专利名称：生物复合材料及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物复合材料，更具体地，涉及一种结合有生物活性分子的高分子聚
合物复合材料。本发明还涉及生物复合材料的制备方法以及其用途。
背景技术：
骨缺损是骨外科治疗中的难点。导致骨缺损的因素包括创伤、疏松性骨性骨折、肿 瘤以及骨坏死等。特别是骨坏死导致的骨缺损发病率较高，对人类的健康和生活质量构成 很大的威胁。 骨坏死在早期出现不完全性修复，引起不完全性修复的原因包括骨髓干细胞池的 活性下降，骨细胞凋亡以及松质骨基质的降解。因此应该提供充足的成骨前体细胞和/或 提高坏死区域细胞的成骨能力来防止这种不完全性修复。在骨坏死早期的治疗中，最常用 的方法是髓腔减压，减压后会在坏死局部形成骨缺损，为了加强手术的治疗效果，往往还伴 有其它治疗方法，包括骨植入治疗、生长分化因子治疗和基因治疗。 单纯的髓腔减压能够有利于骨坏死的治疗，但是如果减压过程中去除过多的死 骨，就会导致坏死区域相对大的骨缺损，往往会加速关节塌陷。自体骨移植增加了患者的额 外创伤机会，且来源有限。异体骨移植避免了自体骨的缺点，但是存在潜在的感染机会和排 异反应。骨形态发生蛋白(BMP)是一种生长分化因子，可以用来促进局部骨生长，但是这种 蛋白降解很快，需要大剂量才能保持其效果，导致费用昂贵；理化性质不稳定，与其它的载 体混合时难以保持其活性；在坏死区域停留时间短暂。基因治疗因其安全性问题只是处于 动物实验阶段，目前还无法应用于临床。
发明内容
第一方面，提供了一种生物复合材料，其包含生物可降解的聚乳酸/乙醇酸共聚 物(poly lactic-co-glycolic acid， PLGA)禾口磷酸三牵丐(tricalcium phosphate, TCP)以 及有效量的淫羊藿素(icaritin)。 优选地，所述生物复合材料由生物可降解的聚乳酸/乙醇酸共聚物、磷酸三钙和 有效量的淫羊藿素组成(PLGA/TCP/淫羊藿素)，其中所述淫羊藿素结合在聚乳酸/乙醇酸 共聚物和磷酸三钙形成的多孔支架材料中。 在一些实施方案中，所述淫羊藿素能够从支架材料中缓慢释放，作用于靶部位发 挥作用。 第二方面，提供了人工骨支架，其由本发明所述的生物复合材料制备，具有三维多 孔结构，其中孔径为约250-450 iim，孔隙率为60% -80%。 第三方面，提供了制备本发明所述的生物复合材料的方法，其包括如下步骤 (1)将聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙溶于第一有机溶剂中； (2)将淫羊藿素溶于与所述第一有机溶剂相同或不同的第二有机溶剂中； (3)将步骤(2)得到的溶液加入步骤(1)得到的溶液中，混匀，制得包含聚乳酸/
3乙醇酸共聚物、磷酸三钙和淫羊藿素的浆料；以及 (4)利用快速成型技术使步骤(3)得到的浆料成型，得到所述的生物复合材料。
第四方面，提供了本发明所述的生物复合材料在制备治疗骨缺损的人工骨支架中 的用途。 本发明所述的生物复合材料可以用于治疗局部组织缺损，特别是治疗骨缺损。其 中，生物复合材料中的聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙为骨长入提供支架平台，而中药 活性分子淫羊藿素从支架中持续释放，长期在骨缺损局部保持疗效，促进骨的生长。
图1显示了淫羊藿素的结构。A图是淫羊藿素的二维结构；B图是淫羊藿素的三维 结构。 图2显示了利用快速成型法制备本发明的生物复合材料的技术路线图。
图3显示了淫羊藿素从生物复合材料中累积释放的曲线。 图4显示了骨髓间充质干细胞在本发明所述的生物复合材料表面的生长，其中骨 髓间充质干细胞染成绿色。 图5是生物复合材料植入兔肌肉6周后的显微CT(MicroCT) 二维图像。A图是 由PLGA和TCP组成的复合材料(PLGA/TCP)的图像，显示了复合材料的均质背景；B图是由 PLGA、 TCP和淫羊藿素组成的复合材料(PLGA/TCP/淫羊藿素)的图像，在孔腔周围显示了 较高的密度。 图6显示了生物复合材料植入兔股骨髁12周后，骨隧道内新骨生成的MicroCT三 维图像。A图，植入由PLGA和TCP组成的复合材料(PLGA/TCP)的骨隧道成骨图像；B图，植 入由PLGA、 TCP和淫羊藿素组成的复合材料(PLGA/TCP/淫羊藿素)的骨隧道成骨图像。
具体实施例方式
第一方面，提供了一种生物复合材料，其包含生物可降解的聚乳酸/乙醇酸共聚 物(PLGA)、磷酸三钙(TCP)和淫羊藿素。 淫羊藿素是从中药材淫羊藿(Herba Epimedii)中提取的一种活性成分，属黄酮醇 类化合物，具有植物雌激素样作用。在本发明中使用的淫羊藿素可以是从中药饮片中提取 的天然淫羊藿素，也可以是其它来源的淫羊藿素，例如合成的淫羊藿素或具有其活性的衍 生物。图1A示例性显示了淫羊藿素的二维化学结构，图1B示例性显示了淫羊藿素的三维结构。 聚乳酸/乙醇酸共聚物与磷酸三钙都是具有良好生物相容性的可生物降解材料， 适于人或动物体内的应用。因此，本发明提供了一种可植入的生物复合材料，例如可直接植 入到组织缺损部位，诸如骨缺损和周围神经缺损部位，且该复合材料携带的中药活性分子 淫羊藿素能够直接作用于缺损部位发挥作用。 在优选的实施方案中，本发明的生物复合材料由PLGA、 TCP和有效量的淫羊藿素 组成。理想地，本发明所述的生物复合材料为多孔的三维支架材料，其中所述淫羊藿素结合 在PLGA和TCP形成的多孔支架中。 在一实施方案中，本发明所述的生物复合材料具有直径约250-450 ii m的相互连通的孔，所述相互连通的孔径优选为250-350 ii m，更优选为约300 y m。 在本发明的实施方案中，生物复合材料中的聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙的
重量配比范围为i : 1-4 : 1，优选为4 : i。 在一实施方案中，本发明所述的生物复合材料包含的高分子聚合物聚乳酸/乙醇 酸共聚物的分子量范围为3万-10万，优选为6万-10万，更优选为10万。乳酸与乙醇酸 的摩尔比是70 : 30。 本发明所述的"有效量"指能够实现特定生物学效应的量，例如，能够促进骨生长 的量，或有效治疗骨缺损的量。在本发明的一实施方案中，以重量比计，生物复合材料中的 淫羊藿素的含量为lmg-10g/100g生物复合材料。 本发明所述的中药活性分子淫羊藿素是从生物复合材料中缓慢释放的，这有利于 淫羊藿素在靶部位持续发挥作用，例如，在较长时间内促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞 的分化和/或促进骨的形成等。淫羊藿素第1天从所述生物复合材料中释放的累积量占 其总量的0% _15%，优选约5%到15%之间，一般不超过15% ;第14天时释放的累积量为 25 % -55 % ，优选为25 % -50 % ，更优选在35 % -45 %之间，最优选为约40 %左右。
此外，淫羊藿素从本发明所述的生物复合材料中释放的百分累积量在第2天为 0% -约25%，优选约5%到约22%。淫羊藿素第7天的百分累积释放量为约10%到约 40%，优选约15%到约32%。 另外，本发明所述的生物复合材料还可包含有效量的下述细胞生长因子的一种或 多种bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、PDGF(血小板衍化生 长因子)、IGF (胰岛素样生长因子)、TGF-13 (转化生长因子)、BMP (骨形态形成/发生蛋 白)、ANG(血管生长素)等。此外，所述的生物复合材料还可包含具有活性的细胞，包括，但 不限于，骨髓间充质干细胞等。这些细胞因子和/或细胞与本发明所述的中药活性小分子 淫羊藿素共同作用，促进组织缺损的修复，如骨缺损的修复。 第二方面，提供了人工骨支架，其由本发明的生物复合材料制备。本发明所述的 "人工骨支架"是指是用于骨修复的人工合成材料，其构成具有相互连通的孔的三维网格结 构，具有生物相容性和骨传导性，对新骨的生成起到引导作用。在本发明的实施方案中，所 述人工骨支架的孔径为约250-450 ii m，优选为250-350 y m，更优选为约300 y m。孔隙率为 60-80%。 在本发明的实施方案中，人工骨支架中的聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙的重
量配比为i : l-4 : i，优选为i : 4，两者形成人工骨支架的多孔结构，这种多孔结构利于
毛细血管和骨组织的长入，为骨长入提供支架平台；同时携带的中药活性分子淫羊藿素从
人工骨支架中缓慢释放，持续作用于骨缺损部位，促进新骨的生成。因此，由本发明的生物 复合材料制备的这种人工骨支架是具有骨引导和促进骨生长作用的理想支架。 第三方面，提供了本发明所述的生物复合材料的制备方法，该方法包括如下步 骤 (1)将聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙溶于第一有机溶剂中； (2)将淫羊藿素溶于与步骤(1)相同或不同的第二有机溶剂中； (3)将步骤(2)得到的溶液加入步骤(1)得到的溶液中，混匀，得到含PLGA、TCP和
淫羊藿素的浆料；以及
(4)利用快速成型技术使上述浆料成型，得到所述的生物复合材料。 在本发明的实施方案中，所述第一有机溶剂可以是二氧六环、二氯甲烷、氯仿、二
甲基亚砜等。在优选的实施方案中，所述第一有机溶剂是二氧六环。 在本发明的实施方案中，所述第二有机溶剂可以是二氧六环、二氯甲烷、氯仿、二 甲基亚砜等。在优选的实施方案中，所述第二有机溶剂是二氧六环。 在制备本发明的生物复合材料的过程中，所述聚乳酸/乙醇酸共聚物的成浆浓度 为10% _30%，优选为10% _20%，更优选为12% -15%。 在制备本发明的生物复合材料的过程中，聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙的重
量之比为l:i-4: i，优选为4 : i。 在根据本发明所述的制备生物复合材料的方法得到的浆料中，淫羊藿素的浓度范 围为10—1QM-10—2M，优选为10—6M-10—2M。更优选地，所述淫羊藿素的浓度为10—4-10—2M。
在本发明的实施方案中，以重量计，淫羊藿素在成型后的生物复合材料中的含量 为lmg-10g/100g生物复合材料。本发明所述的淫羊藿素是一种黄醇酮化合物，在制备过程 中受温度等条件影响较小，与蛋白质成分相比，不易降解，稳定性好。 本发明所述的"快速成型(Rapid Prototyping,RP)技术"是指在计算机管理与控 制下，根据计算机辅助设计(CAD)模型，采用材料精确堆积(由点堆积成面，由面堆积成三 维实体)的方法制造立体材料的技术，是一种基于离散/堆积成型原理的新型制造方法。本 发明可用的快速成型系统包括熔融沉积制造成型、三维印刷成型、多相喷射沉积成型、分层 实体制造成型系统等。在本发明优选的实施方案中，使用的快速成型系统为熔融沉积制造 成型系统或三维印刷成型系统，所述成型系统系统可以分别从例如Stratasys(美国)和Z Corporation (美国)的公司商购。在本发明更优选的实施方案中，使用的快速成型系统为 低温熔融沉积制造成型系统。 第四方面，提供了生物复合材料在制备用于治疗组织缺损的组织工程支架中的用
途。优选地，提供了生物复合材料在制备用于治疗骨缺损的人工骨支架中的用途。 本发明所述的生物复合材料或人工骨支架可以用于修复由各种原因导致的骨缺
损，特别是用于修复骨坏死导致的骨缺损。在本发明的实施方案中，由PLGA、 TCP和淫羊藿
素制成的多孔生物复合支架材料可以用于骨缺损的治疗，可以提高骨坏死早期髓腔减压的
手术效果，避免患者的关节塌陷和全关节置换。 应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或
步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。 上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述
这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和
值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。
实施例 实施例1 由PLGA、 TCP和淫羊藿素组成的生物复合材料的制备 1.材料和设备 PLGA购自山东省医疗器械研究所，PLGA分子量为10万，其中乳酸与乙醇酸的摩尔比为70 : 30 ; TCP购自北京现代东方精细化工用品有限公司；
淫羊藿素由深圳中药及天然药物中心提供；以及 生物材料快速成型机由清华大学机械工程系研制，型号为CLRF-2000-II。
2.生物复合材料的制备过程(参照图2的制备路线图)
(1)将5. 2g PLGA和1. 3g TCP加入40ml 二氧六环中，溶解搅拌24小时;
(2)将1. 6mg淫羊藿素加入到10ml 二氧六环中溶解； (3)取步骤(2)中1ml溶解于二氧六环的淫羊藿素加入步骤(1)得到的溶液中，搅 拌混匀1小时，得到含PLGA、TCP和淫羊藿素的浆料，其中PLGA的成浆浓度为13%，淫羊藿 素的浓度为4ii g/ml ; (4)按照生产厂商的说明，利用快速成型机进行成型，具体操作如下 上样将步骤(3)得到的浆液15ml加入到20ml注射器中，安装到机器，固定，调节
成型材料温度，成型室温度为-25t:; 电脑控制及成型打开软件po卯y， po卯y. exe，调入方法，设置喷头参数，喷头1
和2，网格6，后改为9，反转3X0. lmm，正转3X0. lmm，延迟0，其他不变，开始造型，制成
1 X 1 X lcm的立方体，而后将成型块直接冷冻干燥12小时。 测得生物复合材料的孔隙率为80%，孔隙平均直径约为300 ym。 实施例2 淫羊藿素从生物复合材料中缓慢释放 取150mg由实施例1制备的生物复合材料加入到50ml磷酸盐缓冲液(PBS， M 7.4)中。将上述混合物在37。C下以120rpm振荡水浴。第1， 2， 7， 14天时从中取出5ml液 体，并用等体积的新鲜PBS补足。取出的液体用等体积的乙酸乙酯萃取三次，而后用氮气干 燥。得到的干燥物用100 iU甲醇溶解，振荡下使其充分溶解。在270nm检测波长下用高效 液相(HPLC)法测定淫羊藿素的浓度。 如图3所示，淫羊藿素第1天的释放累积量为13. 5 %，第2天的释放累积量 为20.5%，第7天的百分累积释放量为30.0% ;到第14天时，淫羊藿素的累积释放量为 39. 5%。这些结果表明，淫羊藿素能够从生物复合材料中缓慢稳定地释放，这有利于淫羊藿 素在植入部位长期保持生物学活性，持续作用于组织缺损部位。
实施例3 由PLGA、 TCP和淫羊藿素组成的生物复合材料利于骨髓间充质干细胞的粘附和生 长 提取分离28周新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞，取第四代细胞，经消化后离
心，转染绿色荧光蛋白后接种至实施例1制备的生物复合材料支架上。24小时后，在荧光镜
下观察细胞在支架材料的粘附情况。绿色荧光用来显示骨髓间充质干细胞。 如图4所示，骨髓间充质干细胞在生物复合材料支架上生长良好，这表明本发明
的生物复合材料具有优良的生物相容性，能够促进骨髓间充质干细胞的粘附和生长，提示
对新骨的生成具有促进作用。 实施例4 由PLGA、 TCP和淫羊藿素组成的生物复合材料在体内促进骨的形成
1.实验一 28周龄新西兰大白兔在赛拉嗪(Xylazine，2mg/kg)和氯胺酮(Ketamine， 50mg/
kg)麻醉下，取仰卧位，下肢用2%碘伏消毒，在兔大腿内侧做纵向约3cm长切口 ，暴露大腿
肌肉，切开肌肉表面筋膜，锐性分离肌肉，将5X5X5mm3大小的PLGA/TCP/淫羊藿素支架材
料和PLGA/TCP支架材料分别植入左右两侧的大腿肌肉内，逐层缝合伤口 。手术后6周后取
出支架材料及周围部分肌肉组织，10 %的中性福尔马林固定，行microCT (vivaCT40， Scanco
Medical, Briittisellen， Switzerland)扫描，观察材料内新骨生成情况。 如图5所示，对照组(PLGA/TCP)的图像仅显示了复合多孔材料的均质背景(A
图)；而PLGA/TCP/淫羊藿素组在孔腔周围显示了较高的密度(B图)，提示新骨的形成。这
些结果表明本发明的生物复合材料具有良好的成骨诱导特性，同时也说明了淫羊藿素具有
显著的促进骨生长的作用。 2.实验二 在体重约3. 5kg的28周新西兰大白兔的左、右侧股骨髁分别植入直径为2mm的 PLG/TCP和PLGA/TCP/淫羊藿素生物材料。上述材料植入兔股骨髁12周后，通过MicroCT 观察骨隧道成骨图像。 如图6所示，对照组(PLGA/TCP)的图像显示仅有少量的新生骨(A图)；而PLGA/ TCP/淫羊藿素组出现了大量的新生骨，骨质比对照组致密得多(B图)。以上结果表明，本 发明的生物复合材料具有明显的促新骨形成作用，更说明了淫羊藿素在植入部位发挥了显 著的促进骨生长的作用。 综上所述，可以看出，本发明提供的具有促进成骨作用的生物复合材料是修复骨 缺损的优良材料，其中PLGA和TCP为骨长入提供支架平台，淫羊藿素则作为主要的生物活 性分子有效地促进新骨的形成。 可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显 示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还 可对实施方案中的技术特征、手段等做出各种变化和任意组合。这些变化都在本发明要求 保护的范围内。
权利要求
一种生物复合材料，其包含生物可降解的聚乳酸/乙醇酸共聚物、磷酸三钙和有效量的中药活性分子淫羊藿素。
2. 如权利要求l所述的生物复合材料，其中所述有效量的淫羊藿素的含量为 lmg-10g/100g所述生物复合材料。
3. 如权利要求1或2所述的生物复合材料，其中所述聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三 钙的重量配比范围为1:1-4: 1。
4. 如权利要求3所述的生物复合材料，其中所述聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙的重量配比是4 : i。
5. 如权利要求3所述的生物复合材料，其中所述聚乳酸/乙醇酸共聚物的分子量范围 为3万-10万，乳酸与乙醇酸的摩尔比是70 : 30。
6. 如权利要求1或5所述的生物复合材料，其具有直径约250-450 y m的相互连通的 孔，孔隙率为60% -80%。
7. 如权利要求6所述的生物复合材料，其中所述淫羊藿素从所述生物复合材料中缓慢 释放。
8. 如权利要求7所述的生物复合材料，其中所述淫羊藿素第1天从所述生物复合材料 中释放的累积量为5% -15%，第14天时释放的累积量为25% -50%。
9. 人工骨支架，其由权利要求1-8中任一项所述的生物复合材料制备，具有三维多孔 结构。
10. 制备如权利要求1-8中任一项所述的生物复合材料的方法，其包括如下步骤(1) 将聚乳酸/乙醇酸共聚物和磷酸三钙溶于第一有机溶剂中；(2) 将淫羊藿素溶于与所述第一有机溶剂相同或不同的第二有机溶剂中；(3) 将步骤(2)得到的溶液加入步骤(1)得到的溶液中，混匀，制得包含聚乳酸/乙醇 酸共聚物、磷酸三钙和淫羊藿素的浆料；以及(4) 利用快速成型技术使步骤(3)所述的浆料成型，得到所述的生物复合材料。
11. 如权利要求io所述的方法，其中所述第一有机溶剂是二氧六环。
12. 如权利要求10或11所述的方法，其中所述聚乳酸/乙醇酸共聚物的成浆浓度为 10% -30%。
13. 权利要求1-8中任一项所述的生物复合材料在制备用于治疗骨缺损的人工骨支架 中的用途。
全文摘要
本发明涉及生物复合材料，其包含生物可降解的聚乳酸/乙醇酸共聚物、磷酸三钙和有效量的淫羊藿素。本发明还涉及所述生物复合材料的制备方法以及由所述生物复合材料制备的人工骨支架。此外，还涉及所述生物复合材料在治疗组织缺损，特别是在治疗骨缺损中的用途。
文档编号A61L27/00GK101721747SQ200910178888
公开日2010年6月9日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年10月27日
发明者严永年, 冯国培, 姚新生, 张戈, 彭江, 梁国穗, 熊良俭, 王小红, 王新峦, 秦岭, 谢鑫荟, 郑振耀, 陈启明 申请人:香港中文大学