专利名称：红芪和红芪多糖在制备改善学习记忆及治疗阿尔茨海默病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及红芪及红芪多糖在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，属于中药 领域。技术背景
“人口老龄化”问题，在21世纪是世界上每一个国家都将面临的巨大挑战。世 界现有老人超过6亿(60岁及以上，除注明外下同)，到21世纪的头半个世纪末，即2050 年，世界老年人口将明显增加到20%，即每5个人中就有一位是老年人。“老化”，的 确是21世纪面临的一项挑战。当前，人口老龄化成为经济社会发展过程中的一个重要人 口现象。截止到2006年底，北京市老年人口达到236万人，占全市总人口的14.9%。
阿尔茨海默病(Alzeimer，s disease, AD)是老年人常见的一种神经退行性疾 病，俗称老年性痴呆或早老性痴呆。临床特征是进行性认知功能障碍，至疾病后期，患 者生活不能自理。目前全球大约有两千多万老年人患有老年痴呆病，严重危害中老年人 身心健康，但是给患者及其家属所带来的痛苦和负担要远高于上述两种疾病，成为现代 化社会、经济、医学、家庭亟待解决的问题之一。全世界有MOO万病患，60岁以上人群 的患病率是5.1%，85岁以上者患老年痴呆症的比例是30%。中国目前有5百万患病人 口，相关的医护开支每年达1千亿元人民币。目前，人们对于AD的病理特征和临床表现 已经有一定了解。发现在AD患者脑内老年斑沉积，神经元纤维缠结和神经元丧失是AD 重要的神经病理特征。并且从老年斑中提取出一种主要成分，淀粉样蛋白(amyloid β -protein, Αβ)，同时证明Αβ对神经细胞有毒性作用，可能在AD发病中起重要作 用，但对于AD的病因仍无定论。当前研究对于AD的病因和发病机制众说纷纭，无统 一认识，同时造成临床上对AD的治疗没有突破性进展。如果人类不能找到有效的治疗 方法，25年后全球预计有2200万人患上阿尔茨海默病，到2050年患此疾病的人数将达 4500万人，阿尔茨海默病将成为人类社会的流行病。有人称其为21世纪家庭的灾难。 这将是十分紧迫的社会和医学问题。也是医学界最棘手的难题。
AD的特征病理产物——构成老年斑核心成分的Αβ和引起神经原纤维缠结的异 常磷酸化tau蛋白一直被作为AD研究的重点，并且是目前设计和研发治疗AD相关药物 的重要靶点。其中，Αβ对神经细胞的毒性作用在AD发病过程中起着关键性的作用， 因此，寻找有效抑制Αβ毒性作用的药物是治疗AD的一个重点研究方向。
中医认为痴呆多属肾阴亏虚、痰瘀阻窍等虚实夹杂之证，治疗时多以滋阴补肾 治其本，活血化瘀、豁痰开窍治其标。因此临床多选择滋阴补肾药、活血化瘀药和豁 痰开窍药进行组方配伍治疗痴呆，而且具有一定的疗效。然而从现代医药理论的角度 来看，这些中药治疗老年性痴呆的作用机理仍不清楚，它们的中医功效用现代医学阐释 是否恰当准确，或者还有更丰富的内涵，都需要我们利用现有的医学技术进行验证和探 索。这种验证或者探索既丰富了中医理论，也有可能与现代医学碰擦出新的火花，扩大现代医学的认知领域。
活血化瘀药、豁痰开窍药和滋阴补肾药一般用于临床痴呆治疗，也是实验室研 究AD治疗的常用中药。红芪是重要的补益抗衰老中药，具有镇痛、抗炎、耐缺氧、免 疫调节等作用，其主要提取物红芪多糖在免疫调节方面更是有突出的功效，能明显减少 体内的氧自由基、抑制肿瘤生长，并能较好的保护心、肝等重要脏器。
对于红芪及其提取物对大脑作用的研究较少，通过实验我们发现红芪和红芪多 糖能明显提高Αβ诱导的SH-SY5Y(人神经母细胞瘤)细胞的存活率；改善快速脑老化 小鼠及海马注射Αβ的AD大鼠认知功能障碍，提高快速老化小鼠脑内中枢单胺类神经递 质5-ΗΤ (五羟色胺)、5-ΗΙΑΑ(5-羟吲哚乙酸)、ΝΕ(去甲肾上腺素)、DA(多巴胺)的 水平。由于至今仍无红芪和红芪多糖治疗老年性痴呆的报道，因此研究它们保护脑神经 细胞，调节脑神经递质分泌，防治老年性痴呆的作用机制极具价值。
发明内容
本发明目的在于提供红芪在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明目的在于提供红芪在制备改善学习记忆能力药物中的应用。
本发明目的在于提供红芪多糖在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明目的在于提供红芪多糖在制备改善学习记忆能力药物中的应用。
本发明提供红芪在制备改善认知功能障碍药物中的应用。
本发明提供红芪在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明提供红芪在制备保护SH-SY5Y细胞药物中的应用。
本发明提供红芪在制备提高脑内单胺类神经递质含量药物中的应用；所述脑内 单胺类神经递质为5-HT、5-HIAA、NE、DA。
本发明提供红芪多糖在制备改善认知功能障碍药物中的应用。
本发明提供红芪多糖在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
本发明提供红芪多糖在制备保护SH-SY5Y细胞药物中的应用。
本发明提供红芪多糖在制备提高脑内单胺类神经递质含量药物中的应 用；所述脑内单胺类神经递质为五羟色胺(5-Ser0tadn，5-HT)、5-羟吲哚乙酸 (5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、DA 多巴胺 (dihydroxyphenyl ethylamine，DA)。
红芪、红芪多糖的上述应用，可以理解为红芪、红芪多糖单独用于改善认知功 能障碍、治疗阿尔茨海默病、保护SH-SY5Y细胞、提高脑内单胺类神经递质含量或者是 在与其他药物配伍时其发挥上述的作用。
为临床服用方便，上述红芪可以按照中药制剂的一般工艺如直接粉碎，或者 经常规的溶媒提取后浓缩制成提取物，也包括常规溶媒提取后再进一步精制的方法，如 过大孔树脂柱。
所述红芪多糖优选如下方法制备红芪根粉碎，加入10倍量的水，并加入纤维 素酶(1%量)，调节PH到5，煎煮两次，每次2小时，过滤，收集滤液。滤液调PH至 中性，浓缩至相对密度1.20以上(60°C测定)，加入乙醇，使含醇量达道60%，静置M 小时，倾弃上清液，离心收集沉淀，沉淀用乙醇洗涤两次，冷冻干燥，即得。
上述红芪、红芪多糖可以制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、缓 释、速释制剂或注射剂等临床可接受的剂型，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂 型时加入药学可接受的辅料，例如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味 剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳 素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉 钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括 硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括聚乙烯吡咯烷酮、 微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷 酮、羟丙基甲基纤维素等。
本发明体外细胞实验部分以SH-SY5Y细胞作为研究的靶细胞，来源于一种神经 脊源的恶性胚胎瘤，其形态、生理和生化功能与正常神经细胞相似，可用于神经退行性 疾病的体外细胞模型的研究。通过Αβ 诱导SH-SY5Y细胞损伤的老年性痴呆细胞模 型被广泛应用于国内外老年性痴呆的研究。
A β 25_35是整个A β肽链从第25位至第35位氨基酸顺序所组成的一个氨基酸肽 段，其序列为GSNKGAIIGLM。尽管Αβ 2Μ5存在缺乏与金属结合位点的缺点，但是 它具有聚集的特性，并保留了 Αβ肽段的毒性作用，它被认为是Αβ的有效部位。
体内整体实验中采用的SAM-P/8小鼠是日本竹田俊男教授通过对AKR/J自然变 异小鼠进行近交延代培养得到一种自然快速老化小鼠，该家族诸多品系中的SAM-P/8表 现出明显的学习记忆功能减退，处于一种低紧张、低恐怖的痴呆状态，具备AD的许多特 征，诸如皮质萎缩、皮质和海马锥体神经细胞数目下降、Αβ样颗粒(β-CIGS)广泛沉 着、脑干网状结构大细胞群背侧部出现海绵状变化、星状胶质细胞反应等，是目前国际 上公认的研究认知功能障碍、学习记忆能力以及老年痴呆的最佳模型之一。
本发明以国内外公认的实验模型为基础，采用MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH) 漏出量为评价指标，证实了红芪和红芪多糖能保护人^^5_35对3^￥5￥细胞的损伤，增 加SH-SY5Y细胞的存活；通过Morris水迷宫实验，显示红芪和红芪多糖能改善快速脑老 化小鼠及海马注射Αβ的AD大鼠认知功能障碍；进一步的组织学检测发现，红芪和红 芪多糖可以提高快速老化小鼠脑内中枢单胺类神经递质5-HT、5-HIAA、NE、DA的水 平，这是它们治疗老年痴呆病的作用机制之一。
下述实验用于进一步说明本发明，但是对本发明范围的限制。
实验例1 SH-SY5Y细胞损伤模型的建立
1.材料
1.1细胞来源
人神经母细胞瘤株系SH-SY5Y细胞是由宣武医院神经药理实验室惠赠。
1.2主要试剂
低限基本培养基(MEM)和F-12营养混合物培养基(F12)培养基购于Gibco公 司，胎牛血清和青、链霉素购自于PAA公司，非必需氨基酸购自于Hyclone公司，胰蛋 白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Amresco公司，Αβ25_35、十二烷基硫酸钠6DS)购 于^igma公司，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成试剂公司，其他试剂皆为国产分 析纯。
1.3试验仪器
酶标仪(美国Thermo Labsystems Multiskan MK3型)，倒置相差显微镜(德 国Leica DMIRB型)，数码相机(德国Leica DC300型)，紫外分光光度计(日本岛津 UV-2450)。
2.方法
2.1培养基的配制
基础培养基MEM和F12培养基按照公司说明书分别以三蒸水配制而成，用 HEPES调整pH值为7.4，经0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，4°C下保存。
完全培养基的配置90%基础培养基(MEM和F12的比例为1 1)，10%胎牛 血清，同时还含有0.1%非必需氨基酸和青、链霉素各10万u/L。
2.2Αβ25_Μ溶液的配制
用无菌的三蒸水溶解Αβ25_35，配成lmmol/L浓度的母液，保存于_20°C冰箱。 实验时取出融解后，用不含血清和双抗的基础培养基稀释至所需浓度，至C02培养箱内 37°C孵育4Sh后使用。
2.3 SH-SY5Y 细胞的培养
SH-SY5Y细胞按照美国模式培养集存库(ATCC)的方法进行培养，即细胞以完 全培养基置于37°C，5%C02培养箱中孵育，2天换液，3-4天传代。
2.4 MTT比色测定方法
方法按照文献操作，但略有改动。具体操作为取对数生长期的SH-SY5Y 细胞，使用0.25%的胰酶消化液消化细胞后，用完全培养基将细胞悬液浓度调整至 2.5 X 104个/ml，接种于96孔板内，每孔200ul。置于CO2培养箱内孵育3 后，更换含 一定浓度A β 2M5的培养基，继续培养24h，然后吸取并保存细胞培养液以备LDH测定， 迅速加入含MTT (终浓度为50 μ g/ml)的培养基100 μ 1，置CO2培养箱内孵育4h，加入裂 解液(5%异丙醇(ν/ν)，10% SDS (十二烷基硫酸钠)(m/v)，0.01mol/L HCl) 100 μ 1，在 C02培养箱内过夜培养，酶标仪(双波长检测570-630nm)读取OD值。所收集的数据 以细胞的存活率(公式细胞存活率=所测细胞的OD值/空白组细胞的OD值X 100 % ) 表不。
2.5 LDH活性测定方法
取细胞培养液，按照LDH试剂盒的说明进行操作。
2.6统计方法
实验数据以平均值士标准差(i ±s)表示，采用SPSS13.0软件做统计分析， ANOVA检验进行统计。
3.结果
3.1不同浓度的Αβ m_35对SH-SY5Y细胞影响的形态观察
光镜下可见随浓度的增加SH-SY5Y细胞活力降低，胞浆混浊，细胞突 起明显减少。人^^5_35浓度达到4(^11101/1^时大部分细胞萎缩坏死，细胞贴壁不充分，有 脱落(见附
图1)。
3.2不同浓度的Aβ 25_35对SH-SY5Y细胞影响的活性检测
选取不同浓度的ΑβΜ_35作用于SH-SY5Y细胞，通过MTT比色法检测SH-SY5Y细胞的存活率，选择较为合适者作为老年性痴呆细胞模型的Αβ2Μ5浓度(附图2、表 1)。SH-SY5Y细胞的存活率随着Αβ25_35的浓度增高而呈下降趋势。同时，测定经处理 后的细胞外液的LDH含量，发现LDH的漏出量也随着Αβ2Μ5的浓度增高而上升，说明 了细胞的受损程度在加重(附图3)。
表1不同浓度A β 25_35对SH-SY5Y细胞活性的影响A β浓度 η MTT的细胞存活率(％) LDH漏出量(U/L) ((imol/L)114.43 ±4.75 230.48+2.21** 472.26 ±2.39** 630.70±1.76**
注与Αβ 浓度 0 μ mol/L 组相比，> < 0.05，**P < 0.0
实验例2红芪和红芪多糖对A β致SH-SY5Y细胞损伤模型的影响
1.材料
1.1细胞来源
同实验例1。
1.2药品与试剂
红芪和红芪多糖由兰州大学中西医结合研究所提供。
1.3试验仪器
同实验例1。
2.方法
2.1药物溶液的配制
红芪水煎液的制备步骤
称取300g红芪饮片，加蒸馏水至800ml，浸泡3小时，微火煮沸30η ι，提取滤 液后再将残渣加水至800ml，微火煮沸30η ι，合并两次滤液，蒸馏浓缩至200ml，制成 667g/ml的红芪水煎剂，过滤除菌，4°C冰箱贮存。
红芪粗多糖的提取及纯化
取红芪饮片4000g，粉碎后，加入20L的蒸馏水，68°C共浸提3h，合并过滤液， 置旋转蒸发器于45°C浓缩至过滤液原体积的30%，将浓缩液3000Γ/η ι离心15η ι，取上 清液，加入2倍体积的95%乙醇沉淀粗多糖，收集沉淀，加入适量蒸馏水，充分复溶， 透析，Seviig法按5 1的氯仿-正丁醇溶液脱去蛋白质，离心去蛋白质沉淀，重复8次， 上清液用蒸馏水透析48h，除去小分子杂质及色素，透析后浓缩至适当体积，加乙醇，醇 析多糖，水溶解后再醇析，重复3次，至观此！!!紫外检测无明显蛋白吸收峰，再以2倍体 积的95%乙醇沉淀多糖，最后经无水乙醇脱水，丙酮，乙醚洗涤，干燥，得淡黄色红芪 粗多糖193g，得率为4.8%。
将红芪粗多糖充分复溶于蒸馏水中，先后加入95%乙醇至乙醇终浓度分别为 40%, 60%, 80%,分别在4°C件下静置4h，3000r/mte离心15η ι，收集沉淀，乙醇终 浓度为40%时无沉淀，60%时沉淀较多，80%时有少量沉淀，沉淀均为白色粉末。将权利要求
1.红芪或包含红芪的药物组合物在制备改善认知功能障碍药物中的应用。
2.红芪或包含红芪的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
3.红芪或包含红芪的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病中保护SH-SY5Y细胞药物 中的应用。
4.红芪或包含红芪的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病中提高脑内单胺类神经递 质含量药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其中脑内单胺类神经递质为5-HT、5-HIAA、NE、DA0
6.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备改善认知功能障碍药物中的应用。
7.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
8.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病中保护SH-SY5Y 细胞药物中的应用。
9.红芪多糖或包含红芪多糖的药物组合物在制备治疗阿尔茨海默病中提高脑内单胺 类神经递质含量药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中脑内单胺类神经递质为5-HT、5-HIAA、NE、DA0
全文摘要
本发明公开了红芪及红芪多糖在制备治疗老年性痴呆药物中的新用途，本发明中红芪及红芪多糖能保护Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的损伤，增加SH-SY5Y细胞的存活；通过Morris水迷宫实验，显示红芪和红芪多糖能改善快速脑老化小鼠及海马注射Aβ的AD大鼠认知功能障碍；进一步的组织学检测发现，红芪和红芪多糖可以提高快速老化小鼠脑内中枢单胺类神经递质5-HT、5-HIAA、NE、DA的水平。
文档编号A61P25/28GK102018747SQ20091017641
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者张占军, 朱海燕, 王永炎, 程卫东 申请人:张占军