专利名称：螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物及其应用的制作方法
技术领域：
本申请涉及蛋白酶解产物及其应用。
背景技术：
螺旋藻是对节旋藻属(Arthrospira)的两种蓝藻，即极大节旋藻(Arthrospira maxima)和钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的通称。这两种蓝藻最初被分入螺 旋藻属(Spirulina)，后又分入节旋藻属，但习惯上仍称作“螺旋藻”。藻蓝蛋白是螺旋 藻所含的捕光色素蛋白，可以抗氧化、抗炎症、提高机体免疫力、促进动物细胞再生、抑制 癌细胞生长(Farooqet al.，Chem—Biol Interact, 2004,149,1-7 ；Subhashini et al.， BiochemPharmacol, 2004, 68 453-62 ；Chen and Wong, J Agric Food Chem,2008,56, 4352-4358。发明简述第一方面提供螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。所述酶解可以使用胰蛋白酶、地衣芽 胞杆菌(Bacillus licheniformis)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶或其组合。第二方面提供功能食品，包括第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。第三方面提供药物组合物，包括第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物和药学上 可接受的载体。再一方面涉及第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物在制备药物组合物中的用 途，所述药物组合物用于降低体内的自由基水平，或增强个体的抗氧化体系，和/或预防和 /或治疗自由基相关疾病。
图1显示ABTS法检测的螺旋藻藻蓝蛋白的胰蛋白酶酶解产物的总抗氧化活性。图2显示ABTS法检测的螺旋藻藻蓝蛋白的地衣芽胞杆菌蛋白酶酶解产物的总抗 氧化活性。图3显示ABTS法检测的螺旋藻藻蓝蛋白的胰凝乳蛋白酶酶解产物的总抗氧化活 性。图4显示ABTS法检测的螺旋藻藻蓝蛋白的胃蛋白酶酶解产物的总抗氧化活性。图5显示基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F/MS)鉴定的螺旋藻藻 蓝蛋白的胰蛋白酶酶解产物。
具体实施例方式第一方面提供螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。优选地，所述的螺旋藻藻蓝蛋白的酶 解产物分别是以下实施方式的酶解产物，或者是分别由以下实施方式中描述的方法或其任 意组合所产生的酶解产物。在一些实施方式中，螺旋藻选自极大节旋藻和钝顶节旋藻的品系中的一种或多
3种。极大节旋藻的品系例如是极大节旋藻BJ 2000、极大节旋藻C0NC-040、极大节旋 藻CS-328、极大节旋藻FACHB438、极大节旋藻FACHBSM、极大节旋藻0UCLXC、极大节旋藻 0UQDSM 等。钝顶节旋藻的品系例如是钝顶节旋藻Ap-s、钝顶节旋藻AV、钝顶节旋藻C1、钝顶 节旋藻CG590、钝顶节旋藻EB 9602、钝顶节旋藻Erdos-DD、钝顶节旋藻FACHB341、钝顶节 旋藻FACHB439、钝顶节旋藻FACHB440、钝顶节旋藻FACHB791、钝顶节旋藻FACHB834、钝顶 节旋藻FACHB869、钝顶节旋藻FACHB0UQDS6、钝顶节旋藻HN01、钝顶节旋藻HZ01、钝顶节旋 藻KCTC AG20590、钝顶节旋藻M2、钝顶节旋藻MMG-9、钝顶节旋藻NJ 1999、钝顶节旋藻PCC 7345、钝顶节旋藻PCC 9438、钝顶节旋藻S6、钝顶节旋藻Sp_l、钝顶节旋藻Sp_10、钝顶节旋 藻Sp-11、钝顶节旋藻Sp-12、钝顶节旋藻Sp-14、钝顶节旋藻Sp-15、钝顶节旋藻Sp-16、钝顶 节旋藻Sp-17、钝顶节旋藻Sp-2、钝顶节旋藻Sp-3、钝顶节旋藻Sp-4、钝顶节旋藻Sp-5、钝顶 节旋藻Sp-6、钝顶节旋藻Sp-7、钝顶节旋藻Sp-8、钝顶节旋藻Sp-9、钝顶节旋藻Sp-DL、钝顶 节旋藻Sp-S、钝顶节旋藻str. Lefevre 1963/M-132-1、钝顶节旋藻str. Paraca等。关于极大节旋藻和钝顶节旋藻的形态学、生理学、培养方法及其应用，描述于例 如 Feng Chen, Yue Jiang 所编 Algae and their BiotechnologicalPotential (藻类及其 生物技术潜力)，Kluwer Academic Publishers，2001 和 Avigad Vonshak 所编 Spirulina platensis (Arthrospira) :physiology, cell-biology, and biotechnology (纯顶节方宠藻 生理学、细胞生物学和生物技术)，Taylor & Francis Ltd，1997等。特别地，高生物量高富 硒量螺旋藻的培养模型描述于例如Chen et al.，2006，Enzyme Microb Techno 1 39，103 ; Chen et al.，2006，Biotechnol Tech 97,2260 ；Chen et al.，2008，J Integr PlantBiol 50,40 等。藻蓝蛋白是捕光色素藻胆蛋白家族成员。藻蓝蛋白吸收红光和橙光、特别是620nm 附近的光，并且发射约650nm的荧光。它是叶绿素的辅助色素。在一些实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白是氨基酸序列选自NCBI(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)登录号 AAX68409， AAP69774， AAP69773， CAC10037， ZP_03271569， ZP_03271568， EDZ96897, EDZ96896, AAX68411, AAX68410, ABU48451, AAP69778, AAP69777, AAP69776, AAP69775, AAP69770, AAP69769, AAL66232, AAL66231, ABN70846, ABN70845, ABD64608, BD64607, CAC37391, CAC37389, CAC37387, CAC37390, CAC37388, CAC37386, CAC10047, CAC10046, CAC10045, CAC10044, CAC10043, CAC10042, CAC10041, CAC10040, CAC10039, CAC10038, CAC10035 和 CAC10034 所示序列的螺旋藻藻蓝蛋 白。在某些实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白具有a亚基和0亚基。在特定实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白是钝顶节旋藻藻蓝蛋白，并且其结构如NCBI 登录号 1HA7_X、1HA7_W, 1HA7_V、1HA7_U、1HA7_T、1HA7_S、1HA7_R、1HA7_Q、1HA7_P、1HA7_0、 1HA7_N、1HA7_M、1HA7_L、1HA7_K、1HA7_J、1HA7_I、1HA7_H、1HA7_G、1HA7_F、1HA7_E、1HA7_D、 1HA7_C、1HA7_B 和 / 或 1HA7_A 所示。在一些实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白可以从螺旋藻提取。进行提取时，可以采用 反复冻融法、超声波破碎法、勻浆法、物理破碎、酶溶法、化学渗透法和十二烷基苯磺酸钠 裂解法等方法来破碎螺旋藻细胞(Santiago-Santos et al.，Process Biochem，2004，39，2047-2052)。反复冻融-超声破碎联用法可获得大量的蛋白粗产品，适合于规模化开发。关 于蛋白沉淀，可以使用硫酸胺盐析或冷冻丙酮沉淀。进行纯化时，可以使用离子交换色谱和体积排阻色谱法(Chen andffong, Phytochemistry, 2006,67, 2424-2430)(Benedetti etal, J Chromatogr B，2006，833 :12-18)、膨胀床吸附色谱(Niu et al, JChromatogr B，2007，850 :267_276)、疏 水性相互作用色谱等，优选单独使用或联用离子交换色谱和体积排阻色谱。也可以采用双 水相萃取方法多次萃取得到纯化的藻蓝蛋白(Patil G and Raghavarao，Biochem Eng J, 2007,34 156-164)。此外，还可以使用“硫酸铵分步沉淀_离子色谱层析_分子筛层析柱”(Chen and Wong, Phytochemistry, 2006,67, 2424-2430)纯化藻蓝蛋白。“硫酸铵分步沉淀-离子色谱 层析-分子筛层析柱”将含藻蓝蛋白的纯化因子提高到7. 92。另外，选用DEAE-S印hadex 填料，使用单一离子色谱层析也可获得纯化因子达到5的Se-PC。在一个实施方式中，所用螺旋藻藻蓝蛋白是干粉形式。在另一些实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白是可商购的藻蓝蛋白。例如是厂商 Sigma-Aldrich Co.的产品。在本文中，术语“酶解”意指使用蛋白酶裂解。蛋白酶是对水解蛋白肽键的酶的总称。按水解方式，可以将其分为内肽酶和外肽 酶。内肽酶将蛋白分子内部切断，形成分子量较小的肽片段。外肽酶从蛋白分子的游离氨 基或羧基末端逐个将肽键水解，游离出氨基酸，其中，前者为氨基肽酶，后者为羧基肽酶。按 活性中心，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋 白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。按水解反应的最适PH值，则分为酸性蛋白酶、中性蛋 白酶和碱性蛋白酶。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的特异性。蛋白酶仅能作用于蛋白分子中的特 异肽键，例如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。在一些实施方式中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋 白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、地衣芽胞杆菌蛋白酶、或其组合。所述蛋白酶可以从例 如 Novo Nordisk A/S 和 Sigma-Aldrich Co.的厂商购买。在一些实施方式中，酶解在适当的缓冲液中进行。适当的缓冲液例如是磷酸盐缓 冲液、Tris-HCl缓冲液和Ifepes缓冲液等。可以将螺旋藻藻蓝蛋白和蛋白酶一同加入缓冲 液，从而开始酶解过程。然而，优选地，在向缓冲液加入蛋白酶前，还包括使螺旋藻藻蓝蛋白 溶解于缓冲液的步骤。在一个实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的制备还包括，在向 缓冲液加入蛋白酶前，配制以重量计，1-5%螺旋藻藻蓝蛋白磷酸盐缓冲液。在酶解过程中，可以将缓冲液的pH维持在特定的范围。在某些实施方式中，当所 用蛋白酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或地衣芽胞杆菌蛋白酶时，使缓冲液PH维持在约6. 5 至约7.5。在特定的实施方式中，将缓冲液pH维持在约7.0。在另一个实施方式中，当所用 蛋白酶为胃蛋白酶时，使缓冲液PH维持在约2. 0至约3. 0。对于所用缓冲液，可以通过选用适当的缓冲液浓度来维持酶解过程中的pH。适 当浓度例如是，对于1-5%的螺旋藻藻蓝蛋白磷酸盐缓冲液，所用磷酸盐缓冲液的浓度为 10mM。
优选地，螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的制备还包括，在向缓冲液加入蛋白酶前，将 已溶解螺旋藻藻蓝蛋白的缓冲液的PH调至待维持的pH范围内。在酶解前，可以使用如氢 氧化钠和/或氢氧化钾的苛性碱溶液和/或盐酸调节缓冲液PH。在一些实施方式中，对于酶解过程，可以将缓冲液的温度维持在特定的范围。在某 些实施方式中，缓冲液的温度维持在约35-45°C，特别地约37°C。温度可以借助如水浴锅和 恒温箱的装置来维持。在一些实施方式中，酶解进行0-36小时，特别地1-24小时，更特别地1、2、4、6、10、 12、16、20 或 24 小时。在一些实施方式中，所用蛋白酶的量为螺旋藻藻蓝蛋白干重的约0.3-1.6%，特别 地约 0. 4-1. 0%。在一些实施方式中，酶解是部分水解。在本文中，术语“部分水解”意指，对于反应 底物中的蛋白酶作用位点，其中的一些位点被蛋白酶水解，而另一些却未被水解。在另一些实施方式中，酶解是完全水解。在本文中，术语“完全水解”意指，对于反 应底物中的蛋白酶作用位点，所有位点均被蛋白酶水解。控制酶解过程的缓冲液pH、温度、反应底物量与酶量之比等，尤其是控制酶解进行 的时间，可以使酶解为部分水解。可以采用美国药典(USP)甲醛滴定法，通过氢氧化钠滴定 评估酶解过程中游离氨基的增加量，从而监控水解程度。为了确保蛋白酶酶解产物的恒定，优选使酶解产物接受酶灭活，以终止酶解过程。 酶灭活步骤可以是，在高于约80°C、优选约90-100°C下，处理酶解产物多于约10分钟、优选 约15分钟，其中，所述温度例如通过水浴提供。在一些实施方式中，可以将酶解产物以液体状态存储于室温、优选低于4°C、更优 选低于-20°C的温度。在另一些实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的制备还包括，将酶解产物浓 缩干燥的步骤。在一个实施方式中，通过喷雾干燥液体酶解产物产生粉末形式的酶解产物。 在另一个实施方式中，浓缩干燥是冷冻干燥。任选地，在浓缩干燥前，包括分离酶解产物的 步骤，其中，分离例如使用离心。可以借助质谱，鉴定螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。所述质谱例如是基质辅助激光 解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F/MS)和表面增强激光解吸电离蛋白芯片飞行时间质谱 (SELDI-T0F/MS)等。采用MALDI-T0F/MS或SELDI-T0F/MS获得肽质量指纹谱(PMF)。PMF是蛋白被识 别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列不 同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，因此其PMF也具有特征性。在一些实施方式中，根据获得的PMF，利用例如MASCOT、ProFound、Aldente和 MS-Fit等软件对例如SWIS S-PR0T、NCBI和UniProt的数据库进行搜索，从而鉴定蛋白。在一个实施方式中，螺旋藻藻蓝蛋白的胰蛋白酶酶解产物具有如表1所示的肽片 段。在优选的实施方式中，所述螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物具有高于螺旋藻藻蓝蛋白 的抗氧化性。在更优选的实施方式中，相对于完全酶解，部分酶解的螺旋藻藻蓝蛋白的酶 解产物具有更高的抗氧化性。抗氧化性的确定例如可以使用ABTS自由基清除活性测定法
6(Chen andffong, J Agric Food Chem，2008，56，4352-4358)。在特定实施方式中，在使用 ABTS 自由基清除活性测定法确定酶解产物抗氧化性时，使用例如10mM的磷酸盐缓冲液，将螺旋 藻藻蓝蛋白的酶解产物稀释至浓度小于5mg/ml，特别地至3mg/ml，从而获得待测样品。在某些实施方式中，酶解1-24小时的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物相对于螺旋藻 藻蓝蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定实施方式中，胰蛋白酶酶解16小时的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物相对于 螺旋藻藻蓝蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定实施方式中，地衣芽胞杆菌蛋白酶酶解10小时的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解 产物相对于螺旋藻藻蓝蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定实施方式中，胰凝乳蛋白酶酶解10小时的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物相 对于螺旋藻藻蓝蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定实施方式中，胃蛋白酶酶解16小时的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物相对于 螺旋藻藻蓝蛋白，具有更高的抗氧化性。第二方面提供功能食品，其包括第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。在本文中，术语“功能食品”意指具有特定功能的食品。功能食品具有一般食品的 共性，并且能调节个体生理机能。在一些实施方式中，所述特定功能是增强个体抗氧化能力 或自由基清除能力。在本文中，术语“个体”涉及任意哺乳动物，优选人。在一些实施方式中，所述功能食品包括，lwt % -lOOwt %的、特别地 10wt% -lOOwt %的、更为特别地30wt% -lOOwt %的所述螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。在某 些实施方式中，所述功能食品还包括作为余量的其它任何食品。在本文中，术语“wt% ”意 指重量百分比，所述重量百分比以功能食品的重量为基准。在所述功能食品还包括其它任何食品时，通过例如将第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白 的酶解产物与所述的其它任何食品混合，获得所述功能食品。在一些实施方式中，所述功能食品具有第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的 形态，例如是溶液或干粉。在另一些实施方式中，所述功能食品具有所述的其它任何食品的 形态。在又一些实施方式中，所述功能食品为片剂、丸剂或胶囊。制剂的方法为本领域技术 人员所熟知。所述功能食品可以用于生理机能正常的个体，也可以用于生理机能异常、例如抗 氧化能力降低或自由基清除能力降低的个体。对于个体而言，在包括但不限于下列的情况 下，尤其需要增强抗氧化体系移植手术、心脏手术、选择性血管成形术、冠状动脉搭桥术、 脑手术、止血器械的应用；使用产生自由基的化疗药物进行抗肿瘤或驱虫治疗；暴露于电 离辐射；以及暴露于属于或能产生自由基的外源性化学物质等。第三方面提供药物组合物，包括第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物和药学上 可接受的载体。在本文中，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，例如在Merck & Co.的Merck索引中列出的载体等。所述载体通常含有赋形剂，如淀粉、奶、糖、明胶、滑石、 植物脂或植物油、树胶或其它已知的赋形剂。所述载体还可以包括香料和颜色添加剂，或其 它组分。所述组合物可以通过常规方法、例如Remington ‘ s
7PharmaceuticalSciences (Remington 药剂学)，Mack Pub. Co. 17 版(1985)中记载的方法 制成制剂。根据给药途径和使用目的的不同，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型， 如粉末、颗粒、晶体、溶液、悬液、脂质体、糊剂、乳膏、软膏等。活细胞在行使正常生理功能时，持续产生自由基。自由基是高化学反应性的原子、 分子或分子片段，其具有游离的或未成对的电子。自由基能够与许多生物分子不可逆地反 应，引起生物系统的逐渐衰退。许多自由基反应会对细胞组分造成严重损伤，例如可以造成蛋白交联、DNA突变 和脂质过氧化等。自由基可以和生物分子相互作用而引发链式反应，还可以和核酸分子的 嘌呤和嘧啶碱基反应。由自由基造成的损伤可以引发例如辐射诱导的肿瘤形成(Breimer， L. H. (1988) Brit. J. Cancer 57 6)。自由基通常为体内生成的抗氧化酶(antioxidant enzymes)和从营养物中吸收的 抗氧化剂所中和。在本文中，术语“抗氧化剂”意指，具有抗氧化性的物质，例如是自由基抑 制剂、清除剂或催化剂。抗氧化剂的实例包括但不限于，第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解 产物、谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素E、泛醌和类胡萝卜素等。抗氧化剂如类胡萝卜素与诸如 冠心病、白内障和肿瘤的慢性疾病之间的关系记载在例如，Canfield, et al. (1992)，Proc. Soc. Exp. Biol. Med.，200 :260 中。抗氧化状态是促氧化剂(pro-oxidant)和抗氧化体系之间的平衡。有利于氧化的 不平衡为氧化应激(oxidative stress)。氧化应激可由自由基的过量产生引起。氧化应激 也可由抗氧化体系的削弱引起，而抗氧化体系的削弱由抗氧化剂摄入降低、抗氧化剂的内 源性生成降低和/或抗氧化剂的利用增加导致。氧化应激可导致细胞损伤，引发自由基相 关疾病。在本文中，术语“自由基相关疾病”意指，自由基造成的损伤促成了该疾病的发生 和/或进展，或者当给予抗氧化剂时可以减轻该疾病的临床症状、提高存活率和/或提供有 助于治疗和/或预防疾病的其它临床效果。自由基相关疾病的实例包括但不限于，缺血性 再灌注损伤、炎症性疾病、系统性红斑狼疮、心肌梗死、中风、创伤性出血、脑及脊索创伤、自 身免疫病(例如类风湿关节炎、糖尿病)、白内障、肺气肿、溃疡、氧毒性、肿瘤、非正常细胞 调亡、放射病、毒血症、急性肺损伤和神经变性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发 性硬化症、帕金森氏病、阿尔茨海默病)等。另外，对于个体而言，在包括但不限于下列的情况下，尤其需要增强抗氧化体系 移植手术、心脏手术、选择性血管成形术、冠状动脉搭桥术、脑手术、止血器械的应用；使用 产生自由基的化疗药物进行抗肿瘤或驱虫治疗；暴露于电离辐射；以及暴露于属于或能产 生自由基的外源性化学物质等。基于螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的抗氧化活性、例如自由基清除能力，本方面的 药物组合物可以降低个体体内的自由基水平，或增强个体的抗氧化体系，和/或预防和/或 治疗自由基相关疾病。根据目的的不同，药物组合物可以经例如肠胃外、吸入、局部或全身性给药，并且 以治疗有效量给药。肠胃外给药例如静脉、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。吸入给药例如鼻内或 口腔吸入给药。局部给药例如向表皮外部、口腔给药，以及向耳、眼和鼻中以及不显著进入血流的部位滴注给药。全身性给药例如口服、静脉、腹膜内或肌内给药。在本文中，术语“治疗有效量”意指，足以预防和/或治愈或至少部分缓解疾病的 剂量。治疗有效量根据疾病的严重程度、患者的一般状况及给药途径不同而异，通常使用一 次剂量含有约0. Img-IOg的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物，更常用地使用10mg-2000mg。在另一实施方案中，所述药物组合物被制备成含有所述有效剂量至1/20所述有 效剂量、例如含有1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/8或1/10所述有效剂量的适合所述给药途径的 剂型。因此，再一方面涉及第一方面的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物在制备药物组合物中 的用途，所述药物组合物可以用于降低个体体内自由基水平或增强个体的抗氧化体系，和/ 或预防和/或治疗本文所述的自由基相关疾病。以下实施例意在阐述本发明的实施方式，而不应被理解为对发明范围的限定。实施例实施例1制备螺旋藻藻蓝蛋白的胰蛋白酶酶解产物在40_60°C下，用IOmM的磷酸盐缓冲液溶解分离自钝顶节旋藻(取自广州暨南大 学水生生物研究所)的螺旋藻藻蓝蛋白干粉，将其配制成浓度为(10mg/ml)的反应底物 缓冲液。添加胰蛋白酶(购自Sigma-Aldrich公司)干粉，加酶量为藻蓝蛋白干粉重量的 0. 4-1. 0%，搅拌溶解，调节pH值至6. 5-7. 5。于35-45°C进行恒温酶解，酶解时间为1-24 小时。酶解完成后，将反应溶液在90-10(TC水浴中放置15分钟，随后冷却至室温。离心分 离酶解产物，浓缩冻干，收集酶解产物。实施例2制备螺旋藻藻蓝蛋白的地衣芽胞杆菌蛋白 酶酶解产物在40_60°C下，用IOmM的磷酸盐缓冲溶液溶解分离自钝顶节旋藻(取自广州暨南 大学水生生物研究所)的螺旋藻藻蓝蛋白干粉，将其配制成浓度为(10mg/ml)的反应底 物缓冲液。添加地衣芽胞杆菌蛋白酶(丙二醇水性溶液，购自Sigma-Aldrich公司)，加酶 量为藻蓝蛋白干粉重量的0. 4-1. 0%，搅拌溶解，调节pH值至6. 5-7. 5。于35_45°C进行恒 温酶解，酶解时间为1-24小时。酶解完成后，将反应溶液在90-100°C水浴中放置15分钟， 随后冷却至室温。离心分离酶解产物，浓缩冻干，收集酶解产物。实施例3制备螺旋藻藻蓝蛋白的胰凝乳蛋白酶酶解产物在40_60°C下，用IOmM的磷酸盐缓冲溶液溶解分离自钝顶节旋藻(取自广州暨南 大学水生生物研究所)的螺旋藻藻蓝蛋白干粉，将其配制成浓度为(10mg/ml)的反应底 物缓冲液。添加胰凝乳蛋白酶(购自Sigma-Aldrich公司)干粉，加酶量为藻蓝蛋白干粉 重量的0. 4-1. 0%，搅拌溶解，调节pH值至6. 5-7. 5。于35_45°C进行恒温酶解，酶解时间为 1-24小时。酶解完成后，将反应溶液在90-100°C水浴中放置15分钟，随后冷却至室温。离 心分离酶解产物，浓缩冻干，收集酶解产物。实施例4制备螺旋藻藻蓝蛋白的胃蛋白酶酶解产物在40_60°C下，用IOmM的磷酸盐缓冲溶液溶解分离自钝顶节旋藻(取自广州暨南 大学水生生物研究所)的螺旋藻藻蓝蛋白干粉，将其配制成浓度为(10mg/ml)的反应 底物缓冲液。添加胃蛋白酶(购自Sigma-Aldrich公司)干粉，加酶量为藻蓝蛋白干粉重 量的0. 4-1.0%,搅拌溶解，调节pH值至2. 0-3. O。于35-45°C进行恒温酶解，酶解时间为 1-24小时。酶解完成后，将反应溶液在90-100°C水浴中放置15分钟，随后冷却至室温。离
9心分离酶解产物，浓缩冻干，收集酶解产物。实施例5ABTS自由基清除法检测螺旋藻藻蓝蛋 白及其酶解产物的抗氧化活性ABTS 自由基清除活性的测定如 Chen and Wong，J Agric FoodChem，2008，56， 4352-4358 所述。ABTS试剂的制备如下。将ABTS储液(5mM)通过二氧化锰产生自由基，再通 过0.2μΜ PVDF注射过滤器。滤出液用5mM PBS缓冲液(pH = 7. 4)稀释至吸光度 0. 70士0. 05 (A734nm)。测定时，将3. Oml ABTS试剂与50 μ L待测样品混和。6分钟后，测定 734nm处吸光度。根据吸光度的变化计算抑制百分比。其中，A734nm越小，则ABTS+自由基的 量越少，说明所测试物质的抗氧化活性越强。检测实施例1-4中的螺旋藻藻蓝蛋白及其酶解产物的抗氧化活性，其中，使用磷 酸盐缓冲液将所述藻蓝蛋白和酶解产物的浓度调节为3mg/ml，从而获得待测样品。结果如 图1至图4所示。酶解1-24小时所得酶解产物均具有较高的抗氧化活性，且显著高于藻蓝 蛋白。实施例6MALDI-T0F/MS鉴定螺旋藻藻蓝蛋白的胰蛋白酶酶解产物将实施例1所得24小时酶解产物溶解于0. 1 %的三氟醋酸(TFA)水溶液中，过Zip Tip U-C18柱(Milipore)，以除去盐和其它杂质。将除盐多肽重新溶解于含0. 的TFA的 50%乙腈(ACN)溶液中，加到MALDI192孔板上，风干后上样，利用ABI 4700蛋白组系统进 行MALDI-T0F/MS分析，其中解析离子源为337nm、200Hz激光。根据各肽段的m/z数据，用 Mascot软件，设置适当的搜索参数，在NCBI等蛋白数据库中搜索匹配到图5所列肽段。由 此结果可以看出螺旋藻藻蓝蛋白基本完全水解。对于本文中引用的参考文献，在此将其全部内容并入本文以成为本说明书的一部 分。上述对本发明的一般性描述和对具体实施方式
的描述不应理解为是对本发明技 术特征构成的限制。本领域所属技术人员根据本申请的公开，可以在不违背本发明构成要 素的前提下，对上述一般性描述和/或具体实施方式
(包括实施例)中的技术特征进行增 加、减少或任意组合，形成属于本发明的其它的技术方案。序列表
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1 5
<210>2
<211>13<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>2Phe Leu Ser Ser Thr Glu lie Gln Val Ala Phe Gly Arg1510<210>3<211>15<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>3Ala Asp Ser Leu lie Ser Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr Asn Lys151015<210>4<211>15<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>4Thr Pro Leu Thr Glu Ala Val Ser lie Ala Asp Ser Gln Gly Arg151015<210>5<211>14<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>5Thr Phe Glu Leu Ser Pro Ser Trp Tyr lie Glu Ala Leu Lys1510<210>6<211>17<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>6Met Lys Thr Pro Leu Thr Glu Ala Val Ser lie Ala Asp Ser Gln Gly151015Arg<210>7<211>17<212>PRT<213>钝顶节旋藻
<400>7Phe Pro Tyr Thr Thr Gln Met Gln Gly Pro Asn Tyr Ala Ala Asp Gln151015Arg<210>8<211>25<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>8Ala Asn His Gly Leu Ser Gly Asp Ala Ala Val Glu Ala Asn Ser Tyr151015Leu Asp Tyr Ala lie Asn Ala Leu Ser2025<210>9<211>6<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>9Met Ala Ala Cys Leu Arg15<210>10<211>6<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>10Cys Leu Asn Gly Leu Arg15<210>11<211>7<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>11Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg15<210>12<211>7<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>12
12Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys 15
<210>13 <211>7 <212>PRT <213>钝顶节旋藻 <400>13
Asp Met Glu lie lie Leu Arg 15
<210>14 <211>14 <212>PRT <213>钝顶节旋藻 <400>14
lie Thr Ser Asn Ala Ser Thr lie Val Ser Asn Ala Ala Arg 1510
<210>15 <211>19 <212>PRT <213>钝顶节旋藻 <400>15
Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala Val Gly 151015
Val Gly Lys <210>16 <211>17 <212>PRT <213>钝顶节旋藻 <400>16
Tyr Val Thr Tyr Ala Val Phe Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp 151015
Arg
<210>17 <211>20 <212>PRT <213>钝顶节旋藻 <400>17
Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro Gln Leu lie Ala Pro Gly Gly Asn Ala 151015
Tyr Thr Ser Arg20
<210>18<211>22<212>PRT<213>钝顶节旋藻<400>18Gly Glu Met Leu Ser Thr Ala Gln lie Asp Ala Leu Ser Gln Met Val151015Ala Glu Ser Asn Lys Arg20
权利要求
螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。
2.如权利要求1所述的酶解产物，其中所述酶选自胰蛋白酶、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或其组合。
3.如权利要求1或2所述的酶解产物，其中所述酶选自胰蛋白酶、地衣芽胞杆菌蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶或其组合，并且所述酶解在PH6. 5-7. 5下进行。
4.如权利要求1或2所述的酶解产物，其中所述酶是胃蛋白酶，并且所述酶解在pH 2. 0-3. 0下进行。
5.如权利要求1-4中任一项所述的酶解产物，其中所述酶解在缓冲液、优选磷酸盐缓 冲液中进行。
6.如权利要求1-5中任一项所述的酶解产物，其中所述酶解在35-45°C下进行。
7.如权利要求1-6中任一项所述的酶解产物，其中以重量计，所述酶是所述藻蓝蛋白 的 0. 4% -1. 0%。
8.如权利要求1-7中任一项所述的酶解产物，其中所述酶解进行1-24小时。
9.如权利要求1、3和5-8中任一项所述的酶解产物，其中所述酶解产物具有如图5所 示的肽片段。
10.功能食品，包含如权利要求1-9中任一项所述的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物。
11.药物组合物，包含如权利要求1-9中任一项所述的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物和 药学上可接受的载体。
12.如权利要求1-9中任一项所述的螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物在制备药物组合物中 的用途，所述药物组合物用于降低个体体内的自由基水平，或增强个体的抗氧化体系，和/ 或预防和/或治疗自由基相关疾病。
全文摘要
本申请提供螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物、包含螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物的功能食品、以及包含螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物和药学上可接受的载体的药物组合物。本申请还涉及螺旋藻藻蓝蛋白的酶解产物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于降低个体体内的自由基水平，或增强个体的抗氧化体系，和/或预防和/或治疗自由基相关疾病。
文档编号A61K38/01GK101928743SQ20091017886
公开日2010年12月29日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者陈填烽, 黄荫成 申请人:香港中文大学