专利名称：麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物及其在制备抑制h460细胞增殖药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物及其应用，具体涉及麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物及其在制备抑制H460细胞增殖药物中的应用。
背景技术：
肺癌是世界各国常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中增长是最快的，是目前人类癌症死亡的主要原因，并被认为是当今世界对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤。全球大约每年新增300万病例，同时，每年有超过100万人死于肺癌。在我国，肺癌占恶性肿瘤发病、死亡的首位，年发病率为35例/10万人，患者5年生存率仅为10% ，国际抗癌联盟(UICC)公布到2005年全世界恶性肿瘤患者男性肺癌占第一位，而中国的肺癌及患病绝对人数均占全世界的第一位，有资料称"中国的肺癌将占全球的一半"，约130.8万人。90年代以来我国肺癌的流行病学特点是年轻肺癌病例增多，腺癌病例的发病率在女性继续增长，男性鳞癌病例减少。首发症状不明显，就诊病人多为中、晚期，已无手术机会。
基于近来对肺癌认识的不断加深，由WHO和国际肺癌研究协会联合组成的专门小组对1981年WHO制定的肺肿瘤分类进行了修改，于1999年正式公布于众。肺癌患者中80X是NSCLC (non-small cell lung carcinoma,非小细胞肺癌)，20X是SCLC (smallcell lung carcinoma,小细胞肺癌)，基于两者在光镜下诊断的差异，二者在临床治疗中的方式也是不同的。NSCLC和SCLC是肺上皮源性肿瘤中最常见的2种类型，而其它良性肿瘤，非上皮源性肿瘤等在肺肿瘤中是很少见的。NSCLC包括肺腺癌，肺鳞癌和低分化甚至是未分化大细胞癌，这三种类型的肿瘤同属于NSCLC。
H460细胞(Human large cell lung cancer cell line)是人巨细胞肺癌肿瘤细胞，组织分型属于巨细胞癌。是在1982年由A.F.Gazdar和他的同事从一个患有大细胞肺癌的患者的胸水里分离衍生出来的。该细胞与正常肺组织相比，更容易表达p53基因，并没有表现出严重的结构性的DNA异常。该细胞角蛋白染色和波形呈阳性，神经三重蛋白呈阴性。大细胞癌又称大细胞未分化癌，包括巨细胞癌和透明细胞癌。高度恶性的上皮肿瘤，多发生于周边肺实质。癌细胞大，分化差，形态多样，核大，核仁显著，胞浆丰富，有粘液形成。常见大片出血性坏死。大细胞癌较小细胞癌转移晚，手术切除机会较大。
肺癌西医治疗方法的进展肺癌中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%以上，在国际上均一致承认肺癌是一个高发癌，在很多国家及城市中为各种癌症之首，65%在发现时为III和IV期，往往无手术条件，放疗的效果也不尽人意，而药物治疗中化疗虽说是一种全身性治疗药物，在近10余年较前有了较大进步，大量有效的新化疗药物及减低毒性药物的出现在疗效、耐受性方面较前有了一定的提高，但NSCLC具有耐药性高、疗效差的特点，尤对有远道转移的IV期患者，化疗虽仍为主要治疗方法，对该用多少周期和时间以及给患者带来的不适和痛苦，二者之间是否"合适"，均为目前肿瘤医师、患者所顾虑的问题。寻找一个耐受性低、毒性少而同样有效或更有效的另一种药物成为人们密切关注的事件，生物靶点治疗的发展自然成为肺癌新治疗的重中之重。
肺癌中医治疗方法的进展肺癌属中医"息贲"、"肺积"等范畴。在中医学文献中类似肺癌证候有不少记载。如《素问'咳》"肺咳之状，咳而喘息有音，甚至唾血。"《素问-奇病》"病胁下满气上逆......病名息积，此不妨于食。"《难经'五十六难》称"肺
之积，名曰息贲，在右胁下，覆大如杯，久不已，令人洒淅寒热，喘咳，发肺壅。"明-张
景岳说"劳嗽，声哑，声不能出或喘息气促者，此肺脏败也，必死。"其发病原因，《诸病源候论》云"积聚者，有阴阳不和，腑脏虚弱。受于风邪，搏于腑藏之气所为也。"清-顾松园认为"烟为辛热之魁"，清，赵濂《医门补要》亦有论述"表邪遏伏于肺，失于宣散，并嗜烟酒，火毒上熏，久郁热炽，烁腐肺叶"；同时中医学强调"邪之所凑，其气必虚"，《灵枢，刺节真邪》"虚邪之入于身也深，寒与热相搏，久留而内著......邪气居
其间而不反，发为瘤。"《景岳全书》"凡脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病。"《活法机要》"壮人无积，虚人则有之。"《医宗必读'积聚》指出"积之成者，正气不足，而后邪气踞之"。病机如《杂病源流犀烛》中说:"邪积胸中，阻塞气道，气不得通，为痰、为食、为血，皆邪正相搏，邪积乃生，正不得制之，遂结成形而有块。"说明肺中积块的产生与正虚邪侵、气机不通、痰血搏结有关，对后世研究肺癌的发病和治疗具有重要启迪意义。许多学者对其病因病机有着不同的认识，但无外乎正气虚损和邪毒内积2个方面。病变部位在肺，与脾、肾有关，病理因素主要为气滞、痰浊、瘀血、热毒，病理性质为本虚标实，虚实错杂。刘嘉湘[1]认为脏腑阴阳失调，正气虚损是患病的主要内在原因，"正气不足，而后邪气踞之"，肺、脾、肾三脏气虚均可导致肺气不足，加之嗜烟日久，热灼津液，或房事不节，精血内耗，均可导致肺阴不足，阴虚内热或气阴两虚；外在邪毒得以趁虚而入，客邪留滞，气机不畅，血行瘀滞，津液不布，聚津为痰，痰瘀交阻，日久形成积块。因此，认为肺癌是全身性疾病的一个局部表现，是因虚而致病，因虚而致实，早期的虚多见肺脾气虚或气阴两虚，晚期多为阴虚内热或阴阳两虚，局部的实不外乎气滞、血瘀、痰凝、毒聚的病理变化。洪广祥[21认为血瘀为肺癌的基本病理改变，瘀血阻肺为其基本证型，肺脾气虚则是其病理基础。陈玉琨[3]则认为痰瘀既是邪毒侵肺，脏腑功能失调的病理产物，又是导致正气内虚，邪毒胶结成块的致病因素，因而痰瘀贯穿于肺癌的整个发病过程。
麦门冬汤源自张仲景《金匮要略'肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，其曰"火逆上气，咽喉不利，止逆下气者，麦门冬汤主之"[4]。 一般是治疗"虚热肺痿"的主方。后世对该方的主治范围有所扩大，用治肺阴不足及胃阴不足诸证。麦门冬汤由麦冬、半夏、人参、甘草、粳米、大枣等6味药组成，其主要有两大配伍特点 一是方中重用七升麦冬滋肺养胃，并清虚热，仅用一升半夏降逆下气，化其痰涎，半夏虽辛温，但与大量麦冬配伍则其燥被制，而麦冬得半夏则滋而不腻，两药配伍，相反相成。二是人参、甘草、粳米、大枣补脾益气，体现了虚则补母、培土以生金之法[5]。全方共奏养胃阴而润肺燥，下逆气而止浊唾之功。因其用药精当，主从有序，配伍严谨，疗效显著，故为后世医家所推崇，并加以推广运用。现代药理学研究表明，麦门冬汤具有呼吸道净化、改善呼吸道高敏性、缓解支气管收縮、调节肺表面活性物质分泌等类固醇样药理作用[6—9]，对咳嗽、呼吸道过敏、炎症等引起的呼吸道病变有重要的调节作用。
《千金》苇茎汤出自唐，孙思邈的《备急千金要方》巻十七肺脏方之肺痈第七，同时也见载于《金匮要略*肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，由薏苡仁、瓜瓣、桃仁、苇茎组成，具有清热化痰、逐瘀排脓之功，主治肺痈。其中苇茎清泄肺热；冬瓜仁、生薏仁清化热痰，利湿排脓；桃仁活血祛瘀以消热结。由于麦门冬汤主治"肺中气阴亏虚"、《千金》苇茎汤清肺化痰活血[1<)，与现代中医所认为之肺癌的病机"气阴两虚、热毒痰瘀互结"[11]基本相符。现代有人以其中一首方剂加味的方式应用于临床来治疗肺癌而取效者，如吴玉生氏[12]用加味苇茎汤加减内服治疗124例晚期非小细胞肺癌患者，李柳宁[13]等以千金苇茎汤加味应用在肺癌围放疗期的临床治疗等。参考文献刘嘉湘.肺癌的中医药治疗进展.中国肿瘤,2002，11(6):326[2]洪广祥.论中医药治疗肺癌.中医药通报，2007,6(2):5-8、15[3]陈玉現蒋梅.肺癌的中醫治療.新中医，1999，31(5):31-32[4]张仲景.金匮要略方论[M].北京:中国书店，1993，4.包素珍，陈明显.麦门冬汤治疗慢性肺系疾病的药理学研究述要[J].辽宁中医学院学报，2005，(2):168-169浜洋一郎.麦门冬汤对体外气管炎炎症模型分泌亢进的作用[J].和汉医药学志，1994,11(4):306-307. Aizawa H， Shigyo M， Nakano H， et al. Effect of the Chinese herbal medicine,Bakumondo-to， on airway hyperresponsivenes induced by ozone exposure inguinea-pigs [J].Respirology. 1999,4(4):349-54. Aizawa H, Yoshida M， Inoue H， et al. Traditional oriental herbal medicine, Bakumondo隱to, suppresses vagal neuro-effector transmission in guinea pig trachea [J]. J Asthma. 2003，40(5):497陽500. Isohama Y, Kai H， Miyata T. Bakumondo-to,a traditional herbal medicine,stimulates phosphatidylcholine secretion, through the synergistic cross-talk between different signal transduction systems in alveolar type II cells[J]. Nippon Yakurigaku Zasshi. 1997， 110 Suppl 1:120-125.范永升主编.新世纪全国高等中医药院校规划教材，金匮要略。中国中医药出版社 2003.P114、 118陈四清，周仲瑛.原发性支气管肺癌辨证分型探讨.新中医2002， 34 (11): 6-8 [12]吴玉生，吴凡.加味苇茎汤治疗晚期非小细胞肺癌124例疗效观察.新中医，2004， 36 (7): 13-14李柳宁,刘伟胜.千金苇茎汤加味在肺癌围放疗期的临床应用.辽宁中医杂志2006年 第33巻第12期1599
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，该提
取物对肺癌细胞H460有较好的抑制作用。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述提取物的制备方法。 本发明还要解决的一个技术问题是提供上述提取物在制备抑制H460细胞增殖药物
中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下 一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，它是由下列制备步骤制得
(1) 按重量份数取麦冬200-300份、法半夏100-150份、生晒参200-300份、甘 草80~120份、苹茎200~300份、薏该仁200~300份、冬瓜子200-300份、桃仁100-150 份，粉碎后，加入总药材重量8 12倍的水，浸泡20 60min;加热至沸腾，并保持沸腾 2~3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水， 同样方法再提取1 2次，合并提取液，减压浓縮，得到水提浓縮液；
(2) 将步骤(1)制得的水提浓縮液加90 95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)，静 置20 30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓縮至无醇味后，冷却至 室温，过滤得到醇沉上清浓缩液；(3) 将步骤(2)得到的醇沉上清浓縮液，加入1 2倍容量的环己垸，摇匀后静置， 待分层后分出上层环己垸溶液，下层水溶液再用环己烷用相同方法萃取1 2次后，合并 下层水溶液；
(4) 在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1 2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置， 待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1~2次后， 合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂乙酸乙酯后，得到稠膏。
步骤(1)中，加入水量为总药材重量的10倍。 步骤(1)中，浸泡时间为30min。
步骤(2)中，水提浓縮液加95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)。 上述麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物在制备抑制巨细胞肺癌H460增殖药物中 的应用。
本发明采用麦门冬汤与千金苇茎汤合方，但对其进行的改进，即于麦门冬汤方中删 去了组分粳米和大枣。这是因为粳米、大枣为食源性药物，对疾病治疗性功效较弱；本 研究用处方是两首经典方剂的合用之方，考虑到全方总药味数的问题，故于方中减去此 二物。
麦门冬汤和千金苇茎汤合用，具有清热养阴、润肺降气、祛瘀排脓之功，和现代中 医所认为之肺癌的病机"气阴两虚、热毒痰瘀互结"基本相符。
"气阴两虚、热毒痰瘀互结"是肺癌的主要病机。"从多靶点综合考虑治疗肺癌是我 国中医药治疗肺癌的特色之一"。中药复方的成分复杂、整体层次研究困难，单一成分 研究较容易，但又常失去中医药的特色，因此，对于有效部位群的药效相关性研究就显 得尤为重要，它在中药现代化研究中起着承前启后的作用。
有益效果本发明的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物即乙酸乙酯萃取部分能够 显著抑制人巨细胞肺癌H460的生长，并对人体正常细胞(人胚肺成纤维细胞HFL-1)无 显著影响。提示该提取部位具有细胞毒作用，可以进一步分离筛选抑制人巨细胞肺癌 H460增殖的组分及单体化合物。
图1麦门冬汤合千金苇茎汤有效部位制备流程。
图2 MW-06部位各浓度对H460细胞OD值的影响。其中"与对照组相比p<0.01。
图3 MW-06部位各浓度对H460细胞生长抑制率。
图4 MW-06部位对人体正常细胞人胚肺细胞的影响。
图5 MW-06部位不同浓度作用H460细胞周期流式图。其中，A为对照组，B为10(^g/mLMW-06， C为10ng/mLMW-06， D为lng/mLMW-06。
图6 MW-06部位不同浓度对H460细胞凋亡形态学的观察。其中，A为对照组，
B为100ng/mLMW-06， C为10pg/mLMW-06， D为lpg/mLMW-06。
图7 MW-06部位不同浓度对H460细胞克隆形成的结果。其中，A为对照组，B
为100|ig/mLMW-06， C为10pg/mLMW-06， D为lng/mLMW-06。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例l:材料与方法。
1、 主要试剂
旋转蒸发仪(南京金正教学仪器有限公司，1002升降恒温水浴锅)、水循环式真空泵 (河南巩义市英峪予华仪器厂)、数显调温电热套(通州市张芝山镇)、HH-S数显恒温水浴 锅(金坛市医疗仪器厂)、圆底烧瓶(20L)、冷凝管、铁架台、分液漏斗(5000mL)(南京金 正教学仪器有限公司)。
麦冬(四川)，法半夏(贵州)，生晒参(吉林)，甘草(内蒙古)，苇茎(安徽)，薏苡仁(贵 州)，冬瓜子(安徽)，桃仁(山东)。
药用乙醇(分析纯，南京化学试剂有限公司)，环己烷(分析纯，上海试四赫维化工有 限公司)，乙酸乙酯(分析纯，南京化学试剂有限公司)，纯净水(南京水森活纯净水制备 公司)。
肺癌细胞株NCI-H460和人胚肺成纤维细胞HFL-1均购自中科院上海生物细胞所。 麦门冬汤合千金苇茎汤，提取的8个部位，由南京中医药大学方剂重点实验室制备提供。 RPMI1640培养基为美国GIBCO公司产品；优级新生牛血清为兰州民海生物工程有限 公司产品；胰蛋白酶为AMRESCO公司产品；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide， DMSO)为 AMRESCO公司产品；噻唑蓝(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide: MTT))为AMRESCO公司产品；吉姆萨染液购自南京建成生物工程研究所；Hoechst 33258染色剂为碧云天生物技术研究所产品；顺铂注射液(DDP，批号071201)为江苏豪 森药业股份有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
2、 细胞培养
取对数生长期细胞NCI-H460，用DMEM (含8%小牛血清、青霉素100U/mL、链 霉素100pg/mL， PH7.4)培养液，置于5%C02 、 37。C培养箱中培养。待细胞铺展至培养瓶的80%，用0.25%胰酶消化进行传代培养。HFL-I细胞用alfa-MEM培养液(含体 积分数10%已灭活的胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100ng/mL)培养，其他方法 相同。乙酸乙酯萃取部分(MW-06)用二甲基亚砜(DMSO)助溶，配制成lOmg/mL的 母液，-20匸保存备用。
实施例2:麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备。
称取麦冬200 g，法半夏100 g，生晒参200 g，甘草80 g，苇茎200 g，薏苡仁200 g， 冬瓜子200g，桃仁100g，组成全方共1280g，粉碎后置于20,000 mL圆底烧瓶中，加 药材量10倍量纯净水，振摇混合后，浸泡30min;连接回流冷凝装置，置电热套中缓 缓加热至11(TC沸腾，并保持微沸2小时后，停止加热，放置至溶液温度降为室温，拆 掉回流冷凝装置，倾出烧瓶中的溶液，用纱布过滤。药渣再加入纯净水至与第一次相同 刻度，同样方法再提取一次，合并提取液，分次用10,000 mL圆底烧瓶进行减压浓縮， 得到水提浓縮液(MW-01);如此反复提取药材21.60kg，共得到水提浓縮液(MW-01) 5.37 kg。将上述浓縮液加95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)，静置24小时，得醇沉上 清液2700 mL和醇沉沉淀(MW-02) 3.85 kg;将醇沉上清液减压回收溶剂至无醇味，过 滤得到醇沉上清液回收溶剂后沉淀(MW-03)0.05 kg和醇沉上清浓縮液(MW-04) 1.4 kg; 将醇沉上清浓縮液平均分成两份，分别倒入两个5000 mL的分液漏斗中，各加入1500 mL 环己烷，摇匀后静置，待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己垸同样比例 相同方法萃取两次后，减压回收溶剂，得到环己环萃取部分(MW-05) 0.18 kg;水层再 各加入1500mL乙酸乙酯，摇匀后静置，待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液 再用乙酸乙酯同样比例相同方法萃取两次后，合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂后 得到乙酸乙酯萃取部分(MW-06) 0.13 kg;水层再各加入1500 mL正丁醇，摇匀后静置， 待分层后分出上层正丁醇溶液，下层水溶液再用正丁醇同样比例相同方法萃取两次后， 合并上层正丁醇溶液，减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分(MW-07) 0.46 kg和水溶 性部位(MW-08) 0.65 kg;具体制备流程图见图1。
实施例3:乙酸乙酯萃取部分(MW-06部位)对H460细胞抑制作用实验。 1、实验方法
1.1细胞增殖抑制实验(MTT)法
取对数生长期的NCI-H460细胞和HFL-1细胞，调整细胞浓度为lxl04/mL，接种 于96孔培养板，每孔200jiL，培养24h，吸净上清，各孔换无血清培养基20(HiL， 12h 后，吸净培养液，实验组将MW-06部位按终浓度为0.1jig/mL， 0.5ng/mL， lpg/mL， 5pg/mL， 10jig/mL， 50pg/mL， lOO^ig/mL的含药培养液200uL加入每孔，阴性对照组加入等体积的DMSO(终浓度1%。)培养基，阳性对照组加入终浓度为lpg/mL等体积的 顺铂注射液(DDP)。每组设6个平行孔，作用72h后，每孔加入5mg/mLMTT20uL， 继续培养4h，吸净上清后，每孔加入200uL DMSO,于酶标仪490nm波长条件下测 OD值，根据公式增殖抑制率％= (1-实验孔A值/对照孔A值)><100%计算细胞生长 抑制率。
1.2流式细胞仪检测
根据MTT初筛结果，收集经MW-06部位100[ig/mL， 1(^g/mL， 1^ig/mL各药物浓 度及顺铂注射液lpg/mL处理组和含1%。DMS0对照组处理72h的NCI-H460细胞，收 集各组细胞均匀打散，用PBS洗涤细胞二次，离心，1200rps/min， 10min，弃上清。缓 慢加入lmL冰乙醇(70。/。)固定保存-2(TC。检测时，用PBS洗涤二次。离心，1800rps/min， 10min，弃上清。用PBS重悬，离心1200rps/min， 10min，弃上清。将细胞重悬于PBS， 调整细胞密度为lxl06/mL，加入PI (10mg， NaCl: 1.17g， RNase: 2mg， TritonX-100: lmL，枸橼酸钠200mg)染液混合，4'C避光孵育30min。上机检测。 1.3克隆形成实验
固体表面克隆形成取对数期NCI-H460细胞，制备细胞悬液加于6孔板中，每孔 10(K150个细胞，加培养液至2mL; 24h后，每孔换无血清培养基各2mL; 12h后，吸 弃培养基，各孔分别加MW-06部位，终浓度为100ng/mL， 10pg/mL， lpg/mL，含药 培养基(3%小牛血清)培养，每孔2mL，另设对照组加等体积含1%。DMS0培养基。 每72h加药孔换新鲜含药培养液，对照组换新鲜培养液继续培养；培养7天左右，以对 照组为标准，当对照组可见的细胞团(含50个以上细胞)，终止实验。拍照。计数。 1.4 Hoechst 33258荧光染色
用6孔板培养NCI-H460细胞，预先将无菌小盖玻片置于每个孔板底部，制作细胞 爬片。分别以含r^。DMSO无血清培养基和MW-06部位100pg/mL、 10ng/mL、 lpg/mL 处理72 h后，吸弃培养液，加入0.5mL固定液，固定10min;去固定液，用PBS洗2次， 每次3min，吸弃液体；加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5min;去染色液，用 PBS洗两次，每次3min，吸弃液体；用荧光显微镜观察并拍照。结果判断正常细胞 的细胞核呈现弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒 块状荧光，甚至可见DNA荧光碎片。 2、实验结果 2.1 MTT试验结果
0.1~100ng/mL的麦门冬汤合千金苇茎汤提取部位MW-06部位，作用H460细胞72 h (见表1、图2)可见10吗/mL以上的浓度具有明显抑制细胞生长的作用，在浓度10(Hig/mL (P<0. 01)且随着剂量的增加，细胞存活率降低，在高浓度时有极显著性差 异(PO.Ol)，呈剂量依赖关系；lOpg/mL以上浓度的药物随着浓度的增高药物对细胞的 抑制率上升(见图3)。同时，MW-06部位不抑制正常细胞增殖，与对照组相比/>>0.05 (见表2、图4),即无毒性作用。
表1 MW-06部位各浓度对H460细胞OD值及抑制率的影响
药物浓度(Hg/mL)OD值生长抑制率(％)
DDP10.333±0.041**62.2
MW-06部位1000.706±0.047**19.9
MW-06部位500.826±0.0826.3
MW-06部位100.848±0.0773.8
MW-06部位50.943±0.080-6.9
MW-06部位10.913±0.056-3.52
MW-06部位0.50.905±0.068-2.68
MW-06部位0.10.858±0.062-2.71
对照组0.882±0.0440
注**与对照组相比p<0.01
表2 MW-06部位高浓度对人正常细胞影响的OD值
药物浓度(Hg/mL)OD值
对照组0.504±0.057
100[ig/mLMW-06部位0.488±0.048
注与对照组相比pX).05
2.2流式细胞仪分析结果
_表3 MW-06部位不同浓度作用的细胞周期变化_
_Gi期(。/。) G2期(。/。)s期(。/。) 凋亡(％)
对照组 83.26±1.017.01±1.4 9.73±2.2 2.11±0.16
lHg/mLMW-06部位83.41±1.01 8.15±0.49** 8.44士0.55" 4.36±0.79*
10pg/mLMW陽06部位 85.13±0.67 6.86±1.04 8.27士0.89' 4.73±3.18
100ng/mLMW-06部位83.0U0.33 8.54士0.17" 8.44士0.49" 12.14士2.29'
注*与对照组相比/K0.05, **与对照组相比/7<0.01流式细胞仪测定了 MW-06部位不同浓度作用的细胞周期变化(见表3、图5)。从 表中可以看出lpg/mL， 10pg/mL， 100ng/mL浓度的MW-06部位作用H460细胞72 h 后，在浓度100pg/mL和lKig/mL细胞凋亡率与对照组细胞相比，差异有统计学意义(均 P < 0.01 )。三个浓度MW-06部位主要抑制在S期，实验组与对照组比较差异有统计学 意义。从表中可以看出加入不同浓度的MW-06部位可以诱导肺癌H460细胞发生细 胞凋亡；MW-06部位诱导细胞凋亡率与浓度呈一定的正相关，随着浓度的增加细胞凋 亡增多。
2.3 Hoechst 33258染色检测结果
在荧光显微镜下观察发现，对照组活细胞所发荧光较弱，较均匀，经MW-06部位 不同浓度作用72 h后发生凋亡的H460细胞核明显变小，并可见致密强荧光，可见凋 亡小体。(x400)(见图6) 2.4克隆形成实验结果(见图7、表4)
在药物作用后可见，与对照组相比较，MW-06部位高浓度100ug/mL对H460细胞 有明显的克隆形成抑制作用，且无大克隆形成，并呈现剂量效应依赖性。
表4 MW-06部位不同浓度对H460细胞克隆形成率的影响
浓度_克隆数克隆形成率(％)
对照组 155±1.01 103 lpg/mLMW-06部位 83±1.01 55.5 10ng/mLMW-06部位 91±0.67 60 100pg/mL MW-06部位 17士0.33**_^_
注**与对照组相比p<0.01
3、讨论
实验结果显示，用MTT法观察到不同浓度麦门冬汤合《千金》苇茎汤MW-06部位有 一定的抑制肺癌H460细胞生长的能力，而对正常人胚肺细胞HFL-1无明显作用。说明该 部位对肺癌细胞有细胞毒作用而对正常细胞并无杀伤性。细胞周期失控是肿瘤发病的重 要因素之一，正常细胞与肿瘤细胞的增殖都有赖于细胞周期的运行，肿瘤治疗的中心环 节是干扰肿瘤细胞的细胞周期，从而使肿瘤细胞增殖速率减慢或诱导细胞走向死亡。本 实验结果表明，随着浓度的增加，对肿瘤细胞的抑制主要出现在S期，提示MW-06部位 有一定的细胞周期阻滞作用，并检测结果可见细胞凋亡也随着药物浓度增加而增多。细 胞克隆形成能力是评价单细胞存活和增殖的一个良好指标。由实验结果能够进一步看 出，MW-06部位在高浓度时对肺癌H460细胞有较显著的抑制作用。所有肿瘤细胞都存在凋亡抑制现象。通过诱导细胞凋亡治疗肿瘤己成为肿瘤治疗的新途径。细胞发生凋亡 时，染色质会固縮，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。研究显示， 经麦门冬合方MW-06部位干预72h后的各组细胞，用Hoechst33258荧光染料着染后，均 能找到胞核致密浓縮发白发亮的细胞，表明MW-06部位可以诱导H460细胞凋亡。综合 以上结果，麦门冬合方提取部位群中，MW-06部位对非小细胞肺癌H460细胞株有明显 的细胞毒作用，且对正常细胞人胚肺成纤维细胞HFL-1无毒副作用。因此，对麦门冬合 方有效部位群及其进一步提取组分、化合物单体对非小细胞肺癌的信号转导通路及相关 作用机制研究值得进一步探讨，同时为丰富中医经典复方有效作用机制提供科学依据。
权利要求
1、一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，其特征在于它是由下列制备步骤制得(1)按重量份数取麦冬200～300份、法半夏100～150份、生晒参200～300份、甘草80～120份、苇茎200～300份、薏苡仁200～300份、冬瓜子200～300份、桃仁100～150份，粉碎后，加入总药材重量8～12倍的水，浸泡20～60min；加热至沸腾，并保持沸腾2～3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水，同样方法再提取1～2次，合并提取液，减压浓缩，得到水提浓缩液；(2)将步骤(1)制得的水提浓缩液加90～95％(v/v)乙醇至含醇量为80％(v/v)，静置20～30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓缩至无醇味后，冷却至室温，过滤得到醇沉上清浓缩液；(3)将步骤(2)得到的醇沉上清浓缩液，加入1～2倍容量的环己烷，摇匀后静置，待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己烷用相同方法萃取1～2次后，合并下层水溶液；(4)在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1～2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置，待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1～2次后，合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂乙酸乙酯后，得到稠膏。
2、 权利要求1所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特征在 于该方法包括如下步骤(1) 按重量份数取麦冬200 300份、法半夏100~150份、生晒参200~300份、甘 草80~120份、第茎200~300份、薏苡仁200-300份、冬瓜子200-300份、桃仁100~150 份，粉碎后，加入总药材重量8 12倍的水，浸泡20 60min;加热至沸腾，并保持沸腾 2~3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水， 同样方法再提取1 2次，合并提取液，减压浓縮，得到水提浓縮液；(2) 将步骤(1)制得的水提浓縮液加卯 95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)，静 置20 30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓縮至无醇味后，冷却至 室温，过滤得到醇沉上清浓縮液；(3) 将步骤(2)得到的醇沉上清浓縮液，加入1 2倍容量的环己垸，摇匀后静置， 待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己烷用相同方法萃取1 2次后，合并 下层水溶液；(4) 在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1 2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置， 待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1~2次后， 合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂乙酸乙酯后，得到稠膏。
3、 根据权利要求2所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，加入水量为总药材重量的10倍。
4、 根据权利要求2所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特征在于步骤(1)中，浸泡时间为30min。
5、 根据权利要求2所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特征在于步骤(2)中，水提浓縮液加95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80。/。(v/v)。
6、 权利要求1所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物在制备抑制巨细胞肺癌H460增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，是将麦门冬汤与千金苇茎汤合方经水提、醇沉、环己烷和乙酸乙酯萃取多个步骤后得到的稠膏。本发明公开了上述提取物的制备方法，还公开了上述提取物在制备抑制巨细胞肺癌H460增殖药物中的应用。本发明的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物即乙酸乙酯萃取部分能够显著抑制人巨细胞肺癌H460的生长，并对人体正常细胞无显著影响。提示该提取部位具有细胞毒作用，可以进一步分离筛选抑制人巨细胞肺癌H460增殖的组分及单体化合物。
文档编号A61K36/88GK101647970SQ20091018345
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者周宇辉, 唐于平, 淼 姜, 怡 孙, 旭 张, 戴晓明, 段金廒, 琳 汤, 飞 熊, 明 蒋, 蒋凤荣, 瑧 詹, 赵宏宇, 郑璐玉, 健 马 申请人:南京中医药大学