缀合的因子Ⅷ分子的制作方法

专利名称：缀合的因子Ⅷ分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及缀合的凝固因子VIII分子。具体地，本发明涉及具有改变的循环半衰 期的缀合的因子VIII分子。
背景技术：
A型血友病是由凝固因子VIII (FVIII)活性的缺乏或功能障碍造成的一种遗传性 出血障碍。临床表现不是在初级止血一正常形成血凝块一而是由于缺乏次级凝血酶形成所 导致的凝块不稳定。通过静脉内注射从血液分离的或重组生产的凝固因子FVIII，治疗该疾 病。流行的治疗推荐正在从传统的在要求时(on-demand)治疗转向预防。内源的 FVIII的循环半衰期是12-14小时，因而每周需要进行几次预防性治疗，以使患者得到实际 上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和年轻人，静脉内施用伴有显著的不便和/或疼 痛。因而本领域需要新颖的具有因子VIII活性的因子VIII产品，它们优选地在结构上是 同质的，优选地是安全的，且优选地具有显著延长的循环半衰期，以减少每周施用因子VIII 的次数。此外，本领域需要相对简单的得到和生产这种分子的方法。本领域已知，为了延长循环半衰期，向因子VIII加入聚乙二醇(PEGylation)。但 是，这是得到具有同质结构以及显著提高的循环半衰期的安全产品的障碍。可得到的生产 缀合的因子VIII分子的方法经常是费力的，和/或倾向于导致低得率和/或在结构上不同 质的产品。在W02008011633中已经暗示了人工改造的0-联糖基化位点用于得到治疗蛋 白的应用，所述治疗蛋白具有延长的治疗蛋白循环半衰期，但是，其中没有公开缀合的因子 VIII分子。发明概述在第一个方面，本发明涉及具有改变的循环半衰期的B结构域截短的因子VIII分 子，所述分子在截短的B结构域中通过0-联寡糖与亲水聚合物共价缀合，其中因子VIII激 活导致共价缀合的侧基的去除。在其它方面，本发明另外涉及用于得到这种分子的方法，这种分子的用途和包含 这种分子的药物组合物。因而，提供了具有改变的循环半衰期的缀合的因子VIII分子，其中缀合的侧基 (例如亲水聚合物)在激活后去除。根据本发明的分子优选地在结构上一至少在亲水聚合 物在截短的B结构域中的位置这方面一是同质的，且优选地具有有利的安全概况。同样， 本文另外提供了相对简单的用于得到这种分子的方法。优选地，根据本发明的激活的因子 VIII分子类似于内源激活的因子VIII。发明详述定义因子VIII分子FVIII/因子VIII是一种主要由肝细胞产生的大的、复杂的糖 蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，且含有几个根据同源性定义的不同结构 域。存在3个A-结构域，1个独特的B-结构域和2个C-结构域。结构域次序可以列成NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆中作为在B-A3边界处分开的两条链进行循环。 链通过二价金属离子结合进行连接。A1-A2-B链称作重链(HC)，而A3-C1-C2称作轻链(LC)。内源的因子VIII分子作为一群具有各种大小的B结构域的分子在体内循环。在 体内可能发生的是，B结构域的逐渐酶促去除，从而产生一群具有各种大小的B结构域的分 子。一般认为，随同凝血酶激活发生在位置740处的切割，由此去除B-结构域的最后一部 分。但是，不能排除的是，其中例如在位置740的切割位点已经受损的因子VIII变体可能 是有活性的。本文使用的“因子VIII”或“FVIII”是指一种人血浆糖蛋白，它是内在的凝固途径 的一个成员，且是血液凝固所必需的。“天然的FVIII”是在SEQ ID NO. 1 (氨基酸1-2332) 中所示的全长人FVIII分子。B-结构域跨SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648。SEQ ID NO 1 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGP MASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAA SARAffPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYffHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKK HPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLY GEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTR YYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEF QASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENP GLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIP ENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRP QLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQ LDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKV SISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTS SKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEK NKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFM KNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNT SQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSH SIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTCD QREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGA IKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHA IAAINEGQNKPEIEVTffAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQ SPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYI RAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSD VDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYR FHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAG IWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSffl KVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARY
4IRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNN PKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLL TRYLRlHPQSffVHQIALRMEVLGCEAQDLY根据本发明的因子VIII分子是B结构域截短的因子FVIII分子，其中剩余的结构 域对应着SEQ ID NO. 1中氨基酸编号1-740和1649-2332所述的序列。因而断定根据本发 明的分子是在转化的宿主细胞(优选哺乳动物起源)中生产的重组分子。但是，剩余的结 构域(即3个A-结构域和2个C-结构域)可以稍微(例如约1%、2%、3%、4%或5% ) 不同于在SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)。具体地，可取 的是将氨基酸修饰(取代、缺失等)引入剩余的结构域，例如以修饰因子VIII与各种其它 组分(例如vW因子、LPR、各种受体、其它凝固因子、细胞表面等)的结合能力。此外，似乎 可取的是根据本发明的因子VIII分子在例如截短的B-结构域中和/或在分子的一个或多 个其它结构域中包含其它翻译后修饰。这些其它的翻译后修饰可以是与根据本发明的因子 VIII分子缀合的各种分子的形式，例如聚合物、肽化合物、脂肪酸衍生的化合物等。无论根据本发明的因子VIII分子是否在B结构域之外被修饰、是否具有其它翻译 后修饰，它们都具有因子VIII活性，即以在功能上类似于或等同于FVIII的方式在凝固级 联中起作用，通过与激活的血小板上的FIXa之间的相互作用诱导FXa的形成，及支持血凝 块的形成的能力。通过本领域众所周知的技术，例如凝块分析、内源凝血酶潜力分析等，可 以在体外评估活性。根据本发明的因子VIII分子具有的FVIII活性是天然人FVIII的至 少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至 少90%和100%或甚至超过100%。B结构域因子VIII中的B-结构域跨SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648。B-结构 域在几个不同的位点切割，从而产生循环血浆FVIII分子的大异质性。重度糖基化的B-结 构域的确切功能是未知的。已知的是，该结构域对于凝固级联中的FVIII活性而言是可有 可无的。这种明显的功能缺失得到下述事实的支持，即B结构域缺失的/截短的FVIII似 乎具有与全长天然FVIII相同的体内性质。也就是说，有迹象表明，B-结构域可以减少与 细胞膜的结合，至少在无血清的条件下。B结构域截短的/缺失的因子VIII分子内源的全长FVIII作为单链前体分子来 合成。在分泌之前，前体被切割成重链和轻链。可以从2种不同的策略生产重组的B结构 域缺失的FVIII。单独地合成没有B-结构域的重链和轻链，作为2条不同的多肽链(双链 策略)，或者合成B-结构域缺失的FVIII，作为单条前体多肽链(单链策略)，其以与全长 FVIII前体相同的方式切割成重链和轻链。在B结构域缺失的FVIII前体多肽中，重链和轻链部分正常被接头分开。为了使在 B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性的表位的风险最小化，接头的序列优选地源自FVIII B-结构域。所述接头必须包含蛋白酶的识别位点，其将B结构域缺失的FVIII前体多肽分 开成重链和轻链。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648构成该识别位点。在B 结构域缺失的FVIII激活后导致接头去除的凝血酶位点位于重链中。因而，接头的大小和 氨基酸序列不太可能影响由凝血酶激活将它从剩余的FVIII分子去除。B结构域的缺失对 于FVIII的生产是有利的。尽管如此，在接头中可以包含B结构域部分，而不降低生产力。 B结构域对生产力的消极作用尚未归因于B结构域的任意特定大小或序列。
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截短的B-结构域可以含有几个0-糖基化位点。但是，根据优选的实施方案，该分 子在截短的B-结构域中包含仅1个、或2个、3个或4个0-联寡糖。根据优选的实施方案，截短的B结构域包含仅1个潜在的0-糖基化位点，且亲水 聚合物共价地缀合至该0-糖基化位点。根据本发明的B-结构域截短的分子中的0-联寡糖可以附着至0-糖基化位点， 后者通过重组方式和/或通过截短B-结构域来暴露“隐藏的” 0-糖基化位点而人工生成。 在两种情况下，可以如下制备这种分子设计B-结构域截短的因子VIII氨基酸序列，且随 后对该氨基酸序列进行预测截短的B-结构域中出现0-糖基化位点的概率的计算机分析。 可以在合适的宿主细胞中合成具有相对较高的具备这种糖基化位点的概率的分子，随后分 析糖基化模式，再选择在截短的B-结构域中具有0-联糖基化的分子。适用于生产重组因 子VIII蛋白的宿主细胞优选地具有哺乳动物起源，以确保该分子被糖基化。在实践本发明 时，细胞是哺乳动物细胞，更优选确立的哺乳动物细胞系，包括、但不限于，CH0(例如，ATCC CCL 61)、C0S-1(例如，ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)和 HEK293 (例如，ATCC CRL 1573 ； Graham 等人，J. Gen. Virol. 36 :59-72，1977)细胞系。优选的 BHK 细胞系是 tk_tsl3 BHK 细 胞系(Waechter 和 Baserga，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 1106-1110，1982)，在下文中称 作BHK 570细胞。BHK 570细胞系可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr.，Rockville, MD 20852)在 ATCC 登记号 CRL 10314 下得 到。tk-tsl3 BHK细胞系也可以从ATCC在登记号CRL 1632下得到。优选的CHO细胞系是 可从ATCC在登记号CC161下得到的CHO Kl细胞系以及细胞系CH0-DXB11和CH0-DG44。其它合适的细胞系包括、但不限于，大鼠H印1(大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、大 鼠 H印 II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)、DUKX 细胞(CH0 细胞系)(Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216-4220,1980) (DUKX 细胞也称作 DXBll 细胞)和 DG44(CH0 细胞系)(Cell, 33 405，1983，和 Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555,1986)。也有用的是 3T3 细 胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合体。在有些实施方案中，细胞可以是突 变的或重组的细胞，例如，与它们的来源细胞类型相比，表达在质量上或在数量上不同的酶 谱的细胞，所述酶催化蛋白的翻译后修饰(例如，糖基化酶例如糖基转移酶和/或糖苷酶， 或加工酶例如前肽)。DUKX细胞(CH0细胞系)是特尤其优选的。目前优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨 髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。因而，本发明的发明人已经表明，通过截短B-结构域，可能激活因子VIII B-结构 域中“隐藏的” 0-糖基化位点。虽然不希望受任何理论约束，但该现象可以归因于截短的 B-结构域中的分子的三级结构被改变。“隐藏的” 0-糖基化位点因而“被迫可进行”截短 的B-结构域中的糖基化。该方案的一个优点是，提供就例如变应原性而论具有有利的安全 性的重组分子。另一个优点是，它可以代表更简单的获取在B-结构域中具有0-联寡糖的 B-结构域截短的变体的方案，这是由于B-结构域中糖基化位点的固有丰度，因为以前已经 证实难以在重组蛋白中工程改造人工的0-糖基化位点。野生型FVIII分子中B结构域的长度是约907个氨基酸。根据本发明的分子中的 截短的B结构域的长度可以是约10个氨基酸至约700个氨基酸，例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、 15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40个氨基酸或20-30个氨基酸。截 短的B-结构域可以包含重链和/或轻链的片段和/或在野生型FVIII分子中不存在的人 工引入的序列。术语“B-结构域截短的”和“B-结构域缺失的”可以在本文中互换使用。改变的循环半衰期根据本发明的分子具有与野牛型因子VIII分子相比改变的 循环半衰期，优选增加的循环半衰期。循环半衰期优选地增加了至少10%、优选至少15%、 优选至少20%、优选至少25%、优选至少30%、优选至少35%、优选至少40%、优选至少 45%、优选至少50%、优选至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选 至少75 %、优选至少80 %、优选至少85 %、优选至少90 %、优选至少95 %、优选至少100 %、 更优选至少125%、更优选至少150%、更优选至少175%、更优选至少200%和最优选至少 250%或300%。甚至更优选地，这种分子具有与野生型FVIII的循环半衰期相比增加了至 少400%、500%、600%或甚至700%的循环半衰期。亲水聚合物根据本发明的修饰某闭/亲水聚合物优选地是非天然存在的。在一 个实例中，“非天然存在的修饰基团”是聚合的修饰基团，其中至少一个聚合部分是非天然 存在的。在另一个实例中，非天然存在的修饰基团是修饰的碳水化合物。选择由修饰基团官 能化的部位，从而使它不会阻止“修饰的糖”酶促地添加到多肽上。“修饰的糖”也指任意的 糖基模仿部分，其被修饰基团官能化，且是天然的或修饰的酶(例如糖基转移酶)的底物。添加到多肽上的聚合的修饰基团可以改变这种多肽的性质，例如，它的生物利用 率、生物活性或它在体内的半衰期。根据本发明的示例性的聚合物包括线性的或分支的水 溶性的聚合物，且可以包括一个或多个独立地选择的聚合部分，例如聚(亚烷基二醇)和其 衍生物。根据本发明的聚合的修饰基团可以包括水溶性的聚合物，例如聚(乙二醇)和其 衍生物(PEG，m-PEG)、聚(丙二醇)和其衍生物(PPG, m-PPG)等。术语“水溶性的”是指在水中具有一些可检测程度的溶解度的部分。检测和/或 定量水溶性的方法是本领域众所周知的。根据本发明的示例性的水溶性的聚合物包括肽、 糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有混合的序列，且由单个氨基酸组成，例如， 聚(赖氨酸)。示例性的多糖是聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如， m-PEG。聚(乙烯亚胺)是示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。根据本发明的水溶性的聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即PEG)。与本 发明有关的术语PEG包括任意形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能的PEG、多臂的 PEG、叉状的(forked)PEG、分支的PEG、悬垂的(pendent)PEG(即具有一个或多个从聚合物 主链悬垂的官能团的PEG或有关的聚合物)或具有可降解的键的PEG。聚合物主链可以是线性的或分支的。分支的聚合物主链是本领域普遍已知的。一 般地，分支的聚合物具有中心分支核心部分和连接到该中心分支核心的许多线性的聚合物 链。PEG通常以分支形式使用，其可以通过将环氧乙烷添加到各种多元醇(例如丙三醇、季 戊四醇和山梨糖醇)上来制备。中心分支部分也可以源自几个氨基酸，例如赖氨酸或半胱 氨酸。在一个实例中，分支的聚(乙二醇)可以表示为通式R(_PEG-0H)m，其中R代表核心 部分，例如丙三醇或季戊四醇，且m代表臂的数目。多臂的PEG分子，例如在本文中整体并 入作为参考的美国专利号5，932，462中所述的那些，也可以用作聚合物主链，图8显示了在本发明的实施方案中使用的代表性分支的PEG聚合物，在本文中称
7作“SA-丙三醇-PEG”。图8A显示了 CMP-SA-丙三醇-PEG或与聚糖或多肽氨基酸连接的 SA-丙三醇-PEG的示例性的SA-丙三醇-PEG组分。图8B显示了通过Gal残基连接至聚 糖或多肽上的SA-丙三醇-PEG部分。图8C显示了通过Gal-GalNAc残基连接至聚糖或多 肽上的SA-丙三醇-PEG部分。图8D显示了通过Gal-GalNAc部分连接至多肽氨基酸上的 SA-丙三醇-PEG部分。在各种实施方案中，AA是苏氨酸或丝氨酸。在示例性的实施方案中， 通过缺失FVIII多肽的B-结构域，将AA转变成O-联糖基化位点。下文W032]段落中关于 聚合物分子量的讨论，通常也适用于在图8中所示的分支的PEG。在图8中，下标“η”代表 任意整数，其提供具有在下面W032]段落中讨论的所需分子量的线性的(和因而分支的) m-PEG。在各种实施方案中，选择“n”，从而使得线性的m_PEG部分是约20KDa至约40KDa， 例如，约20KDa、约30KDa或约40KDa。与这些m_PEG分子量对应的整数等于约400 (例如约 455)至约900 (例如约910)。因此，选择“n”，以提供约40KDa至约80KDa、例如约40KDa、约 50KDa、约 60KDa、约 70KDa 或约 80KDa 的分支的 PEG。许多其它的聚合物也适用于本发明。非肽的和水溶性的聚合物主链在本发明 中特别有用。合适的聚合物的实例包括、但不限于，其它聚(亚烷基二醇)例如聚(丙 二醇)(〃 PPG")、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化的多元醇)，聚(烯醇)， 聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)，聚(α-羟酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈 (polyphosphazene)，聚”恶唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，例如在本文中整体并入作为参考的美 国专利号5，629，384中所述的那些，以及它们的共聚物、三元共聚物和混合物。
尽管聚合物主链的每条链的分子量可以变化，但它通常是在从约IOODa至 约160，OOODa、例如从约5，OOODa至约100，OOODa的范围内。更具体地，根据本发明的每个缀 合的亲水聚合物的大小可以从约500Da至约80，OOODa变化，例如约IOOODa至约80，OOODa ； 约 2000Da 至约 70，OOODa ；约 5000 至约 70，OOODa ；约 5000 至约 60，OOODa ；约 10，000 至约 70，OOODa ；约 20，000 至约 60，OOODa ；约 30，000 至约 60，OOODa ；约 30，000 至约 50，OOODa ； 或约30，000至约40，OOODa。应当理解，这些大小代表估计值，而不是精确测量值。根据 优选的实施方案，根据本发明的分子缀合亲水聚合物的异质群体，例如大小为例如10，000、 40，000 或 80，OOODa士 约 5000、约 4000、约 3000、约 2000 或约 IOOODa 的 PEG。0-联寡糖通过生产蛋白的细胞，使N-聚糖和0-聚糖附着到蛋白上。随着新生 的蛋白从核糖体转运到内质网，细胞的N-糖基化机构识别和糖基化氨基酸链中的N-糖基 化信号(N-X-S/T 基序)(Kiely 等人 1976 ；Glabe 等人 1980)。同样地，0-聚糖附着氨基酸链中的特定0-糖基化位点，但是触发0-糖基化的基 序比N-糖基化信号的异质性高得多，我们仍然不能预测氨基酸序列中的0-糖基化位点 (Julenius等人2004)。人工的0-糖基化位点的构建因而伴有一些不确定性。一般的假设 是，天然FVIII分子不含有任何0-糖基化位点，且技术人员因此预期，在实践本发明方面， 必须构建至少一个人工的0-糖基化位点，并插入B结构域。截短的因子VIII B结构域中的0-联寡糖因而可以共价地连接天然存在的0-联 糖基化序列或已经通过重组技术人工构建的0-联糖基化序列。根据本发明的优选的实施方案，0-联寡糖连接至天然存在的0-联糖基化序列， 后者在野生型因子VIII分子中不暴露于糖基化，但是作为B结构域截短的结果，变得可进 行0-糖基化。其实例显示在实施例和SEQ ID NO 2中(截短的B-结构域对应着氨基酸742-763)。即使B-结构域在稍微不同的位置被截短，S卩如果截短的B结构域与SEQ ID NO 2 相比稍微更短(例如比SEQ ID NO 2短1、2、3、4或5个氨基酸)或更长(例如长1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 个氨基酸)，SEQ ID NO 2 中的“隐藏的”0-糖 基化位点似乎也变成糖基化的。该通过截短B-结构域来激活“隐藏的” 0-糖基化位点、而 不是生成人工0-糖基化位点的方案，具有生成具有有利的安全概况(即减少的变应原性 等)的分子的优点。通过以不同方式截短分子，同样可以激活因子VIII B-结构域中的其 它0-糖基化位点。
0-联寡糖的糖-PEG化(Glyco-PEGylation)通过在牛物合成的相对早期，添加唾 液酸残基，可以修饰和终止0-聚糖的生物合成。某些唾液酸转移酶在核心1 GalT作用后能 作用于GalNAc α -Ser/Thr或早期0_聚糖核心亚型。术语T抗原与Gal β l_3GalNAc α -Ser/ Thr 二糖的存在有关。这些结构的产生涉及糖基转移酶之间竞争相同的底物，且因而高尔基 体内糖基转移酶的表达水平和亚细胞分布决定了 0-聚糖生物合成的结构结果和多样化。 如

图1所示，仅Gal β l-3GalNAc α -Ser/Thr 二糖顺从糖PEG化。但是，通过用唾液酸酶或核心1 GalT或它们的组合处理蛋白，可以极大地增强该 结构的可利用量。作为糖PEG化过程的结果，通过与靶蛋白的Gal β l-3GalNAc α -Ser/Thr 二糖的α 3键，唾液酸PEG添加到天然结构上(图1)。其它亲水聚合物也可以附着到0-联寡糖上。通过0-聚糖将其它亲水聚合物酶 促地缀合到FVIII上的基本要求是，如在W003031464中公开的通过游离氨基使它们与甘 氨酰基_唾液酸衍生物偶联的能力。这可以通过本领域技术人员已知的许多种偶联化学 来实现。激活的生物相容的聚合物的实例包括聚环氧烷，例如、但不限于，聚乙二醇(PEG)、 2-(甲基丙烯酰基氧)乙基磷酸胆碱(mPC)聚合物(如W003062290所述)、葡聚糖、多聚乙 酰神经氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸或特定肽序列的聚合物、生物素衍生 物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-马来酐共聚物、苯乙烯_苹果酸酐 共聚物、聚v恶唑啉、聚丙烯酰吗啉、肝素、清蛋白、纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉例如羟乙 基_淀粉和羟丙基_淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物、瓜耳胶、支链淀粉、菊粉、黄原胶、角叉 菜聚糖、果胶、藻酸水解产物、其它生物聚合物和它们的任意等价物。药物组合物药物组合物在本文中优选地意在包括适合肠胃外施用的包含根据本 发明的因子villi分子的组合物，例如即可使用的无菌含水组合物或可以在例如水或含水 缓冲液中重构的干燥的无菌组合物。根据本发明的组合物可以包含各种药学上可接受的赋 形剂、稳定剂等。这种组合物中的其它成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节 齐U、螯合剂、金属离子、油性载体、蛋白(例如，人血清清蛋白、明胶或蛋白)和两性离子(例 如，氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这种其它成分当然不 应不利地影响本发明的药物制剂的总稳定性。借助于注射器，任选笔样注射器，通过皮下 的、肌内的、腹膜内的或静脉内的注射，可以进行肠胃外施用。或者，借助于输注泵，可以进 行肠胃外施用。另一个选择是鼻或肺喷雾剂形式的组合物，其可以是用于施用FVIII化合 物的溶液或悬浮液。作为另一个选择，含有本发明的FVIII化合物的药物组合物也可以适 合于经皮施用(例如通过无针注射或来自贴剂，任选离子电渗疗法贴剂)或跨粘膜的(例 如口腔含化的)施用。
在第一个方面，本发明因而涉及具有改变的循环半衰期的B-结构域截短的因子 VIII分子，所述分子在截短的B结构域中通过0-联寡糖与亲水聚合物共价缀合，其中因子 VIII激活(分子的激活)导致共价缀合的亲水聚合物的去除。根据一个实施方案，亲水聚合物是PEG。PEG聚合物的大小可以是约10，000至 约 160，OOODa,例如 10，000 至 80，OOODa,例如约 10，000、15，000,20, 000,25, 000,30, 000、 35，000,40, 000,45, 000,50, 000,55, 000,60, 000,65, 000,70, 000,75, 000 或 80，OOODa0 优 选地，0-联寡糖附着到通过截短B-结构域、而不是通过插入在野生型FVIII分子中不存在 的人工0-糖基化位点产生的0-糖基化位点上。
根据特别优选的实施方案，根据本发明的分子包含如SEQ ID NO 2所述的氨基酸 序列。这种分子具有独特的特征，因为激活的FVIII分子与天然的活性FVIII分子相同。该 特征似乎在安全性评判方面具有有利的性质。本发明也涉及包含根据本发明的分子的药物组合物。本发明此外涉及得到根据本发明的分子的方法，其中所述方法包含，通过截短的B 结构域中的0-联寡糖，给B-结构域截短的因子VIII分子缀合亲水聚合物，例如PEG基团。 因而断定，本发明也涉及通过这种方法得到的或可以得到的分子。在另一个方面，本发明涉及治疗血友病的方法，其包含给需要治疗的患者施用治 疗有效量的根据本发明的分子。本文使用的术语“治疗”是指需要治疗的任意人或其它动物受试者的医学疗法。 预期所述受试者已经经历医学从业人员的体检，所述人员已经给出推测的或确定的诊断， 其可指示所述特定治疗的应用对所述人或其它动物受试者的健康是有益的。根据受试者的 健康现状，所述治疗的时间选择和目的可以随个体不同而异。因而，所述治疗可以是预防性 的、治标的、针对症状的和/或治愈的。在另一个方面，本发明涉及根据本发明的分子作为药物的用途，以及根据本发明 的分子用于生产治疗血友病的药物的用途。在最后的方面，本发明涉及工程改造根据本发明的B-结构域截短的因子VIII分 子的方法，所述方法包含，(i)截短B-结构域，和任选地对该截短的因子VIII分子的氨基 酸序列进行鉴定潜在的0-联糖基化位点的分析，(ii)在合适的宿主细胞中生产该分子，和 (iii)选择在截短的B-结构域中具有0-联聚糖的分子。附图简述在附图中，缀合基团的大小有时称作“K”，它在本文中意在等同于KDa(千道尔 顿)。图1 :0_联寡糖的糖PEG化过程的示意图。该图不代表取得在实施例中得到的产 物的可行方式的穷尽列表。图2 反应混合物在Source 15Q上的离子交换层析(A)。收集的级分的SDS-PAGE， 含有分子标记(左边)(B)。图3 加帽的产物在superdex 200大小排阻层析上的纯化。图4 使用各种aPTT试剂，0_糖PEG化的rFVIII的凝固活性。㈧显示了凝固活 性和生色活性之间的比。(B)显示了比凝固活性。图5 :40K-PEG-
-N8在FVIII KO小鼠中的体内作用(闭塞时间)。
图6:显示生产根据本发明的糖PEG化的因子FVIII所包含的过程步骤的流程图。图7 在实 施例中生产的根据本发明的因子VIII分子的示意图。
实施例实施例1重组的B结构域截短的0-糖基化的因子VIII的生产在SEQ ID NO 2中给出了 B-结构域缺失的因子VIII分子的氨基酸序列的实例。该 多肽也可以称作“N8”。该分子包含21个氨基酸残基的接头序列(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR， 加有下划线的S是在实施例2的含有加入聚乙二醇的0-聚糖的丝氨酸残基)。根据本发明的因子VIII分子在实施例中可以以各种方式提及，但是所有提及的 “因子VIII分子”都表示根据本发明的因子VIII分子，或者在转变成根据本发明的因子 VIII分子的过程中的因子VIII分子。SEQ ID NO 2 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGP MASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAA SARAffPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYffHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKK HPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLY GEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKffTVTVEDGPTKSDPRCLTR YYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEF QASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENP GLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRE ITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGS VPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPR KNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFF TIFDETKSWYFTE匪ERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIH FSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRD FQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKK WQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDA QITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSS QDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY细胞系和培养过程使用因子VIII cDNA，构建哺乳动物表达质粒，其编码具有SEQ IDNO 2所述氨基酸 序列的B-结构域缺失的因子VIII。该质粒编码包含全长人因子VIII的氨基酸1-740的因 子VIII重链和包含全长人因子VIII的氨基酸1649-2332的因子VIII轻链。重链和轻链 序列通过具有全长人因子VIII的氨基酸741-750和1638-1648的序列的21氨基酸接头相 连。用编码BDD因子VIII的质粒转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并用二氢叶酸还原酶系统 选择，最终产生在无动物组分的培养基中培养的无性系悬浮生产细胞。
该过程的第一步是，将来自工作细胞库小瓶的细胞小瓶接种进化学成分确知的且无动物组分的生长培养基中。最初，解冻后，在τ-瓶中温育细胞。解冻后1或2天，将细胞 转移至摇瓶，并通过连续稀释扩大培养体积，以便使细胞密度维持在0. 2-3. OxlO6细胞/ml。 下一步是，将摇瓶培养物转移进种子生物反应器。在这里进一步扩大培养体积，然后最终转 移至生产生物反应器。相同的化学成分确知的且无动物组分的培养基用于所有接种物增殖 步骤。转移至生产生物反应器后，给培养基补充增加产物浓度的组分。在生产生物反应器 中，以3天的循环时间，以重复的分批方法培养细胞。在收获时，将80-90%的培养体积转移 至收获罐。然后用新鲜的培养基稀释剩余的培养液，以得到最初的细胞密度，且然后开始新 的生长期。通过离心和过滤，澄清收获批，并转移至贮藏罐，然后开始纯化过程。将缓冲液加 入贮藏罐中的无细胞的收获物，以稳定化pH。在生产运行结束前，收集细胞，并冷冻，以造成生产细胞库的结束。测试该细胞库 的支原体、无菌性和病毒污染。纯化为了从细胞培养基分离B-结构域缺失的因子VIII，使用4步纯化程序，包括在 Capto MMC柱上的浓缩步骤、免疫吸附(immunoabsorbent)层析步骤、阴离子交换层析和最 终的凝胶过滤步骤。通常，使用下述程序以15ml/分钟的流速，用泵将11升无菌过滤的 培养基泵到Capto MMC (GE Healthcare，瑞典)的柱(1.6x12cm)上，后者在缓冲液A中平 衡20mM 咪唑，IOmM CaCl2, 50mM NaCl，0. 02 % 吐温 80，pH = 7. 5。用 75ml 缓冲液 A 洗涤 柱，然后用含有1.5M NaCl的75ml缓冲液A洗涤。以Iml/分钟的流速，用20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐温80、2. 5M NaCl、8M乙二醇、pH = 7. 5洗脱蛋白。收集8ml级分，且测定因 子VIII活性(CoA-实验)。合并含有因子VIII的级分，且正常得到约50ml的合并体积。已经开发了抗因子VIII的单克隆抗体(Kjalke Eur J Biochem 234773)。通过 对该抗体进行表位绘图(结果未显示)，发现F25识别从氨基酸残基725至740的重链远 C-末端序列。基本上如生产商所述，以2. 4mg/ml凝胶的密度，将F25抗体偶联至NHS-激活 的 S印harose 4FF (GE Healthcare, Bio-Sciences AB，Uppsala，瑞典)。用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐温80、pH = 7. 3，将来自前述步骤的库稀释10倍，并以0. 5ml/分钟的流速， 应用于 F25 S印harose 柱(1.6x9. 5cm)，后者用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、150mM NaCl.O. 02% 吐温80、IM丙三醇、pH = 7. 3平衡过。用平衡缓冲液洗涤柱，直到紫外信号恒定，且然后用 20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 65M NaCUpH = 7. 3洗涤，直到紫外信号再次恒定。以Iml/分钟 的流速，用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐温 80、2. 5M NaCl、50% 乙二醇、pH = 7. 3 洗脱 因子VIII。收集Iml级分，且测定因子VIII活性(CoA-实验)。合并含有因子VIII的级 分，且正常得到约25ml的合并体积。为离子交换步骤制备缓冲液A :20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐温80、IM丙三醇、 PH = 7. 3和缓冲液B :20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐温80、1M丙三醇、IM NaCUpH = 7. 3。 以2ml/分钟的流速，用85%缓冲液A/15%缓冲液B平衡Macro-Pr印25Q Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)的柱(IxlOcm)。用缓冲液A将来自前述步骤的库稀释 10倍，且以2ml/分钟的流速泵到柱上。以2ml/分钟的流速，用85%缓冲液A/15%缓冲液 B洗涤柱，且以2ml/分钟的流速，以从15%缓冲液B至70%缓冲液B的线性梯度，在120ml范围内洗脱因子VIII。收集2ml级分，且测定因子VIII活性(CoA-实验)。合并含有因子 VIII的级分，且正常得到约36ml的合并体积 将来自前述步骤的库应用到Superdex 200制备级(GE Healthcare，Bio-Sciences AB，Uppsala，瑞典)柱(2. 6x60cm)，后者用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、0. 02% 吐温 80、1M 丙三 醇、150mM NaCl、pH = 7. 3平衡过，并用其在lml/分钟洗脱。收集3ml级分，且测定因子VIII 活性(CoA-实验)。合并含有因子VIII的级分，且正常得到约57ml的合并体积。在_80°C 储存含有因子VIII的库。 利用上述的4步纯化程序，得到约15 %的总得率，如通过CoA活性和ELISA测量来 判断的。用于生产N8的细胞系是用在PTSV7中的表达质粒#814 F8-500稳定转染的重组 的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，所述在pTSV7中的表达质粒#814 F8-500由含有插入片段 的pTSV7表达载体组成，所述插入片段含有编码F8-500蛋白的cDNA。“N8”在本文中意在对 应于具有SEQ ID NO 2所列出的氨基酸序列的蛋白。从N-末端开始，F8-500蛋白(N8)由 FVIII信号肽(氨基酸-19至-1)、然后是没有B结构域的FVIII重链(氨基酸1_740)、21氨 基酸接头(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR)和FVIII轻链(野生型人FVIII的氨基酸1649-2332) 组成。21氨基酸接头的序列源自FVIII B结构域，且由全长FVIII的氨基酸741-750和 1638-1648 组成。用在pTSV7中的814 F8-500转染CHO细胞，并用二氢叶酸还原酶系统选择，最终 产生在无动物组分的培养基中培养的无性系悬浮生产细胞。如下开始生产运行解冻工作 细胞库小瓶，并增殖细胞，直到转移至生产生物反应器。相同的化学成分确知的且无动物组 分的培养基用于所有接种物增殖步骤。转移至生产生物反应器后，给培养基补充增加产物 浓度的组分。在生产生物反应器中，以3天的循环时间，以重复的分批方法培养细胞。在收 获时，将80-90%的培养体积转移至收获罐。然后用新鲜的培养基稀释剩余的培养液，以得 到最初的细胞密度，且然后开始新的生长期。通过离心和过滤，澄清收获批，并转移至贮藏 罐，然后开始纯化过程。将缓冲液加入贮藏罐中的无细胞的收获物，以稳定化PH。实施例2重组的B结构域截短的且0-糖基化的因子VIII的加入聚乙二醇使用下述程序，用聚乙二醇(PEG)缀合在实施例1中得到的重组因子VIII分子为了有效地进行在实施例1中得到的重组因子VIII分子的糖PEG化，> 5mg/ml 的FVIII浓度是优选的。由于FVIII在该浓度正常是不溶的，所述筛选选择的缓冲液组合 物(参见表1中的一些结果)。基于这些考虑，发现含有50mM MES、50mM CaC12、150mM NaCl、20%丙三醇、pH 6.0 的缓冲液是合适的反应缓冲液。表1反应条件对FVIII溶解度和聚集的影响的评价
权利要求
具有改变的循环半衰期的B 结构域截短的因子VIII分子，所述分子在截短的B结构域中通过O 联寡糖与亲水聚合物共价缀合，其中因子VIII激活导致共价缀合的亲水聚合物的去除。
2.根据权利要求1的分子，其中所述0-联寡糖附着到通过截短B-结构域产生的0-糖 基化位点上。
3.根据权利要求1-2中任一项的分子，其中所述亲水聚合物是PEG。
4.根据权利要求3的分子，其中所述PEG的大小是约10，000至约160，OOODa0
5.根据权利要求4的分子，其中所述PEG的大小是约40，OOODa0
6.根据权利要求1-5中任一项的分子，其包含如SEQID NO 2所述的氨基酸序列。
7.药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项的分子。
8.制备根据权利要求1-6中任一项的分子的方法，其中所述方法包含，通过截短的B结 构域中的0-联寡糖，给B-结构域截短的因子VIII分子缀合亲水聚合物。
9.通过根据权利要求8的方法可得到的分子。
10.治疗血友病的方法，其包含，给需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求 1-6中任一项的分子。
11.根据权利要求1-6中任一项的分子作为药物的用途。
12.根据权利要求1-6中任一项的分子用于生产治疗血友病的药物的用途。
13.工程改造根据权利要求1-6中任一项的B-结构域截短的因子VIII分子的方法，所 述方法包含，(i)截短B-结构域，和任选地对该截短的因子VIII分子的氨基酸序列进行鉴 定潜在的0-联糖基化位点的分析，(ii)在合适的宿主细胞中生产该分子，和(iii)选择在 截短的B-结构域中具有0-联聚糖的分子。
全文摘要
本发明涉及具有改变的循环半衰期的B-结构域截短的因子VIII分子，所述分子与亲水聚合物共价缀合。本发明此外涉及用于得到这种分子的方法以及这种分子的用途。
文档编号A61P7/04GK101965200SQ200980106738
公开日2011年2月2日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月27日
发明者B·B·S·范达尔, G·博尔特, H·R·斯特尼克, L·蒂姆, S·德弗里斯, T·D·斯蒂恩斯特鲁普 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司