和减少活化的T细胞增生(下文)。因此，应该领会到，除了别的之外，可以有利地使用考虑的化合物来治疗与1型细胞因子表达增加有关的疾病，或2型细胞因子表达降低有关的疾病，或与1型细胞因子表达增加和2型细胞因子表达降低有关的疾病。因此，特别预期使用考虑的化合物的治疗包括1型细胞因子介导的炎症反应和自身免疫疾病。因而，应该领会到考虑的化合物可以作为免疫调节剂，尤其是作为1型细胞因子抑制剂和/或作为2型细胞因子刺激剂。
一般来说，根据本发明的最优选的用途是活性化合物对非靶宿主细胞的毒性相对较低，且对靶的活性相对高。在这个方面，L核苷增加稳定性的能力高于D核苷也可能是有利的，可能产生较好的药物动力。这个结果可以达到，因为L核苷可能不被酶识别，因此可能具有较长的半衰期。
给药预期根据本发明的化合物可以以任何适当的药物制剂形式且在任何适当的方案下给予。因此，可以通过口服、胃肠外(包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或灌注技术)、吸入喷雾、或直肠、局部给药等，并以含有常规无毒药物可接受载体、佐剂和媒介的剂量单位制剂形式给予。
作为实例，预期根据本发明的化合物可与药物可接受载体配制成混合物。例如，本发明的化合物可作为药物可接受盐口服给予。因为本发明的化合物大部分是水溶性的，所以它们可以以生理盐水溶液的形式(如缓冲至pH大约7.2至7.5)静脉内给予。常规缓冲液如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐可用于此目的。当然，一个本领域普通技术人员可以在说明书的教导下修改配方，提供大量不表现本发明组合物不稳定或危害其治疗活性的特殊给药途径的制剂。特别是，修饰本发明化合物而使它们更易溶于水或其它媒介，例如，可以通过本领域普通技术人员熟知的小的改动(盐制剂、酯化等)轻易完成。为了控制本发明化合物的药动学以达到对患者最有益的效果而改变特定化合物的给药途径和剂量安排也是本领域普通技术人员熟知的。
在某些药物剂量形式中，优选本化合物的前体药物形式，特别包括本化合物的酰化(乙酰化或其它)衍生物、吡啶酯和各种盐形式，且可以以治疗患者病症的方法给药。
而且，根据本发明的化合物可以单独或与其它用于治疗上面感染或病症的试剂联合给予。根据本发明的联合治疗包括给予至少一种本发明的化合物或其功能性衍生物和至少一种其它药物活性成分。该活性成分和药物活性试剂可以分开或一起给予，当分开给药时，可以任何次序同时或分开给予。为了达到期望的联合治疗效果，可以选择活性成分和药物活性试剂的量和给药的相对时间。优选，联合治疗包括给予一种本发明的化合物或其生理功能衍生物和一种此下提及的试剂。
预期与考虑的化合物联合有效的其它药物或活性成分的例子是抗病毒试剂如干扰素，包括但不限于干扰素α和γ、三氮唑核苷、无环鸟苷和AZTTM；抗真菌试剂如托萘酯、FungizoneTM、LotriminTM、MycelexTM、制霉菌素和两性霉素；抗寄生虫剂如MintezolTM、NiclocideTM、VermoxTM和FlagylTM、肠道试剂如ImmodiumTM、LomotilTM和PhazymeTM；抗肿瘤试剂如干扰素α和γ、阿霉素TM、环磷酰胺TM、Itnuran TM、氨甲喋呤、Mithracin TM、Tiazofurin TM、Taxol TM；皮肤病试剂如AclovateTM、CyclocortTM、Denorex、FloroneTM、氧化补脂骨素TM、碳焦油和水杨酸；偏头痛制剂如麦角胺化合物；上面未列的甾族化合物和免疫抑制剂，包括环孢菌素、DiprosoneTM、氢化可的松，霉酚酸、AravaTM(leflunomide)；FloronTM、LidexTM、Topicort和Valisone；和代谢试剂如胰岛素，和不能很好分入上面种类的其它药物，包括细胞因子如IL2、IL4、IL6、IL8、IL10和IL12。特别优选的初期药物是AZT、3TC、8位取代的鸟苷类似物、2，3-双脱氧核苷、白介素II、干扰素如IαB-干扰素、tucaresol、左旋咪唑、异丙肌苷和cyclolignans。
这种进一步的治疗试剂的例子包括有效调节免疫系统或伴发病症的试剂，如AZT、3TC、8位取代的鸟苷类似物、2’，3’-双脱氧核苷、白介素II、干扰素如α-干扰素、tucaresol、左旋咪唑、异丙肌苷和cyclolignans。根据本发明的某些化合物可通过降低根据本发明的某些试剂的代谢或灭活而有效增强其生物活性，为达到这种效果，二者一起给药。
关于剂量，一个本领域普通技术人员会认识到治疗有效量会随待治疗的感染或病症，其严重性，使用的治疗安排，所用试剂的药动学，和被治疗的患者(动物或人)而变化。预期各种可供选择的剂量，包括0.5mg/kg和0.1mg/kg之间和更小的剂量也是适当的，0.5到2.0mg/kg(如1.25mg/kg)和更高的剂量也是适当的。进一步预期，考虑的化合物的血浆浓度相对低时可成功治疗有些疾病病症，而其它疾病病症可能需要相对高的剂量。然而预期，适当的安排可以这样进行，通过给予少量，然后增加量直到副作用变得十分不利，或达到了预期效果。
活性化合物的给药可以从连续给药到每天几次口服给药(如每天四次)变化，除了其它给药途径外，可以包括口服、局部、胃肠外、肌内、静脉内、皮下、经皮(可以包括渗透增强试剂)、颊粘膜和栓剂给药。
为了制备根据本发明的药物组合物，优选治疗有效量的一种或多种根据本发明的化合物与药物可接受载体密切混合，根据常规药物配合技术制备一种制剂。载体可以是各种形式，依赖于期望的制剂给药形式，如口服或胃肠外。在制备口服剂量形式的药物组合物中，可使用任何通常的药物介质。因此，对于液体口服制剂如悬浮剂、酏剂和溶液，可以使用合适的载体和添加剂包括水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂等等。对于固体口服制剂如粉剂、片剂、胶囊，以及对于固体制剂如栓剂，可以使用合适的载体和添加剂包括淀粉、糖载体，如葡萄糖、甘露醇、乳糖和相关载体、稀释剂、粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等等。如果需要，可通过标准技术对片剂或胶囊进行肠包衣或持久释放。
对于胃肠外制剂，载体通常包括无菌水或氯化钠水溶液，然而也可包含其它包括辅助分散的成分。当然，当使用无菌水并保持无菌时，组合物和载体也应该灭菌。也可以制备可注射悬浮剂，在这种情况下也可使用适当的液体载体，悬浮试剂等等。
实施例提供下列实施例解释考虑的化合物的一些生物作用。特别是，实验数据表明考虑的化合物显示出以剂量依赖性方式对人T细胞产生活化-诱导IFNγ、IL-2和TNFα分泌和T细胞增生，但增强IL-4和IL-5产生。
考虑的化合物介导的对外周T细胞在48h的生物效果达到高峰，用PMA/离子霉素或PHA刺激可看到，在正常个体和类风湿性关节炎患者的细胞因子蛋白和mRNA水平观察到，2型数量增加而1型产生细胞因子细胞数量减少。
而且，考虑的化合物对2型细胞因子的偏向诱导与可诱导一氧化氮合成酶、c-myc、IL-6和IL-1b(表现抗炎症作用)的mRNA表达减少相并行，对人T细胞的CD4+群更加明显。此外，考虑的化合物在体外偏向诱导鼠淋巴结来源的Th1细胞的Th2细胞因子，(以0.3和0.6mg/kg)腹膜内给予BALB/c小鼠，抑制两个1型细胞因子介导的急性炎症反应-对二氮氟苯的接触性过敏和葡萄球菌肠毒素B介导的炎症反应。
这些在体内的作用与淋巴器官中IL-10的mRNA表达增加和IFNγmRNA表达降低关联。收集的这些数据表明考虑的化合物在体外和体内可功能性偏向诱导Th2细胞因子。
化合物示例的考虑的化合物7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒如前描述(Synthesis and cytokine modulation properties of pyrrolo[2，3-d]-4-pyrimidone nucleosides.J Med Chem.2000 Jun 2943(13)2566-74.)进行合成。两个化合物具有309.28的分子量且可溶于水溶液中。
人T细胞的制备和在体外的活化采用密度梯度离心，随后用Lymphokwik(One Lambda，Canoga ParkCA)进行T细胞富集的方法，从健康供体或类风湿性关节炎患者分离外周血单核细胞。附着于塑料上去除含污染的单核细胞。纯化的T细胞＞99％CD2+、＜1％HLA-DR+和＜5％CD25+，维持在RPMI-AP5(含20mMHEPES缓冲液，pH 7.4、5％自体固有血浆、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和0.05％2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基)中。
为确定细胞因子蛋白水平，添加10ng PMA加0.5μg离子霉素(均来自Calbiochem，La Jolla，CA)活化T细胞(1ml体积中含1×106个细胞)，在20μM核苷存在下，24孔板中，37℃，5％CO2的加湿保温箱中培养达到48小时。活化后，分析上清中细胞来源的细胞因子产量。对于增生和活力研究，方案如上，但改为96孔板规格，使用0.2ml体积中含0.2×106个细胞，用2ng PMA和0.1μg离子霉素活化。在独立的实验中，用20ngPMA加1μg离子霉素活化2ml的5×106个T细胞。这里培养6-24小时后从T细胞分离总RNA并用RT-PCR分析确定各种细胞因子和炎性介质的mRNA水平。也在独立的实验中，进一步纯化人T细胞(使用来自Stem CellTechnologies，Vancouver，BC的细胞富集试剂)获得纯的CD4+(＜1％ CD8+使用RosetteSep人CD4+T细胞分离试剂)，和CD8+(＜1％CD4+使用RosetteSep人CD4+T细胞分离试剂)T细胞亚型群体，用PMA和离子霉素活化每毫升1×106个细胞，如总T细胞实验。
细胞外细胞因子分析在适当稀释后，使用特异性针对IL-2、IFNg，TNFa、IL-4和IL-5的ELISA试剂盒(Biosource International，Camarillo，CA)确定细胞上清中的人细胞因子水平。用特异性针对鼠IFNg和IL-4(R and D Systems，Minneapolis，MN)的ELISA试剂盒确定鼠细胞因子水平。所有ELISA结果以pg/ml表示。有些数据以活化对照的百分比显示，以测试核苷存在下活化T细胞细胞因子水平超过未活化T细胞的细胞因子水平的比率×100％计算。测试核苷对细胞因子水平没有作用将给出活化对照值100％的百分比。可供选择的数据是以由活化对照改变的百分比显示([(测试pg/ml-活化对照pg/ml)/活化对照pg/ml×100％])。测试核苷对细胞因子水平没有作用将是0％。
zELISA斑点实验用含捕获抗体的无菌PBS包被ELISA斑点板(Whatman Polyfiltronics，Rockland，MA)过夜。对于IFNg使用4mg/ml抗人干扰素g的鼠单克隆抗体(mAb)(IFNg，克隆MD1，Biosource)。对于IF-2使用抗IL-2捕获抗体(4μg/ml，克隆5334.21，R&D Systems)，对于IL-4使用5μg/ml抗IL-4捕获抗体(克隆8D4-8，Pharmingen，San Diego，CA)，对于IL-5使用抗IL-5捕获抗体(5μg/ml，克隆TRFK-5，Pharmingen)。用无菌PBS洗涤2次后，用含1％BSA的无菌PBS阻断平板，其后用无菌PBS洗涤3次。在含4μg/mlPHA以及含有和不含核苷(10μM)的每个孔中放入含0.2×106PBMC的200ml RPMI培养基(含1％pen-strep，1％谷酰胺和10％FCS)在37℃下5％CO2下培养24小时(IL-2)或48小时(IL-4，IL-5，IFNγ)。洗涤后，加入生物素化的抗淋巴因子检测抗体过夜，抗人IFNγ(4μg/ml，Biosource)，抗IL-2(3μg/ml，R&D Systems)，抗IL-4(2μg/ml，Pharmingen)，和抗IL-5(2μg/ml，Pharmingen)。为了估计生物素化抗体的结合，使用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(PBS中1∶2000，0.025％Tween，室温下1.5小时，Vector，Burlingame，CA)。使用400μl AEC(Sigma，St.Louis，MO，10mg溶于1ml二甲基甲酰胺)与12ml 0.1M醋酸钠缓冲液，pH5.0，加6mlH2O2混合使平板显色。在计算机辅助ELISA斑点图像分析仪(ImmunoSpotTMImage Analyzer，Celluar Technology，Ltd.，Cleveland，OH)上计算所得斑点，它根据预先确定的标准检测ELISA斑点。
增生和活力实验测定每个实验最后16小时[3H]-胸腺嘧啶核苷(lμCi，ICN，Irvine，CA)的掺入来估计T细胞增生反应。细胞涂布于过滤器上，用Wallac Betaplate计数器(Perkin-Elmer/Wallac，Gaithersburg，MD)计算闪烁后测定DNA合成。用碘化丙锭(5μg/ml)估计活力，排出未处理的和核苷处理的FITC-CD3(Becton Dickinson，San Jose，CA)染色的人T细胞。加入碘化丙锭(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)后，用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson)测定CD3+细胞的活力。
接触性过敏(CHS)测定BALB/c对接触性变应原的反应，DNFB，如前所述(Ishii，N.，K.Takahashi，H.Nakajima，S.Tanaka，P.W.Askenase.1994.DNFB contactsensitivity(CS)in BALB/c and C3H/He mice.J.Invest.Dermatol.102321)。简而言之，给新生小鼠剪毛腹部施用20μl含0.3％DNFB的4∶1的丙酮∶橄榄油，使小鼠致敏。为了得到最佳的CHS诱导，用20μl的0.12％DNFB攻击小鼠每个耳朵的两侧，5天后致敏。未致敏的小鼠也进行攻击并在每个实验中用作对照。24小时后，进行耳朵厚度测定，用攻击前值减去攻击后值来估计对DNFB的反应。这里指出，在用DNFB攻击的同时，腹膜内注射含6.2μg 7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒的50μlPBS(0.3mg/kg)，或含12.4μg的100μl PBS(0.6mg/kg)的剂量。在初步优化研究中，这些剂量的7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒得到了最佳的效果。最后的耳朵厚度测定后，颈部脱位杀死小鼠，并取出腋窝/腋窝侧边淋巴结。从分离的淋巴结细胞分离总细胞RNA后，进行RT-PCR和Southern印迹分析来监测鼠IFNg、IL-2和IL-10mRNA水平。
葡萄球菌肠毒素B在体内的处理在第0天，以每只鼠50μg SEB的剂量腹膜内注射给每4只鼠一组的3个组。一个组注射6.2μg 7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒(0.3mg/kg)，一个组注射12.4μg 7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒(0.6mg/kg)，都在SEB注射前以50μl PBS腹膜内注射。在初步优化研究中，0.6mg/kg剂量的7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒得到了最佳的效果。24小时后，用适当剂量的吸入麻醉剂甲氧氟烷(Abbott Labs，N.Chicago，IL)麻醉所有小鼠，心脏穿刺exanguinate以获得全血，去除脾脏。用ACK裂解缓冲液(0.15M NH4Cl，1mM KHCO3和0.1mM Na2EDTA调节至pH7.2-7.4并过滤)去除污染的红细胞后，由各自的脾脏制备脾细胞悬液。从分离的脾细胞分离总细胞RNA之后，进行RT-PCT和Southern印迹分析以监测鼠IFNγ、IL-2和IL-10和iNOS mRNA水平。从凝固的血液中获得血清，用于确定一氧化氮的产生。一氧化氮的产生是通过其稳定的终产物亚硝酸盐和硝酸盐来测定的。亚硝酸盐还原酶反应将硝酸盐还原为亚硝酸盐后，基于用Griess试剂将总亚硝酸盐的还原变为紫色偶氮化合物的比色法实验(Sigma)，测定亚硝酸盐/硝酸盐总水平。
细胞因子mRNA分析用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)提取细胞总RNA。用oligo(dT)12-18引物和Superscript II(Life Technologies)逆转录酶进行cDNA合成反应。PCR反应(GeneAmp PCR试剂盒，Perkin-Elmer，FosterCity，CA)由含cDNA、dNTPs(每种200μM)、每个0.5μM的引物对和1.25单位Taq聚合酶的50μl混合物组成。使用人IL-2，IL-10，IL-4，IL-6，IL-1b，IFNg，c-myc，IL-2R，CD40L的引物(Stratagene，La Jolla，CA)、iNOS(Clontech，Palo Alto，CA)和pHE7核糖体基因。典型的扩增条件包括94℃变性5分钟和60℃退火5分钟，后跟35个循环的72℃1.5分钟，94℃45秒和60℃45秒，最后72℃延伸时间10分钟。从Stratagene获得鼠IL-2、IFNγ和β-肌动蛋白的引物，从Clontech获得鼠IL-10引物。Stratagene鼠细胞因子引物的扩增条件是94℃变性5分钟和60℃退火5分钟，后跟35个循环的72℃1.5分钟，94℃45秒和60℃45秒，最后72℃延伸时间10分钟。对于IF-10，PCR条件是94℃变性5分钟后，35个循环的94℃45秒，60℃45秒和72℃2分钟，最后72℃延伸时间7分钟。
对于每个基因产物，实验测定最优cDNA稀释度，定义为可获得远低于饱和条件的可检测到浓度的cDNA稀释度。在含溴化乙锭的2％琼脂糖上分离PCR产物，并用0.4MNaOH和0.2MNaCl固定到Hybond N+膜(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)上过夜。斑点与32P-γ ATP标记的寡核苷酸探针杂交，该探针由原始引物(Stratagene)或由设计与各自PCR产物内中心区互补的特异性引物(人iNOS，鼠IL-10和人pHE7)产生。与pHE7有义引物产生的探针杂交后，估计等分的加样液。然后用PhosphoImager(Biorad，Richmond，CA)分析洗涤的斑点。细胞因子或其它测试mRNA的相对改变以光密度读数表示，并通过测定感兴趣的mRNA相对于看家基因pHE7的mRNA的光密度比率使输入RNA的任何变异正常化。
Th1和Th2T细胞的产生颈部脱位杀死8至10只BALB/c或C57BL/6小鼠，并取出腋窝/腋窝侧边淋巴结。制备每个动物的淋巴结细胞悬液并混合。用StemSep鼠T细胞富集试剂(Stem Cell Technologies)从每个小鼠株混合的淋巴结制剂中分离鼠CD4+T细胞。采用与前述(Austrup，F.，D.Vestweber，E.Borges，M.Lohning，R.Brauer，U.Herz，H.Renz，R.Haqllmann，A.Scheffold，A.Radbruch，A.Hamann.1997.P-and E-selectin mediate recruitment of T-hekper-1 but notT-hekper-2 cells into inflamed tissues.Nature.38581)类似的方案产生Th1和Th2细胞。简而言之，在最佳量(每孔1mg)的抗CD3mAb(克隆145-2Cll，Pharmingen)包被的24孔组织培养板上，在所示重组鼠细胞因子和细胞因子Abs(全部来自Pharmingen)(IL-2单独，50U/ml；Th1IL-2，50U/ml；IL-12，1000U/ml；IFNg含和不含10mM ICN 10776和Th2IL-2，50U/ml；IL-4，10ng/ml；抗IFNg(克隆XMG1.2)10mg/ml)存在下活化细胞，培养4天。将细胞转移到介质不变的新鲜板上，进一步培养48小时，然后洗涤三次并加入新鲜培养基，培养过夜，然后用PMA(10ng)和离子霉素(0.5mg)重新刺激5小时。然后使用无细胞上清进行ELISA测定鼠IL-4和IFNg水平。没有重新刺激的细胞，IL-4和IFNγ阴性，表明培养过程中加入的细胞因子没有被带出。
统计分析用单因素或双因素ANOVA分析进行趋势分析。使用Student-Newman-Keuls多比较方法估计统计学显著性、相关性。
结果ICN10776对人活化T细胞的细胞因子和增生反应的剂量效应我们研究了7-β-D-呋喃核糖基-4-氧合吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-甲脒(ICN 10776)与人活化外周T细胞培养48小时后诱导的1型和2型细胞因子谱，和对T细胞增生反应的影响。在0.2至20μM的剂量范围，ICN 10776能以剂量依赖性方式增强PMA-离子霉素(PMA-ION)-诱导2型细胞因子、IL-4和IL-5水平，在10μM时达到增强高峰，分别是166％和77％(图1B，1D)。数据显示的是5个供体中的一个典型。而且，ICN 10776以相同剂量范围，也以剂量依赖性方式大大抑制PMA-ION诱导的1型细胞因子、IL-2、IFNγ和TNFα水平，在20μM时的高峰抑制分别为62％、72％和78％(图1A，1C，1E)，也基本抑制T细胞增生，在20μM时的高峰抑制为99％(图1F)。也采用基于用线粒体脱氢酶使四唑鎓盐MTT转变为甲_染料(在540nm可检测到)的光密度实验(MTT细胞增生试剂盒I，RocheMolecular Biochemicals)进行第二次增生实验。采用这个实验，ICN 10776也大大抑制了T细胞增生(数据未显示)，证明ICN 10776引起的作用不是由于已经在其它核苷类似物中证明的胸腺嘧啶核苷吸收的干扰。在T细胞中也见到了对细胞因子调节类似的作用，以及PHA刺激的PBMCs(数据未显示)。
在第二组实验中，在RNA分离前，单独用PMA-ION或在2，5或10μMICN 10776或其L旋光对映体ICN 17465存在下活化T细胞6小时或24小时，RT-PCR分析确定1型和2型细胞因子mRNA水平。我们观察到随着ICN 10776剂量的增加，IL-4mRNA增加，IFNγ和TNFα的mRNA同时降低(图2，显示来自三个供体的一个代表的数据)。有趣的是，ICN 10776的L旋光对映体ICN 17465时，没有观察到对这些细胞因子活化水平的相似调节，证明对于生物活性来说，绝对需要D核糖糖部分(图2)。
在第三组实验中，单独用PHA或在10μM ICN 10776或其L旋光对映体ICN 17465存在下，在特异性细胞因子抗体结合ELISA斑点板上活化PBMCs 24-48小时。然后如材料和方法中描述，测定特异性细胞因子产生细胞的数量。观察到在ICN 10776存在时，IL-2和IFNγ产生细胞的数量大大下降，但其L旋光对映体ICN 17465存在下未观察到(图3)。相比之下，ICN 10776诱导IL-4和IL-5产生细胞的数量显著增加，而L旋光对映体ICN 17465没有(图3)。
综合这些数据表明ICN 10776能以剂量依赖性方式降低1型细胞因子产生和T细胞增生，而升高2型细胞因子水平。在蛋白和mRNA水平观察到ICN 10776对细胞因子反应的作用并影响特异性细胞因子产生细胞的数量。而且，由于该核苷的L旋光对映体未显示相似的生物活性，因此2型细胞因子的偏向诱导需要D-核糖基化。
ICN 10776对人活化T细胞的活力、细胞因子反应和增生的短暂作用我们确定了1型细胞因子表达抑制和T细胞增生反应抑制是否仅仅由于ICN 10776引起T细胞毒性产生的。如果这些观察结果是由于毒性，那么培养时间和ICN 10776的剂量都会影响T细胞的活力。采用碘化丙锭排出分析，我们观察到在与20μM 10776培养48小时后，静息CD3+T细胞的活力确实从95％降低至85％(图4A，4B)。在未用核苷处理，PMA-ION活化CD3+T细胞时，观察到活力短暂降低，从8小时的91±1％降低到24小时的88±2％到48小时的83±1％。然而发现，在剂量范围跨越0.2至20μM的核苷ICN 10776存在下，这些数值没有显著性差异(图4C)。这些数据提示活力微降推测是由于活化诱导T细胞凋亡引起的，不是由于核苷引起的直接毒性作用。而且，与ICN 10776培养的短暂作用确实显示出T细胞增生(图4D)和IFNγ分泌(图4F)的剂量依赖性降低，但在48小时达到高峰抑制。同样，在48小时也观察到IL-4高峰剂量依赖性将降低(图4E)。这些数据表明用ICN 10776处理后观察到的生物作用不是体外毒性的结果，且在培养48小时后具有高峰作用。48小时后作用下降可能与核苷通过脱磷酸或脱核糖基化而代谢为失活降解产物有关。
ICN 10776对正常供体和类风湿性关节炎患者活化外周T细胞的TNFα、IFNγ和IL-4产生的对比作用前已表明当与正常供体比较时，类风湿性关节炎(RA)患者的外周T细胞在体外向2型表型的分化受到影响(Berg，D.J.，M.W.Leach，R.Kuhn，K.Rajewski，W.Muller，N.J.Davidson，D.Rennick.1995.Interleukin 10 but notinterculeukin 4 is a natural suppressant of cutaneous inflammatory responses.J.Exp.Med.18299)。这里我们比较了ICN 10776对来自16个正常供体和16个RA患者的PMA-ION活化外周T细胞的活化细胞因子谱的影响。我们观察到来自正常供体和RA患者的活化外周T细胞中发生了活化10μM ICN10776对2型细胞因子的偏向诱导，由分泌IFNγ水平降低(分别是43％和63％，p＝0.0008，ICN 10776＜未处理组和ICN17465组)和IL-4产生增高(分别是266％和192％，p＜0.0001，ICN 10776＞未处理组和ICN17465组)测定(图5A，左板)。尽管正常组的细胞因子反应明显增加(p＜0.0001)，二者任何一组中由ICN 10776偏向诱导的2型细胞因子数量没有显著性差异(图5A，左板)。在外周T细胞接触10μM ICN 10776的L旋光对应体ICN 17465接触后，二者任何一组都没有观察到对活化细胞因子谱的相似作用(图5A，右板)。在独立实验中，在10μM ICN 10776和ICN17465存在和缺乏下，测定正常供体和RA患者由PMA-ION刺激的外周T细胞的活化细胞因子mRNA谱。如上面分泌细胞因子蛋白数据见到的，ICN 10776可使两个受试组的外周T细胞的IL-4mRNA水平升高和抑制IFNγ和TNFα，而ICN17465没有(图5B)。因此ICN 10776在蛋白和mRNA水平上对2型细胞因子的偏向诱导，代表了外周血T细胞的一般现象，看来不受RA患者外周T细胞的影响。
ICN 10776介导的细胞因子反应对炎症前和抗炎症介质的影响由于1型细胞因子偏向一般诱导炎症前反应，而2型细胞因子偏向通常诱导抗炎症反应，我们确定了人活化T细胞的1型和2型mRNA水平，将这些的表达与相同供体细胞内的某些临床抗炎症或炎症前介质的mRNA水平进行比较。我们观察到ICN 10776，除了它对1型(抑制IFNγ、TNFα和IL-2)和2型(增加IL-4)的影响外，也促进抗炎症细胞因子IL-10增加，并抑制两个炎症前细胞因子IL-6和IL-1β的水平。此外，也观察到一种负责产生炎症前介质一氧化氮的酶-可诱导一氧化氮合成酶(iNOS)的表达协同降低(图6)。而且，ICN 10776的抗增生作用明显是由于一种上调增生淋巴细胞的基因-原癌基因c-myc被抑制(图6)。这些数据表明ICN 10776处理引起的2型细胞因子反应增强和1型细胞因子反应降低，导致外周T细胞的抗炎症环境增加和明显的抗增生作用。
ICN 10776对CD4+和CD8+T细胞亚型的活化细胞因子反应的影响T辅助(CD4+)和毒性(CD8+)T细胞亚型在对抗原的免疫反应中都起着重要的作用，无论是外来的还是自身的。两个亚型可分化产生1型或2型细胞因子。由于CD4+和CD8+T细胞在自身免疫的发病和对抗原的保护性反应中起着不同的作用，因此区分这两种T细胞亚型中ICN 10776引起的2型细胞因子偏向诱导的任何不同作用是重要的。因此我们比较了相同供体的分离CD4+和CD8+T细胞和总T细胞中ICN 10776介导的活化细胞因子反应。与未处理的活化对照相比，在ICN 10776存在下，用PMA-ION刺激48小时后，总T细胞组的分泌IL-4水平明显增高，但在17465存在下不增高(p＜0.0001，ICN 10776＞未处理和ICN 17465)(图7)。此外，与活化对照或ICN 17465处理组相比，所有三个T细胞组的IFNγ水平明显降低(p＜0.0001)。奇怪的是，ICN 10776介导的IL-4增高在CD4+T细胞中最显著(分别与CD8+T细胞和总T细胞中228％和32％相比，增加超过活化对照994％，p＜0.03)。而且，尽管ICN 10776对所有三个T细胞组的抑制都明显，但是ICN 10776再次对IFNγ的抑制在CD4+T细胞中显然更明显(分别与CD8+T细胞和总T细胞中37％和52％相比，增加超过活化对照81％，p＜0.05)(图7)。用ICN 17465处理后，所有三个T细胞组未观察到类似的抑制作用。也提示CD8+T细胞可能对ICN 10776介导的作用更具抗性，并可能实际上给CD4+T细胞提供调节信号，降低ICN 10776引起的2型细胞因子偏向诱导。
ICN 10776对鼠Th1细胞产生的作用我们确定了ICN 10776甚至在鼠淋巴T细胞正常产生Th1 T细胞的条件下，是否能偏向诱导2型细胞因子。分离BALB/c和C57BL/6淋巴结T细胞，如前描述(Austrup，F.，D.Vestweber，E.Borges，M.Lohning，R.Brauer，U.Herz，H.Renz，R.Haqllmann，A.Scheffold，A.Radbruch，A.Hamann.1997.P-and E-selectin mediate recruitment of T-hekper-1 but not T-hekper-2 cells intoinflamed tissues.Nature.38581)在平板结合抗CD3 Ab和IL-2、IFNγ和IL-12存在下初次培养后，产生了Th1细胞。与抗CD3 Ab和IL-2单独处理相比，这些Th1细胞再次刺激分泌低水平的IL-4和相当量的IFNγ(图8)。然而，第一次培养时期与ICN 10776共同培养能诱导这些鼠T细胞产生升高水平的IL-4和低水平IFNγ，类似于Th2细胞中观察到的(用抗CD3Ab，IL-2，IL-4和IFNγ处理T细胞再次刺激后产生)(图8)。两个鼠株的这些观察结果一致。收集的这些数据表明ICN 10776能诱导Th2细胞产生，甚至在倾向产生Th1细胞的条件下。
给予ICN 10776后导致接触性过敏反应的损害与鼠淋巴结细胞中IL-10表达升高和IL-2和IFNγ表达降低有关如前述(Ishii，N.，K.Takahashi，H.Nakajima，S.Tanaka，P.W.Askenase.1994.DNFB contact sensitivity(CS)in BALB/c and C3H/He mice.J.Invest.Dermatol.102321)用0.2％DNFB攻击后，DNFB致敏的BALB/c小鼠产生了接触性过敏(CHS)反应。图9A显示了在攻击后，确定DNFB致敏的和原初小鼠的耳朵肿胀测定，DNFB致敏的小鼠用0.3mg/kg和0.6mg/kg ICN 10776处理。在这个代表性实验中，攻击的同时腹膜内注射ICN 10776，以剂量依赖性方式大大损害了对DNFB的CHS反应，如在攻击后24小时，给予0.3mg/kg的剂量后耳朵厚度平均降低42％，给予0.6mg/kg的剂量后平均降低68％显示(从DNFB攻击的未致敏小鼠(原初)的反应减去计算CHS的抑制)。在用丙酮∶橄榄油攻击的DNFB致敏小鼠或用DNFB攻击的丙酮∶橄榄油致敏小鼠中未观察到攻击后耳朵厚度实质变化。此外，如图9B所示，与单独DNFB致敏小鼠相比，ICN 10776处理的DNFB致敏小鼠的淋巴结细胞中IL-10的mRNA表达大大增强，但IL-2和IFNγmRNA表达水平降低。收集的这些数据证明ICN 10776引起BALB/c小鼠体内CHS反应的降低与对DNFB起CHS反应的主要调节细胞因子-IL-10升高，和CHS反应的重要调节剂-IL-2和IFNγ的抑制有关。
体内给予ICN 10776后，用一氧化氮释放估计SEB诱导的炎症反应损害与小鼠脾细胞中IL-10表达升高和IFNγ表达下降有关如前述(Tam，R.C.，K.Ramasamy，J.Bard，B.Pai，C.Lim，D.R.Averett.2000.The ribavirin analog ICN 17261 demonstrates reduced toxicity andantiviral effects with retention of both immunomodulatory activity and reductionof hepatitis-induced serum alanine aminotransferase levels.Antimicrob.AgentsChemother.441276)50μg SEB腹膜内注射后，小鼠产生SEB诱导的炎症反应。图10A显示了在SEB攻击后，确定的用0.3mg/kg或0.6mg/kg ICN10776处理的小鼠的总血清亚硝酸盐测定结果。在这个代表性实验中，攻击的同时腹膜内注射ICN 10776，以剂量依赖性方式大大损害了对SEB的炎症反应，如在攻击后24小时，给予0.3mg/kg的剂量后血清亚硝酸盐水平平均降低54％，给予0.6mg/kg的剂量后平均降低78％。而且，如图10B所示，与单独SEB攻击小鼠相比，ICN 10776处理的SEB攻击小鼠的脾细胞中鼠IL-10的mRNA表达大大增强，但IFNγmRNA表达水平显著降低。收集的这些数据证明ICN 10776引起BALB/c小鼠体内SEB诱导的炎症反应降低与抗炎症细胞因子，SEB诱导的炎症中主要的调节细胞因子-IL-10升高，和SEB诱导的炎症反应的重要调节剂-IFNγ的抑制有关。
权利要求
1.一种治疗患者病症的方法，包括给予根据分子式1的化合物，其中化学构型可以是L构型或D构型。 分子式1ICN-10776
2.权利要求1的方法，其中病症是自身免疫疾病。
3.权利要求1的方法，其中自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎、多发性硬化和糖尿病组成的组。
4.权利要求1的方法，其中自身免疫疾病是类风湿性关节炎。
5.权利要求1的方法，其中自身免疫疾病是多发性硬化。
6.权利要求1的方法，其中自身免疫疾病是糖尿病。
7.权利要求1的方法，其中病症是炎症疾病。
8.权利要求1的方法，其中炎症疾病是接触性皮炎。
9.权利要求7的方法，其中炎症疾病包括1型细胞因子的表达水平高于健康人的1型细胞因子表达水平。
10.权利要求9的方法，其中1型细胞因子是白介素2。
11.权利要求9的方法，其中1型细胞因子是肿瘤坏死因子α。
12.权利要求1的方法，其中给药步骤包括体内给药。
13.权利要求1的方法，其中给药步骤包括口服给药。
14.权利要求1的方法，其中给药步骤包括注射L核糖核苷。
15.权利要求1的方法，其中给药步骤包括给予剂量在患者每kg体重0.1mg和患者每kg体重1.0mg之间的化合物。
16.权利要求2的方法，其中自身免疫疾病包括2型细胞因子的表达水平高于健康人的2型细胞因子表达水平。
17.权利要求16的方法，其中2型细胞因子是白介素4。
全文摘要
公开了新的核苷类似物化合物。新化合物或其可药用的酯或盐可以用于药物组合物，这种组合物可以用于治疗感染、侵染、瘤或自身免疫疾病。新化合物也可以用于调节免疫系统的方面，包括1型和2型活性的调节。
文档编号A61K31/7068GK1420779SQ01805036
公开日2003年5月28日 申请日期2001年2月15日 优先权日2000年2月15日
发明者R·谭, 王广义, 洪志, J·劳 申请人:里巴药品公司