专利名称：麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物及其在制备抑制a549细胞增殖药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物及其应用，具体涉及麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取 物及其在制备抑制A549细胞增殖药物中的应用。
背景技术：
肺癌是世界各国常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤中增长是最快的，是目前人 类癌症死亡的主要原因，并被认为是当今世界对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤。 全球大约每年新增300万病例，同时，每年有超过100万人死于肺癌。在我国，肺癌占 恶性肿瘤发病、死亡的首位，年发病率为35例/10万人，患者5年生存率仅为lOo/o ， 国际抗癌联盟(UICC)公布到2005年全世界恶性肿瘤患者男性肺癌占第一位，而中国的 肺癌及患病绝对人数均占全世界的第一位，有资料称"中国的肺癌将占全球的一半"，约 130.8万人。90年代以来我国肺癌的流行病学特点是年轻肺癌病例增多，腺癌病例的发 病率在女性继续增长，男性鳞癌病例减少。首发症状不明显，就诊病人多为中、晚期， 已无手术机会。
基于近来对肺癌认识的不断加深，由WHO和国际肺癌研究协会联合组成的专门小 组对1981年WHO制定的肺肿瘤分类进行了修改，于1999年正式公布于众。肺癌患者 中80X是NSCLC (non-small cell lung carcinoma,非小细胞肺癌)，20%是SCLC (small cell lung carcinoma,小细胞肺癌)，基于两者在光镜下诊断的差异，二者在临床治疗中的 方式也是不同的。NSCLC和SCLC是肺上皮源性肿瘤中最常见的2种类型，而其它良 性肿瘤，非上皮源性肿瘤等在肺肿瘤中是很少见的。NSCLC包括肺腺癌，肺鳞癌和低 分化甚至是未分化大细胞癌，这三种类型的肿瘤同属于NSCLC。
A549细胞(Human lung adenocarcinoma epithelial cell line)是人肺泡基底上皮肿瘤 细胞，组织分型属于肺腺癌，常作为II型肺泡上皮细胞药物代谢的体外模型，细胞角蛋 白阳性，p53基因为野生型，ras基因突变。
肺癌西医治疗方法的进展肺癌中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%以上，在国际 上均一致承认肺癌是一个高发癌，在很多国家及城市中为各种癌症之首，65%在发现时 为III和IV期，往往无手术条件，放疗的效果也不尽人意，而药物治疗中化疗虽说是一 种全身性治疗药物，在近10余年较前有了较大进步，大量有效的新化疗药物及减低毒 性药物的出现在疗效、耐受性方面较前有了一定的提高，但NSCLC具有耐药性高、疗 效差的特点，尤对有远道转移的IV期患者，化疗虽仍为主要治疗方法，对该用多少周否"合适"，均为目前肿瘤医师、患 者所顾虑的问题。寻找一个耐受性高、毒性少而同样有效或更有效的另一种药物成为人 们密切关注的事件，生物靶点治疗的发展自然成为肺癌新治疗的重中之重。
肺癌中医治疗方法的进展肺癌属中医"息贲"、"肺积"等范畴。在中医学文献中类 似肺癌证候有不少记载。如《素问*咳》"肺咳之状，咳而喘息有音，甚至唾血。"《素 问-奇病》"病胁下满气上逆......病名息积，此不妨于食。"《难经*五十六难》称"肺
之积，名曰息贲，在右胁下，覆大如杯，久不已，令人洒淅寒热，喘咳，发肺壅。"明-张 景岳说"劳嗽，声观，声不能出或喘息气促者，此肺脏败也，必死。"其发病原因，《诸 病源候论》云"积聚者，有阴阳不和，腑脏虚弱。受于风邪，搏于腑藏之气所为也。" 清-顾松园认为"烟为辛热之魁"，清'赵濂《医门补要》亦有论述"表邪遏伏于肺，失 于宣散，并嗜烟酒，火毒上熏，久郁热炽，烁腐肺叶"；同时中医学强调"邪之所凑，其 气必虚"，《灵枢'刺节真邪》"虚邪之入于身也深，寒与热相搏，久留而内著......邪气居
其间而不反，发为瘤。"《景岳全书》"凡脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病。" 《活法机要》"壮人无积，虚人则有之。"《医宗必读'积聚》指出"积之成者，正气不 足，而后邪气踞之"。病机如《杂病源流犀烛》中说:"邪积胸中，阻塞气道，气不得通， 为痰、为食、为血，皆邪正相搏，邪积乃生，正不得制之，遂结成形而有块。"说明肺 中积块的产生与正虚邪侵、气机不通、痰血搏结有关，对后世研究肺癌的发病和治疗具 有重要启迪意义。许多学者对其病因病机有着不同的认识，但无外乎正气虚损和邪毒内 积2个方面。病变部位在肺，与脾、肾有关，病理因素主要为气滞、痰浊、瘀血、热毒， 病理性质为本虚标实，虚实错杂。刘嘉湘[1]认为脏腑阴阳失调，正气虚损是患病的主要 内在原因，"正气不足，而后邪气踞之"，肺、脾、肾三脏气虚均可导致肺气不足，加之 嗜 烟日久，热灼津液，或房事不节，精血内耗，均可导致肺阴不足，阴虚内热或气阴两 虚；外在邪毒得以趁虚而入，客邪留滞，气机不畅，血行瘀滞，津液不布，聚津为痰， 痰瘀交阻，日久形成积块。因此，认为肺癌是全身性疾病的一个局部表现，是因虚而致 病，因虚而致实，早期的虚多见肺脾气虚或气阴两虚，晚期多为阴虚内热或阴阳两虚， 局部的实不外乎气滞、血瘀、痰凝、毒聚的病理变化。洪广祥[2]认为血瘀为肺癌的基本 病理改变，瘀血阻肺为其基本证型，肺脾气虚则是其病理基础。陈玉琨[3]则认为痰瘀既 是邪毒侵肺，脏腑功能失调的病理产物，又是导致正气内虚，邪毒胶结成块的致病因素， 因而痰瘀贯穿于肺癌的整个发病过程。
麦门冬汤源自张仲景《金匮要略'肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，其曰"火逆 上气，咽喉不利，止逆下气者，麦门冬汤主之"[4]。 一般是治疗"虚热肺痿"的主方。后世 对该方的主治范围有所扩大，用治肺阴不足及胃阴不足诸证。麦门冬汤由麦冬、半夏、人参、甘草、粳米、大枣等6味药组成，其主要有两大配伍特点 一是方中重用七升麦 冬滋肺养胃，并清虚热，仅用一升半夏降逆下气，化其痰涎，半夏虽辛温，但与大量麦 冬配伍则其燥被制，而麦冬得半夏则滋而不腻，两药配伍，相反相成。二是人参、甘草、 粳米、大枣补脾益气，体现了虚则补母、培土以生金之法[5]。全方共奏养胃阴而润肺燥， 下逆气而止浊唾之功。因其用药精当，主从有序，配伍严谨，疗效显著，故为后世医家 所推崇，并加以推广运用。现代药理学研究表明，麦门冬汤具有呼吸道净化、改善呼吸 道高敏性、缓解支气管收縮、调节肺表面活性物质分泌等类固醇样药理作用[6—9]，对咳 嗽、呼吸道过敏、炎症等引起的呼吸道病变有重要的调节作用。
《千金》苇茎汤出自唐今i、思邈的《备急千金要方》巻十七肺脏方之肺痈第七，同时 也见载于《金匮要略，肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》，由薏苡仁、瓜瓣、桃仁、苇茎 组成，具有清热化痰、逐瘀排脓之功，主治肺痈。其中苇茎清泄肺热；冬瓜仁、生薏仁 清化热痰，利湿排脓；桃仁活血祛瘀以消热结。由于麦门冬汤主治"肺中气阴亏虚"、 《千金》苇茎汤清肺化痰活血[1()]，与现代中医所认为之肺癌的病机"气阴两虚、热毒痰 瘀互结"[11]基本相符。现代有人以其中一首方剂加味的方式应用于临床来治疗肺癌而取 效者，如吴玉生氏[12]用加味苇茎汤加减内服治疗124例晚期非小细胞肺癌患者，李柳宁 [13]等以千金苇茎汤加味应用在肺癌围放疗期的临床治疗等。 参考文献刘嘉湘.肺癌的中医药治疗进展.中国肿瘤,2002,11(6):326 [2]洪广祥.论中医药治疗肺癌.中医药通报，2007，6(2):5-8、15 [3]陈玉琨.蒋梅.肺癌的中醫治療.新中医，1999，31(5):31-32 [4]张仲景.金匮要略方论[M].北京:中国书店，1993,4.包素珍，陈明显.麦门冬汤治疗慢性肺系疾病的药理学研究述要[J].辽宁中医学院 学报，2005,(2): 168-169浜洋一郎.麦门冬汤对体外气管炎炎症模型分泌亢进的作用[J].和汉医药学志， 1994,11(4):306-307. Aizawa H, Shigyo M， Nakano H, et al. Effect of the Chinese herbal medicine, Bakumondo-to, on airway hyperresponsivenes induced by ozone exposure inguinea-pigs [J]. Respirology. 1999，4(4):349-54. Aizawa H, Yoshida M, Inoue H， et al. Traditional oriental herbal medicine, Bakumondo-to, suppresses vagal neuro-effector transmission in guinea pig trachea [J]. J Asthma. 2003,40(5):497-500. Isohama Y， Kai H， Miyata T. Bakumondo-to,a traditional'herbal medicine,stimulatesphosphatidylcholine secretion, through the synergistic cross-talk between different signal transduction systems in alveolar type II cells[J]. Nippon Yakurigaku Zasshi.1997,110 Suppl 1:120-125.范永升主编.新世纪全国高等中医药院校规划教材'金匮要略。中国中医药出版社 2003.P114、 118陈四清，周仲瑛.原发性支气管肺癌辨证分型探讨.新中医2002， 34 (11): 6-8 [12]吴玉生，吴凡.加味苇茎汤治疗晚期非小细胞肺癌124例疗效观察.新中医，2004， 36 (7): 13-14李柳宁,刘伟胜.千金苇茎汤加味在肺癌围放疗期的临床应用.辽宁中医杂志2006年 第33巻第12期1599
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，该提
取物对肺癌细胞A549有较好的抑制作用。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述提取物的制备方法。 本发明还要解决的一个技术问题是提供上述提取物在制备抑制肺腺癌细胞A549细
胞增殖药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下 一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，它是由下列制备步骤制得
(1) 按重量份数取麦冬200~300份、法半夏100~150份、生晒参200 300份、甘 草80-120份、苹茎200~300份、薏苡仁200~300份、冬瓜子200-300份、桃仁100~150 份，粉碎后，加入总药材重量8 12倍的水，浸泡20 60min;加热至沸腾，并保持沸腾 2~3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水， 同样方法再提取1 2次，合并提取液，减压浓縮，得到水提浓缩液；
(2) 将步骤(1)制得的水提浓縮液加90 95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)，静 置20 30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓缩至无醇味后，冷却至 室温，过滤得到醇沉上清浓縮液；
(3) 将步骤(2)得到的醇沉上清浓縮液，加入1 2倍容量的环己烷，摇匀后静置， 待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己烷用相同方法萃取1 2次后，合并 下层水溶液；
(4) 在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1 2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置， 待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1~2次后，合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂乙酸乙酯后，得到稠膏。 步骤(1)中，加入水量为总药材重量的10倍。 步骤(1)中，浸泡时间为30min。
步骤(2)中，水提浓縮液加95。/。(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)。 上述麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物在制备抑制巨细胞肺癌A549增殖药物中 的应用。
本发明采用麦门冬汤与千金苇茎汤合方，但对其进行的改进，即于麦门冬汤方中删 去了组分粳米和大枣。这是因为粳米、大枣为食源性药物，对疾病治疗性功效较弱；本 研究用处方是两首经典方剂的合用之方，考虑到全方总药味数的问题，故于方中减去此 二物。
麦门冬汤和千金苇茎汤合用，具有清热养阴、润肺降气、祛瘀排脓之功，和现代中 医所认为之肺癌的病机"气阴两虚、热毒痰瘀互结"基本相符。
"气阴两虚、热毒痰瘀互结"是肺癌的主要病机。"从多靶点综合考虑治疗肺癌是我 国中医药治疗肺癌的特色之一"。中药复方的成分复杂、整体层次研究困难，单一成分 研究较容易，但又常失去中医药的特色，因此，对于有效部位群的药效相关性研究就显 得尤为重要，它在中药现代化研究中起着承前启后的作用。
有益效果本发明的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物即乙酸乙酯萃取部分能够 显著抑制肺腺癌细胞A549的生长，并对人体正常细胞(人胚肺成纤维细胞HFL-1)无显 著影响。提示该提取部位具有细胞毒作用，可以进一步分离筛选抑制肺腺癌细胞A549 增殖的组分及单体化合物。
图1麦门冬汤合千金苇茎汤有效部位制备流程。
图2 MW-06部位各浓度对A549细胞和HFL-1细胞增殖的影响。其中*表示与 D(596。DMSO对照组)相比p<0.05， **表示与D(596。DMSO对照组)相比pO.Ol 。
图3 MW-06部位各浓度对A549细胞增殖的影响(x400)。其中A为空白对照组， B为5%。DMSO对照组，C为500pg/mLMW-06， D为100ng/mL MW-06, E为lO^g/mL MW-06, F为lpg/mL MW-06。
图4 MW-06部位各浓度对A549细胞克隆形成的影响。其中A为空白对照组，B 为5%。DMSO对照组，C为l吗/mLDDP顺钼，D为500|_ig/mLMW-06, E为100pg/mL MW-06, F为10pg/mL MW-06, G为lpg/mL MW-06。
图5 MW-06部位对A549细胞克隆数影响的柱形图。其中*表示与D(596。DMSO对照组)相比p<0.05， **表示与D(596oDMSO对照组)相比p<0.01 。
图6 MW-06部位各浓度诱导A549细胞凋亡的作用(x400)。其中A为空白对照 组，B为1%。DMS0对照组，C为lng/mLDDP， D为100|jg/mLMW-06， E为lO^g/mL MW-06, F为lpg/mL MW-06。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例l:材料与方法。
1、 主要试剂
旋转蒸发仪(南京金正教学仪器有限公司，1002升降恒温水浴锅)、水循环式真空泵 (河南巩义市英峪予华仪器厂)、数显调温电热套(通州市张芝山镇)、HH-S数显恒温水浴 锅(金坛市医疗仪器厂)、圆底烧瓶(20L)、冷凝管、铁架台、分液漏斗(5000 ml)(南京金 正教学仪器有限公司)。
麦冬(四川)，法半夏(贵州)，生晒参(吉林)，甘草(内蒙古)，苇茎(安徽)，薏苡仁(贵 州)，冬瓜子(安徽)，桃仁(山东)。
药用乙醇(分析纯，南京化学试剂有限公司)，环己垸(分析纯，上海试四赫维化工有 限公司)，乙酸乙酯(分析纯，南京化学试剂有限公司)，纯净水(南京水森活纯净水制备 公司)。
肺癌细胞株A549和人胚肺成纤维细胞HFL-1均购自中科院上海生物细胞所。麦门 冬汤合千金苹茎汤提取部位，由南京中医药大学方剂重点实验室制备提供。RPMI1640 培养基为美国GIBCO公司产品；优级新生牛血清为兰州民海生物工程有限公司产品； 胰蛋白酶为AMRESCO公司产品；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)为AMRESCO 公司产品；噻唑蓝(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazoli腦bromide, MTT)为 AMRESCO公司产品；吉姆萨染液购自南京建成生物工程研究所；Hoechst 33258染色 剂为碧云天生物技术研究所产品；顺铂注射液(DDP，批号071201)为江苏豪森药业股份 有限公司产品，其余试剂均为国产分析纯。
2、 细胞培养
取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺细胞HFL-1用含10%小牛血清 的RPMI1640 (青霉素100U/mL、链霉素100pg/mL， PH7.4)培养液，置于37°C、 5% C02 培养箱中培养。待细胞铺展至培养瓶的80%，用0.25%胰酶消化进行传代培养。乙酸乙酯萃取部分(MW-06部位)用二甲基亚砜(DMSO)助溶，配制成10mg/mL的母液，-20 'C保存备用。
实施例2:麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备。
称取麦冬200 g,法半夏100 g，生晒参200 g，甘草80 g，苇茎200 g，薏苡仁200 g， 冬瓜子200g，桃仁100g，组成全方共1280g，粉碎后置于20,000 mL圆底烧瓶中，加 药材量10倍量纯净水，振摇混合后，浸泡30min;连接回流冷凝装置，置电热套中缓 缓加热至11(TC沸腾，并保持微沸2小时后，停止加热，放置至溶液温度降为室温，拆 掉回流冷凝装置，倾出烧瓶中的溶液，用纱布过滤。药渣再加入纯净水至与第一次相同 刻度，同样方法再提取一次，合并提取液，分次用10,000 mL圆底烧瓶进行减压浓縮， 得到水提浓縮液(MW-01);如此反复提取药材21.60kg，共得到水提浓縮液(MW-01) 5.37 kg。将上述浓縮液加95Q/。(v/v)乙醇至含醇量为80。/。(v/v)，静置24小时，得醇沉上 清液2700mL和醇沉沉淀(MW-02) 3.85kg;将醇沉上清液减压回收溶剂至无醇味，过 滤得到醇沉上清液回收溶剂后沉淀(MW-03)0.05 kg和醇沉上清浓縮液(MW-04) 1.4 kg; 将醇沉上清浓縮液平均分成两份，分别倒入两个5000 mL的分液漏斗中，各加入1500 mL 环己垸，摇匀后静置，待分层后分出上层环己垸溶液，下层水溶液再用环己烷同样比例 相同方法萃取两次后，减压回收溶剂，得到环己环萃取部分(MW-05) 0.18 kg;水层再 各加入1500mL乙酸乙酯，摇匀后静置，待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液 再用乙酸乙酯同样比例相同方法萃取两次后，合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂后 得到乙酸乙酯萃取部分(MW-06)0.13kg;水层再各加入1500mL正丁醇，摇匀后静置， 待分层后分出上层正丁醇溶液，下层水溶液再用正丁醇同样比例相同方法萃取两次后， 合并上层正丁醇溶液，减压回收溶剂后得到正丁醇萃取部分(MW-07) 0.46 kg和水溶 性部位(MW-08) 0.65 kg;具体制备流程图见图l。
实施例3:乙酸乙酯萃取部分(MW-06)对A549细胞抑制作用实验。 1、实验方法
1.1细胞增殖抑制实验(MTT)法
消化收集对数生长期的A549细胞和HFL-1细胞，以5><103/孔接种于96孔板中， 待细胞融合至80%，换无血清培养液培养12h，使细胞同步化，之后实验组分别加入用 RPMI1640培养液稀释的终浓度为500pg/mL， lOOpg/mL, 10pg/mL和lpg/mL的MW-06 部位，每孔200uL，同时设等体积的含DMSO对照组(即终浓度5%。)和不含DMSO 的空白对照组，每组设8个平行孔，继续培养72h，显微镜下(x400)观察后，每孔加 入用PBS配置的浓度为5mg/mL MTT 20pL于37°C 、 5% C02培养箱孵育4h，弃上清后以二甲亚砜溶解蓝紫色颗粒，以Ascent酶标仪检测490 nm波长的每孔吸光度值，根据 公式细胞存活率-实验孔OD值/对照孔OD值><100%，计算细胞存活率。 1.2克隆形成实验
取对数生长期的A549细胞，经胰酶消化制备成单细胞悬液，以250个细胞/孔均匀 接种于六孔板中，24h后，每孔换无血清培养基各2mL， 12h后，吸去培养液，加入用 含10%小牛血清的RPMI1640培养液稀释的终浓度为500pg/mL, 100ng/mL, 10pg/mL和 lpg/mL的MW-06部位，每孔2mL，同时设等体积含5%>DMSO对照组、不含DMSO 的空白对照组和终浓度为lpg/mL的顺铂注射液(DDP)阳性药对照组，每组3个平行 孔，置37。C、 5%0)2培养箱中培养7天，去除培养液，95%乙醇固定10 min,吉姆萨 染液染色10min，自来水冲洗，晾干，用Quantity One软件计算克隆数。克隆形成率-克隆数/接种细胞数xlOO。/。；克隆形成抑制率=(1-实验组克隆形成率)/对照组克隆形成率 xl00%。
1.3Hoechst 33258荧光染色
预先将无菌盖玻片置于6孔板内，取对数生长期的A549细胞，经胰酶消化制备成 单细胞悬液，均匀接种于预置盖玻片的六孔板中，24h后，分别以RPMI1640培养液稀 释的终浓度为100ng/mL、 lOpg/mL和lpg/mL的MW-06部位处理，同时设1%。DMS0 对照组、不含DMSO的空白对照组和浓度为lng/mL的顺铂注射液(DDP)阳性药对照 组，72h后，吸弃培养液，加入0.5mL固定液，固定10min;去固定液，用PBS洗2次， 每次3min，吸弃液体；加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5min;去染色液，用 PBS洗两次，每次3min，吸弃液体；用荧光显微镜观察并拍照。结果判断正常细胞 的细胞核呈现弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒 块状荧光，甚至可见DNA荧光碎片。 2、实验结果 2.1细胞增殖抑制实验 2丄1 MTT试验
表1 MW-06部位对A549细胞和HFL-1细胞生长的影响(n=8)
细胞株药物浓度(Hg/mL)OD值存活率
A5495000.295375±0扁3**52.08%
1000.376375±0.0485**70.41%
100.2565±0.0219**43.28%
10.233375±0.020**38.05%
c(对照组)0.581125±0.2162116.75%(续表1)
D(596。DMSO)0.507125±0.0720100.00%
HFL國15000.269±0.0157100.53%
1000.288375±0.0815112.32%
100.327125±0.0523**135.89%
10.296875±0.0679117.49%
c(对照组)0.32625±0.0290135.36%
D(596oDMSO)0.268125±0.0296100.00%
注*表示与D(596oDMSO对照组)相比p<0.05， **表示与D(596。DMSO对照组)相比pO.Ol
由表1、图2可见50(Vg/mL, 100ng/mL， lO^ig/mL和l^ig/mL MW-06部位均表现 出抑制A549细胞增殖的作用(P<0.01 )，而对正常细胞HFL-1作用不明显，即对HFL-1 细胞无毒性作用。
2丄2形态学观察
药物作用72小时之后，显微镜(x400)下观察发现对照组细胞大小均一，数目 较多，形态正常，而MW-06部位各浓度加药组细胞形态不规则，数量明显减少，在 500ng/mL药物组出现细胞模糊的现象，可能与药物颜色和浓度较高有关(见图3)。 2.2平板克隆形成试验
药物作用7天后，MW-06部位各浓度对A549细胞克隆形成的影响见图4， 5%。DMSO 对照组较不含DMSO的空白对照组单克隆所含细胞数少，提示5%。DMSO对A549细胞 有轻度影响，500pg/mL和lpg/mL顺铀组无克隆形成，统计结果见表2、图5: 500ng/mL， 10(Vg/mL， 10pg/mL和l|ag/mLMW-06部位均明显抑制A549细胞克隆形成的能力(PO. 01)。
表2 MW-06部位对A549细胞克隆数的影响
组别浓度(jig/mL)克隆数(个)克隆形成率克隆形成抑率
65000.00%117.37%
100162±25.12*64.80%41.31%
1063±6.24**25.20%87.79%
156±6.08**22.40%91.08%
C241±9.0296.40%
D213±9.0785.20%
DDP10**0.00%117.37%
12注*表示与D(596。DMSO组)p〈0.05, **表示与D(596。DMSO组)p〈0.01
2.2 Hoechst 33258染色
在荧光显微镜下观察发现，对照组细胞所发荧光较弱，较均匀，经MW-06部位不 同浓度作用72 h后，细胞数量减少，细胞核明显变小，荧光强度增高，可见凋亡小体 (x400)(见图6)。 3、讨论
实验结果显示，采用MTT法和形态学观察发现不同浓度麦门冬汤合千金苹茎汤 MW-06部位有明显抑制肺癌A549细胞增殖的能力，而对正常对照细胞HFL-1无明显抑制 作用，说明该部位对肺癌细胞有细胞毒作用而对正常细胞并无杀伤性。细胞克隆形成能 力是评价单细胞存活和增殖的一个良好指标。由实验结果能够进一步看出，MW-06部位 在不同浓度时对肺癌A549细胞均有显著抑制克隆形成的作用。所有肿瘤细胞都存在凋亡 抑制现象，通过诱导细胞凋亡治疗肿瘤已成为肿瘤治疗的新途径。细胞发生凋亡时，染 色质会固縮，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。9f究显示，经MW-06 部位干预72h后的各组细胞，用Hoechst33258染色后，均能找到胞核致密浓縮发白发亮 的细胞，表明MW-06部位可以诱导A549细胞凋亡，提示MW-06部位抑制A549细胞增殖 的主要机制可能是诱导细胞凋亡。综合以上结果，提取部位群中，MW-06部位对非小细 胞肺癌A549细胞株有明显的细胞毒作用，且对正常细胞人胚肺成纤维细胞HFL-1无毒副 作用。因此，对有效部位群及其进一步提取组分、化合物单体对非小细胞肺癌的信号转 导通路及相关作用机制研究值得进一步探讨，同时为丰富中医经典复方有效作用机制提 供科学依据。
权利要求
1、一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，其特征在于它是由下列制备步骤制得(1)按重量份数取麦冬200～300份、法半夏100～150份、生晒参200～300份、甘草80～120份、苇茎200～300份、薏苡仁200～300份、冬瓜子200～300份、桃仁100～150份，粉碎后，加入总药材重量8～12倍的水，浸泡20～60min；加热至沸腾，并保持沸腾2～3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水，同样方法再提取1～2次，合并提取液，减压浓缩，得到水提浓缩液；(2)将步骤(1)制得的水提浓缩液加90～95％(v/v)乙醇至含醇量为80％(v/v)，静置20～30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓缩至无醇味后，冷却至室温，过滤得到醇沉上清浓缩液；(3)将步骤(2)得到的醇沉上清浓缩液，加入1～2倍容量的环己烷，摇匀后静置，待分层后分出上层环己烷溶液，下层水溶液再用环己烷用相同方法萃取1～2次后，合并下层水溶液；(4)在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1～2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置，待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1～2次后，合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂乙酸乙酯后，得到稠膏。
2、 权利要求1所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特征在 于该方法包括如下步骤(1) 按重量份数取麦冬200~300份、法半夏100-150份、生晒参200-300份、甘 草80-120份、等茎200-300份、薏攻仁200~300份、冬瓜子200~300份、桃仁100-150 份，粉碎后，加入总药材重量8 12倍的水，浸泡20 60min;加热至沸腾，并保持沸腾 2~3小时；停止加热，冷却至室温，过滤得滤液，药渣再加入与第一次水煎相同量的水， 同样方法再提取1 2次，合并提取液，减压浓縮，得到水提浓縮液；(2) 将步骤(1)制得的水提浓縮液加90~95% (v/v)乙醇至含醇量为80% (v/v)，静 置20 30小时，得醇沉上清液和醇沉沉淀，将醇沉上清液减压浓縮至无醇味后，冷却至 室温，过滤得到醇沉上清浓縮液；(3) 将步骤(2)得到的醇沉上清浓縮液，加入1 2倍容量的环己垸，摇匀后静置， 待分层后分出上层环己垸溶液，下层水溶液再用环己垸用相同方法萃取1 2次后，合并 下层水溶液；(4) 在步骤(3)得到的下层水溶液中加入1 2倍容量的乙酸乙酯，摇匀后静置， 待分层后分出上层乙酸乙酯溶液，下层水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1~2次后， 合并上层乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂乙酸乙酯后，得到稠膏。
3、 根据权利要求2所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特 征在于步骤(1)中，加入水量为总药材重量的10倍。
4、 根据权利要求2所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特 征在于步骤(1)中，浸泡时间为30min。
5、 根据权利要求2所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物的制备方法，其特 征在于步骤(2)中，水提浓縮液加95。/Q(v/v)乙醇至含醇量为80%(v/v)。
6、 权利要求1所述的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物在制备抑制肺腺癌细胞 A549增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物，是将麦门冬汤与千金苇茎汤合方经水提、醇沉、环己烷和乙酸乙酯萃取多个步骤后得到的稠膏。本发明公开了上述提取物的制备方法，还公开了上述提取物在制备抑制肺腺癌细胞A549增殖药物中的应用。本发明的麦门冬汤与千金苇茎汤合方的提取物即乙酸乙酯萃取部分能够显著抑制肺腺癌细胞A549的生长，并对人体正常细胞无显著影响。提示该提取部位具有细胞毒作用，可以进一步分离筛选抑制肺腺癌细胞A549增殖的组分及单体化合物。
文档编号A61K36/8994GK101653575SQ20091018345
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者周宇辉, 唐于平, 淼 姜, 怡 孙, 旭 张, 戴晓明, 段金廒, 琳 汤, 飞 熊, 王明艳, 明 蒋, 蒋凤荣, 赵宏宇, 郑璐玉, 健 马 申请人:南京中医药大学