专利名称：：化合物2-甲基戊酸离子聚合体用于制备抗肿瘤药物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域的化合物，具体涉及一种已知的化合物2-甲基戊酸离子聚合体在制备抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
：目前医学界认为肿瘤的发生最终是由基因组水平的改变所引起的，即癌基因的激活和抑癌基因的功能丧失。基因失活的外遗传机制包括核小体组蛋白乙酰化、DNA甲基化和染色质高级结构中其他成分的修饰，这些修饰使染色体重塑，基因转录调节发生变化，基因表达异常，从而导致癌变。其中核小体组蛋白乙酰化是染色质重塑、基因异常表达的重要机制之一。核小体组蛋白的乙酰化水平是由组蛋白乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)与组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACI)活性的平衡控制着，这种平衡是受到严格控制的，平衡的打破成为产生某些癌症的直接诱因。抑制HDAC异常活动所致的转录异常成为肿瘤治疗的一个方向。化合物2_甲基戊酸离子聚合体(divalproexsodium)是丙戊酸与丙戊酸钠的多聚体化合物，具有独立的化学结构和物理化学特性，研究表明化合物2-甲基戊酸离子聚合体具有抑制组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)活性的作用，属于组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACI)。根据申请人所作的查新检索，目前还没有将化合物2-甲基戊酸离子聚合体用于治疗肿瘤疾病的相关报道。
发明内容本发明的目的在于，提供化合物2_甲基戊酸离子聚合体用于制备抗肿瘤药物的应用，经过申请人通过进一步研究发现，化合物2-甲基戊酸离子聚合体可以用于治疗白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肉瘤或黑色素瘤胆管癌、前列腺癌、等肿瘤疾病，能够作为制备抗肿瘤药物用于临床，可制成药剂学上可以接受的一切剂型，通过医学上可以接受的一切途径给药。具体实施例方式申请人:通过对化合物2-甲基戊酸离子聚合体进行体外抗肿瘤筛选，采用多个浓度，用多种人的肿瘤细胞株进行考察试验，结果显示，化合物2_甲基戊酸离子聚合体对白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肉瘤或黑色素瘤均具有一定的治疗作用。申请人:进一步通过对2_甲基戊酸离子聚合体进行小鼠体内多浓度，多种肿瘤细胞株的考察，结果显示2_甲基戊酸离子聚合体对白血病、非依赖性前列腺癌、人卵巢癌具有一定的治疗作用。将2-甲基戊酸离子聚合体制成药剂学上可以接受的一切剂型，这些剂型均可以3通过医学上可以接受的一切途径给药。以下是发明人给出的具体实验，证明了化合物2_甲基戊酸离子聚合体对具有肿瘤特征的疾病有一定的治疗作用或辅助治疗作用，能够作为制备抗肿瘤药物用于临床。—、化合物2-甲基戊酸离子聚合体体外抗肿瘤细胞的研究每孔4Xl(f个细胞接种于96孔板。37度、5%0)2条件下培养2处后加入化合物2-甲基戊酸离子聚合体(购自美国Sigma-Aldrich集团公司)，设计药物终浓度分别为0(对照组)、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L，每个浓度梯度设6个复孔同时设仅加入完全培养液的空白对照，培养72h后每孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT溶液继续培养4h，然后加入100ul的DMS0，震荡混匀30min后酶标仪检测(A492nm)，根据A值计算生长抑制率(％)=[(l-药物组A492-空白对照A492)/(对照组A492-空白对照A492)]X100%。表1不同浓度2-甲基戊酸离子聚合体作用于不同肿瘤细胞生长抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>结果表明，化合物2_甲基戊酸离子聚合体对于卵巢癌细胞SK0V3、肝癌细胞H印G2、乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、胃癌细胞BGC-823、结肠癌细胞HT-29、胰腺癌细胞AsPc、大肠癌细胞PA319、食管癌细胞CaEs-17、宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞EJ、肾癌细胞ketr-3、肉瘤细胞0S-732、黑色素瘤细胞A375均有较强的抑制作用，细胞生长被明显抑制，与对照组比较，差异有统计学意义(p<0.01)，并呈剂量依赖趋势。二、化合物2-甲基戊酸离子聚合体在动物体内抗肿瘤作用的研究化合物2-甲基戊酸离子聚合体具有内在的抑制组蛋白脱乙酰化酶活性，体外实验表明，其具有抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC3生长的作用，而体内作用情况尚不明了，申请人以裸鼠肿瘤模型进一步探讨化合物2_甲基戊酸离子聚合体对肿瘤生长的抑制作用。建立前列腺癌PC3细胞裸鼠移植模型，探讨化合物2-甲基戊酸离子聚合体长期给药抑制人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞裸鼠移植瘤生长的效应。实验组分别ip含400mg/kg和600mg/kg的2-甲基戊酸离子聚合体溶液，对照组给予生理盐水，给药4周，每隔3d测量肿瘤体积1次。取裸鼠移植瘤组织，免疫组化检测p21WAF/CIP和Ki67，Westernblot检测p21WAF/CIP和乙酰化H3(Ac-H3)蛋白的表达，Tunnel法检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明，对照组肿瘤体积大于实验组，肿瘤生长抑制率53.55%(400mg/kg)和78.49%(600mg/kg)。实验组p21WAF/CIP表达强于对照组(分别P<0.05，P<0.01)，而Ki67表达弱于对照组。实验组Ac-H3表达增加(分别P<0.05，P<0.01)。实验组平均每个视野中凋亡细胞数高于对照组(P<0.05，P<0.01)。1、材料与方法1.1细胞株及实验材料前列腺癌PC3细胞系，购自上海细胞生物研究所；Balb/c裸鼠，购自中国医学科学院实验动物中心；化合物2-甲基戊酸离子聚合体，购自美国Sigma-Aldrich集团公司；单克隆鼠抗人p21WAF/CIP抗体及单克隆兔抗人Ki67、H3抗体，购自美国CST公司，T皿nel凋亡检测试剂盒，购自Roche公司。1.2.1动物模型的建立将PC3细胞置于以含10X胎牛血清的Ham/F12培养液中，371\5%(A孵箱培养，收集细胞生长状态良好的细胞。每只裸鼠皮下注射细胞数量在1X108左右。随机分为实验组和对照组，每组10只裸鼠.1.2.2给药及裸鼠处理待肿瘤长至0.5cm时开始给药，将2_甲基戊酸离子聚合体配成400mg/kg和600mg/kg的水溶液，ip给药，对照组给与同体积的生理盐水。每3d测量肿瘤体积(分别用a、b、c表示3个径线)1次至试验结束，每周颈总静脉取血0.2mL，监测血药浓度、肝功能、血常规1次。给药4周后脱颈处死，将肿瘤组织分为两部分，一部分投入液氮中保存，一部分用多聚甲醛固定。1.3T皿nel法检测细胞凋亡石蜡切片脱蜡至水，将切片浸入蛋白酶K溶液中，37t:条件下孵育30分钟，加入50微升Tu皿el反应液(阴性对照只加标记液)，37。C避光孵育60分钟，PBS洗3次，每次5分钟，荧光显微镜下观察、拍照，统计学处理。1.4免疫组化检测p21WAF/CIP和Ki67:将多聚甲醛固定标本做石蜡包埋，切片，常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇溶液去除内源性过氧化物酶，修复抗原；分别滴加稀释的p21WAF/CIP和Ki67—抗(1:100度)，温育30分钟，4。C过夜。滴加生物素化1:100稀释HRP标记二抗，37t:温育45分钟；滴加SABC复合物，DAB显色镜下观察，至目的组织出现棕黄色阳性颗粒而周围组织无非特异显色；苏木素复染细胞核盐酸乙醇分化，自来水返蓝；脱水、透明，中性树胶封片。用已知的阳性片作阳性对照，PBS替一抗作阴性对照。显微镜下观察拍照，每组取5张切片，经图像分析仪测量肿瘤细胞阳性细胞的光密度(0D)。1.5统计学处理采用SPSS12.0软件，肿瘤平均体积以x±s表示，肿瘤抑制率％=(l一实验组瘤平均体积/对照组瘤平均体积)X100X，进行两因素方差分析。将实验组和对照组的平均光密度和标准差作t验。2、结果2.1化合物2-甲基戊酸离子聚合体对于裸鼠荷瘤生长的影响PC3细胞裸鼠腹腔注射后l周肉眼可见成瘤，12d时瘤体最大径线均超过0.6cm，实验开始后实验组与对照组瘤体体积按照以下公式计算aXbXCX3.14/6，结果见表1。4周实验结束时处死动物。研究结果表明，用药l周后实验组与对照组体积即出现明显差异(P<0.05)，4周肿瘤抑制率53.55%(400mg/kg)和78.49%(600mg/kg)(均P<0.01)。未发现明显血液学指标变化。2.2化合物2-甲基戊酸离子聚合体对PC3肿瘤组织p21WAF/CIP和Ac_H3蛋白表达的影响化合物2-甲基戊酸离子聚合体具有内在的抑制组蛋白脱乙酰化酶活性可以调节一系列基因的表达，WesternBlotting检测结果表明，实验组p21WAF/CIP表达明显强于对照组，比值分别从O.04±0.Ol禾PO.07±0.18增加到0.70±0.22禾P0.98±0.25(P<0.01，P<0.05)。2.3Tunnel法检测细胞凋亡的结果显示实验组(400mg/kg)(600mg/kg)平均每个视野中凋亡细胞数高于对照组(均P<0.01)，凋亡指数明显高于对照组，说明2-甲基戊酸离子聚合体可以诱导肿瘤细胞凋亡(P<0.05，P<0.01)。三、化合物2-甲基戊酸离子聚合体在动物体内抗肿瘤作用的研究化合物2-甲基戊酸离子聚合体具有内在的抑制组蛋白脱乙酰化酶活性，体外实验表明，其具有抑制雄卵巢癌SK0V3细胞生长的作用，而体内作用情况尚不明了，申请人进一步探讨化合物2-甲基戊酸离子聚合体对裸鼠肿瘤模型生长的抑制作用。建立人卵巢癌31((^3细胞裸鼠转移瘤模型，随机分4组，每组8只，对照组、2-甲基戊酸离子聚合体组(400mg/kg)，(600mg/kg))、卡铂组(3mg/kg)。观察并记录各组裸鼠及皮下移植肿瘤的生长情况，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤体积和肿瘤生长抑制率。测肿瘤组织细胞凋亡率、c-myc基因蛋白的表达、CA-125含量，检测裸鼠肝脏、脑组织细胞凋亡率。结果2_甲基戊酸离子聚合体能够明显抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的生长，并能诱导肿瘤细胞凋亡，抑制原癌基因c-myc的表达，降低肿瘤组织中CA-125含量，表明2-甲基戊酸离子聚合体有诱导SK0V3肿瘤细胞向良性方向分化的作用。1.材料与方法1.1细胞株及实验材料人卵巢癌SK0V3细胞系，西安交通大学第一附属医院分离；Balb/c裸鼠，购自中国医学科学院实验动物中心；化合物2-甲基戊酸离子聚合体，购自美国Sigma-Aldrich集团公司；单克隆抗体，购自美国Zymed公司；1.2动物模型及分组制备卵巢癌细胞株SK0V3单细胞悬液，调整细胞浓度至1X10个/mL，接种于实验裸鼠右侧腋窝皮下，每只鼠皮下接种细胞数约2X108个，出现直径约2mm大的皮下移植瘤后开始治疗实验。将合格模型裸鼠随机分为4组，每组8只，每日腹腔内注射O.2ml，分别为对照组生理盐水、实验组为含400mg/kg和600mg/kg的2-甲基戊酸离子聚合体生理盐水溶液，阳性对照组为卡铂生理盐水溶液每周注射一次。给药周期为4周。1.2.3动物生长检测每日观察裸鼠的饮食、观察肿瘤形成及活动状况；每周测量裸鼠体重，进行药物毒性评价，即末体重(FBW)/初体重(IBM)>0.8为无毒性反应，<0.8为有毒性反应。每3d测量肿瘤体积(分别用a、b、c表示3个径线)1次至试验结束，计算肿瘤体积和肿瘤抑瘤率。1.2.4测定肿瘤细胞凋亡和肝、脑组织细胞凋亡各组织切碎，置质量分数为75%的冷乙醇固定过夜，制成组织混悬液。细胞DNA含量测定染色，制细胞悬液，用10%鸡红细胞液作内参标准，与样品同步染色，加碘化丙啶lml，染色30min，过滤，检测。1.2.5c-myc蛋白、CA-125测定取肿瘤细胞悬液1X105个/ml，加入鼠抗人单克隆抗体c-myc、CA-125各0.lml，温育30min，加PBS10ml洗涤，加二抗工作液，避光温育，加入PBS等，按照Morkve方法确定c-myc、CA-125的相对含量。2.结果2.1成瘤及生长情况裸鼠皮下移植卵巢癌细胞SK0V3后，约6_8d潜伏期，肿瘤呈中央膨胀性逐渐增大，质地坚硬，活动状，不黏连，个别移植瘤出现结痂坏死，至实验结束动物均成活。比较实验期间各组移植瘤生长体积，对照组生长体积明显大于治疗组体积(P<0.01)，其中两组2-甲基戊酸离子聚合体呈现量效关系，详见表1。表1:化合物2-甲基戊酸离子聚合体对裸鼠皮下移植瘤生长的影响(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与对照组相比，*P<0.05，料P<0.012.2肿瘤细胞凋亡率情况各组SK0V3细胞裸鼠转移瘤凋亡情况显示，对照组凋亡率最低，与各治疗组比较均有显著差异，其中两组2_甲基戊酸离子聚合体呈现量效关系，详见表2。表2化合物2-甲基戊酸离子聚合体对裸鼠皮下移植瘤凋亡率的影响(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P值为与对照组相比2.3化合物2-甲基戊酸离子聚合体对肿瘤组织中蛋白表达的影响通过对c-myc和CA_125蛋白表达的检测，显示各治疗组经治疗后，肿瘤组织中c-myc和CA-125蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01)，其中两组2-甲基戊酸离子聚合体呈现量效关系，详见表3。表312-甲基戊酸离子聚合体对裸鼠皮下移植瘤凋亡率的影响(n=8)组别c-myc率00CA-125生理盐水1.021±0.0141.019±0.0272-甲基戊酸离子聚合体组(400mg/kg)0.727±0.026*0.761±0.019*2-甲基戊酸离子聚合体组(600mg/kg)0.597±0.028*0.642±0.025*卡铂(3mg/Kg)0.541±0.0315**0.638±0.0360**与对照组相比，*P<0.05，**P<0.018权利要求化合物2-甲基戊酸离子聚合体用于制备抗肿瘤药物的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包括用于治疗白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肉瘤或黑色素瘤或前列腺癌的药物。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物制成药剂学上可以接受的一切剂型。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物通过医学上可以接受的一切途径给药。全文摘要本发明公开了化合物2-甲基戊酸离子聚合体用于制备抗肿瘤药物的应用，证明了化合物2-甲基戊酸离子聚合体对具有肿瘤特征的疾病有一定的治疗作用或辅助治疗作用，能够作为制备抗肿瘤药物用于临床，抗肿瘤药物包括治疗人的白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、肉瘤、黑色素瘤或前列腺癌等的药物。可以制成药剂学上可以接受的一切剂型，并可以通过医学上可以接受的一切途径给药。文档编号A61K31/20GK101766589SQ20091021955公开日2010年7月7日申请日期2009年12月17日优先权日2009年12月17日发明者卜昕,毛幼桦,翟小刚申请人:陕西天森药物研究开发有限公司