宫颈癌疫苗的制作方法

专利名称：宫颈癌疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及人宫颈癌的药物疫苗组合物，预防人宫颈癌的方法，及制备人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的方法。
背景技术：
已知多于80种类型的人乳头瘤病毒(HPV)，及约30类型通过性接触引发宫颈感染，已知其中一半类型与宫颈癌相关(Zur HausenH, Mol. Carcinogenesis 8 147-150(1988))。其中，已知被16及18型HPV感染的女性的患癌率比正常女性高约500 倍，且16及18型HPV感染生殖器官上皮细胞，经恶性转化引发宫颈癌(Zur Hausen H， Mol.Carcinogenesis 8 147-150(1988) ；Hausen, Biochemica. Biophysica. Acta. 1288 55-78(1996))。目前已使用高危型HPV病毒样颗粒(VLP)开发了预防宫颈癌的疫苗。VLP是HPV 的主衣壳蛋白(Li蛋白，约55kDa)，且作为疫苗候选物具有各种优势，包括(a)无需其他病毒基因产物(如见于天然HPV病毒粒子)自装配成VLP的能力；(b)持续长期免疫；及(c) 由于针对基因型的类型特异性而高效。使用VLP 的 ‘Gardasil，(Merck&Co.，Inc.)是使用针对最常见的 6、11、16 及 18 型HPV的各抗原，及使用‘Alum，作为免疫佐剂开发的疫苗。‘Cervarix，(GlaxoSmithKline Plc.)是使用作为引发宫颈癌的代表性因子的16及18型HPV，及使用独立开发的‘AS04’ 作为免疫佐剂开发的疫苗。在‘gardasil’中用作免疫佐剂的Alum已被用于白喉、破伤风及乙型肝炎病毒疫苗，且据报道Alum增强抗原稳定性及诱导细胞因子释放。但是，gardasil的使用受到以下限制(a)使不可能冻干或冷冻疫苗；(b)并非对所有抗原有效；及(c)其仅促进体液免疫应答。以诱导强力及持久的免疫应答为目的开发了含于GSK的Cervarix的AS04，其由氢氧化铝及单磷酰脂质A (MPL)组成。本文中的术语“MPL”指能直接活化关键免疫应答的免疫刺激物质，发挥增强针对含于疫苗的抗原的免疫应答的作用。免疫佐剂最近受到注目，其用于各种疫苗(例如宫颈癌疫苗及流感疫苗)。其中， 细菌DNA作为抗癌剂自上世纪60年代开始受到注目，且持续研究至今。但是，细菌DNA由于其低功效而未能单独用作抗癌剂(Glick，J. L. The specificity of inhibition of tumor cellviability by DNA. Cancer Res. 27 :2338 (1967))。尽管有此缺陷，已证实，已知细菌 DNA无严重副作用地活化各种免疫细胞，且作为佐剂具有许多优势(McCluskie MJ, et al., CpG DNA is a potentenhancer of systemic and mucosal immune responses against hepatitisB surface antigen with intranasal administration to mice. J Immunol. Novl ; 161 (9) :4463-6(1998))。对于细菌DNA的这些效果，日本的Yamamoto等人主张含CG的重复序列在细菌DNA的效果中起重要作用，这也被Krieg等人证实(Yamamoto S. et al. Uniquepalindromic sequences in syntheticoligonucIeotides are required to induce IFN and augmentlFN-mediated natural killer activity. J. Immunol. 148 :4072(1992)； Krieg AM, Antitumor applications of stimulating toll-like receptor 9with CpG oligodeoxynucleotides. Curr. Oncol. Rep. Mar ；6 (2) :88-95 (2004)) 自上世纪 Θ0 年代中期，CpG的相关研究显示了将含未甲基化的CG的合成的DNA(CpG-ODN)作为抗癌剂的DNA 抗癌剂的可能性，尤其研究了抑制短合成的DNA降解的二酯键中的S取代。通过这些努力， CpG-ODN相关产品不仅作为佐剂，也作为抗癌剂用于临床试验(http://www. coleypharma. com) ο但是，仍待解决的一些问题包括CpG-ODN的二酯键中的S取代的免疫原性及仍低的抗癌活性。目前临床中使用的CpG 7909是诱发抗DNA Ab的硫代磷酸酯寡核苷酸 (Clin Immunol. Aug； 100 (2) :157-63 (2001))，且其与自身免疫疾病(例如)SLE(全身性红斑狼疮)紧密相关(J Clin Immunol. July ；6 (4) :292-8 (1986))。此外，已知硫代磷酸酯结构发挥TI Ag的作用，给针对感染的免疫保护带来扰乱(Mol Immunol. Dec ；35 (18) 1161-70(1998))。对于自上世纪50年代开始已知具有抗癌效果的LPS，由于ng水平的LPS即可导致由败血症的死亡，使难以利用LPS。普遍认为LPS与DNA的连接引发严重细胞毒性， 因而消除LPS被认为是在DNA相关的药品中非常重要的过程(Gao JJ. et. al, Bacterial DNA andlipopoIysaccharide induce synergistic production of TNF-alphathrough a post-transcriptional mechanism. J Immunol 166 (11) :6855-60 (2001))。在功效方面， 认为由LPS刺激的免疫应答显著强于由DNA刺激的免疫应答，然而由于所述应答不是对于抗癌重要的Thl型应答，而是Th2型应答，所以LPS不适宜作为抗癌剂(LebmanDA et al Interleukin 4 causes isotype switching to IgE in Tce11-stimulated clonal B cell cultures. J Exp Med. Sep 1 ； 168 (3) :853-62 (1988))。尤其是 Th2 型免疫活性抑制 Thl 型免疫活性,非常难以将LPS用作抗癌剂(Rengarajan J et al. Transcriptionalregulation of Thl/Th2 polarization. Immunol Today. Oct ；21 (10) :479_83 (2000))。进行了试图对LPS脱毒的多种研究，在通过除去多糖链或脂质A脱酰基化来降低其细胞毒性中成功(Katz SS et al Deacylation oflipopolysaccharide in whole Escherichia coli during destruction bycellular and extracellular components of a rabbit peritoneaIinflammatory exudate. J Biol Chem. Dec 17 ；274(51) 36579-84 (1999))。例如通过除去LPS的多糖链而得到的脂质A的磷酸化来得到单磷酰脂质 A(MPL)而开发了免疫治疗抗癌剂。但是，已知其功效相当低(http://www. corixa. com)。对此，本发明人已开发新免疫佐剂来弥补上述免疫佐剂的缺点(韩国专利 No. 0740237(2007. 07. 10))。本申请通篇参考了各种专利及出版物，及在括号内提供了引文。这些专利及出版物的公开内容通过引用以其整体并入本申请，以更详细说明本发明及本发明所属领域的状态。

发明内容
技术课题
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本发明人经锐意研究开发了可克服上述常规宫颈癌疫苗的问题的新疫苗。结果， 我们发现，可在使用16或18型HPV的LlVLP进行免疫的过程中将从脂质A除去部分脂肪酸的非毒性LOS (脂寡糖)用作免疫佐剂，从而比基于VLP的常规疫苗更显著诱导HPV免疫应答，使能成为预防人宫颈癌的优良疫苗。因此，本发明旨在提供人宫颈癌的药物疫苗组合物。本发明还旨在提供预防人宫颈癌的方法。本发明又旨在提供制备HPV Ll VLP的方法。本发明还旨在提供编码16型HPV的Ll VLP的新核酸序列。本发明还旨在提供编码18型HPV的Ll VLP的新核酸序列。本发明还旨在提供经上述新核酸序列转化的酿酒酵母。本发明的其他目的及优势将通过以下详述及随附的权利要求书及附图而显而易见。解决课题的技术方案本发明的一方面，提供了人宫颈癌的药物疫苗组合物，其含(a) (i)16型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)，18型HPV的Ll VLP,或上述之组合；及(ii)脱酰基化的非毒性脂寡糖(L0Q ；及，(b)药学可接受载质。本发明另一方面，提供了预防人宫颈癌的方法，包括给人施用上述药物组合物。本发明人经锐意研究开发了可克服上述常规宫颈癌疫苗的问题的新疫苗。结果， 我们发现，可在使用16或18型HPV的LlVLP进行免疫的过程中将从脂质A除去部分脂肪酸的非毒性LOS (脂寡糖)用作免疫佐剂，从而比基于VLP的常规疫苗更显著诱导HPV免疫应答，使能成为预防人宫颈癌的优良疫苗。本发明的药物组合物中使用的VLP源于16或18型HPV的L1VLP。已知16或18 型HPV是高危型HPV，且是诱导宫颈癌的代表性HPV。本文中的术语“HVP Ll蛋白”指由HPV的Ll基因表达的HPV衣壳中的主要蛋白。 Ll蛋白可在适宜条件下与构成HPV衣壳的另一次要蛋白L2蛋白一起或Ll蛋白本身自我装配。本发明中使用的VLP包括编码天然16或18型HPV的Ll蛋白，及其功能性Ll蛋白衍生物的总序列。本文中的术语“功能性HPV Ll衍生物”指序列虽不同于编码天然HPV Ll蛋白的总序列，但能形成VLP且诱导免疫应答的天然HPV Ll蛋白衍生物。例如，功能性 HPVLl衍生物是除去了细胞核定位信号的截短的Ll蛋白。能在本发明中使用的HPV Ll蛋白的另一例包括除去了其C-端的34个氨基酸的16型HPV的Ll蛋白，或除去了其C-端的 35个氨基酸的18型HPV的Ll蛋白。编码16或18型HPV的LlVLP的例示氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO 2 及 SEQ ID NO :4。作为本发明的药物组合物中诱导免疫应答的抗原，使用HPV16L1 VLP或HPV18 Ll VLP，优选两者。或者，除HPV16L1VLP或HPV18L1VLP之外，LlVLP作为抗原还可包括选自下列的至少 1 种 LlVLP 31 型 HPV，45 型 HPV，6a 型 HPV，6b 型 HPV，11 型 HPV，33 型 HPV，35 型 HPV，39 型 HPV，51 型 HPV，52 型 HPV，56 型 HPV，58 型 HPV 及 68 型 HPV 的 LlVLP。或者，本发明中使用的LlVLP可与其他蛋白(例如L2蛋白)融合。
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本发明的药物组合物的最大特征是利用脱酰基化的非毒性L0S(脂寡糖)作为免疫佐剂。本文中首先采用的术语“L0S(脂寡糖)”指具有短于天然LPS的糖链的低分子量 LPS(脂多糖)变体。LOS在脱酰基化前具有5，000 10，OOODa范围的分子量。本文中的术语“脱酰基化的L0S”指从LOS除去与脂质A的葡萄糖胺经-C(O)O-键连接的脂肪酸的 LOS形式，导致细胞毒性相比LPS显著降低。脂肪酸与脂质A的葡萄糖胺通过-C(O)O-键及-C (0) NH-键连接。本发明的脱酰基化的LOS是通过脂质A脱酰基化除去了经-C (0) 0-键连接的脂肪酸的L0S。本发明的脱酰基化的非毒性LOS可根据各种方法制备，例如本发明人之前的专利 (包括韩国专利 No. 0456681 ；WO 2004/039413 ；韩国专利 No. 0740237 ；及 WO 2006/121232) 中公开的方法。例如，通过用强碱(例如2N NaOH)处理LPS (脂多糖)而脱酰基化来从脂质A除去LOS中的部分脂肪酸及脱毒。根据优选实施方式，本发明中用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性LOS通过由碱处理LPS (脂多糖)的脂质A脱酰基化来脱毒。碱的优选例包括NaOH、KOH、Ba(OH)2、CsOH, Sr (OH)2, Ca (OH)2, LiOH, RbOH 及 Mg (OH)2,更优选 NaOH、KOH、Ba (OH)2, Ca (OH)2, LiOH 及 Mg (OH)2,再更优选 NaOH、KOH 及 Mg (OH) 2，及最优选 NaOH。LPS的脱毒程度可根据本领域技术人员已知的各种方法分析。例如，脱毒可通过测量用LPS处理的THP-I (急性单核细胞白血病)中分泌的TNF- α (瘤坏死因子-α )的量来测定。本发明的脱酰基化的非毒性LOS相比常规LPS诱导相对少量的TNF-α分泌。本发明的脱酰基化的非毒性LOS的另一特征是具有低于一般常规LPS的分子量。 本发明中使用的脱酰基化的非毒性LOS优选具有1，500 10，OOODa范围的分子量，更优选2，000 5，OOODa,再更优选2，000 4，OOODa,又再更优选3，000 4，OOODa,及最优选 3，200 3，700Da范围的分子量。分子量的测量可使用常规方法进行，例如MALDI-MASS。根据优选实施方式，本发明的脱酰基化的非毒性LOS源于大肠杆菌(E. coli)，及最优选由本发明人分离的大肠杆菌EG0021 (KCCM10374)。本发明中使用的脱酰基化的非毒性LOS由于相比常规免疫佐剂免疫刺激效果更优良且细胞毒性显著低，因此非常适宜用于本发明的疫苗组合物。如下文实施例所证实，本发明的脱酰基化的非毒性LOS具有比为降低LPS细胞毒性而通过除去LPS的多糖链而得到的脂质A的磷酸化来得到的单磷酰脂质A(MPL)更低的细胞毒性。如下文实施例中所示(见图23 24)，一起施用本发明的脱酰基化的非毒性LOS 与HPV LlVLP还诱导与Th2型免疫应答(体液免疫)相关的IgGl以及与Thl型免疫应答 (细胞免疫)相关的化6加水平，证实本发明的脱酰基化的非毒性LOS可与HPV LlVLP—起协同诱导免疫应答。本发明的疫苗组合物可仅以含HPV 16L1VLP, HPV 18L1VLP或上述之组合，及脱酰基化的非毒性LOS的基本组成发挥宫颈癌预防功效。或者，本发明的疫苗组合物还可包括其他免疫佐剂，例如包括选自Mg、Ca、Sr、Ba及Ra的II族元素；选自Ti、Zr、Hf及Rf的 IV族元素；或铝的盐或它们的氢氧化物。盐优选以氧化物、过氧化物、氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、硫酸盐或硅酸盐形成。例如，还能用于本发明的疫苗组合物的免疫佐剂包括氢氧化镁、氢氧化碳酸镁五水合物、二氧化钛、碳酸钙、氧化钡、 氢氧化钡、过氧化钡、硫酸钡、硫酸钙、焦磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、氢氧化铝、磷酸铝及硫酸铝钾水合物(Alum)。还能用于本发明的疫苗组合物的免疫佐剂最优选为氢氧化铝。根据优选实施方式，16或18型HPV的LlVLP通过纯化过程得到，所述纯化过程包括下列步骤(i)培养含编码16或18型HPV Ll的核苷酸序列的酵母；(ii)裂解培养的酵母；(iii)通过用硫酸铵沉淀酵母裂解物以除去杂质；及(iv)对已除去杂质的酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析。以下详述纯化过程。本发明的药物疫苗组合物中的药学可接受载质可为制备制剂时常规使用的药物可接受载质，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、 羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、及矿物油，但不限于此。本发明的药物组合物还可包括润滑剂、 湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及防腐剂。适宜药学可接受载质及制剂的详述可见于 Remington' s Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995),其通过弓丨用并入本文。本发明的药物组合物可经口服或肠胃外施用。当本发明的药物组合物肠胃外施用时，可通过静脉内、皮下、肌肉内、腹腔及经皮施用。本发明的药物组合物的适宜剂量可根据药物组合物的药物制剂方法、施用方法、 患者年龄、体重、性别、疾病严重性、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度及敏感性而变化。 本发明的药物组合物优选以0. 0001 1，000mg/kg(体重)的日剂量施用。根据本领域技术人员已知的常规技术，药物组合物可与上述药学可接受载质和/ 或赋形剂制成制剂，从而提供多种剂型(包括单元剂型及多剂型)。制剂可为油或水介质中的溶液，悬浮液或乳液，提取剂，粉剂，颗粒剂，锭剂及胶囊剂，且还可包括分散剂或稳定剂。本发明的药物疫苗组合物可比常规疫苗(包括Cervarix 及Gardasil )诱导更强的针对HPV的免疫应答，因而具有优良的宫颈癌预防功效。此外，本发明的药物疫苗组合物由于本发明中用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性LOS几乎无细胞毒性而具有优良安全性。如下文实施例所证实，施用本发明的药物疫苗组合物比施用Cervarix 及 Gardasil 显著提高与Thl型免疫应答(细胞免疫)相关的干扰素_ Y >IgG2a及IgG^水平，以及与Th2型免疫应答(体液免疫)相关的IgGl水平。换言之，本发明的药物疫苗组合物可诱导均优于Cervarix 及Gardasil 的针对HPV的Thl型免疫应答(细胞免疫)及 Th2型免疫应答(体液免疫)。本发明另一方面提供了制备人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的方法， 包括下列步骤(i)培养含编码HPV Ll的核苷酸序列的酵母；(ii)裂解培养的酵母；(iii)用硫酸铵沉淀酵母裂解物以除去杂质；及(iv)对已除去杂质的酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析。本发明人为开发用于制备针对HPV的疫苗的HPV VLP的酵母表达系统中简化产生 HPV VLP的过程，及提高HPV VLP产率的纯化方法进行了锐意研究。结果我们发现，用硫酸铵沉淀酵母裂解物及进行肝素层析或阳离子交换层析可达到优良纯化效力(产率及纯度)。以下根据下列步骤详述本发明
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( )表汰HPV Ll蛋白的经转化酵母的培养根据本发明的方法，对于作为Ll蛋白来源的HPV类型不特别限制，其包括6a型 HPV, 6b 型 HPV，11 型 HPV，16 型 HPV，18 型 HPV，31 型 HPV，33 型 HPV，35 型 HPV，39 型 HPV，45 型HPV，51型HPV，52型HPV，56型HPV，58型HPV及68型HPV，但不限于此。，本发明的Ll蛋白优选源于选自下列的HPV :6a型HPV，6b型HPV，11型HPV，16型HPV，18型HPV，31型HPV， 33型HPV及45型HPV，且更优选16型HPV及18型HPV。本发明中用作宿主细胞的细胞是酵母，例如包括但不限于面包酵母、酿酒酵母、 ELS^i惠## (Saccharomyces pastorianus), ##M M## (Schizosaccharomyces pombe)等。本发明的宿主酵母最优选为酿酒酵母。表达HPV Ll蛋白的经转化酵母指经成功表达HPV Ll蛋白的表达载体转化的酵母细胞。本领域技术人员已知的各种启动子例如包括可与待在表达载体中表达的HPV Ll 基因上游连接的 GALl 启动子、GALlO 启动子(Johnson，Μ.，and Davies, R. W.，Mol. and Cell. Biol.，4 :1440-1448 (1984))、ADH2 启动子(Russell, D.，et al.，J. Biol. Chem.，258 2674-2682, (1983))、PH05 启动子(ΕΜΒ0 J. 6 :675-680, (1982))或 MFal 启动子；及可含于表达载体中的多聚腺苷酸化序列包括ADHI、MFal或TPI-derived多聚A序列(Alber， Τ. and Kawasaki, G.，J. Mol. &Appl. Genet. 1 :419-434(1982))。作为酵母表达载体，YEp6、 YEpl3、YEp4 及 YEGa (S. N. Kim, et al. , J. Virol. Methods 139 (2007) 24-30 ；R. Kirnbauer, et al. , J Virol 67(1993)6929-6936)为本领域所熟知。经表达HPV Ll蛋白转化的酵母可根据本领域技术人员已知的各种方法制备，例如包括美国专利No. US 7250170、US 6613557、US5888516、US 5871998、US 5618536 及 US5437951，它们通过引用并入本文。根据优选实施方式，经转化的酵母在补充了一种或多种葡萄糖及半乳糖碳源的培养基中培养。根据另一优选实施方式，葡萄糖及半乳糖之比是葡萄糖半乳糖重量之比= 0 1 3 4，更优选葡萄糖半乳糖=0.5 1 3. 5 4，且最优选为葡萄糖半乳糖 =1 3。本发明的培养基中使用的葡萄糖及半乳糖重量之比在上述范围内时HPV Ll蛋白表达可最大化。培养经转化酵母中使用的例示培养基是YPDG培养基，其包括酵母提取物、胨、葡萄糖及半乳糖。(ii)培养的酵母的裂解本发明中培养的酵母的裂解方法不限于特定方法，优选获得酵母细胞全裂解物的裂解方法。例如，能在本发明中使用的裂解方法包括但不限于超声处理或使用玻璃珠搅勻。( ) mmmmmm^^mmmmm通过向酵母裂解物加入硫酸铵来沉淀表达蛋白及除去杂质。根据优选实施方式，待加入的硫酸铵的浓度在20 60wt%范围内，更优选在40 50wt %范围内，及最优选在42 48wt %范围内。当硫酸铵浓度在不多于40wt %范围内时， 本发明中表达的HPV Ll蛋白的沉淀效力降低。硫酸铵浓度在不少于50wt%范围内时，本发明中表达的HPV Ll蛋白的沉淀效力不随硫酸铵增加而提高。或者，裂解通过硫酸铵沉淀得到的蛋白沉淀物，且与不少于0. 5M的NaCl混合，之后于4°C温育至少12小时。
(iii-2)低浓度盐(例如NaCl)中杂质的去除在含低浓度盐(例如NaCl)的缓冲液中透析从步骤(iii)得到的溶液，然后于室温温育以除去不溶性杂质。根据本发明的一个实施例，低浓度盐的浓度使用0. 001 0. 3M范围的浓度，更优选0.01 0. 2M，且最优选0. 1 0. 8M，且待使用的盐选自=NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, Na2SO4 及(NH4) 2S04，且最优选NaCl。根据优选实施方式，低浓度盐处理过程在非离子型表面活性剂存在下进行。例如， 非离子型表面活性剂包括聚氧基亚烷基山梨聚糖脂肪酸酯，山梨聚糖脂肪酸酯，亚烷基二醇脂肪酸酯，聚氧基亚烷基脂肪酸酯，脂肪酸酯，聚氧基亚烷基脂肪酸醚，C16_24脂肪酸，脂肪酸单-、二-或聚-甘油酯，聚氧基亚烷基烷基酚，烷基苯基醚，聚氧基乙烯-聚氧基丙烯嵌段共聚物，脂肪酸胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺，烷基纤维素，羧基烷基纤维素或聚氧基亚烷基蓖麻油衍生物，且优选聚氧基乙烯山梨聚糖单-或三-月桂基，棕榈基，硬脂基或油基酯 (例如)聚氧基乙烯00)山梨聚糖单月桂酸酯(Tween-20)，聚氧基乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(Tween-21)，聚氧基乙烯00)山梨聚糖单棕榈酸酯(Tween-40)，聚氧基乙烯00) 山梨聚糖单硬脂酸(Tween-60)，聚氧基乙烯00)山梨聚糖三硬脂酸(Tween-65)、聚氧基乙烯00)山梨聚糖单油酸酯(Tween-80或聚山梨酯80)或聚氧基乙烯Q0)山梨聚糖三油酸酯(Tween-85)。此外，优选用浓度0. 001 0. 01%的非离子型表面活性剂处理。上述低浓度NaCl处理步骤对于除去杂质非常有效，及显著贡献于本发明的方法中缩短过程及改善纯化效力。通过离心除去所述步骤中产生的不溶性蛋白，导致显著增加待通过肝素层析或阳离子交换层析洗脱的VLP的纯度。因此显示，所述步骤通过简单方法除去杂质来起提高纯化效力的作用。(iv)肝素层析或阳离子交换层析对除去了杂质的溶液进行肝素层析或阳离子交换层析。将除去了杂质的溶液用上述肝素层析或阳离子交换层析纯化时，可非常有效除去杂质。进行肝素层析的步骤中，在装载进肝素树脂柱前，将步骤(iii)或(iii-幻的溶液用适宜肝素树脂的结合缓冲液平衡。结合缓冲液优选包括NaCl及非离子型表面活性剂(例如Tween-80)，且NaCl优选以低浓度(0. 1 0. 2M)使用。然后，样品施加肝素层析，然后将蛋白从树脂洗脱下来。洗脱方法优选使用线性NaCl梯度。更优选以NaCl(0.33 0.66M) 线性梯度洗脱杂质，然后以NaCl (0. 66 2M)线性梯度洗脱希望的Ll蛋白。可使用各种树脂进行阳离子交换层析，优选与硫、硫烷基(例如硫甲基、硫乙基及硫丙基)、磷酸或磷酸烷基官能团，且最优选磷酸官能团连接的阳离子交换剂。进行阳离子交换层析的步骤中，在装载进肝素树脂柱前，将步骤(iii)或(iiiD的溶液用适宜肝素树脂的结合缓冲液平衡。结合缓冲液优选包括NaCl及非离子型表面活性剂(例如Tween-80)， 且NaCl优选以低浓度(0.3 0.4M)使用。之后，样品施加阳离子交换层析，然后将蛋白从树脂洗脱下。洗脱方法优选使用NaCl阶段性梯度。更优选使用含0.611，0.711，0.811及说的NaCl的洗脱缓冲液洗脱希望的Ll蛋白。(V)浓缩
根据优选实施方式，将通过上述层析得到的Ll蛋白级分用膜滤器浓缩。优选将层析级分使用能截留分子量50 IOOkDa的蛋白的膜来浓缩。由于VLP具有平均约50nm的大小，相比其他蛋白大，从而无法通过膜而被浓缩，而大部分残余杂质能通过膜而被除去。从而，此步骤不仅增加HPV 16L1蛋白的纯度，还提高HPV 16L1蛋白的浓度。本发明的制备方法在进行本发明的层析步骤前通过利用在特定条件下处理细胞勻浆而除去杂质的方法来使Ll蛋白的纯化效力最大化。用硫酸铵沉淀细胞勻浆来首次除去杂质，然后在低浓度盐条件下温育来二次除去杂质。上述方法可除去约80%的杂质及回收不少于80%的Ll蛋白，从而简单地提高纯度。因此，本发明的方法具有许多优势，例如 (a)无需进行多个层析步骤而以高纯度纯化Ll蛋白；(b)将此方法应用于以试验及工业规模生产及纯化，则可显著节约生产蛋白中所需要的时间、成本及人工。本发明另一方面提供了编码16型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP) 的核酸序列，其含SEQ ID NO :1的核苷酸序列。此外，本发明提供编码18型人乳头瘤病毒 (HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列，其含SEQ ID NO 3的核苷酸序列。本发明另一方面提供了酿酒酵母(保藏号KCCM11036P)，其经上述编码16型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列转化。此外，本发明提供酿酒酵母(保藏号KCCM11037P)，其经上述编码18型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列转化。SEQ ID NO :1及SEQ ID NO 3的核苷酸序列经优化以高效表达编码HPV Ll蛋白的核苷酸序列。发明效果将本发明的特征及优势总结如下(a)人宫颈癌的药物疫苗组合物利用HPV 16L1VLP、HPV 18L1VLP，或者HPV 16L1VLP及HPV 18L1VLP作为抗原，及脱酰基化的非毒性LOS作为免疫佐剂。(b)脱酰基化的非毒性LOS在针对HPV的免疫应答中具有非常优良的免疫刺激效果，及由于几乎无细胞毒性而具有更高安全性。(c)此外，脱酰基化的非毒性LOS通过增强由HPV LlVLP诱导的Thl型免疫应答 (细胞免疫)及Th2型免疫应答(体液免疫)两者来协同诱导针对HPV的免疫应答。(d)本发明的药物疫苗组合物在针对HPV的Thl型免疫应答(细胞免疫)及Th2 型免疫应答(体液免疫)中均优于Cervarix 及Gardasil ，作为人宫颈癌疫苗表现出优良功效。(e)本发明的HPV LlVLP制备方法允许通过一个层析步骤以高纯度纯化Ll蛋白， 及将此方法应用于以试验及工业规模生产及纯化，则具有可显著节约生产蛋白中需要的时间、成本及人工的效果。


图1 2是表达16型及18型HPV LlVLP蛋白的YEP (酵母表达载体)的DNA图谱。AmpR是氨苄西林抗性基因，是合成乳清苷5-磷酸脱羧酶的基因，2-micron是复制原点，其他表示限制性内切酶位点。图3是显示用于纯化HPV 16L1及HPV 18L1的实验过程的流程图。用2种纯化方
11法分离前，通过硫酸铵沉淀样品及以低浓度NaCl温育来除去不溶性污染物。方法1是肝素层析，方法2是阳离子交换层析方法。图4 6是显示HPV 16L1纯化结果的电泳图谱。图4显示不经过除去不溶性污染物的步骤而肝素层析后得到的样品的SDS-PAGE结果。图5是根据图3中的方法1的肝素层析的SDS-PAGE结果。图6是肝素层析后的蛋白印迹结果。泳道1及2是装载的样品及未结合的样品。泳道3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16各代表样品级分9、12、 15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45 及 48。箭标指示 Ll 蛋白的分子量。图7 8是显示HPV 16L1的纯化结果的电泳图谱。图7显示通过根据图3中的方法2的阳离子交换层析得到的样品的SDS-PAGE结果。图8是阳离子交换层析后的蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别是装载的样品、未结合的样品及洗涤的样品。泳道4、5、6、7、 8及9各代表样品级分1、2、3、4、5、6。样品级分1、2及3分别用含0. 6,0. 7及0. 8M NaCl 的缓冲液洗脱。样品级分4、5及6用含IM NaCl的缓冲液洗脱。箭标指示Ll蛋白的分子量。图9是显示合并从肝素层析及阳离子交换层析的Ll级分后，用截留大小50 IOOkDa的膜滤器浓缩的纯化的HPV 16L1样品的电泳图谱。图9A是SDS-PAGE结果，图9B 是蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别代表BSA、通过方法1纯化的HPV 16L1及通过方法2 纯化的HPV 16L1。样品使用Bradford测定法定量，各泳道装载200ng的样品。图10 11表示根据图3中的方法1及方法2纯化的HPV 16L1蛋白的电子显微镜照片。将纯化的HPV 16L1蛋白附着于包被了碳的网格，及用磷酸钨酸负染色。用透射电子显微镜以41，000X放大倍数拍摄显微照片。误差棒是lOOnm。图12 14是显示HPV 18L1的纯化结果的电泳图谱。图12显示未经过除去不溶性污染物的步骤而肝素层析后得到的样品的SDS-PAGE结果。图13是根据图3中的方法1 的肝素层析的SDS-PAGE结果。图14是肝素层析后的蛋白印迹结果。泳道1及2是装载的样品及未结合的样品。泳道3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16各代表样品级分9、 12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45 及 48。箭标指示 Ll 蛋白的分子量。图15 16是显示HPV 18L1的纯化结果的电泳图谱。图15显示根据图3中的方法2的阳离子交换层析得到的样品的SDS-PAGE结果。图16是阳离子交换层析后的蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别是装载的样品、未结合的样品及洗涤的样品。泳道4、5、6、7、 8及9各代表样品级分1、2、3、4、5、6。样品级分1、2及3分别用含0. 6,0. 7及0. 8M NaCl 的缓冲液洗脱。样品级分4、5及6用含IM NaCl的缓冲液洗脱。箭标指示Ll蛋白的分子量。图17是显示合并从肝素层析及阳离子交换层析的Ll级分后，用截留大小50 IOOkDa的膜滤器浓缩的纯化的HPV 18L1样品的电泳图谱。图17A是SDS-PAGE结果，图17B 是蛋白印迹结果。泳道1、2及3分别代表BSA、通过方法1纯化的HPV 18L1及通过方法2 纯化的HPV 18L1。样品使用Bradford测定法定量，各泳道装载200ng的样品。图18 19代表根据图3中的方法1及方法2纯化的HPV 18L1蛋白的电子显微镜照片。将纯化的HPV 18L1蛋白附着于包被了碳的网格及用磷酸钨酸负染色。用透射电子显微镜以41，000X放大倍数拍摄显微照片。误差棒是lOOnm。图20 21是显示各通过肝素层析及阳离子交换层析纯化的HPV16及18L1的中和活性的坐标图。3周间免疫接种3次纯化的Ll蛋白。血清中的中和抗体效价通过基于 SEAP的中和测定测量。X轴中，“对照”是仅用佐剂免疫接种的组；“肝素”是用通过肝素层析纯化的Ll蛋白免疫接种的组；及“阳离子交换”是用通过阳离子交换层析纯化的Ll蛋白免疫接种的组。Y轴是血清的稀释倍数。图22是显示具有低于MPL的细胞毒性(TNF-α分泌)的新佐剂CIA05的坐标图。图23 M是显示依赖于新佐剂CIA05、HPV 16L1VLP及氢氧化铝(Alum)的各种浓度混合的抗体效价(图2 及其增加倍数(图24)的坐标图。空心棒是总IgG，灰色棒是 IgGl及实心棒是IgG^i。图25是显示依赖于新的CIA05、HPV 16L1VLP及氢氧化铝(Alum)的各种浓度混合的从脾细胞的INF-γ分泌水平的坐标图。灰色棒是用HPV 16L1VLP处理2天的样品；实心棒是用HPV 16L1VLP处理3天的样品。图沈 27是显示依赖于新的CIA05、HPV 16/18L1VLP及氢氧化铝(Alum)的各种浓度混合的总IgG效价分析结果的坐标图。图沈是朋￥ 16L1VLP的总IgG效价数据，图27 是HPV 18L1VLP的总IgG效价数据。图观 四是显示依赖于新的CIA05、HPV 16/18L1VLP及氢氧化铝(Alum)的各种浓度混合的针对HPV 16L1VLP的血清中IgGl效价(图28)及IgGh效价(图29)的分析结果的坐标图。图30是显示依赖于新的CIA05、HPV 16/18L1VLP及氢氧化铝(Alum)的各种浓度混合的从脾细胞的INF-Y分泌水平的坐标图。实施方式以下通过实施例更详细说明本发明。本领域技术人员明晰，这些实施例仅旨在更具体阐述本发明，本发明的范围将由随附的权利要求书确定，而不限于这些实施例。
实施例实施例1 16及18型人乳头瘤病毒VLP Ll的蛋白表达及纯化产生16及18型HPV Ll蛋白的重组酵母表达系统的构建使用酵母(酿酒酵母)最佳密码子/表达，从序列表选择用于16型HPV LlDNA的 SEQ ID NO :1，及从序列表选择用于 18 型 HPV LlDNA 的 SEQ ID NO :3。使用 “Synthesis in BHB Standard Vectors”服务(www, blueheronbio. com)合成 DNA(参照从序列表的 SEQ IDNO :1 及 SEQ ID NO 3)。在优化的 DNA 序列两端连接 HindIII (AAGCTT)及 ClaI (ATCGAT) 限制性酶切位点。通过DNA克隆构建用于表达重组HPV16L1及HPV18L1蛋白的酵母表达载体，YEG α-HPVl6L1-0RS 及 YEG α-HPVl8L1-0RS (图 1)。以下是克隆方法用 HindIII 及 ClaI 消化编码 16 型 HPV LlDNA (SEQ ID NO 1，序列表)或 18 型 HPV LlDNA (SEQ ID NO 3，序列表)的pUCminusMCS载体(Invitrogen)及YEG-MCS酵母表达载体。电泳后使用 HiYield Gel/PCR DNA Extraction Kit(#YDF100, RBC)提取经消化的 DNA。使用连接酶 (TAKARA, 2011a)连接16型或18型HPV DNA与YEG-MCS载体，及导入dam(-)大肠杆菌感受态细胞(TAKARA，9129)。挑选经转化细胞形成的集落，培养，及通过用酶消化纯化的质粒来确定它们的大小。用确定大小的质粒转化酵母(酿酒酵母)及接种于SD(-Ura)平板。当集落开始生长时，挑选25个集落，及接种于YPDG培养基050印!11，301，振摇2天)。仅挑选在SD(_Ura)培养基中生长良好的集落接种于YPDG培养基。基于其培养时的0.D值，细胞裂解后的蛋白总量，纯化后(下述方法)ELISA及蛋白印迹分析选择最佳菌株。将经编码重组HPV16L1 及 HPV18L1 的 YEG α -HPV16L1-0RS 及 YEG α -HPV18L1-0RS 载体转化的菌株于2009年10月7日以保藏号KCCMl 1036Ρ及KCCMl 1037Ρ (KCCM11036P-酿酒酵母EG0216 ；KCCMl 1037Ρ-酿酒酵母EG0218)保藏于位于韩国、首尔、西大门区、弘济 1 洞、Yurim B/D、361_221 号的韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。细胞培养在带挡板的瓶中，将经转化的酵母菌株接种于缺乏尿嘧啶的合成的完全培养基 (SD-ura ；Clontech)中，于30°C振摇培养。为由GAL10启动子表达HPV16L1及HPV18L1蛋白而使用了 YPDG培养基。所有培养基含酵母提取物(DIFC0 Laboratories, USA), 2% 胨(DIFC0 Lab0rat0ries，USA)、l%葡萄糖及3%半乳糖。将经质粒转化的酵母菌株接种于 3L YPDG培养基中，并于30°C培养48小时。制备细胞裂解物通过离心收集培养物，并将沉淀物于-70°C保存待用。于4°C进行所有以下实验。 加入蛋白酶抑制剂混合剂(Roche，USA)前，将细胞沉淀物重悬浮于100ml冰冷的破碎缓冲液(20mM 磷酸钠，pH7. 2，IOOmM NaCl, 1. 7mM EDTA，0. 01% Tween 80)中。通过涡旋 5 分钟在Bead-Beater (Biospec Products, USA)中用玻璃珠(Sigma，USA)破碎细胞。然后将粗提取物于4°C以10，OOOg离心10分钟来除去未破碎细胞。硫酸铵沉淀通过硫酸铵(Sigma，USA)沉淀从澄清的细胞裂解物得到HPV Ll蛋白。通过加入 43%或45%硫酸铵及于4°C搅拌30分钟，然后以12，OOOg离心10分钟来得到蛋白沉淀。将由硫酸铵沉淀产生的沉淀物悬浮于PBS缓冲液+0. 01 % Tween-80，然后加入NaCl至终浓度 0. 5M或更高。将此溶液于4°C温育至少12小时。通过用低浓度NaCl温育来除去污染物将用高浓度NaCl温育的溶液用PBS缓冲液+0. 01% Tween 80透析，及用含0. 15M NaCl及0. 01% Tween 80的磷酸钠缓冲液(pH7. 2)稀释至终蛋白浓度2 5mg/ml。将此溶液于室温静置多于2小时以形成不溶性蛋白。不溶性蛋白沉淀物通过以10，OOOg离心10 分钟来去除。肝素层析对用低浓度NaCl温育的溶液进行离心，及将上清用结合缓冲液(PBS缓冲液+0. 2M NaCl pH 7. 0,0. 01% Tween 80)透析。用5倍树脂体积的结合缓冲液平衡填充了肝素树脂 (5ml或20ml)的柱(GEHeal thcare，USA)。将经透析的样品溶液装载于肝素柱而使结合， 然后用5倍树脂体积的结合缓冲液洗涤。用始于0. 33M及在35分钟后达到0. 66M的线性 NaCl梯度洗脱污染物。用浓度在0. 66M 2M范围内变化的线性NaCl梯度洗脱Ll蛋白。阳离子交换层析对用低浓度NaCl温育的溶液进行离心，及将上清用结合缓冲液(PBS缓冲液 +0. 2M NaCl pH7. 0,0. 01% Tween 80)透析。将填充P-11纤维素磷酸酯树脂的8cmX^m 的Poly-Pr印树脂柱(Whatman，UK)用5倍树脂体积的结合缓冲液平衡。将经透析的样品
14溶液装载于P-Il柱而使结合，然后用5倍树脂体积的结合缓冲液洗涤。用结合缓冲液洗涤后，通过流过4 5ml洗脱缓冲液(含0. 6M、0. 7M、0. 8M及IMNaCl的结合缓冲液)来逐步洗脱Ll蛋白。使用膜滤器的VLP浓缩收集从肝素层析或阳离子交换层析得到的HPV 16L1或HPV 18L1级分，并用含浓度0. 1 0. 325M的NaCl的PBS缓冲液+0. 01% Tween 80透析。将经透析的样品用ami con ultra YM-50 或 YM-100 (Mi 11 ipore，USA)，根据厂商说明书浓缩。SDS-PAGE及蛋白印迹根据Laemml i，s方法，使用12. 5 %聚丙烯酰胺凝胶，通过SDS-PAG电泳 (SDS-PAGE)分离样品(M. P. McCarthy, W. I. White,F. Palmer-Hill, S. Koenig, J. A. Suzich, J Virol 72(1998)32-41)。对于蛋白印迹分析，将含HPV 16L1或HPV 18L1的样品以200mA经 120 分钟从 SDS-PAG 转移到 PVDF 膜(Q-Biogene，USA)。使用兔抗 HPV 16L1 或抗 HPV 18L1 抗体(PIERCE，USA)作为第一抗体。将山羊抗兔IgG-HRP缀合物(PIERCE，USA)用作第二抗体来检测Ll蛋白。使用蛋白印迹苯巴比妥剂(Santa Cruz Biotechnology,USA)显现条
市ο电子显微镜检将纯化的HPV Ll蛋白附着于包被了碳的网格，及用2%磷酸钨酸负染色。使用透射电子显微镜TEM200CX以41，000X的放大倍数拍摄显微照片(S. N. Kim, et al.，J. Virol. Methods 139(2007)24-30) 假病毒的构建将表达HPV 16 或 HPV 18L1 蛋白及 L2 蛋白的质粒 pl6SheLL (由 National Cancer hstitute提供)及pl8SheLL(由National CanceHnstitute提供)与携带报告基因的质粒 pYSEAP (由 National CancerInstitute 提供)使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA)共转染入细胞(由National Cancer Institute提供)。将经转染的细胞培养72小时后，用裂解缓冲液(PBS+0. 5 % Brij58,0. 2% Benzonase，0. 2 %质粒-safe ATP依赖性DNA酶)破碎。将细胞碎片以12，OOOg离心10分钟来沉淀后，将澄清的细胞上清用于中和测定。小鼠免疫对6周龄雄性Balb/c小鼠在3周间皮下免疫接种3次。将各从肝素层析及阳离子交换层析纯化的2yg Ll蛋白用于免疫。将弗氏完全佐剂(Sigma)用于首次施用，之后用弗氏不完全佐剂(Sigma)进行2次追加施用。对照组施用经PBS等比例稀释的弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂。第二次追加施用10天后，将动物经尾静脉放血，及将合并的血清用于中和测定。基于SEAP的中和测定将四317细胞以3X104细胞/孔接种于96-孔培养板，及于37°C及5% 0)2培养4小时。将免疫接种16型HPV及18型HPV Ll蛋白的小鼠血清从1 100连续稀释到 1 10，000，000。然后，将血清用16型及18型HPV假病毒以1 4稀释。将经稀释的血清-假病毒混合物于4°C反应1小时后添加到生长于96-孔平板的293TT细胞，及于37°C 及在5% CO2下培养4小时。通过使用对硝基苯磷酸盐二钠盐六水合物(Sigma，USA)作为
15底物测定培养72小时后培养基中SEAP的表达水平。中和抗体效价确定为含仅经假病毒感染的细胞的孔的0. D值的半值。实验结果1. HPV 16L1的纯化结果肝素层析分析了通过肝素层析的HPV 16L1蛋白的纯化性质。以下是根据图3中的方法1的肝素层析结果。如图4所示，未通过低浓度NaCl温育步骤来除去不溶性污染物时，肝素层析结果显示高水平的不溶性污染物。但是，当用低浓度NaCl预处理样品时，肝素层析结果显示，Ll蛋白纯度增加(图5)。结合于肝素柱的蛋白用从0. 325Μ到0. 66Μ的NaCl线性梯度首次洗脱，之后用从0. 66到2Μ的NaCl梯度再次洗脱。大部分污染物在0. 325Μ 0. 5Μ 的NaCl范围内被洗脱出(图5)，且HPV 16L1蛋白在从0. 5Μ到1. 3Μ的NaCl梯度被洗脱出 (图6)。结果提示，通过与低浓度NaCl温育来除去不溶性污染物提高通过肝素层析实验的 Ll蛋白的纯度。用除去不溶性污染物的样品装载肝素层析柱是纯化Ll蛋白的有效方法。阳离子交换层析分析了通过阳离子交换层析的HPV 16L1蛋白的纯化性质。以下是根据图3中的方法2的阳离子交换层析结果。如图7及图8所示，大部分污染物通过结合于柱树脂而被除去(图7)，HPV 16L1用从0. 7Μ到IM的NaCl梯度被洗脱出(图8)。结果提示，通过与低浓度NaCl温育来除去不溶性污染物提高通过阳离子交换层析纯化的Ll蛋白纯度。经纯化的HPV 16L1的纯度合并经纯化的Ll蛋白级分，及用截留大小50 IOOkDa的膜(ΥΜ-50或ΥΜ-100) 浓缩。如图9所示，Ll蛋白纯度与可商购的BSA标准物(纯度高于96%)几乎相近(图 9Α)。可见于SDS-PAGE上的55kDa条带通过蛋白印迹被检测为单体。见不到BSA条带(图 9B)。此结果显示，通过此纯化过程纯化出高度纯化的HPV 16L1。经纯化的HPV 16L1蛋白的自我装配如图10及图11所示，根据上述2种过程纯化的HPV 16L1蛋白自我装配成形状及大小一致的具有均一的35nm或64nm(平均直径49nm)颗粒的VLP (K. A. Aires, et al.， Appl. Environ. 368Microbiol. 72(2006)745-752)。此结果显示，2 种纯化方法对 Ll 蛋白的自我装配能力无影像，提示这2种纯化方法适宜于纯化HPV 16L1蛋白。使用夹心ELISA方法分析了各纯化步骤的蛋白产率。通过细胞裂解、硫酸铵沉淀及与低浓度NaCl温育除去平均80%的污染物。这些步骤后Ll蛋白的平均回收率是81 % (表1及表幻。细胞裂解步骤时Ll蛋白纯度是0. 2%，但在通过硫酸铵沉淀除去污染物后提高到0.8 1%。蛋白纯度提高4 5倍(表1及表2)。表权利要求
1.人宫颈癌的药物疫苗组合物，其含(a)(i) · 16型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)， 18 型 HPV 的 L1VLP，或 上述之组合；及( )脱酰基化的非毒性脂寡糖(LOS)；及(b)药学可接受载质。
2.权利要求1的组合物，其中所述16或18型HPV的LlVLP通过纯化过程获得，所述纯化过程包括下列步骤(i)培养含编码所述16或18型HPV的Ll的核苷酸序列的酵母； ( )裂解所述培养的酵母；(iii)通过用硫酸铵沉淀所述酵母裂解物来除去杂质；及(iv)对已除去所述杂质的所述酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析。
3.权利要求1的组合物，其中所述非毒性LOS通过由碱处理LPS(脂多糖)的脂质A脱酰基化来脱毒。
4.权利要求1的组合物，其中所述非毒性LOS具有1，500 10，OOODa范围的分子量。
5.权利要求4的组合物，其中所述非毒性LOS具有2，000 4，OOODa范围的分子量。
6.权利要求1的组合物，其中所述非毒性LOS源于大肠杆菌(Escherichiacoli)。
7.权利要求1的组合物，其中所述药物组合物还含免疫佐剂，所述免疫佐剂是下列的盐或它们的氢氧化物 选自Mg、Ca、Sr、Ba及的II族元素； 选自Ti、Zr、Hf及Rf的IV族元素；或 iS ο
8.预防人宫颈癌的方法，包括给人施用权利要求1 7中任一项的药物组合物。
9.制备人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的方法，包括下列步骤 (i)培养含编码HPV Ll的核苷酸序列的酵母；( )裂解所述培养的酵母；(iii)用硫酸铵沉淀所述酵母裂解物以除去杂质；及(iv)对已除去所述杂质的所述酵母裂解物进行肝素层析或阳离子交换层析。
10.权利要求9的方法，其中所述HPV是16型HPV或18型HPV。
11.权利要求9的方法，其中所述方法还在所述步骤(iii)及所述步骤(iv)之间包括步骤(iii-2)另外用0. 001 0. 3M NaCl沉淀所述酵母裂解物，以除去所述杂质。
12.权利要求9的方法，其中所述阳离子交换层析用含磷酸基团的阳离子交换剂进行。
13.编码16型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列，其含SEQID NO 1的核苷酸序列。
14.编码18型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列，其含SEQID NO 3的核苷酸序列。
15.酿酒酵母(保藏号KCCM11036P)，其经权利要求13的编码16型人乳头瘤病毒 (HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列转化。
16.酿酒酵母(保藏号KCCM11037P)，其经权利要求14的编码18型人乳头瘤病毒(HPV)的Ll病毒样颗粒(VLP)的核酸序列转化。
全文摘要
本发明涉及人宫颈癌的药物疫苗组合物，其含(a)(i)16型人乳头瘤病毒(HPV)的L1病毒样颗粒(VLP)、18型HPV的L1VLP，或上述之组合；及(ii)脱酰基化的非毒性脂寡糖(LOS)；及(b)药学可接受载质；及制备人乳头瘤病毒(HPV)的L1病毒样颗粒(VLP)的方法。本发明的药物疫苗组合物在针对HPV的Th1型免疫应答(细胞免疫)及Th2型免疫应答(体液免疫)中优于CervarixTM及GardasilTM，作为人宫颈癌疫苗表现出优良功效。
文档编号A61K39/00GK102215861SQ200980111082
公开日2011年10月12日 申请日期2009年10月20日 优先权日2009年6月19日
发明者张镇旭, 李奈暻, 赵良济, 金亨真, 金光成, 金洪珍 申请人:艾金株式会社