几丁聚醣作为传输工具的应用和方法

专利名称：：几丁聚醣作为传输工具的应用和方法
技术领域：
：本发明关于一种几丁聚醣的基本组成制成的几丁聚醣奈米微粒作为经由皮肤传输工具的应用与方法。
背景技术：
：目前所知的脱氧核糖核酸(DNA)疫苗的传递通常通过肌肉注射和基因枪轰击金微粒到皮肤(例如Chenetal.，JVirol73:10137-45(1999)的论文中便有提及相关技术)，且DNA覆盖在金微粒上并通过直接轰击的方式进入至细胞的细胞质及细胞核中，藉以达到促进其编码蛋白质表现的效果，也因此基因枪通常使用高压氦气以传递覆盖有DNA的金微粒使其穿过表皮的角质层(此技术揭露在Bellhouseetal.，US5，899，880的专利说明书中)。不过，由于高压基因枪的轰击具有较高的成本，其因在在高压基因枪的操作需要通过技术较为纯熟的操作手法并配合上具有非降解性的金微粒方可达到较佳的实施效果，不过，根据目前的文献(Linetal.，MolTher13:S291(2006))显示，基因枪所普遍使用的非降解性金微粒却可能因产生体内堆积等情况而导致不良的副作用。是以，目前生物
技术领域：
中，积极地研究无针剂疫苗直接以皮肤作为DNA疫苗免疫管道，以期可达到方便、简单，并同时提高其安全性，而在目前常见的无针剂疫苗中较可行的方式为以贴布形式经皮传输抗原作为疫苗，通过皮肤具有大量免疫部位且存在大量抗原呈现细胞的特征而得以达到较佳的效果，更详细来说，经皮免疫可引起广大的免疫反应是因为存在表皮层和真皮层中的朗格汉细胞和树突细胞(如Romanietal.，JE邓Med161(6):1368-83(1985);Berryetal.，InfectI匪n72(2):1019-28(2004)的研究i仑文中均有相关叙述)。另外，在许多的研究中，抗原经由皮肤传递的原理是一些佐剂或它们的次单位被使用在贴布和其它引起巨大免疫反应的传递基础，其中一般常使用的佐剂有霍乱毒素、绿脓杆菌外毒素、黏膜黏液素A、大肠杆菌中忌热性肠毒素以及它们突变的次单位(可参酌Kerstenetal.，InfectI匪n;68(9):5306-13(2000)的技术论文)，由于上述的佐剂可诱发局部专一性T细胞粘膜免疫反应对抗毒素或共同所传递的抗原(可参酌Freytagetal.，CurrTopMicrobiolImmunol236:215-36(1999)的技术论文)，但上述公知的经皮传递技术均各有其困难点而较不可能应用在未来临床使用。也因此，为了克服上述传统技术缺点，本发明以几丁聚醣作为传输工具的方法减轻和消除上述的问题。
发明内容发明的主要目的是提供以几丁聚醣为基本组成的几丁聚醣奈米粒子为传输工具，并形成几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体及几丁聚醣_蛋白质复合体以装载脱氧核糖核酸或蛋白质。本发明为几丁聚醣奈米粒子为经皮传输的工具，当几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体通过贴布及低压基因枪由皮肤传递而引起免疫反应。本发明可采用以下技术方案来实现的。本发明的一种制作几丁聚醣作为传输工具的方法，其特征在于几丁聚醣是奈米级粒子，且几丁聚醣是纯度至少去乙酰度81%以上的几丁聚醣作为原料，所述方法包括下列步骤以1%(w/v)在167mM醋酸溶解几丁聚醣产生几丁聚醣溶液；调整几丁聚醣溶液的酸碱度介于pH4.0-6.0;以及添加交联剂到几丁聚醣溶液混合降解生成几丁聚醣奈米粒子。前述的方法，其中几丁聚醣溶液降解方法选择其一，包括离子凝胶、乳剂聚合乳化扩散。本发明的一种几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其特征在于，包括至少一个含氨基的几丁聚醣奈米粒子；至少一个交联剂；以及至少一个脱氧核糖核酸，与几丁聚醣奈米粒子交联N/P比不大于1:5。前述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体，其中脱氧核糖核酸与几丁聚醣奈米粒子交联N/P比不小于1:0.25。前述的几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体，其中几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体交联剂为硫胺焦磷酸(TPP)。前述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其中几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体N/p比介于i:2至i:5。前述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其中几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体的脱氧核糖核酸是脱氧核糖核酸质体。前述的几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体，其中几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体的脱氧核糖核酸是脱氧核糖核酸疫苗。前述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体，其中几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体的脱氧核糖核酸是日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗。前述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体，其中几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体包括佐剂。前述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其中佐剂为未甲基化寡脱氧核醣核酸(oligodeoxyribo皿cleotides(0DN)containingCpGmotif)。本发明的一种几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法，其特征在于，包括下列步骤配制几丁聚醣奈米粒子的几丁聚醣运输工具；混合蛋白质和几丁聚醣运输工具；以及添加交联剂到几丁聚醣溶液混合降解生成几丁聚醣奈米粒子。前述的制备方法，其中调整几丁聚醣水溶液酸碱值5.5。本发明的一种几丁聚醣_蛋白质复合体的组成，其特征在于，所述几丁聚醣_蛋白质复合体的组成为几丁聚醣奈米粒子的几丁聚醣运输工具，所述复合体中的蛋白质与几丁聚醣以互相交联包裹型成，C/P比介于1:0.5至1:5。前述的几丁聚醣_蛋白质复合体的组成，其中几丁聚醣_蛋白质复合体，交联剂为硫胺焦磷酸(TPP)。前述的几丁聚醣-蛋白质复合体的组成，其中几丁聚醣-蛋白质复合体，蛋白质为胶原蛋白。前述的几丁聚醣_蛋白质复合体的组成，其中几丁聚醣_蛋白复合体，表皮生长因子。本发明的一种几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法，其特征在于，包括下列步骤以醋酸溶解几丁聚醣温和加热型成几丁聚醣水溶液，调整酸碱度至PH6，降解几丁聚醣水溶液型成几丁聚醣奈米粒子；以12000g离心移除沉淀物；稀释几丁聚醣奈米粒子后在室温混合蛋白质反应数小时；以及离心取出上清液则含有几丁聚醣_蛋白质复合体。前述的制备方法，其中酸碱度至pH6的几丁聚醣水溶液作为几丁聚醣运输工具。前述的制备方法，其中蛋白质与几丁聚醣奈米粒子的比例为1:2。本发明的一种基因枪发射子弹组成，其特征在于，所述基因枪发射子弹组成包括前述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体。本发明的一种基因枪发射子弹组成，其特征在于，所述基因枪发射子弹组成包括前述的几丁聚醣_蛋白质组成的制备方法所得的几丁聚醣_蛋白质复合体。本发明的一种皮肤贴布组成，其特征在于，所述皮肤贴布组成包括前述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体。本发明的一种皮肤贴布组成，其特征在于，所述皮肤贴布组成包括前述的几丁聚醣_蛋白质组成的制备方法所得的几丁聚醣_蛋白质复合体。本发明的一种药膏组成，其特征在于，所述药膏组成包括前述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体。本发明的一种药膏组成，其特征在于，所述药膏组成包括前述的几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法所得的几丁聚醣_蛋白质复合体。因此，几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体为一个能具体传递脱氧核糖核酸疫苗且能诱发专一性的免疫反应。在另一个方面，本发明也以经皮传输几丁聚醣-蛋白质复合体使用低压基因枪，并且以几丁聚醣-蛋白质复合体经皮传输以贴布传递蛋白质。几丁聚醣-蛋白质复合体有效传递胶原蛋白质，可利用在美妆，伤口重建或化妆品上。图l显示不同磷酸根阴离子/氨基比例的几丁聚醣和脱氧核糖核酸质体复合体的平均粒径和表面电荷。图2显示以低压基因枪经皮传输几丁聚醣和日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗复合体在皮肤中日本脑炎外套蛋白的表现量。图3A显示以低压基因枪经皮传输几丁聚醣和日本脑炎DNA疫苗复合体免疫小鼠C3H/HeN所诱发的血清中抗日本脑炎外套蛋白的抗体力价。图3B显示以低压基因枪经皮传输几丁聚醣和日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗复合体免疫小鼠C3H/HeN所诱发的保护效果。图4显示不同比例的几丁聚醣和脱氧核糖核酸质体复合体对于仓鼠肾细胞的转染效率。图5显示以贴布经皮传输几丁聚醣和日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗复合体免疫在皮肤中日本脑炎外套蛋白的表现量。图6A显示贴布经皮传输几丁聚醣和日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗复合体免疫小鼠C3H/HeN所诱发的血清中抗日本脑炎外套蛋白的抗体力价。图6B显示以贴布经皮传输几丁聚醣和日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗复合体免疫小鼠C3H/HeN所诱发的保护效果。图7显示几丁聚醣和蛋白质复合体(几丁聚醣-胶原蛋白复合体)对于仓鼠肾细胞的细胞毒性。图8显示不同浓度几丁聚醣_胶原蛋白复合体处理老鼠巨噬细胞株Raw264.7所产生的一氧化氮累积生成量。图9显示以贴布经皮传输及低压基因枪经皮传输几丁聚醣和FITC标定胶原蛋白复合体在皮肤中的荧光强度。具体实施例方式本发明提供几丁聚醣传输工具以几丁聚醣奈米粒子为基础，其中几丁聚醣奈米粒子由去乙酰度至少81%以上的几丁聚醣为原料。对于人或动物，由于高去乙酰度的几丁聚醣是较不具毒性的，因此几丁聚醣奈米粒子是以去乙酰度81_85%几丁聚醣为材料。几丁聚醣的分子量在本发明中并未特别地具体限制。几丁聚醣作为运输工具其分子量范围从15kDa到800kDa是可接受作为几丁聚醣奈米粒子，但作为几丁聚醣运输工具，分子量的范围从80到108kDa更佳，而所述的几丁聚醣的来源是从自然获得，且来源也可由商业提供。此发明所使用的几丁聚醣来源为Sigma(St.Louis，M0)所提供的天然甲壳动物的壳。以几丁聚醣为运输脱氧核糖核酸或蛋白质利用经皮传输或经皮渗透应用在独立个体。脱氧核糖核酸的例子可包括基因治疗脱氧核糖核酸、质体和一个能产生免疫反应的脱氧核糖核酸，例如脱氧核糖核酸疫苗，不过并不以上述为限制，其中，蛋白质也是抗原、抗体、药物或者化妆蛋白质(例如胶原蛋白)。上述需要脱氧核糖核酸或蛋白质治疗的个体也许是人或非人哺乳动物。例如可用来产生免疫性保护力来抵抗感染性病原，例子可为日本脑炎病毒(JEV)。以下，将详述几丁聚醣做为运输工具的方法。首先，将几丁聚醣溶在在乙酸溶液使几丁聚醣溶解，调整几丁聚醣溶液酸碱度至PH4.0-6.0;且以几丁聚醣溶液降解的几丁聚醣奈米粒子平均直径为200毫微米。更佳的实施例则是乙酸溶液是167微摩尔浓度(mM)，并且几丁聚醣在乙酸溶液到重量体积比浓度为1%(w/v)。此外，几丁聚醣去乙酰度至少81%，其中较佳的几丁聚醣则是去乙酰度81-85%。一般制造几丁聚醣运输工具的方法包括(a)溶解上述几丁聚醣，几丁聚醣浓度为1%(w/v)在167mM乙酸温和加热，使几丁聚醣溶解；(b)调整几丁聚醣溶液酸碱度至pH5.5-6.0;并且(c)以离子凝胶方法经由超音波在室温制成几丁聚醣粒溶液；(d)以12，000g离心分离几丁聚醣奈米粒子和去除大颗聚集物。一方面降低几丁聚醣溶液所制成几丁聚醣奈米粒子为一简单的技术，其中虽然没有提及离子凝胶化、乳化液聚化和乳化扩散法，但所述方法也包括在本发明的范围内。而有关几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体而言，在本发明中所述的几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体经由经皮传输或经皮渗透来传递脱氧核醣核酸是非常有效，其因在于脱氧核醣核酸与以交联剂所制成几丁聚醣奈米粒子的几丁聚醣运输工具。几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体根据早先报告的方法配制(Sato，etal.，ChemLett1996:725-6(1996))。这样方法包括准备一个超音波处理的脱氧核糖核酸的水溶液；混合脱氧核糖核酸溶液与几丁聚醣溶液，脱氧核糖核酸磷酸盐阴离子与几丁聚醣的阳离子是比为l:2;允许脱氧核糖核酸和几丁聚醣的交互作用；获得几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体。在本发明中，几丁聚醣为运输工具的几丁聚醣奈米粒子去乙酰度至少81%。而几丁聚醣做为运输工具由去乙酰度81_85%则更佳。几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体包括几丁聚醣、和TPP(三聚磷酸钠)交7联反应形成几丁聚醣奈米粒子，再与脱氧核糖核酸静电交互形成复合体。具体化，O.84mg/mlTPP水溶液的8毫升缓慢加入几丁聚醣的20毫升溶液。如上述，几丁聚醣为运输工具的几丁聚醣奈米粒子去乙酰度至少81%。其中去乙酰度81-85%则更佳。以低压基因枪经皮传递几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体是有用的。一般低压基因枪比常规高压基因枪更好的原因在于低压基因枪较不伤害于个体。然而，比较一般高压基因枪所使用的金属微粒，本发明所揭露的几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体具有生物可分解性。用几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体和低压基因枪，能高效率地交付脱氧核糖核酸经皮渗透入个体。另外，几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体的皮肤贴布也是有效地经皮渗透交付进入个体。当几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体提供脱氧核糖核酸经皮渗透且可以高效率地被执行而无须使用佐剂。几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体也能作为软膏直接地在皮肤应用。脱氧核糖核酸质体包括磷酸盐阴离子，且几丁聚醣奈米粒子包括氨基。因此，「N/P比率」为氨基(被省略作为「N」)对磷酸盐阴离子(被省略作为「P」)从i:0.25范围到i:5。而N/p比率为i:i的几丁聚醣-脱氧核醣核酸有沉淀物产生，故本发明n/p比率为i:i的几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体混合物没有用在此。一般首选的N/p比率从i:2范围到i:5。以下将详述制作几丁聚醣-脱氧核醣核酸的方法，以几丁聚醣运输工具的几丁聚醣奈米粒子主要透过相互交联脱氧核糖核酸形成几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体。制作几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体方法包括(a)准备几丁聚醣传输工具的几丁聚醣奈米粒子；(b)混合脱氧核糖核酸与几丁聚醣奈米粒子；并且(c)增加一个相互交联的试剂例如TPP允许脱氧核糖核酸与几丁聚醣奈米粒子相互交联。更好地，在步骤(a)以几丁聚醣为传输工具的几丁聚醣奈米粒子溶液其酸碱度至pH5.5，并且去乙酰度至少81%。而几丁聚醣做为运输工具以去乙酰度81-85%则更佳。脱氧核糖核酸的准备过程主要取决在脱氧核糖核酸结构和特点。在本发明的首选的具体实施态样中，几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体包括几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体奈米粒子。举例来说，其中一种方法可为几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体包括混合10yl脱氧核糖核酸质体溶液(lmg/ml)与几丁聚醣传输工具的几丁聚醣奈米粒子。混合物温和地被搅动在室温两、三个小时，脱氧核糖核酸与几丁聚醣奈米粒子相互交联。用在形成几丁聚醣脱氧核醣核酸复合体的脱氧核糖核酸也许是基因治疗脱氧核糖核酸、质体和一个产生免疫的脱氧核糖核酸(例如脱氧核糖核酸疫苗)。脱氧核糖核酸疫苗的例子是从日本脑炎病毒取出的日本脑炎病毒的脱氧核糖核酸。建构表现北京株日本脑炎病毒的膜蛋白和外套蛋白的脱氧核糖核酸。膜蛋白和外套蛋白的序列由(碱基431-2477)以反转录PCR日本脑炎病毒北京株基因体RNA获得。构筑入pCJ-3载体Hindi11/EcoRI两切点产生质粒pCJ-3/ME(Wuetal.，MicrobesInfect8:2578-2586(2006))。脱氧核糖核酸质体转型至大肠杆菌DH5。使用Qiagen质体Giga套件(Qiagen、Hilden，German)根据制造商的指示抽取脱氧核糖核酸质体(pCJ-3/ME)，存放在-7(TC作备用。再，脱氧核糖核酸的另一个例子是报导基因的质体，此脱氧核糖核酸有pGFP-Nl和pCMV13由(Clontech，PaloAlto，CA)所购得。pGFP-Nl包括绿色荧光蛋白质，并且pCMVP包括巨细胞病毒促进调控P半乳糖甘酶基因。脱氧核糖核酸在大肠杆菌DH5a中放大(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)并以一个标准程序和纯化。脱氧核糖核酸也许使用质体纯化套件(Qiagen，Hilden，German)。以去离子水回溶的脱氧核糖核酸被存放在4"C备用。8几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体包括脱氧核糖核酸疫苗与几丁聚醣奈米粒子以交互作用形成。更好地，几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体可添加佐剂加强效果。佐剂剌激个体的免疫系统导致增加脱氧核糖核酸疫苗的免疫作用。本发明也证实将蛋白质以几丁聚醣-蛋白质复合体经皮传输或经皮渗透是可行的。几丁聚醣的表面正电和TPP以离子凝胶形成几丁聚醣奈米粒子。预先将蛋白质溶液和不同浓度几丁聚醣奈米粒子混合。「P/C比率」为蛋白质体积(被省略作为「P」)对几丁聚醣奈米粒子体积(被省略作为「c」)比例范围从i:0.5到i:5。第一首选的p/c比率是i:2。此比率在室温以磁性搅拌。以低压基因枪经皮传输几丁聚醣-蛋白质复合体较不会有害在个体。几丁聚醣-蛋白质复合体优点归结于它生物可分解性。利用高效率的低压基因枪经皮传输几丁聚醣-蛋白质复合体是可行的。另外，经皮传输几丁聚醣-蛋白质复合体进入个体是没有添加佐剂。几丁聚醣-蛋白质复合体也许能以贴布或软膏方式，直接作用在皮肤。另外，制做几丁聚醣-蛋白质复合体方法包括(a)以乙酸溶液温和地加热溶解几丁聚醣形成几丁聚醣溶液；(b)调整几丁聚醣酸碱度至pH6;(c)以离子凝胶方法经由超音波在室温制成几丁聚醣粒溶液；(d)以14，000g离心分离几丁聚醣奈米粒子和去除大颗粒聚集物；(e)稀释几丁聚醣奈米溶液；(f)准备蛋白质溶液；(g)与几丁聚醣奈米溶液在室温混合蛋白质；(h)在室温下反应；(i)离心分离混合物吸取上清液含有几丁聚醣_蛋白质复合体；(j)获得几丁聚醣-蛋白质复合体。更好地，在步骤(a)乙酸溶液是167mM。在步骤(c)，以离子凝胶方法经由超音波在室温制成几丁聚醣粒溶液。在步骤(g)，在磁石搅拌蛋白质与几丁聚醣奈米溶液混合液。在步骤(h)，混合时间是2个小时。在步骤(i)，混合物溶液也许被分离在14，OOOrpm30分钟。此外，几丁聚醣去乙酰度至少81%。而几丁聚醣做为运输工具以去乙酰度81-85%则更佳。首选方法的具体实施态样则是在步骤(f)，P/C比率，即蛋白质与几丁聚醣奈米溶液体积比是l:2。在步骤(c)几丁聚醣溶液为10mg/ml以29W超音波机器反应4分钟。首选方法的具体实施态样是在步骤(e)到(g)几丁聚醣用二次水稀释到50iig/mL，且原蛋白质浓度是lmg/mL蛋白质溶液。此外，1毫升的lmg/mL蛋白质溶液与2毫升的50iig/mL几丁聚醣奈米溶液混合制成。用在形成几丁聚醣-蛋白质复合体的蛋白质也许是抗体、抗原、抗生素、生长因子或者是化妆品为目的蛋白质作为皮肤修复。胶原蛋白为改进皮肤状态和提供保养所而生的化妆品。而皮肤修理的例子则是增长因子例如EGF(表皮增长因子)。期间所使用的蛋白质也包括胜肽。在应用方面，本发明提供包括皮肤贴布及基因枪子弹几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体或几丁聚醣_蛋白质复合体，和几丁聚醣_脱氧核醣核酸复合体或几丁聚醣_蛋白质复合体的软膏。上述的基因枪子弹、皮肤贴布和软膏在生物工业上，对于诊断和治疗领域会有帮助。实施例一、通过低压基因枪经皮传输免疫抵抗日本脑炎病毒脱氧核糖核酸疫苗。A.配制奈米微粒关于图l，带正电的几丁聚醣与TPP以离子凝胶法制成几丁聚醣奈米粒子。配置不同N/P比的奈米粒子的粒径大小和表面电荷如图1所示。除了几丁聚醣pCJ-3/ME的重量比为l.O:l.O，其它比值所形成的复合体都为毫微米等级。理论显示出在这重量比，整体带电比率(正电荷-NH3+在几丁聚糖对带负电荷的-P04-在脱氧核糖核酸)几丁聚醣奈米粒子近似地是l.O:l.O，因而造成聚集。几丁聚醣奈米粒子的大小是在150-270奈米范围内，其表面正电或负电，根据使用的几丁聚醣和脱氧核糖核酸的相对使用的浓度所致。当大量带负电的脱氧核糖核酸超出了带正电的几丁聚醣(几丁聚醣脱氧核糖核酸=0.5:i.o)，几丁聚醣奈米粒子将倾向在有在他们的表面吸附脱氧核糖核酸，因而有负极表面电荷。相反，当大量带正电几丁聚醣超出了带负电的脱氧核糖核酸(几丁聚醣脱氧核糖核酸=1.5:1.0-5.0:i.o)，则几丁聚醣分子会在几丁聚醣奈米粒子表面。因此，几丁聚醣奈米粒子显示了一个正电荷表面。雷射光散射仪扫描观察的奈米粒子直径和扫瞄式电子显微镜术(SEM)是同样相似。B.侦测以低压基因枪经皮传输C3H/HeN老鼠皮肤中荧光蛋白质和JEV外套蛋白质表现侦测经皮传输免疫C3H/HeN老鼠皮肤中绿色发荧光蛋白质和JEV外套蛋白质表现，每组四只6-8周C3H/HeN母鼠以低压基因枪免疫50yg几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体。老鼠质体单独免疫，不使用几丁聚醣作为控制组。在72h以后，皮肤由荧光显微镜观察获得结果。大多绿荧光蛋白质表现位在皮肤表皮区域。在直接应用的位置也被发现表现绿荧光蛋白细胞在表皮和真皮毛囊，但不在肌肉。几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体有效率传递pCJ-3/ME后测量目标蛋白质在皮肤上的表现。关于图2，几丁聚醣-JEV外套蛋白质的表现量在低压基因枪传递下比没有几丁聚醣的控制组高2.2士0.05倍。以低压基因枪经皮传输老鼠其绿色荧光蛋白质和蛋白质皆有较佳的表现，故几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体将可做为经皮免疫的运输工具。C.经皮传输后C3H/HeN老鼠的GFP+细胞和DC细胞从皮肤迁移到淋巴结表皮中的抗原呈现细胞，Langerhans细胞显示拥有运输抗原的功能从皮肤迁移到淋巴结(Glennetal.，Expert.Opin.Investig.Drugs8:797-805(1999);Gargetal.，Nat.Immunol.4:907-912(2003))。首先，研究观察被处理几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体经皮传输C3H/HeN老鼠是否被Langerhans细胞摄入。因此，每组三只6-8周C3H/HeN母鼠，剔除腹部毛发且以脱毛膏去除残毛，然后以低压基因枪免疫50g几丁聚醣-pGFP-Nl复合体作用72个小时。取免疫部位皮肤进行免疫荧光染色(Imm皿ofluorescence)，以Hamsteranti-mouseCDllcconjugatePE染色后，再利用荧光显微镜观察。发现在毛囊处有明显两种荧光重迭现象。为了了解几丁聚醣-DNA复合体经皮渗透，并经细胞摄入后，从表皮层迁移至脾脏及淋巴结的动态及分布情形，以液态基因枪传输几丁聚醣-DNA复合体(50iigpCMVP)于24小时到第5天，制备脾脏及淋巴结单一悬浮细胞，再以FDG染色处理后以流式细胞仪观察绿荧光表现情形。在0，24，48，72和96个小时以后，P半乳糖甘酶在腋下及鼠膝部淋巴结表现，且主要表现在鼠膝部淋巴结，其结果不同于先前研究，可能一个目标染色时间的增加所造成(Anju6reetal.，Blood93:590-598(1999);Xuetal.，J.Exp.Med.197:1255-1267)。接着以流式细胞仪P半乳糖甘酶的绿荧光讯号能持续侦测直到第四天，其鼠膝部淋巴结P半乳糖甘酶的绿荧光讯号到达3%。D.几丁聚醣-pCJ-3/ME复合体经皮免疫C3H/HeN老鼠引起血清anti-E抗体力价及保护效果实验已知没有几丁聚醣装载的JEV脱氧核糖核酸疫苗以低压基因枪经皮传输较10无法引起免疫反应。为确认活体实验中以低压基因枪经皮传输几丁聚醣装载JEV脱氧核糖核酸疫苗是否可能提高免疫效力，C3H/HeN老鼠腹部皮肤经皮传输免疫与几丁聚醣装载50iigpCJ-3/ME-脱氧核糖核酸或没有几丁聚醣装载单独质体作为控制组。间隔2个星期时间老鼠接受了二次免疫相同数量方法脱氧核糖核酸免疫。如图3A显示，在8周后低压基因枪免疫没有几丁聚醣装载pCJ-3/ME的老鼠没有生产任何anti-E，但以几丁聚醣装载处理的组别，则有产生大量anti-E抗体(50.l±10U/ml)。所有老鼠在8周接受50倍LD50(3X107PFU/每只老鼠)JFV北京株的攻毒。如图3B所显示，没有几丁聚醣装载pCJ-3/ME的免疫老鼠的组别，则无老鼠存活。相反，以低压基因枪传输几丁聚醣装载脱氧核糖核酸疫苗组别有60%存活下来。这些结果表示，以低压基因枪经皮传输免疫脱氧核糖核酸疫苗将产生更高的保护抗体，对抗JEV攻毒。E.经皮免疫几丁聚醣-pCJ-3/ME老鼠血清中anti-E抗体亚型不同免疫方式在免疫反应期间可能导致辅助T细胞(Th)细胞类型不同而产生不同抗体种类。一般来说，Thl免疫反应促进IgG2a抗体的生产，而Th2免疫反应提高IgGl的抗体生产。经皮免疫几丁聚醣-pCJ-3/ME的C3H/HeN老鼠所产的抗体亚型被分析。两组免疫老鼠在28天血清中anti-E抗体相似。关于IgG亚型，经皮传输组别几乎完全生产了IgGlanti-E抗体，而IgG2a抗体在老鼠只被小量侦测出来。实施例二、藉贴布经皮传输免疫抵抗日本脑炎病毒脱氧核糖核酸疫苗。A.配制奈米微粒关于图l，带正电的几丁聚醣与TPP以离子凝胶法制成几丁聚醣奈米粒子。配置不同N/P比的奈米粒子的粒径大小和表面电荷如图1所示。除了几丁聚醣pCJ-3/ME的重量比为l.O:l.O，其它比值所形成的复合体都为毫微米等级。理论显示出在这重量比，整体带电比率(正电荷-NH3+在几丁聚糖对带负电荷的-P04-在脱氧核糖核酸)几丁聚醣奈米粒子近似地是1.0:1.0，因而造成聚集。几丁聚醣奈米粒子的大小是在150-270奈米范围内，其表面正电或负电，根据使用的几丁聚醣和脱氧核糖核酸的相对使用的浓度所致。当大量带负电的脱氧核糖核酸超出了带正电的几丁聚醣(几丁聚醣脱氧核糖核酸=0.5:i.o)，几丁聚醣奈米粒子将倾向在有在他们的表面吸附脱氧核糖核酸，因而有负极表面电荷。相反，当大量带正电几丁聚醣超出了带负电的脱氧核糖核酸(几丁聚醣脱氧核糖核酸=1.5:1.0-5.0:i.o)，则几丁聚醣分子会在几丁聚醣奈米粒子表面。因此，几丁聚醣奈米粒子显示了一个正电荷表面。因此表一显示几丁聚醣奈米粒子粒径大小及表面电荷。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>B.细胞毒性为了评估计微粒的制备过程是否会导致任何细胞毒性，以不同N/P比几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体处理BHK-21及Vero细胞，由MTS分析评估细胞毒性。微粒无任何细胞毒性，并且所有测试组别细胞存活约80%。处理的细胞增生比未处理的细胞活跃，这些结果可能也被解释作为几丁聚醣奈米粒子可能促进细胞增殖。这大概是暗示几丁聚醣奈米粒子也许有利地影响细胞的lysosomal和线粒体活动(Glennetal.，InfectImmun67(3):1100-6(1999))。C.几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体的转染效率几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体转染BHK-21或Vero细胞使用10%血清，并且转染后在24小时及48小时荧光被侦测。在BHK-21细胞，荧光强度随着转染后时间增强，最大的基因表现量在48h(图4)。进一步使用流式细胞仪分析转染效率，发现不同比例几丁聚醣-DNA复合体的转染能力有差异，BHK细胞的最适比例为N/P=3;Vero细胞的最适比例为N/P=5。影响几丁聚醣-pGFP-Nl复合体的转染效率认为和细胞摄入和胞内复合体有关。所以，几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体转染机制以荧光标定几丁聚醣或质体。D.侦测以贴布经皮传输C3H/HeN老鼠皮肤JEV外套蛋白质的表现侦测活体实验JEV-E蛋白质的表现量，每组五只68周母C3H/HeN老鼠经贴布皮传输接种与50g几丁聚醣-pCJ-3/ME复合体。皮肤贴布(体积1001，几丁聚醣-脱氧核酸复合体包括50iigpCJ-3/ME或pGFP-Nl溶在二次水的添加不织布内)经皮传输在剃毛的腹部皮肤的lcm2区域。老鼠接单独接种质体不用几丁聚醣装载作为控制组。在72小时后，牺牲老鼠获得皮肤，以免疫墨点法侦测每个样品JEV-E蛋白质表现量。JEV-E蛋白质表现以皮肤贴布接种几丁聚醣_脱氧核酸复合体组别超过单独接种质体的1.5倍(图5)。而细菌的寡脱氧核醣核苷酸(oligodeoxyribo皿cleotides(ODN))中的CpG被报导可剌激老鼠和人免疫系统。ODN为强力佐剂可剌巨噬细胞和自然凶手(NK)细胞的活性在几个老鼠动物实验中(Verthelyietal.，JImmunol168:1659-1663(2002))。图5显示以皮肤贴布接种几丁聚醣_脱氧核酸复合体联合的CpG包括的0DN的老鼠可产生最高的JEV-E蛋白质表现。以皮肤贴布经皮传输老鼠其日本脑炎蛋白质有较佳的表现，故几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体应该是可做为经皮免疫的运输工具。E.几丁聚醣-pCJ-3/ME复合体经皮免疫C3H/HeN老鼠引起血清anti-E抗体力价及保护效果实验已知没有几丁聚醣装载的JEV脱氧核糖核酸疫苗以皮肤贴布传输较无法引起免疫反应。要确认活体实验中皮肤贴布经皮传输几丁聚醣装载JEV脱氧核糖核酸疫苗是否可以提高免疫效力，C3H/HeN老鼠腹部皮肤经皮传输免疫与几丁聚醣装载50iigpCJ-3/ME脱氧核糖核酸或没有几丁聚醣装载单独质体作为控制组。间隔2个星期时间老鼠接受了二次免疫相同数量方法脱氧核糖核酸免疫。如图6A显示，在8周后低压基因枪免疫没有几丁聚醣装载pCJ-3/ME的老鼠没有生产任何anti-E，而相似以几丁聚醣装载处理的组别，则有产生大量anti-E抗体(42.l±15U/ml)。图6A也表示，老鼠以皮肤贴布接种CS-DNA复合体包括CpGmotif的ODN能导致最高anti-E抗体(45.2±6.4U/ml)。所有老鼠在8周接受50倍LD50(3X107PFU/每只老鼠)JEV北京株的攻毒。如图6B所显示，没有几丁聚醣装载pCJ-3/ME的免疫老鼠的组别，无老鼠存活。相反，以皮肤贴布传输几丁聚醣装载脱氧核糖核酸疫苗组别有40%存活下来。皮肤贴布接种几丁聚醣-脱氧核酸复合体包括CpGmotif的0DN有100%存活率。CpGmotif的0DN也许是强力佐剂以皮肤贴布经皮传输脱氧核糖核酸疫苗。这些结果表示，以皮肤贴布经皮传输免疫的脱氧核糖核酸疫苗产生更高的保护抗体，对抗JEV攻毒。F.经皮免疫几丁聚醣pCJ-3/ME老鼠血清中anti-E抗体亚型不同免疫方式在免疫反应期间可能导致辅助T细胞(Th)细胞类型不同而产生不同抗体种类。一般来说，Thl免疫反应促进IgG2a抗体的生产，而Th2免疫反应提高IgGl的抗体生产。经皮免疫几丁聚醣-pCJ-3/ME的C3H/HeN老鼠所产的抗体亚型被分析。两组免疫老鼠在28天血清中anti-E抗体相似。关于IgG亚型，经皮传输组别几乎完全生产了IgGlanti-E抗体，而IgG2a抗体在老鼠只被小量侦测出来。实施例三、以低压基因或皮肤贴布经皮传输几丁聚醣_胶原蛋白复合体A.配制几丁聚醣-胶原蛋白复合体几丁聚醣奈米粒子以带正电的几丁聚醣与三聚磷酸钠(TPP)以离子凝胶法制成。1克的胶原蛋白溶在10毫升酸碱度至pH6的去离子水。将胶原蛋白水溶液稀释至lmg/mL胶原蛋白溶液与2毫升浓度50iig/ml的几丁聚醣奈米水溶液混合在室温下搅拌。B.细胞毒性测试为了评估计几丁聚醣奈粒的制备过程是否会导致任何细胞毒性，以不同浓度几丁聚醣_胶原蛋白处理BHK-21细胞，由MTS分析评估细胞毒性。图7显示了几丁聚醣奈粒无任何细胞毒性，并且所有测试组别细胞存活约80%。处理的细胞增生比未处理的细胞活跃，这些结果可能也被解释作为几丁聚醣奈米粒子可能促进细胞增殖。这些结果显示几丁聚醣-胶原蛋白复合体有良好体外生物兼容性，对纤维细胞剌激增生(Chenetal.，colloidsandsurfacesA.313-314:183-8(2008))。C.几丁聚醣_胶原蛋白复合体在RAW264.7细胞的一氧化氮实验评估几丁聚醣-胶原蛋白复合体是否会诱使任何发炎反应，以几丁聚醣_胶原蛋白复合体处理不同老鼠的巨噬细胞(RAW264.7)配合和在亚硝酸盐的浓度累积评估NO(—氧化氮)产生量。因为的氧化氮快速转换成亚硝酸盐(N02-)进一步转变硝酸盐(N03)。简单，硝酸盐被转换为亚硝酸盐的曲霉亚硝酸盐还原，以Griess试剂测试亚硝酸盐含量，并以ELISA阅读器在吸光值550nm读取吸光值。图8显示，亚硝酸盐的浓度有显著低于以内毒素处理的控制组，但几丁聚醣-胶原蛋白复合体处理组不引发任何硝酸盐积累。这些数据显示几丁聚醣-胶原蛋白复合体并不会引起炎症，适合在化妆品上使用。D.以荧光显微镜观察皮肤经皮传输和经皮渗透FITC标定几丁聚醣_胶原蛋白复合体评估低压基因枪及皮肤贴布经皮传输几丁聚醣胶原蛋白复合体是否可行。以FITC标定几丁聚醣胶原蛋白复合体，经皮免疫C3H/HeN小鼠以荧光显微镜评估经皮渗透的能力。参考文献(Limetal.，Pharm.Res.20，1812-19(2003))标定胶原蛋白，以异硫氰酸官能基与主要的胶原蛋白氨基反应。未标定的物质以(10分钟10000g)离心、沉淀、清洗，直到在该上清液未能检测到荧光。获得标定FITC的胶原蛋白以配制几丁聚醣-胶原蛋白复合体。6-8周母C3H/HeN小鼠被用作经皮渗透和经皮传输。每个组中有6只小鼠(3小鼠被用作经皮传递研究与皮肤贴布，其它3只老鼠被用作低压基因枪传递研究)C3H/HeN小鼠被ac印romazine麻醉(i.p.)，并限制腹部皮肤面积，剔除毛发。随后，几丁聚醣-胶原蛋白复合体包括25iigFITC标定的胶原蛋白以二次水补至总体积100iU注入在低压基因枪轰击(60Psi氮压力设置)的其中一组的3只小鼠。皮肤贴布(几丁聚醣-胶原蛋白质复合体包括25i！gFITC标定的胶原蛋白以二次水补至总体积100i！1)经皮传输至无毛腹部皮肤。一小时后，将几丁聚醣-胶原蛋白复合体处理的小鼠牺牲。搜集老鼠的皮肤立即冷冻-20oC。组织以O.C.T.(SakuraFinetekUSA，Torrance,California)包埋，然后进行冷冻切片。切片再以Olympus荧光显微镜BX-51(JanpenOlympus)观察。在低压基因枪及皮肤贴布经皮传输FITC标定几丁聚醣_胶原蛋白的组别，荧光讯号大多数位在老鼠表皮区域真皮层不在肌肉层。皮肤贴布经皮传输FITC标定几丁聚醣-胶原蛋白的组别的荧光强度更是FITC胶原蛋白的组别的13倍。低压基因枪经皮传输FITC标定几丁聚醣-胶原蛋白的组别的荧光强度更是FITC胶原蛋白的组别的18倍(图9)。最低荧光强度则是以未使用几丁聚醣装载组别评估。从这些荧光强度的实验数据显示低压基因枪或皮肤贴布经皮传输几丁聚醣_胶原蛋白质复合体，几丁聚醣可作为蛋白质经皮渗透的运输工具。尽管很多本发明的优势已提出的结构详细信息以及在发明功能上的描述。只能说明描述信息特别形状、大小、准备工作、原理部分。附加声明则表示一般意义最大范围内对发明所有权进行描述。1权利要求一种制作几丁聚醣作为传输工具的方法，其特征在于几丁聚醣是奈米级粒子，且几丁聚醣是纯度至少去乙酰度81％以上的几丁聚醣作为原料，所述方法包括下列步骤以重量体积比1％在167mM醋酸溶解几丁聚醣产生几丁聚醣溶液；调整几丁聚醣溶液的酸碱度介于pH4.0-6.0；以及添加交联剂到几丁聚醣溶液混合降解生成几丁聚醣奈米粒子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于几丁聚醣溶液降解方法选择其一，包括离子凝胶、乳剂聚合乳化扩散。3.—种几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体，其特征在于，包括至少一个含氨基的几丁聚醣奈米粒子；至少一个交联剂；以及至少一个脱氧核糖核酸，与几丁聚醣奈米粒子交联的氨基对磷酸盐阴离子的比不大于1!5。4.根据权利要求3所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其特征在于脱氧核糖核酸与几丁聚醣奈米粒子交联的氨基对磷酸盐阴离子的比不小于l:0.25。5.根据权利要求3所述的几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体，其特征在于几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体交联剂为硫胺焦磷酸。6.根据权利要求3所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其特征在于几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体的氨基对磷酸盐阴离子的比介于l:2至1:5。7.根据权利要求3所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其特征在于几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体的脱氧核糖核酸是脱氧核糖核酸质体。8.根据权利要求3所述的几丁聚醣脱氧核糖核酸复合体，其特征在于几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体的脱氧核糖核酸是脱氧核糖核酸疫苗。9.根据权利要求8所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其特征在于几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体的脱氧核糖核酸是日本脑炎脱氧核糖核酸疫苗。10.根据权利要求8所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体，其特征在于几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体包括佐剂。11.根据权利要求10所述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体，其特征在于佐剂为未甲基化寡脱氧核醣核酸。12.—种几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法，其特征在于，包括下列步骤配制几丁聚醣奈米粒子的几丁聚醣运输工具；混合蛋白质和几丁聚醣运输工具；以及添加交联剂到几丁聚醣溶液混合降解生成几丁聚醣奈米粒子。13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，调整几丁聚醣水溶液酸碱值5.5。14.一种几丁聚醣_蛋白质复合体的组成，其特征在于，所述几丁聚醣_蛋白质复合体的组成为几丁聚醣奈米粒子的几丁聚醣运输工具，所述复合体中的蛋白质与几丁聚醣以互相交联包裹型成，几丁聚醣奈米粒子体积对蛋白质体积的比例范围介于1:0.5至1:5。15.根据权利要求14所述的几丁聚醣-蛋白质复合体的组成，其特征在于，几丁聚醣_蛋白质复合体，交联剂为硫胺焦磷酸(TPP)。16.根据权利要求14所述的几丁聚醣-蛋白质复合体的组成，其特征在于，几丁聚醣-蛋白质复合体，蛋白质为胶原蛋白。17.根据权利要求14所述的几丁聚醣-蛋白质复合体的组成，其特征在于，几丁聚醣_蛋白复合体，表皮生长因子。18.—种几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法，其特征在于，包括下列步骤以醋酸溶解几丁聚醣温和加热型成几丁聚醣水溶液，调整酸碱度至PH6，降解几丁聚醣水溶液型成几丁聚醣奈米粒子；以12000g离心移除沉淀物；稀释几丁聚醣奈米粒子后在室温混合蛋白质反应数小时；以及离心取出上清液则含有几丁聚醣_蛋白质复合体。19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，酸碱度至pH6的几丁聚醣水溶液作为几丁聚醣运输工具。20.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，蛋白质与几丁聚醣奈米粒子的比例为1:2。21.—种基因枪发射子弹组成，其特征在于，所述基因枪发射子弹组成包括权利要求3所述的几丁聚醣_脱氧核糖核酸复合体。22.—种基因枪发射子弹组成，其特征在于，所述基因枪发射子弹组成包括权利要求18所述的几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法所得的几丁聚醣_蛋白质复合体。23.—种皮肤贴布组成，其特征在于，所述皮肤贴布组成包括权利要求3所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体。24.—种皮肤贴布组成，其特征在于，所述皮肤贴布组成包括权利要求18所述的几丁聚醣_蛋白质组成的制备方法所得的几丁聚醣_蛋白质复合体。25.—种药膏组成，其特征在于，所述药膏组成包括权利要求3所述的几丁聚醣-脱氧核糖核酸复合体。26.—种药膏组成，其特征在于，所述药膏组成包括权利要求18所述的几丁聚醣-蛋白质组成的制备方法所得的几丁聚醣_蛋白质复合体。全文摘要本发明中是以几丁聚醣奈米粒子作为传输工具，且制作成几丁聚醣-脱氧核糖核酸和几丁聚醣-蛋白质复合体，此复合体可作为脱氧核糖核酸和蛋白质经由皮肤传输的运输工具，且对于皮肤贴布或低压基因枪的传输方式而言，其效果更是非常显著的。本发明同时揭露制作几丁聚醣-脱氧核糖核酸及几丁聚醣-蛋白质复合体的方法以及其实际的应用。因此，几丁聚醣-脱氧核醣核酸复合体为一个能具体传递脱氧核糖核酸疫苗且能诱发专一性的免疫反应。在另一个方面，本发明也以经皮传输几丁聚醣-蛋白质复合体使用低压基因枪，并且以几丁聚醣-蛋白质复合体经皮传输以贴布传递蛋白质。几丁聚醣-蛋白质复合体有效传递胶原蛋白质，可利用在美妆，伤口重建或化妆品上。文档编号A61K9/70GK101711877SQ20091017899公开日2010年5月26日申请日期2009年10月9日优先权日2008年10月3日发明者吴彰哲,陈建龙,陈正宪,黄瀚宁申请人:吴彰哲;黄瀚宁;陈建龙;陈正宪