专利名称：松杉灵芝活性物质、其制备法及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种松杉灵芝活性物质，特别是指一种可预防动脉粥状硬化的松杉 灵芝活性物质、其制备法及其组合物。
背景技术：
数千年来，在东方国家中，灵芝科(Ganodermataceae family)植物已被证实具有 药用效果，灵芝的抗氧化效果是其医药效果中的一种。松杉灵芝(Ganoderma tsugae)为一 种灵芝属扁平状多孔的蕈类，也是一种在台湾被作为膳食补充剂的栽培品种。近年来，松杉 灵芝固态培养的子实体与菌丝体的萃取物已被报导具有免疫调节、抗癌、抗发炎以及抗氧 化等疗效。然而，有关松杉灵芝液态酸酵培养所产生的胞外多醣体(exopolysaccharides)， 其抗氧化的特性或其它活性成分却很少被了解。氧化压力(oxidative stress)在动脉粥状硬化(Atherosclerosis)的病理生理 学上扮演重要的角色。氧化压力可被定义为过度产生氧化物(oxidants)所造成的病理结 果，该氧化物会覆盖可溶性抗氧化剂(soluble antioxidants)与自由基抑制酵素(free radical-quenching enzymes)的抗氧化能力。近来研究显示，由于第一型血红素氧化酶 (heme oxygenase-1, H0-1)具有抗氧化能力，因此该酵素具有细胞保护的效果。文献亦指 出过度表现第一型血红素氧化酶(H0-1)会减少动脉粥状硬化的发生，由此可突显以第一 型血红素氧化酶(H0-1)作为预防心血管疾病的新颖治疗标的的潜力。最近，一个氧化还原 敏感个生转录因子(redox-sensitive transcription factor), NF—E2 才目关因子 2 (Nuclear factor-erythroid 2related factor 2，Nrf2)被显示可调节许多抗氧化剂蛋白质的 表现，这些蛋白质包含第一型血红素氧化酶(H0-1)、麸胱甘肽硫转移酶(glutathione S_transferase，GST)、麸胺酰半胱胺酸合成酶(glutamylcysteine synthase, GCS)以及硫 氧化还原蛋白酶(Thioredoxin reductases，TrxR)。就此，寻找新颖以及更具有潜力的转 录因子Nrf2相关基因的诱导剂，将有助于针对预防或治疗心血管失调新治疗方法的发展。本案发明人鉴于上述灵芝所具有的广泛功效，以及动脉粥状硬化学理研究，研究 松杉灵芝液体培养所产生的活性物质，对于内皮细胞中第一型血红素氧化酶(H0-1)与第 一型硫氧化还原蛋白酶(TrxRl)表现的影响。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种松杉灵芝活性物质，该活性物质具有可预防动脉粥 状硬化的效果。可达成上述发明目的的松杉灵芝活性物质，是将松杉灵芝菌丝体经过下列步骤所
产生步骤1 将松杉灵芝进行培养，以取得培养物；步骤2 将步骤1所得培养物，以压榨过滤取得的滤液，经过乙醇萃取，得到乙醇萃 取沉淀物；
步骤3 将步骤2所得乙醇萃取沉淀物以胶体过滤层析纯化，得到胶体过滤层析 物；步骤4 将步骤3所得胶体过滤层析物以丙酮萃取，得到的上清液即为松杉灵芝活 性物质。步骤1所述的培养方式包含但不限于液态酸酵培养、固态培养或其它适用本发明 的培养方法。优选地，所用的松杉灵芝(Ganoderma tsugae)是得自寄存于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC ；地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，寄存编号为CGMCC No. 2861，寄存日期为2009年1月8日，但本发明所述的松杉灵芝活性物质不限于由此菌株 所得。优选地，该液体酸酵培养步骤为在含有蛋白质水解物0. 1 Iwt. %、综合性氮源 0. 2 2wt. %、微量矿物质0. 01 0. Iwt. %、无机盐类0. 01 0. Iwt. %以及综合性碳源 2 IOwt. %的培养液中，以20 35°C、槽压0. 5 lvvm、20 IOOrpm搅拌速率条件下培 养5 15天；其中该综合性碳氮源可为榖类或豆类；其中该无机盐类可为硫酸镁、磷酸氢 二钾、硫酸铁等；其中该综合性碳源可为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等。优选地，该乙醇萃取步骤为以最终浓度10%乙醇萃取30 60分钟后，离心取得 的上清液再以最终浓度20%乙醇萃取30 60分钟。于另一较佳实施例中，该乙醇萃取步 骤为以最终浓度20%乙醇萃取30 60分钟。优选地，该胶体过滤层析步骤为将该乙醇萃取沉淀物注入丙烯葡聚醣凝胶 S-400 胶体管柱，以 0. 05 0. 5M 三羟甲基氨甲烷盐(tris (hydroxymethyl) aminomethane， Tris)缓冲溶液(pH 6. 8 7. 2)为移动相，流速为0. 5毫升/分钟，收集第161 200毫升 或第321 400分钟的过滤液。优选地，该丙酮萃取步骤为于8 -20°C下，以最终浓度55wt. %丙酮萃取30 120分钟。另外，本发明并提供一种预防动脉粥状硬化的组成物，是包含上述松杉灵芝活性 物质，以及适当的稀释剂、赋形剂或载体。本发明所提供的松杉灵芝活性物质，与其它已知技术或物质相互比较时，更具有 下列优点经试验证明，本发明所提供的松杉灵芝活性物质可经由增加细胞核内转录因子 Nrf2的数量(促进Nfr2转位进入细胞核)，提高抗氧化反应片段启动子(AREpromoter)的 活性、硫氧化还原蛋白酶启动子(TrxR promoter)的活性，进而诱导第一型血红素氧化酶 (H0-1)与第一型硫氧化还原蛋白酶(TrxR)表现，以达到预防动脉粥状硬化的效果；相较之 下，已知的松杉灵芝活性物质并无这样的效果。
请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发 明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为图1为本发明松杉灵芝活性物质萃取的流程图，图中显示由松杉灵芝液体培养滤液制备不同萃取物的步骤；图2为松杉灵芝萃取物F5-2在内皮细胞中诱导第一型血红素氧化酶(H0_1)表现 的分析，其中_代表控制组(未添加萃取物进行处理)；图3为经PNGase F酵素水解后的松杉灵芝萃取物F5_2弱化诱导第一型血红素氧 化酶(H0-1)表现的分析。其中-代表未进行该项处理；+代表进行该项处理，如第一条lane 即表示内皮细胞未处理F5-2、F5-2无经PNGase F酵素水解及未煮沸处理；图4A为松杉灵芝萃取物F5-2诱导第一型硫氧化还原蛋白酶(TrxR-I)表现的分 析；图4B为松杉灵芝萃取物F5-2诱导硫氧化还原蛋白酶(Thioredoxin reductases, TrxR)的启动子活性的分析，其中-代表控制组(未添加萃取物进行处理)；图5A及图5B分别为松杉灵芝萃取物F5-2增加细胞核内转录因子Nrf2转位以及 诱导ARE-Iuciferase报导基因活性表现的分析，其中-代表控制组(未添加萃取物进行处 理)；图6A为松杉灵芝萃取物F5-2对抗氧化逆境的保护效果分析，结果以mean士SEM 表示，该试验独立重复5次以上；*p < 0. 05即相对于未处理的对照组，代表有显着差异；#p < 0. 05即相对于只处理H2O2的对照组，代表有显着差异；图6B为松杉灵芝萃取物F5-2对 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)表现的分析。其中-代表控制组(未添加萃取物进行处理)。
具体实施例方式本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。实施例1松杉灵芝酸酵液的制备1. 1松杉灵芝来源本实施例所用的松杉灵芝是得自寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，寄存 编号为CGMCC No. 2861，寄存日期为2009年1月8日，但本发明所述的松杉灵芝活性物质不 限于由此菌株所得。1. 2松杉灵芝培养将松杉灵芝接种于马铃薯葡萄糖洋菜培养基(Potato Dextrose Agar, PDA, Difco ,REF213400)的培养皿上，于20 35°C条件下培养5 10天后，将其切割成碎块后 接种入内含马铃薯葡萄糖培养液(Potato Dextrose Broth,PDB,Difco ,REF254920)的3L 凹槽摇瓶中，以20 35°C、100 200rpm振荡速率条件下培养5 10天。将3L凹槽摇瓶内培养完成的松杉灵芝种菌，于无菌操作台内转接入无菌接菌瓶 中，再利用蒸气灭菌后无菌管路转接入内含蛋白质水解物0. 1 Iwt. %、综合性氮源0.2 2wt. %、微量矿物质0.01 0. Iwt. %、无机盐类0.01 0. Iwt. %、综合性碳源2 IOwt. % 等营养源的50L酸酵种菌槽，起始酸酵pH4 6，以20 35°C、槽压0. 5 Ivvm(无菌空 气)、90 120rpm搅拌速率条件下培养3 7天。再于50L酸酵槽内种菌，利用蒸气灭菌2hr后无菌管路转接入内含蛋白质水解物 0.1 Iwt. %、综合性氮源0. 2 2wt. %、微量矿物质0.01 0. Iwt. %、无机盐类0.01 0. Iwt. %、综合性碳源2 IOwt. %等营养源的500L酸酵种菌槽，起始酸酵pH4 6，以20 35°C、槽压0. 5 Ivvm(无菌空气)、20 50rpm搅拌速率条件下培养3 7天。接着，于500L酸酵槽内种菌，利用蒸气灭菌2hr后无菌管路转接入内含蛋白质水 解物0. 1 Iwt. %、综合性氮源0. 2 2wt. %、微量矿物质0. 01 0. Iwt. %、无机盐类 0.01 0. Iwt. %、综合性碳源2 IOwt. %等营养源的5000L酸酵生产槽，起始酸酵pH4 6，以20 35°C、槽压0. 5 Ivvm(无菌空气)、20 60rpm搅拌速率条件下培养5 10 天。松杉灵芝菌酸酵液压榨将硅藻土(Celite)以5 IOwt. %添加量混入5000L酸 酵生产槽，与松杉灵芝菌丝体酸酵液搅拌混合均勻，再以无菌管路输送至板式压榨机进行 压榨作业。压榨完成的液体即为松杉灵芝酸酵滤液。实施例2松杉灵芝活性物质的制备与成分及生物活性分析2. 1 材料第一型血红素氧化酶(H0-1)的初级抗体(primary antibody)是购自Stressgen Biotechnologies公司(SB，圣地亚哥，加州，美国)。抗转录因子Nrf2的抗体则自Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz，加州，美国)购得。结合过氧化物酶(peroxidase) 的抗-兔子抗体与抗-小鼠抗体则自Amersham公司(Arlington Heights，伊利诺伊州，美 国)购得。其它所有试剂或材料可购自Sigma公司(St. Louis，密苏里州，美国)，或其它易 于取得的市售管道。2. 2 方法(1)内皮细胞培养牛主动脉内皮细胞(bovineaortic endothelial cells, BAECs)培养在 DMEM 培 养液(Dulbecco' s modified Eagle' s medium, Invitrogen公司)，并添加10%小牛血清 (fetal bovine serum，FBS，Invitrogen公司)及适当浓度的适用抗生素。细胞置于37°C、 5% CO2培养箱中进行培养至长满培养皿。清除培养液后加入无血清的DMEM培养液取代， 并于进行试验前，先将细胞置于培养箱12小时。(2)细胞溶解物(cell lysates)的准备内皮细胞的总溶解物(whole lysates)是依照常规方法取得总溶解物(whole lysates)的技术取得。为了制备细胞核萃取物，在冰冷的磷酸缓冲溶液(PBS)中以刮棒收 集内皮细胞。细胞团块随后以 IOmM HEPESU. 5mM MgCl2UOmM KClUmM DTT,0. 5mM PMSF 以 及 0.3% Nonidet P-40 溶解。再以含有 25% glycerol、20mM HEPES、0· 6M KCl U. 5mM MgCl2 以及0. 2mM EDTA的缓冲溶液萃取细胞核蛋白质。蛋白质浓度以protein assay DC系统 (Bio-Rad, Richmond，力口州，美国)决定的。(3)西方点墨法(Western blotting)请参考现有技术中的的西方点墨法的技术步骤，简述如下将总量IXlO6个细胞 在分解缓冲液(1% NP-40、0. 5% sodium deoxycholate、0. 1% SDS以及蛋白质水解酶抑制 剂混合物)中于冰上静置，再将得到的总细胞萃取物以10%电泳胶片(SDS-PAGE)分离。再 将蛋白质转印到硝化纤维膜(Millipore)上。加入第一型血红素氧化酶(H0-1)抗体于4°C 下缓和震荡。结果以ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech)利用化学发光反应来观测， 操作方法是根据厂商建议进行。(4)细胞存活能力测定(Cell Viability Assay)
细胞存活能力的评估是以Alarmar blue分析法测定，操作方法是根据厂商 (Serotec，牛津，英国)建议进行。该分析法是使用一种会从氧化态(蓝色)变成还原态 (红色)的氧化还原指示剂，来侦测活细胞内的代谢活性。红色的强度与细胞存活能力成正 比，且该强度由波长570nm与600nm吸光值的差异计算而来。该数值是以对照组的百分比 来表不。(5)过渡性转染作用(Transient transfection)及荧光素酶(Luciferase)活性 分析在转染的前一天，将IXlO6个内皮细胞置于培养皿内进行继代培养。到细胞约长 满时，以 Iipofectamine 将带有抗氧化反应片段(antioxidant response element, ARE)序 列的质体(plasmid)转染至细胞内，操作方法是根据厂商(GIBC0-BRL)建议进行。该些细 胞于各组中共转染(co-transfected)带有pSV-β-galactosidase基因的质体，以使转染 效率标准化。经过隔夜转染后，该细胞以不同浓度的F5-2萃取液处理，接着以磷酸缓冲溶 液(PBS)清洗，并以报告基因裂解缓冲液(importer lysis buffer,Promega)溶解细胞，离 心取上清液，加入 ONPG (ortho-nitrophenyl- β -D-galactopyranoside)混合静置 2 3 天 后，以酵素免疫分析仪(ELISA reader)读取420nm波长的值(A)。另外取上清液加入荧光 素酶活性分析试剂混合，混合后立即以单管冷光仪测定报告基因表现的Luciferase活性 数值(B)，两数值经计算后(B/A)再除以控制组数值，做长条图。(6)谷胱甘肽(GSH)含量分析以F5-2处理后的细胞，吸除培养液，以磷酸缓冲液(PBS)清洗，并以 monochlorobimane (MCB, 40 μ Μ)避光处理后，将细胞溶解。使用荧光分光仪(Shimadzu， Rf-5301PC)，以激发波长380nm及放射波长470nm來侦测GSH的含量相对值。(7)自松杉灵芝以生物分析导向(Bioassay-guided)分离活性物质F5-2松杉灵芝酸酵滤液依照图1流程图进行萃取。先将冻干的松杉灵芝酸酵滤液以水 溶解，并分别以10%、20%乙醇(体积百分比)萃取30 60分钟，离心以收集萃取液的沉 淀物，将沉淀物于40°C下真空干燥后，以去离子水溶解，标示为GTFE-2。GTFE-2 再以胶体过滤层析法(Gel filtration chromatography)将 GTFE-2 的成 分分离；使用 S印hacryl S-400 管柱(16mmX 100cm) (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire，美国)，以0. 05 0. 5M三羟甲基氨甲烧盐(Tris)缓冲溶液(pH 6. 8 7. 2)，以0. 5mL/min速度流洗。每4mL收集一管，收集第161 200毫升或第321 400分 钟的过滤液，命名为F5。F5再以丙酮萃取(于8 -20°C下，以最终浓度55wt. %丙酮萃取30 120分钟) 并离心，上清液于40°C真空下去除丙酮。所得到分离液命名为F5-2。F5-2接着进行化学分 析与生物活性分析。F5-2的特性描述(8)F5_2经PNGase F酵素醣解(Glycolysis)后，诱导第一型血红素氧化酶(H0-1) 表现能力分析取F5-2萃取物加入0.5M sodium phosphate (pH 7. 5)、50mM EDTA、0. 5% (w/v) SDS 以及5% (ν/ν) β-mercaptoethanol，以肽-N-糖苷酶F(P印tide-N-glycosidase F,PNGase F，BioLabs0Inc.，新英格兰)进行水解作用(glycolysis)。在37°C下以PNGase F水解12小时。取1. 6% F5-2对牛主动脉内皮细胞(BAECs)作用6小时，另外以煮沸的F5-2或经 PNGase F醣解过的F5-2处理细胞。收集细胞溶解物并以第一型血红素氧化酶(H0-1)抗体 或微管蛋白(Tubulin，作为样品内对照)进行西方转渍法分析。(9)统计分析所有试验的数据皆来自至少3次独立的试验，每次试验3重复。以变异数分析方法 (ANOVA)分析这些数据；接着，针对有显着的变异数分析，使用Tukey test (SPSS software package，芝加哥，伊利诺伊州，美国)以事后比较(post hoc Comparison)进行对照组与试 验组之间的成对比较(pair-wise comparison) 0以*p < 0. 05作为群组之间具有显着差异 的指标。在所有的图表中，数据是以平均值士标准差(mean士SD)显示。2. 3 结果(1)松杉灵芝活性物质F5-2诱导第一型血红素氧化酶(H0-1)表现F5-2以西方墨点法分析内皮细胞中第一型血红素氧化酶(H0-1)的表现量。小牛 动脉内皮细胞(BAECs)分别处理萃取物F5-2(l、l. 3、1. 6或2. 0% ) 6小时，以西方点墨法分 析细胞内H0-1蛋白质表现量，以微管蛋白为样品内对照，结果如图2所示，F5-2明显诱导 第一型血红素氧化酶(H0-1)的表现。(2)F5_2经PNGase F (醣蛋白分解酵素)酵素水解后，诱导第一型血色素氧化酶表 现能力减弱PNGase F酵素主要作用在具有N-glycan的醣蛋白或糖胜肽的GIcNAc和 asparagines键结位置上。将F5-2以PNGase F酵素水解后，进行细胞H0-1活性测定，结果 如图3所示以PNGase F处理过的F5-2的诱导活性减弱。因此，F5-2诱导内皮细胞表现第 一型血红素氧化酶(H0-1)的活性可能来自N-glycans。(3)F5-2 为胜肽醣(ρ印tidoglycan)类似物分析F5-2的总醣与蛋白质含量，以硫酸酚法测定总醣含量，以Lowry-Folin测定 蛋白质浓度，结果为总醣含量63. 7mg/mL，蛋白质含量0. 77mg/mL，总醣与蛋白质含量比 例为82比1。经分析F5-2含有16种不同的胺基酸，该些胺基酸的名称与浓度(mg/mL)分 别为天冬胺酸(Asp)O. 83、苏胺酸(Thr)O. 44、丝胺酸(Ser) 0. 41、麸胺酸(Glu) 1. 63、脯胺 酸(Pro)O. 54、甘胺酸(Gly)O. 46、丙胺酸(Ala)O. 70、胱胺酸(Cys)O. 17、缬胺酸(Val)O. 43、 甲硫胺酸(Met)O. 10、异白胺酸(Ile)O. 31、白胺酸(Leu)O. 44、酪胺酸(Tyr)O. 10、苯丙胺酸 (Phe)O. 26、离胺酸(Lys)O. 20、组胺酸(His)O. 36、精胺酸(Arg)O. 35。以三氟乙酸(TFA) 水解F5-2后，不同单醣的莫耳比是由气相层析仪测定。F5-2含有6种不同的单醣葡萄 糖(D-glucose)、甘露糖(D-mannose)、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)、阿拉 伯糖(L-arabinose)、半乳糖(D-galactose)、岩藻糖(L-fucose)；这些单醣的莫耳比为 12. 8 3. 2 5. 2 5. 2 1. 2 1。且 F5-2 在以 Coomassie blue 染剂分析的 SDS-PAGE 上显示具有蛋白质条带，在以Schiff’ s reagent染剂分析的SDS-PAGE上显示具有红色多 醣体条带。F5-2以胶体透析层析仪(gel permeation chromatography,GPC)分析F5-2分 子量为IlKDa等结果，说明F5-2为一胜肽醣(ρ印tidoglycan)类似物。(4) F5-2诱导第一型硫氧化还原蛋白酶(TrxR-I)的表现对内皮细胞处理F5-2后，可发现第一型血红素氧化酶(H0-1)表现增加。因此，进 一步分析F5-2是否也会诱导其它与转录因子Nrf2有关的基因的表现。如图4A所示，当内皮细胞以1. 3%,2. 0%,2. 3%浓度的F5-2处理时，第一型硫氧化还原蛋白酶(TrxR-I)(另 一个转录因子Nrf2相关基因)的蛋白表现也会增加。将细胞转染带有TrxR-luciferase的 构筑物(以习知的TrxR启动子连接报导基因Iuciferase于构筑物上)，待12小时后，被转 染的细胞以低血清培养基培养6小时，随后分别处理不同浓度(1.3、1.6、2.0%)的F5-2， 时间为12小时。之后将细胞融解并分析Iuciferase的活性；结果如图4B所示，硫氧化还 原蛋白酶(Thioredoxin reductases, TrxR)的启动子活性也会被F5_2的处理活化。(5) F5-2增加转录因子Nrf2转位(translocation)的速度并诱导抗氧化反应片段 启动子(ARE promoter)-Iuciferase报告基因的活性进一步检测在内皮细胞中，转录因子Nrf2本身是否会被F5-2所活化。结果如图 5A所示，与未处理的细胞相较，处理1.3%与1.6%F5-2的内皮细胞，其细胞核萃取物中有 较多的转录因子Nrf2累积，且于处理后30分钟时就可以观察到转录因子Nrf2的累积。习知转录因子Nrf2是一个调节抗氧化反应片段(ARE)以驱动基因表现的主要转 录因子。以转染抗氧化反应片段启动子(ARE promoter)-荧光素酶(Luciferase)报导基 因构筑物的内皮细胞，来分析F5-2对于ARE序列的专一性；结果如图5B所示，处理F5-2的 细胞显示其ARE-Iuciferase的活性增加。(6) F5-2对氧化逆境的保护效果由以上试验数据显示，F5-2是一种对第一型血红素氧化酶(H0-1)与第一型硫氧 化还原蛋白酶(TrxR-I)表现的有效诱导剂。因此，进一步测试F5-2是否对于内皮细胞具 有对抗氧化逆境的保护效果。内皮细胞先以1. 6% F5-2处理6小时，以促进转录因子Nrf2 相关基因的诱导。之后，将培养基以含有10%过氧化氢(H2O2)的培养基取代，处理2小时 后分析细胞存活能力。结果如图6A所示，未处理F5-2的内皮细胞曝露于过氧化氢环境下， 导致细胞存活率大幅下降；但预先对内皮细胞处理F5-2则会减弱此细胞毒性。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种抗氧化剂，且由谷胺酰半胱胺酸合成酶 (glutamylcysteine synthetase，一种依赖转录因子Nrf2的酵素)的诱导而增加。因此， 以F5-2预先处理后，经过不同时间后，再测试内皮细胞内GSH的浓度。结果如图6B所示，细 胞内GSH浓度在F5-2预先处理后6小时增加，经过12小时仍持续增加。该数据显示F5-2 所诱导的基因为细胞对抗氧化反应所必需。上列详细说明是针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限 制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案 的专利范围中。
权利要求
一种松杉灵芝活性物质，其特征是，它是将松杉灵芝经过下列步骤所产生的步骤1将松杉灵芝进行培养，以取得培养物；步骤2将松杉灵芝培养物经过乙醇萃取，得到乙醇萃取沉淀物；步骤3将步骤2所得乙醇萃取沉淀物以胶体过滤层析纯化，得到胶体过滤层析物；步骤4将步骤3所得胶体过滤层析物以丙酮萃取，得到的上清液即为松杉灵芝活性物质。
2.如权利要求1所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述松杉灵芝为寄存于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的松杉灵芝CGMCC No. 2861。
3.如权利要求1所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述培养步骤为在含有蛋白质 水解物0. 1 Iwt. %、综合性氮源0. 2 2wt. %、微量矿物质0. 01 0. Iwt. %、无机盐类 0.01 0. Iwt. %以及综合性碳源2 IOwt. %的培养液中，以20 35°C、槽压0. 5 lvvm、 20 IOOrpm搅拌速率条件下培养5 15天。
4.如权利要求1所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述乙醇萃取步骤为以最终浓 度10%乙醇萃取30 60分钟后，离心取得的上清液再以最终浓度20%乙醇萃取30 60 分钟。
5.如权利要求1所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述乙醇萃取步骤为以最终浓 度20%乙醇萃取30 60分钟。
6.如权利要求1所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述胶体过滤层析为将所述 乙醇萃取沉淀物注入胶体管柱，以盐类缓冲液为移动相，流速为0. 5毫升/分钟，收集第 161 200毫升或第321 400分钟的过滤液。
7.如权利要求6所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述胶体管柱为丙烯葡聚醣凝 胶S-400管柱。
8.如权利要求1所述的松杉灵芝活性物质，其特征是，所述丙酮萃取步骤为于 8 -20°C下，以最终浓度55wt. %丙酮萃取30 120分钟。
9.一种预防动脉粥状硬化的组成物，其特征是，包含如权利要求1所述的松杉灵芝活 性物质，以及适当的稀释剂、赋形剂或载体。
10.如权利要求9所述预防动脉粥状硬化的组成物，其特征是，具有诱导第一型血红素 氧化酶及第一型硫氧化还原蛋白酶的活性，以及促进转录因子Nrf2进入细胞核。
全文摘要
一种松杉灵芝活性物质，是将松杉灵芝经过下列步骤所产生者(1)将松杉灵芝以液体酦酵培养；(2)将所得酦酵滤液经过乙醇萃取，得到乙醇萃取沉淀物；(3)将所得乙醇萃取沉淀物以胶体过滤层析纯化，得到胶体过滤层析物；(4)将所得胶体过滤层析物以丙酮萃取，得到的上清液即为松杉灵芝活性物质。本发明还提供含有经上述步骤产生的松杉灵芝活性物质的组合物，该组合物可用以诱导或增加细胞核内转录因子Nrf2的量、提高抗氧化反应片段启动子的活性、硫氧化还原蛋白酶启动子的活性、可诱导第一型血红素氧化酶与第一型硫氧化还原蛋白酶表现，以达到细胞保护或预防动脉粥状硬化的效果。
文档编号A61P9/10GK101904875SQ20091020317
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者翁炳孙, 谢佳雯, 魏钰珊 申请人:生展生物科技股份有限公司