专利名称：：一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，属于医学生物
技术领域：
和实验动物学领域。
背景技术：
：胃食管反流病(gas加esophagealrefluxdisease,GERD)是一种临床常见的慢性、易复发的功能性胃肠病，在我国其发病率呈上升趋势。GERD是一种多种因素造成的消化道动力障碍性疾病，其发病原因及机制尚未完全明确，因此，多年来，人们一直探索建立一种客观的，重复性好的动物模型，以此为平台来研究GERD的发病机理。陈莹、王峰综述了胃食管反流动物模型的研究现状，包括破坏食管下括约肌的GERD动物模型，结扎幽门或十二指肠的GERD动物模型，食管十二指肠吻合术的GERD动物模型和食管酸灌注GERD动物模型。(陈莹、王峰，胃食管反流动物模型的研究现状，ChinJGastroenterol,2006，11(9):568-570。)该综述中所述的制模方式多样，但是动物模型成功的标准多局限于反流性食管炎的病理变化，而近年来，胃食管反流源性呼吸疾病，特别是"哮喘"的发病机理受到各方面的关注和研究。2007年我国汪忠鎬院士结合解放军第二炮兵总院胃食管返流中心收治的200余例GERD患者的临床特点，开创性的提出胃食管喉气管综合症的概念。(汪忠镐，刘建军，陈秀等，胃食管喉气管综合症(GELTS)的发现与命名，临床误诊误治，2007，20(5):5-9。)他在文中这样描述此概念"由GERD引起的以咽喉部为核心的、常以呼吸道表现尤其是哮喘、喉气管痉挛为突出点的、涉及呼吸和消化两大系统和耳鼻口腔的一系列相应临床症候群(但偏偏可以没有烧心和反酸)，姑且称为胃食管喉气管综合症(gastroesophagolarygotrachealsyndrome,GELTS综合症)或两管一腔综合症(Twotrack-onecavitysyndrome),似不为过。"他认为GERD的临床表现可以概括为三类食管性、呼吸性和口腔性。并指出喉腔不但从解剖上是联系消化呼吸系统的枢纽，为GELTS综合症的核心器官，胃内容物经此喷射分至口咽和气道，而且喉腔的功能紊乱是其他食管外病变的基础和前提，无疑此概念的提出纠正了食管外症状庞杂的局面，使此病有一个直接明确的概念。同时，他根据对临床患者的观察及自身患病诊治的经历，进一步指3出胃食管反流源性"哮喘"并非真正的哮喘，它实为酸性内容物直接反流激惹喉气道引起的呼吸窘迫(Zhonggaowang.Abelatedrevelation:fromgastroesophagealrefluxderivedasthmatolaryngotrachealirritationevenspasm.Frontiersofmedicineinchina.2008(2):127-129.)。(汪忠镐。迟来的揭示从胃食管反流源性哮喘到喉气道激惹甚至痉挛。中国医学前沿。2008(2):127-129)。因此，反流机制对GERD源性呼吸疾患的影响值得进一步研究，而长期以来，由迷走神经介导的反射机制在胃食管反流病引起的呼吸道疾病中的重要地位已经确立，人们忽视反流机制在GERD源性呼吸疾病中的作用，近年来，GERD患者气道内及肺灌洗液中胃蛋白酶的发现被认为是证明反流机制的有力证据，人们开始重视直接反流机制对呼吸道的影响及其内在机制，有必要建立一种适当、符合致病机理的胃食管喉气道反流模型以提供研究平台。启发于上述背景，需要建立一种客观、公认和重复性好的动物模型，为进一步明确GERD源性呼吸窘迫的病因和发病机制，以期获得更好的临床治疗方法。本发明人前期对此进行了探索(.来运钢，汪忠镐，吴继敏等。动物实验探讨胃食管喉气管反流。中华实验外科杂志。2008;25(10):1352-1353)。破坏大鼠的食管下括约肌，结扎阻断幽门环，胃内注入亚甲兰溶液，术后我们发现实验组喉气道内出现不同程度的蓝染，结合临床观察，我们认为经解剖途径的反流机制是GERD源性呼吸疾患的重要病因之一。但是以此制备模型制备的大鼠术后生存时间过短，10组大鼠平均术后生存时间为22小时，其中一只仅为2小时。且结扎阻断幽门环，完全封闭胃部出口，虽然可以造成胃内容物剧烈迅速的反流，但是制备方式与临床致病因素不符，缺乏说服力。目前胃食管反流动物模型多注重于反流性食管炎的研究，对反流源性呼吸疾患缺乏探讨，也没有较为适合研究反流机制在GERD源性呼吸窘迫中作用的动物模型被报道。技术内容本发明要解决的技术问题是提供一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于将实验动物固定于手术台上，切开腹部并切开实验动物的胃壁，将食管扩张器经胃切口向贲门口插入食管腔，向上至食管裂孔下方，胃切口连续全层加浆肌层缝合关闭；于幽门环远端十二指肠处用塑胶片包绕肠管外周，并缝扎固定于肠系膜，缝合腹部切口和包扎，建立胃食管喉气管反流动物模型。4所述实验动物为大鼠。所述切开腹部并切开实验动物胃壁的方法是取腹正中切口，起于剑突向下长5cm，进腹显露胃前壁，于胃食管交界下lcm无血管区纵行切开胃壁，切口长5mm。所述包绕肠管的塑胶片长为1415mm，宽为68mm。所述于幽门环远端十二指肠处用塑胶片包绕肠管外周的方法是于幽门环至幽门环远端1.5cm之间十二指肠处用塑胶片紧贴肠管环形包绕肠管外周，形成环状结构，包绕前该处肠管直径为45mm，包绕后该环状结构的直径与包绕前该处肠管的直径一致。所述食管扩张器为喇叭形。该食管扩张器上口直径为3mm,下口直径为5mm，管长为25腿。所述实验动物还可以为兔、犬、羊或猪。食道扩张器的直径及长度，塑胶片的具体大小可依据不同动物的实际情况给与变更，且还可利用塑胶片对相应动物肠道进行多段包绕，造成肠道不同程度的动力障碍。本发明所述的胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，可以用人造的模型动物来模拟实验动物进行模型构建及相关研究。本发明的特点是(1)食管下括约肌功能缺损是胃食管反流的致病解剖基础，同时食管动力异常也是重要的致病因素。对伴有呼吸症状的GERD患者进行食管动力测试，同时行24小时食道内PH动态监测，发现均有食道动力异常，特别是无效食管动力与食管内酸暴露总时间、卧位时间、卧位食管酸清除时间均密切相关，认为食管动力异常在伴有呼吸症状的GERD患者的发病机制中起重要作用。本发明的动物模型制备方法中，食管扩张器经胃部切口置于食管腔内，长度由胃食管交界处直至食管裂孔下方，完全跨越食管下段，抵消食管下括约肌的功能，致使食管下括约肌功能丧失。同时食道下段本身管壁紧贴于扩张器外周，肌纤维被动牵拉延伸，该部食管动力功能受损，扩张器植入食管段处于无效食管动力状态，而且食管下段是迷走神经分布较为密集的区域，反射机制多通过胃内容物对此区域的迷走神经激惹而发挥效应。本模型中的食道扩张器可屏蔽胃酸性内容物对食管下段部迷走神经的刺激，完全规避反射机制对呼吸道的作用，仅就直接反流机制对呼吸道的作用进行观察研究。同时我们也可通过改变减少扩张器的长度，不同程度去除扩张器对食管下段的屏蔽，同时观察反射和反流机制对呼吸系统的双重作用。(2)随着对GERD研究的不断深入，人们注意到许多GERD患者同时存在上腹胀、5早饱、嗳气、恶心、呕吐等胃动力障碍症状。提示GERD患者可能存在胃运动功能受损，胃肠功能障碍是胃食管反流的重要致病因素之一。研究表明，约33%的GERD患者存在胃排空延迟。核素扫描发现部分GERD患者存在胃液体、固体排空延迟。并且使用促动力药治疗或抗反流手术治疗后，症状缓解，胃排空恢复正常。对GERD病人进行餐前、餐后体表胃电图(EGG)监测，发现GERD患者存在餐前、餐后胃电活动异常，说明胃排空延迟与胃食管反流有关。有些收治的病人中，患者因肠系膜血管压迫十二指肠致胃十二指肠动力障碍，胃内容物反流引发类哮喘症状，手术解除肠道梗阻后，患者呼吸症状明显改善。本发明的动物模型制备方法中，于幽门环远端十二指肠处用塑胶片环行包裹肠管外周，未致包裹段肠腔狭窄，但实验动物进食时，可抑制局部肠道蠕动，使胃肠排空功能障碍，而在实验动物死亡时解剖示包裹段肠管通畅，其近段肠管及胃扩张，内含食物滞留，说明动物模型远端肠道的制备方法可致胃肠排空障碍，从而促进胃内容物的反流。而既往反流性食管炎的动物模型制备方法中，多采用以外科手术致胃幽门、十二指肠完全或不完全梗阻，从而构成促进胃十二指肠内容物反流的重要因素。而本模型采用塑胶片包裹局部肠腔，并未引起局部肠道的机械性狭窄，保护肠腔自然通畅，但动物进食时，包裹肠管局部蠕动功能受到制约，局部食物在肠道内运行缓慢受阻，直接导致排空障碍，从而构成胃内容物的反流因素，并且可以通过调节塑胶片的宽度或采用多段肠道的包裹，从而改变被包裹肠管的长度，进而改变肠道排空障碍的程度。同时，我们的临床观察认为GERD患者胃肠功能障碍是胃食管反流的重要致病因素，这与本模型的制备原理相吻合。此外，本发明的动物模型中肠管的塑胶片包裹，可以根据实验情况改变塑胶片的包裹长度或行多段肠管包裹而改变胃食管排空障碍程度。(3)与前期建立的胃食管喉气管反流动物制备方式，即破坏大鼠的食管下括约肌，结扎阻断幽门环，胃内注入亚甲兰溶液的动物模型相比使用本动物模型成功制备10只大鼠，于大鼠死亡后均可以观察到其喉气道内有胃内容物的存在，且有气道分泌物出现，说明此种制备方法是一种成功的胃食管喉气道反流的制备方式，为进一步研究反流机制所致的GERD源性气道炎症提供实验动物平台。较前期建立的动物制备方式，动物制型成功后生存时限明显延长，进食固体食物时最长时限可达6天，若采用液体营养喂食，有继续喂养的可能，便于观察病程进展。本动物模型中，通过破环食管下括约肌功能，食道蠕动功能丧失，胃肠排空障碍作为制备原理基础，更加符合临床实际。6下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1:试验组大鼠的喉气道反流，箭头所指为胃内亚甲兰反流至喉气道引起局部蓝染及分泌物形成的图2:试验组大鼠的喉气道反流，箭头所指为胃内亚甲兰反流至喉气道引起局部蓝染及分泌物形成的图。具体实施例方式实施例l:建模实验一.实验动物及分组1.大鼠(Sprague-Dawley，SD),雌雄各半，体重为250-300克，由首都医科大学实验动物中心提供。共20只。词养条件室温2325。C，置大鼠不锈钢笼具中词养，每笼5只，自由摄水摄食。2.20只实验动物采用随机分组的方法分为两组，实验组和对照组，每组10只。二.模型制作实验组术前禁食24h，不禁水。以10%水合氯醛(2.5-3ml/kg)腹腔注射法施行麻醉。动物取仰卧位，四肢及头部固定于手术台。术区备皮铺巾如常规。取腹正中切口，起于剑突向下长5cm，进腹显露胃前壁，于胃食管交界下lcm无血管区纵行切开胃壁长5mm，以上口直径3mm，下口直径5mm，管长25mm的喇叭形食管扩张管经胃切口向贲门口缓缓插入食管腔(食管下段外径2-3mm)，向上至食管裂孔下方，切口连续全层加浆肌层缝合关闭。于幽门环至幽门环远端1.5厘米之间十二指肠处(欲包裹处肠管直径为45mm)，紧贴肠管用长14mm，宽7mm的塑胶片环形包绕，形成环状结构，该环状结构的直径与包绕前该处肠管的直径一致，并缝扎固定于肠系膜。缝合腹部切口和包扎。对照组进腹后，简单翻动肠管，缝合腹部切口并包扎。实施例2:建模实验一.实验动物及分组1.大鼠(Sprague-Dawley，SD)，雌雄各半，体重为250300克，由首都医科大学实验动物中心提供。共20只。词养条件室温2325"C,置大鼠不锈钢笼具中饲养，每笼5只，自由摄水摄食。2.20只实验动物采用随机分组的方法分为两组，实验组和对照组，每组10只。二.模型制作-实验组术前禁食24h，不禁水。以10%水合氯醛(2.5-3ml/kg)腹腔注射法施行麻醉。动物取仰卧位，四肢及头部固定于手术台。术区备皮铺巾如常规。取腹正中切口，起于剑突向下长5cm，进腹显露胃前壁，于胃食管交界下lcm无血管区纵行切开胃壁长5mm，以上口直径3mm，下口直径5mm，管长25mm的喇叭形食管扩张管经胃切口向贲门口缓缓插入食管腔(食管下段外径2-3mm)，向上至食管裂孔下方，切口连续全层加浆肌层缝合关闭。于幽门环至幽门环远端1.5厘米之间十二指肠处(欲包裹处肠管直径为45mm)，紧贴肠管用长15mm，宽8mm的塑胶片环形包绕，形成环状结构，该环状结构的直径与包绕前该处肠管的直径一致，并缝扎固定于肠系膜。缝合腹部切口和包扎。对照组进腹后，简单翻动肠管，缝合腹部切口并包扎。实施例3:胃食管喉气管反流研究1.方法如实施例l所述方法构建模型后，每只大鼠均单笼放置并观察，术后第一天禁食禁水，术后第二天给与亚甲兰溶液(江苏济川制药有限公司)，术后第三天开始给与少量颗粒鼠料。2.结果实验组术后生存时间为3-6天，死亡解剖示IO只大鼠喉气道不同程度轻微淡染，气道内可见泡沫样分泌物，其中2只大鼠喉气道内有少量食物残留。双肺均未见异常。食管扩张器及塑胶片均未脱落，胃及食道不同程度蓝染，胃不同程度扩张，内有食物残留，塑胶片包裹近段肠管扩张，但包裹段肠腔通畅，鼠身均可见蓝染痕迹，鼠笼底可见蓝染痕迹和粪便存留。见表1对照组术后存活良好，于术后6天处死，解剖示喉气道均未见蓝染和气道分泌物，双肺未见异常，胃十二指肠未见异常。见表2。表l:实验组反流结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注胃最大横径以胃部水平线最长距离为准，上下径以胃食管连接部在垂直线上的最长距离为准。十二指肠直径塑胶片包裹近端肠管外径。第l、8只喉气道内可观察到少量食物残留。表2:对照组反流结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与对照组相比，实验组大鼠喉气道内均可见蓝染，部分大鼠气道内可见泡沫状分泌i物甚至胃内食物，见附图1，2。说明实验组食管下段植入扩张器，致使食管下括约肌功能丧失及食道动力异常，以上两种致病因素的持续存在和作用加上胃肠排空障碍，促使实验组中食管外直接反流达到了最大程度，胃内容物可反流至喉气道，气道受到反流物的侵袭激惹而使局部分泌物增多。同时也进一步说明直接反流机制是GERD源性呼吸疾患的重要机制之一。权利要求1.一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于将实验动物固定于手术台上，切开腹部并切开实验动物的胃壁，将食管扩张器经胃切口向贲门口插入食管腔，向上至食管裂孔下方，胃切口连续全层加浆肌层缝合关闭；于幽门环远端十二指肠处用塑胶片包绕肠管外周，并缝扎固定于肠系膜，缝合腹部切口和包扎，建立胃食管喉气管反流动物模型。2.根据权利要求l所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述实验动物为大鼠。3.根据权利要求1或2所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述切开腹部并切开实验动物胃壁的方法是取腹正中切口，起于剑突向下长5cm，进腹显露胃前壁，于胃食管交界下lcm无血管区纵行切开胃壁，切口长5mm。4.根据权利要求1或2所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述包绕肠管的塑胶片长为1415mm，宽为68腿。5.根据权利要求1或2所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述于幽门环远端十二指肠处用塑胶片包绕肠管外周的方法是于幽门环至幽门环远端1.5cm之间十二指肠处用塑胶片紧贴肠管环形包绕肠管外周，形成环状结构，包绕前该处肠管直径为45mm，包绕后该环状结构的直径与包绕前该处肠管的直径一致。6.根据权利要求1或2所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述食管扩张器为喇叭形。7.根据权利要求6所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述喇叭形食管扩张器上口直径为3腿，下口直径为5mm，管长为25mm。8.根据权利要求l所述的一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，其特征在于所述实验动物还可以为兔、犬、羊或猪。全文摘要本发明涉及一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，属于医学生物
技术领域：
和实验动物学领域。该胃食管喉气管反流动物模型的制备方法，是将实验动物固定于手术台上，切开腹部并切开实验动物的胃壁，将食管扩张器经胃切口向贲门口插入食管腔，向上至食管裂孔下方，胃切口连续全层加浆肌层缝合关闭；于幽门环远端十二指肠处用塑胶片包绕肠管外周，并缝扎固定于肠系膜，缝合腹部切口和包扎，建立胃食管喉气管反流动物模型。本发明的特点是手术操作简单，动物术后存活时间长，制备原理更接近临床实际，支持反流机制在GERD源性呼吸疾患中的作用。文档编号A61B19/00GK101507659SQ20091008005公开日2009年8月19日申请日期2009年3月18日优先权日2009年3月18日发明者吴继敏,姜合作,建张,李建新,来运钢,汪忠镐,秀陈申请人:首都医科大学宣武医院