治疗失明的新型治疗工具和方法

专利名称：治疗失明的新型治疗工具和方法
技术领域：
本发明涉及治疗失明的方法。本发明也涉及用于治疗失明的构建体，以及它们在 制造用于治疗失明的药物中的应用。
背景技术：
失明是造成世界上数百万人残疾的主要健康问题。失明的最常见成因是视网膜的 功能障碍。视网膜性失明的三种最常见形式是色素性视网膜炎(RP)、黄斑变性(MD)以及青 光眼(G)。在RP和MD中，首要问题是光受体的变性以及随之发生的光敏感性的丧失。因 此，需要能够避免与此种光受体变性相关的问题。一种方法是开发视网膜赝复体，该视网膜赝复体是在眼睛中植入有多达1，000个 微小电极的“导盲”芯片。这将具有帮助已经丧失视力的人重获足够的视力以独立活动的 潜能，但是电极的数量完全不够提供要获得之高的视力程度或水平。此外，存在与向眼睛中 插入外来物相关的问题。近来，已经分离和/或利用了许多基因，这些基因在表达时可以使细胞对光敏感。 在一些情形下，也需要其它非遗传因子来使细胞对光敏感。Eli在2001年的一个提议是使用菠菜中的含叶绿素的蛋白质来治疗视力丧失。这 些蛋白质在捕获入射光的光子能量后释放小的电压。尽管该研究显示出因为在被光照射时 产生了电压的实验上的等效物而可将光系统I反应中心引入脂质体并且显示出可行使功 能，但是迄今，这还没有显示出在视网膜细胞中有影响。加州大学伯克利分校(UC Berkeley)的神经生物学家Richard Kramer进行的其 它工作着眼于负责光而非电压的钾通道的重新改造，以便允许向通常对光不敏感的脑细胞 中插入光活化的开关。然而，必须将该通道突变以便它总是保持开启并且对于光敏感的化 学“插头”与该通道相连以便当用长波长UV光照射时，从该通道释放插头，使得钾从通道外 流。较长波长的光造成插头插回到通道中并使钾的释放停止。然而应理解的是，这样的系 统是极其复杂的并且如果将该通道送至错误的视网膜细胞类型，那么很可能引起问题。Bi等人(Neuron，50，2006，第23-33页)公开了微生物型视紫红质用于使光受体 变性的小鼠回复视觉反应。然而，视紫红质基因的表达很可能在眼睛中的多种类型的细胞 中发生，这可能是不想要的和/或有问题的。产生反应所需的临界光强度似乎也比用于正 常视杆和视椎光受体的要高很多，但是没有教导这将如何在诸如低亮度环境下工作。本发明的一些发明人已经在W0-A-2008/022772中描述了替代的方法，其中，例 如，将视紫红质通道蛋白_2靶向诸如ON-细胞。然而，这一方法存在对于OFF细胞不理想 的缺点。本发明的目的之一在于避免和/或改善上述缺点中的至少一种。本发明的一个目的还在于提供适于用来预防和/或治疗受试者失明的系统。发明概述为了满足这一需要，本发明的发明人研究了在用于失明的实验模型中，在视杆和 视椎光受体中特异表达的、系统发育上古老的超极化光传感器，如来自archeon (古生菌)Natronomas pharaonis (NpHR)的盐细菌视紫红质，用于恢复视力的能力。出人意料地，发明 人认识到这一受体自身在被导入视杆和视椎光受体时能够刺激ON-和OFF-系统，并且自身 能恢复一些视力，即不需要任何的通常在视杆和视椎光受体中发现的大量其他光转导级联 组分。因此，本发明涵盖分离的核酸分子，包括编码来自古生菌的超极化光门控离子通 道或泵基因或者所述基因的光活性片段的核苷酸序列，或者与所述核苷酸序列互补的核苷 酸，以用于治疗或改善失明。所述光门控离子通道或泵基因可以是盐细菌视紫红质基因，例 如来自Natronomaspharaonis (NpHR)的盐细菌视紫红质基因。本发明的分离的核酸分子可以通过给予视锥、视杆、水平细胞、视杆双极细胞、 ON-视锥双极细胞、OFF-视锥双极细胞、无长突细胞、节细胞中至少一种并在其中表达来使 用。因此，本发明的分离的核酸分子可以包括控制光门控离子通道或泵基因表达的细胞特 异性启动子，例如人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子，Grm6启动子。此外，该分离的核酸分子可以与去极化光门控离子通道基因，如视紫红质通道蛋 白(charmelrhodopsin)，如视紫红质通道蛋白-2 —起同时或顺序使用。例如，该去极化光 门控离子通道基因可以处于人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子和Grm6启动子的控制 下。本发明也涵盖用于治疗失明的分离的核酸分子，包括编码超极化光门控离子通道 或泵基因的核酸序列或者编码去极化光门控离子通道或泵基因的核酸序列。其一个实施方 式为分离的核酸分子，其中所述超极化光门控离子通道或泵基因是盐细菌视紫红质，例如， 来自Natronomas pharaon is (NpHR)的盐细菌视紫红质，并且所述去极化光门控离子通道基 因是视紫红质通道蛋白，例如视紫红质通道蛋白_2。这一情形下，该超极化光门控离子通道 或泵以及该去极化光门控离子通道可以以在表达时形成融合蛋白的方式来编码。此外，所 有基因都可以共同地或者独立地处于启动子的控制下，该启动子选自人视紫红质启动子， 人红视蛋白启动子和Grm6启动子。本发明还涵盖包括本发明核酸的重组载体或包括所述载体的宿主细胞。此外，本发明也涵盖试剂盒，其包括本发明分离的核酸分子，包括所述分子的重组 载体或包括所述载体的宿主细胞。


图 1 :AAV2-Rho-NpHR-EYFP 基因组载体图2 小鼠的AAV-NpHR-感染的视网膜(灰)和未处理的对照视网膜(黑)的光 谱调谐曲线(请注意小鼠通常不具有红光敏感型受体)(光ON期间，对每种细胞和光水平 归一化的尖峰的平均总数)。发明详述为了满足这一需要，本发明的发明人研究了在用于失明的实验模型中在视 杆和视椎光受体中特异表达的、系统发育上古老的超极化光传感器，如来自古生菌 Natronomaspharaonis (NpHR)的盐细菌视紫红质，用于恢复视力的能力。出人意料地，发明 人认识到这一受体自身在被导入视杆和视椎光受体时能够刺激ON-和OFF-系统，并且自身 能恢复一些视力，即不需要任何的通常在视杆和视椎光受体中发现的大量其他光转导级联组分。本发明因此涵盖分离的核酸分子，包括编码来自古生菌的超极化光门控离子通道 或泵基因或者所述基因的光活性片段的核苷酸序列，或者与所述核苷酸序列互补的核苷 酸，以用于治疗或改善失明。所述光门控离子通道或泵基因可以是盐细菌视紫红质基因，例 如来自Natronomas pharaonis (NpHR)的盐细菌视紫红质基因。本发明的分离的核酸分子可以通过给予视锥、视杆、水平细胞、视杆双极细胞、 ON-视锥双极细胞、OFF-视锥双极细胞、无长突细胞、节细胞中至少一种并在其中表达来使 用。因此，本发明的分离的核酸分子可以包括控制光门控离子通道或泵基因表达的细胞特 异性启动子，例如人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子，Grm6启动子。此外，该分离的核酸分子可以与去极化光门控离子通道基因，如视紫红质通道蛋 白，如视紫红质通道蛋白_2 —起同时或顺序使用。例如，该去极化光门控离子通道基因可 以处于人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子和Grm6启动子的控制下。本发明也涵盖用于治疗失明的分离的核酸分子，包括编码超极化光门控离子通道 或泵基因的核酸序列或者编码去极化光门控离子通道或泵基因的核酸序列。其一个实施方 式为分离的核酸分子，其中所述超极化光门控离子通道或泵基因是盐细菌视紫红质，例如， 来自Natronomas pharaon is (NpHR)的盐细菌视紫红质，并且所述去极化光门控离子通道基 因是视紫红质通道蛋白，例如视紫红质通道蛋白_2。这一情形下，该超极化光门控离子通道 或泵以及该去极化光门控离子通道可以以在表达时形成融合蛋白的方式来编码。此外，所 有基因都可以共同地或者独立地处于启动子的控制下，该启动子选自人视紫红质启动子， 人红视蛋白启动子和Grm6启动子。本发明还涵盖包括本发明核酸的重组载体或包括所述载体的宿主细胞。此外，本发明也包括试剂盒，其包括本发明分离的核酸分子，包括所述分子的重组 载体或包括所述载体的宿主细胞。此外，本发明也涵盖使用本发明的分离的核酸分子或载体来治疗失明的方法。本发明也涵盖包括本发明核酸分子的组合物。所述组合物可以是可药用的组合 物。此外，本发明的核酸分子可以用于制造药物和/或治疗患者。因此，本发明也涵盖 使用本发明核酸分子进行治疗的方法。应理解，该药物通常是在治疗上使用的，但它可用于预防疾病的意义上，即当受试 者被鉴定为可能罹患失明，但尚未发生或仅小量发生实际的视力丧失。“失明”意指完全或部分的视力丧失。通常，该药物可用于治疗与黄斑变性、青光眼 和/或色素性视网膜炎相关的失明。然而，应理解可使用该药物治疗任何导致眼睛中光受 体变性或无功能的疾病或病症。此外，不希望受任何理论限制，相信在光受体功能丧失但光 受体-双极突触可能仍旧完整时，本发明将尤其对于治疗在视网膜变性(rd)早期的失明是 有效的。“光门控离子通道或泵的活性片段”是这样的片段，当其表达时产生仍旧能够作为 光捕获分子发挥功能的多肽，其造成随后的离子流入或流出该通道所定位的细胞以及由此 的电压改变。“超极化”意指细胞膜电位的降低。“去极化”意指细胞膜电位的增加。
应理解，本发明也延及通过向罹患或倾向于发生失明的患者给予根据本发明的 DNA构建体来预防性地或治疗性地治疗失明的方法，该DNA构建体包括光门控离子通道或 泵基因序列或其活性片段，该基因序列或其片段能够在视网膜细胞中表达一或多拷贝的光 门控离子通道或泵蛋白，从而所述一或多拷贝的光门控离子通道或泵蛋白的表达导致细胞 光敏感性以便能够治疗或改善失明。通常，本发明的光门控离子通道或泵基因序列或其片段可以以包括所述光门控离 子通道基因序列或其活性片段的重组分子的形式给予受试者，所述光门控离子通道基因序 列或其活性片段在适当的转录/翻译控制下以允许所述光门控离子通道或泵蛋白在给予 受试者的视网膜细胞时表达。应理解，该光门控离子通道或泵序列或其片段可处于适当启 动子，如组成型和/或可控启动子的控制下。本发明因此也提供包括光门控离子通道或泵基因序列或其活性片段的本发明重 组分子以用于治疗。该重组分子可为质粒、噬粒或病毒载体的形式。另外，可生产重组表达 的或化学合成的光门控离子通道或泵蛋白，或者其功能上重要的片段并将它通过适当的软 膏或其他药学介载体施用于眼睛作为治疗或预防措施来治疗前述疾病。用于基因疗法的许多不同的病毒和非病毒载体以及它们的递送方法是已知的，例 如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral vectors)载体、疱 疹病毒载体、脂质体、裸露的DNA给药等。Wright教导了用于将基因递送到期望的眼睛细胞 中的可能技术的详细综述(Br J Ophthalmol，1997 ;81 :620-622)，其在此通过引用作为参 考。此外，例如，也可使用由Neurotech开发的微囊化细胞技术。光门控离子通道或泵基因是盐细菌视紫红质基因并且如果需要则可以与视 紫红质组合，该视紫红质例如来自微生物的视紫红质，例如单胞藻，通常来自衣藻属 (Chlamydononas)物种，特别是莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。优选的视紫红质 是视紫红质通道蛋白_2 (ChR2)，其是来自莱茵衣藻的光门控阳离子通道，参见例如Boyden 等人，2005(NatureNeuroscience，8，9 ； 1263-1268)和 TO-A-2003/084994。优选地，要被给予药物或载体的细胞，以及要表达该基因的细胞是视杆双极细胞、 ON视锥双极细胞、OFF视锥双极细胞、水平细胞、无长突细胞和节细胞。此外，丧失了光敏感 性，但是未“死”的光受体细胞(视杆和视锥细胞)自身可以用于表达光门控离子通道或泵 基因。此外，光门控离子通道或泵基因在光受体中的表达可用于阻止变性或显示降低的变 性。应理解的是，优选本发明的光门控离子通道基因的表达以细胞特异性启动子的 方式被控制。因此，细胞特异性启动子可用于确保该光门控离子通道基因只在特异的细 胞类型中表达。例如，可使用mGluR6启动子(Ueda等人，J Neurosci. 1997May 1 ；17(9) 3014-23)来控制在ON-双极细胞中的表达。光门控离子通道或泵蛋白一旦在适当的视网膜细胞中表达，就插入细胞的质膜 中，导致细胞对光敏感并且能够响应光而造成离子(阳离子或阴离子)输送。然而，尽管已 知由于光受体的适应性质而使视网膜对于非常大范围的光强度是敏感的，但是光门控离子 通道或泵可能不能适应并且可能因此只响应于窄范围的光强度。如果是这种情形，那么此 种限制可通过使用本领域已知的图像增强器和/或图像转换器来缓解。例如，已用上述方 法治疗的患者可佩戴例如安装在眼镜上的图像增强器等。
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作为实例，图像增强装置，如Telesensory提供的那些(http://www. telesensory. com)可与 Microvision 开发的视网膜扫描装置(RSD) (http //www, microvision. com/milprod. html)组合，以提供能够直接向视力受损的患者的视网膜递送 明亮、增强的图像的头戴式设备(http //www, telesensory. com/home8. html)。简言之，RSD 将图像投射到视网膜上以便个体可以观看到大的全动态图像而不需要其他屏幕或监控器。 因此，通过将增强的图像直接投射到视力受损的个体的视网膜，可能能改善被认为将失明 的那些人的视力。在视网膜双极或节细胞中表达光门控离子通道或泵的情形下，视网膜的网络处理 能力的一些方面可能丧失。例如，如果光激活双极或节细胞，那么可能丧失介导侧抑制的水 平细胞。在这些情形下，诸如处理器的视网膜(D. Balya和B. Roska :“Retina model with real time implementation",International Symposium on Circuits and Systems ISCAS 2005，Kobe, Japan, May,第 5222-5225 页，也参见 http://www. anafocus. com/ 禾口 http:// www. eutecus. com/)可以与 Microvision 系统组合。如前所述，如果光门控离子通道或泵在光受体中表达，那么在光受体中光响应的 极性可以逆转。这可以通过逆转投射图像的极性而校正暗像素变亮而亮像素变暗。本领域技术人员将根据在此的教导而显见本发明的这些和其他方面。为了方便，下面也提供在说明书、实施例、所附权利要求中使用的某些术语和短语 的含义。除非上下文中明确地指出，否则单数形式的“一”、“该”包括复数。“Archaea(古生菌)”是一类原核单细胞微生物。在这方面它们与细菌相似但这两 类进化不同，并且在三域系统中被分为不同的域。最初这些生物被命名为古细菌。尽管在 系统发生上仍存在不确定，Carl Woese于1977年将古生菌、真核生物和细菌引入作为三域 系统分类法的基础。如原核生物一样，在传统的五界Lirmaean分类法中，也将古生菌归类 在原核生物界。尽管它们的原核细胞结构与细菌的相似，但是古生菌的基因和其若干代谢 途径更与真核生物的那些密切接近。解释其的一个方法是将古生菌和真核生物一起分类到 Neomura进化枝，其可能起于革兰氏阳性细菌。另一方面，其它研究表明古生菌可能替代成 为世界上最古老的谱系，细菌和真核生物从该组趋异。古生菌最初描述于极端环境中，但是 自从发现后在所有生态环境中找到它们而且可能占总生物质的至多20%。这些细胞在海洋 中由其常见，并且浮游生物中的古生菌可能是星球上最丰富的生物群落之一。来自该域单 一个体或者物种称为古生菌(有时拼写为“archeon”)，而其形容词性词拼写为archaeal
arChaean0“盐细菌视紫红质”是对于氯离子特异的、光驱动型离子泵，并且存在于被称作“盐 细菌”的系统发育上古老的“细菌”(古生菌)中。它是视黄醇(retinylidene)蛋白家族 中的7-跨膜蛋白，与光驱动型质子泵细菌视紫红质同源，并且与脊椎动物视紫红质在三级 结构上类似(但一级结构不同)，脊椎动物视紫红质是在视网膜中感应光的色素。盐细菌视 紫红质也与作为光驱动型离子通道的视紫红质通道蛋白具有序列相似性。盐细菌视紫红质 含有必要的光可异构化(light-isomerizable)的维生素A衍生的全反式视黄醛。盐细菌 视紫红质是少数晶体结构已知的膜蛋白之一。盐细菌视紫红质同工型可以见于多种盐细菌 中，包括盐沼盐杆菌OLsalinarum)和N. pharaonis。许多进行中的研究正在探讨这些差异，并且使用它们来分析区分光周期和泵特性。继细菌视紫红质之后，盐细菌视紫红质可能 是所研究的最佳的I型(微生物)视蛋白。盐细菌视紫红质视网膜复合体的峰值吸收约为 570nm。近来，盐细菌视紫红质已经成为光发生学(optogenetics)中的工具。正如蓝光激 活的离子通道视紫红质通道蛋白-2展示了利用蓝光的短脉冲(brief pulse)激活可激发 细胞(例如神经元、肌肉细胞、胰脏细胞和免疫细胞)的能力，盐细菌视紫红质展示了利用 黄光的短脉冲使可激发细胞沉默的能力。因此，盐细菌视紫红质和视紫红质通道蛋白一起 使得多色光激活、沉默以及使神经活性去同步化、产生强有力的神经改造工具盒。“多核苷酸”和“核酸”在此互换使用，都指任何长度的聚合形式的核苷酸，无论是 核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。因此，这些术语包括但不限于单_、双_、或多-链DNA或 RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或者其他天然的、化学或生 化修饰的、非天然的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。这些术语还包括但不限于包括有内 含子序列的mRNA或cDNA。多核苷酸的骨架可以包括糖和磷酸基团(如通常可见于RNA或 DNA中)，或者修饰的或取代的糖或磷酸基团。或者，多核苷酸骨架可以包括合成亚基如亚 磷酰胺的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷亚磷酰胺或混合的亚磷酰胺_磷酸二酯寡聚 体。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其 他糖、以及连接基团如氟核糖(fluororibose)和thioate，以及核苷酸支链。核苷酸序列 可被非核苷酸组分打断。多核苷酸还可在聚合后被修饰，如通过与标记组分缀合。这一定 义中包括的其他类型的修饰是加帽、一或多个天然发生的核苷酸被类似物的取代、以及用 于将该多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他核苷酸或固体支持物的手段的引 入。术语“多核苷酸”也涵盖肽性核酸、PNA和LNA。多核苷酸还可包括基因组DNA、cDNA或 DNA-RNA杂合体。“序列同一性”指相似性或互补性程度。可能是部分同一性或完全同一性。部分互 补序列是至少部分抑制相同序列与靶多核苷酸杂交的序列；提及时使用功能性术语“基本 上相同”。可使用杂交检测法(Southern或Northern印迹，溶液杂交等)，在低严谨性条件 下检测完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上相同序列或探针将在低严谨性条件下与 完全相同序列或探针竞争和靶序列的结合(即杂交)或者抑制该结合。这并不意味着低严 谨性条件是允许非特异性结合；低严谨性条件需要两个序列彼此的结合是特异的(即选择 性)相互作用。可通过使用甚至缺乏部分程度的互补性(例如，低于约30%同一性)的第 二靶序列来检测非特异性结合的缺失；在没有非特异性结合时，探针将不与该第二非互补 靶序列杂交。就两核酸或多肽序列而言，另一种观察序列同一性的方法包括在比对特定区域的 最大一致性时，对两序列中相同的残基的参考。如在此使用，序列同一性百分数意指通过 在比较窗中比较两最佳比对序列所测定的数值，其中比较窗中的那部分多核苷酸序列可包 括为了两序列最佳比对而相比于参考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，空 位)。该百分数是通过测定在两序列中都出现相同核酸碱基处的位置数来得到匹配位置数， 将该匹配位置数除以比较窗中的总位置数并将结果乘以100以得到序列同一性百分数。“基因”指包括产生多肽或前体所需的控制和编码序列的多核苷酸序列。多肽可以 由全长编码序列或由编码序列的任何部分所编码。基因可由未被打断的编码序列组成或者 它可包括由适当的拼接位点所结合的一或多个内含子。此外，基因可在编码或非翻译区含有一或多个可影响表达产物的生物活性或化学结构、表达率或表达控制方式的修饰。此种 修饰包括但不限于一或多个核苷酸的突变、插入、缺失以及取代。在这一方面，此种修饰的 基因可被称作“天然”基因的“变体”。“表达”通常指多核苷酸序列经历成功的转录和翻译以便表达出可检测水平的氨 基酸序列或蛋白质的过程。在此的某些上下文中，表达指mRNA的生产。在其他上下文中， 表达指蛋白质的生产。“细胞类型”指来自给定来源(例如组织或器官)的细胞或者处于给定分化状态的 细胞，或者与给定病理学或遗传组成相关的细胞。“多肽”和“蛋白质”在此互换使用，都指任何长度的聚合形式的氨基酸，其可包括 翻译的、未翻译的、化学修饰的、生化修饰的、和衍生的氨基酸。多肽或蛋白质可为天然发生 的、重组的或合成的，或者这些的任何组合。此外，多肽或蛋白质可包括天然发生的蛋白质 或肽的片段。多肽或蛋白质可为单分子或可为多分子复合物。另外，此种多肽或蛋白质可 具有修饰的肽骨架。该术语包括融合蛋白质，包括与异源氨基酸序列融合的蛋白质，具有异 源和同源前导序列，具有或不具有N端甲硫氨酸残基，经免疫标记的蛋白质的融合体，等。“蛋白质片段”指作为另一蛋白质的一部分的蛋白质。例如，蛋白质片段可包括通 过消化从培养细胞分离的全长蛋白质所获得的多肽。在一个实施方式中，蛋白质片段包括 至少约6个氨基酸。在另一实施方式中，该片段包括至少约10个氨基酸。在又另一实施方 式中，蛋白质片段包括至少约16个氨基酸。 “表达产物”或“基因产物”是生物分子，如蛋白质或mRNA，它是在生物中的基因被 转录或翻译或翻译后修饰时所生产的。“宿主细胞”指微生物，原核生物细胞、真核生物细胞或作为单细胞实体培养的细 胞系，其可用作或者已经用作重组载体或者多核苷酸的其他转移物的接受体，并且包括已 经被转染的原始细胞的后代。由于天然的、偶然的或故意突变，单细胞的后代可不必与原始 亲本在形态学或基因组或总DNA染色体上完全相同。术语“功能等效物”旨在包括天然基因或病毒的“片段”、“突变体”、“衍生物”、“等 位基因”、“杂合体”、“变体”、“类似物”或“化学衍生物”。“分离的”指处于与多核苷酸、多肽、免疫球蛋白、病毒或宿主细胞天然发生的环境 不同环境下的多核苷酸、多肽、免疫球蛋白、病毒或宿主细胞。“基本上纯化的”指这样的化合物，其从天然环境中移出并且至少约60%不含、至 少约65%不含、至少约70%不含、至少约75%不含、至少约80%不含、至少约83%不含、至 少约85%不含、至少约88%不含、至少约90%不含、至少约91%不含、至少约92%不含、至 少约93%不含、至少约94%不含、至少约95%不含、至少约96%不含、至少约97%不含、至 少约98%不含、至少约99%不含、至少约99. 9%不含、或至少约99. 99%不含、或者更高地 不含与其天然相关的其他组分。“诊断”通常包括受试者对于疾病或病症的易感性的测定、受试者目前是否受到疾 病或病症影响的测定、受疾病或病症影响的受试者的预后(例如，转移前或转移性癌症状 态、癌症阶段的鉴定，或者癌症对于治疗的反应性)以及therametrics (例如监控受试者状 况以提供关于治疗效果或效力的信息)。“生物样品”涵盖多种获自可用于诊断或监控检测的生物的样品类型。该术语涵盖
9生物源的血液和其他液体样品、固体组织样品，如活检标本，或者组织培养物或来自该组织 培养物的细胞以及其后代。该术语特别涵盖临床样品并且还包括细胞培养物中的细胞、细 胞上清物、细胞裂解物、血清、血浆、尿、羊水、生物流体以及组织样品。该术语也涵盖在取得 后以任何方式被操作的样品，如用试剂处理、溶解、或富集某些组分。“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在此互换使用，都指需要诊断、处理或治疗的 任何哺乳动物受试者。在一个优选的实施方式中，个体、受试者、宿主或患者是人类。其他 受试者可包括但不限于牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、灵长类和小鼠。“杂交”指多核苷酸序列通过碱基配对结合互补序列的任何过程。杂交条件可以通 过例如，预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺浓度，或者通过杂交温度来限定，并且是本领域 公知的。杂交可以在多种严谨性条件下发生。“严谨性条件”指探针可与其靶多核苷酸序列杂交而不与其他序列杂交的条件。严 谨性条件是序列依赖性的(例如较长序列在较高温度下特异杂交)。通常，严谨性条件被选 择为在限定离子强度和PH下比特异序列的溶解温度(Tm)低约5°C。Tm是50%与靶序列互 补的探针与该靶序列杂交处于平衡状态下的温度(在限定的离子强度、PH和多核苷酸浓度 下)。典型地，对于短探针(例如10至50各核苷酸)，严谨性条件将是在约pH7. 0至约pH 8. 3下离子浓度至少约0. 01至约1. OM钠离子浓度(或其他盐)以及温度至少约30°C。严谨性条件也可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。“生物分子”包括多核苷酸和多肽。“生物活性”指蛋白质或肽的生物行为和效果。可在细胞水平和分子水平来影响蛋 白质的生物活性。例如，可通过在分子水平的改变来影响蛋白质的生物活性。例如，反义寡 核苷酸可阻止特定mRNA的翻译，从而抑制由该mRNA所编码的蛋白质的生物活性。此外，免 疫球蛋白可结合特定蛋白质并且抑制该蛋白质的生物活性。“寡核苷酸”指包括例如约10个核苷酸(nt)至约IOOOnt的多核苷酸序列。用于 本发明的寡核苷酸长度为，例如约15nt至约150nt，例如约150nt至约lOOOnt。寡核苷酸 可为天然发生的寡核苷酸或者合成的寡核苷酸。“修饰的寡核苷酸”和“修饰的多核苷酸”指在所有或任何的碱基、糖部分、核苷酸 间磷酸键的天然分子结构的分子水平上，具有一或多个化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸， 以及在这些位点具有添加的取代基或这些修饰的组合的分子。核苷酸间磷酸键可为磷酸二 酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、亚氨酸乙酯(acetamidate)、氨基甲 酸酯、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥 接硫代磷酸酯或砜核苷酸间键、或3' -3' ,5' -3'或5' -5'键，以及此种类似键的组 合。磷酸二酯键可被取代键所代替，例如硫代磷酸酯、甲氨基、磷酸甲酯、氨基磷酸酯和胍， 并且多核苷酸的核糖亚基也可被取代(例如己糖磷酸二酯；肽性核酸)。修饰可为寡核苷酸 分子内部的(单个或重复)或者在端部，并且可包括对于分子添加核苷酸间磷酸键，如切割 相反链或相关酶或其他蛋白质或者与它们交联的脱氧核糖和磷酸修饰。术语“修饰的寡核 苷酸”和“修饰的多核苷酸”也包括对糖部分有修饰的寡核苷酸或多核苷酸(例如，3'-取 代的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体)，任意这些寡核苷酸或多核苷酸通过5’到3’键结 合在一起。“生物分子序列”或“序列”指全部或者部分的多核苷酸或多肽序列。
术语“可检测的”指通过本领域熟练技术人员公知的聚合酶链式反应(PCR)、反转 录酶(RT)PCR、差异显示和Northern分析的标准技术而可检测的多核苷酸表达类型。类似 地，多肽表达类型可通过包括诸如Western印迹的免疫检测法的标准技术而被“检测”。“靶基因”指通常源自生物样品，为其设计寡核苷酸探针以特异性杂交的多核苷 酸。或者将检测靶多核苷酸的存在与否，或者将量化靶多核苷酸的量。靶多核苷酸具有与 针对于该靶标的相应探针的多核苷酸序列互补的序列。靶多核苷酸也可指探针所针对的较 大多核苷酸的特异子序列或者想要检测其表达水平的整个序列(例如基因或mRNA)。“靶蛋白”指通常源自生物样品、被蛋白质捕获剂特异杂交或结合的多肽。或者将 检测靶蛋白的存在或不存在，或者将量化靶蛋白的量。靶蛋白具有被针对于靶标的相应蛋 白质捕获剂所识别的结构。靶蛋白或氨基酸也可指蛋白质捕获剂所针对的较大蛋白质的特 异子结构或者想要检测其表达水平的整个结构(例如基因或mRNA)。“互补”指探针分子与其靶标的相互作用表面的拓扑兼容性或匹配在一起。靶标及 其探针可以描述为互补体，并且接触表面特性是彼此互补的。核苷酸或核酸之间，例如双链 DNA分子的两条链或者寡核苷酸探针及靶标之间的杂交或碱基配对是互补的。“标记”指能够或者是直接的或者通过与信号产生系统的一或多个其他成员相互 作用而提供可检测的信号的试剂。可直接检测的并且可用于本发明的标记包括荧光标记。 特异的荧光团包括荧光素、罗丹明、B0DIPY、花青染料等。术语“融合蛋白”指由两种或更多种多肽构成的蛋白质，它们尽管通常在天然状 态下不结合，但是通过它们各自的氨基和羧基末端经肽键而结合在一起以形成一个连续多 肽。应理解的是该两种或更多种多肽组分可以直接结合或者通过肽接头/间隔物而间接结
I=I O术语“正常生理条件”意指在活生物体或细胞内部的典型条件。尽管一些器官或 生物体提供极端环境，但是生物体内和细胞内环境一般围绕PH7变化(即从pH 6. 5至pH 7. 5)，含有水作为主要的溶剂，并且在高于0°C且低于50°C的温度存在。多种盐的浓度取决 于用作参考的器官、生物体、细胞或细胞区室。“BLAST”指 Basic Local Alignment Search Tool，它是用于检测匹配给定检索序 列的非空位子序列的技术。“ BLASTP ”是将氨基酸检索序列与蛋白质序列数据库相比较的BLAST程序。 “BLASTX”是将核苷酸检索序列(双链)的六-框概念上的翻译产物与蛋白质序列数据库相 比较的BLAST程序。在GenBank DNA序列输入中使用“cds”来表示编码序列。编码序列是推测编码基 因的DNA序列的子序列。如在此所理解，“共有序列”或“重叠群序列”是一组组装的重叠序列，特别是在本 发明的一或多个数据库中的序列之间。本发明的核酸分子可以通过带有编码相关基因序列的核酸的病毒来生产。该病毒 可包括能够控制和/或增强该核酸表达的元件。该病毒可为重组病毒。该重组病毒也可包 括其它功能元件。例如，重组病毒可以设计为使该病毒在靶细胞中自主复制。这种情形下， 重组病毒可能需要诱导核酸复制的元件。重组病毒也可包括启动子或调控子或增强子以按 照需要来控制核酸的表达。可使用组织特异性启动子/增强子元件来调控特异细胞类型中的核酸表达。启动子可为组成型或诱导型的。“启动子”是通常定位在需要被转录的基因上游(朝向5’区)的DNA区。启动子 允许其所控制的基因的适当激活或抑制。适于本发明的启动子的实例是人视紫红质启动子 (Allocca 等人，Novel AAV serotypes efficientlytransduce murine photoreceptors, J Virol. (2007))，人红视蛋白启动子(Nathan 等人，Science. 1986 Apr 11 ；232 (4747) 193-202)，红视锥视蛋白启动子，即arr3启动子(Zhu，X.等人，Mouse cone arrestin genecharacterization :promoter targets expression to cone photoreceptors. FEBS Letters 524，116-122 (2002))或 Grm6 启动子(Masu, Μ.等人，Specific deficit of the ON response in visual transmission by targeteddisruption of the mGluR6gene. Cell 80,757-765(1995))ο天然环境的污染组分是将干扰本发明方法和组合物的物质，并且可包括酶、激素 和其它蛋白质或非蛋白质溶质。通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离试剂。在一个实 施方式中，将该试剂纯化为按重量计至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%， 至少约80%，至少约85%，至少约88%，至少约90%，至少约92%，至少约95%，至少约 97 %，至少约98 %，至少约99 %，至少约99. 9 %，或者至少约99. 99 %。在细胞中“表达”蛋白质意指确保该蛋白质存在于该细胞中，例如出于感兴趣的方 法的目的。在众多实施方式中，“表达”蛋白质将包括将包括编码该蛋白质的多核苷酸的转 基因导入细胞中，该转基因有效连接启动子以及定位序列，其中该启动子是组成型启动子， 或者在建立了足以用于诱导的条件的诱导型启动子。然而，例如，可以使用天然表达目的蛋 白质而不用操作的细胞并且这被认为是“表达”蛋白质。“荧光探针”指任何在被另一波长的光所激活时，具有发射某一波长的光的能力的 化合物。“荧光性”指荧光信号的任何可检测的特性，包括强度、光谱、波长、细胞内分布等。“检测”荧光性指使用定性或定量的方法来评估细胞的荧光性。例如，使用定量手 段，如测量荧光强度、光谱或细胞内分布来测定荧光性，使得允许对在不同条件下获得的数 值进行统计学比较。该水平也可以通过使用定性方法来测定，例如通过人对多个样品的视 觉分析和比较，该样品例如使用荧光显微镜或其它光学监测器(如图像分析系统等)所检 测。荧光性的“改变”或“调节”指在特定条件下，相比于另一条件的荧光的强度、细胞内分 布、光谱、波长或其他方面的任何可检测的差异。例如，“改变”或“调节”是定量检测的，并 且该差异是统计学上显著的差异。荧光性的任何“改变”或“调节”可以使用标准仪器如荧 光显微镜、CCD、或任何其它荧光检测器来检测，并且可以使用自动化系统，如集成系统来检 测，或者可以通过人观察者来反映改变的主观检测。以“均质形式”进行的检测意指该检测可以在单个容器中进行，而不需要操作或纯 化任何测定该检测的结果所需的组分，例如，可以向检测体系中添加检测试剂并且直接测 量任何效果。通常，此种“均质形式”检测法将包括至少一个在检测试剂存在或不存在下“被 淬灭的”或者被修饰的组分。本发明可以使用多种细胞类型中的任一种。例如，可以使用任意的真核细胞，包 括植物、动物和真菌细胞。在一些实施方式中，将使用神经元。如在此使用，“细胞”可以包 括整个细胞(未处理的细胞)、透化细胞、分离的线粒体以及脂蛋白体，如与UCP或另一目的蛋白质重构的脂蛋白体。细胞包括酵母细胞的照管和保持是本领域熟练技术人员公知 的并且可以见于多种途径的任意一种中，例如Freshney (1994)Culture of AnimalCells. Manual of Basic Technique,Wiley-Liss,New York,Guthrie & Fink(1991),Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, Ausubel 等人， (1999)Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates,以及 其它。根据染料、测试试剂以及具体的检测条件，可以密度范围广范的任意值密度使用 细胞。例如，使用密度约0D_ = 0. 01至1，例如，在约0. 05和0. 5之间，例如约0. 1。在细胞中表达异源蛋白的方法是本领域技术人员公知的并且描述于例如， Ausubel (1999), Guthrie and Fink(1991), Sherman φ 人(1982)Vlethodsineast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Freshney,以及其它。典型地,在此种实施 方式中，将编码目的异源蛋白质的多核苷酸有效地连接到用于特定宿主细胞的适当表达控 制序列上，其中该异源蛋白在该宿主细胞中表达。此种方法可以使用大量公知的启动子中 的任意。启动子的选择将取决于要实现的表达水平以及想要的细胞特异性。其他元件如聚 腺苷酸化信号，5’和3’非翻译序列等也描述于公知的参考书中。在后生生物(具有由分化成组织和器官的细胞所组成的机体的动物)细胞中， 用于表达异源蛋白的启动子和其他元件是普遍使用的并且是熟练技术人员公知的。参 见，例如 Cruz & Patterson(1973)Tissue Culture, Academic Press ；Meth.Enzymology 68 (1979), Academic Press ；Freshney, HH (1994) Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Techniques，Wiley-Liss。用于此种细胞的启动子和控制序列包括，例如普遍 使用的来自猿猴病毒40 (SV40)的早期和晚期启动子，或者其他病毒启动子，如来自多瘤病 毒、腺病毒2、牛乳头瘤病毒或者鸟类肉瘤病毒，疱疹病毒家族(如巨细胞病毒、单纯性疱 疹病毒、或EB病毒)的那些，或者免疫球蛋白启动子和热休克蛋白启动子(参见，例如， Sambrook, Ausubel, Meth. EnzymologyPouwells，等人，上文(1987))。此外，可以使用受调 控的启动子，如金属硫蛋白(即，MT-I和MT-2)，糖皮质激素，或抗生素基因“开关”。也可以 使用此种启动子的增强子区。通常将表达盒导入载体中，该载体促进表达盒进入宿主细胞并维持表达盒在宿主 细胞中的表达。此种载体被普遍使用并且是本领域技术人员公知的。许多的此种载体是 市售可得的，例如来自Invitrogen，Stratagene, Clontech等，并且描述于许多指南中，如 Ausubel, Guthrie, Strathem，或Berger，都在上文。此种载体通常包括启动子、聚腺苷酸 化信号等，结合有多克隆位点，以及其他元件如复制起点，选择标记基因(例如LEU2、URA3、 TRP1、HIS3、GFP)，着丝粒序列等。对于在哺乳动物细胞中的表达，可以使用多种载体中的任一种，例如PSV2、 PBC12BI、和p91023，及lytic病毒载体(例如，痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒)，游离型病毒 载体(例如，牛乳头瘤病毒)，以及逆转录病毒载体(例如，鼠科逆转录病毒)。如在此使用，术语“病症”指病症、疾病、小病、临床症状、或病理症状。如在此使用，术语“可药用运载体”指不干扰活性成分的生物学活性的效力的运载 体介质是化学惰性的，并且对于其所给予的患者没有毒性。如在此使用，术语“可药用衍生物”指试剂的任何同源物、类似物或片段，例如使用本发明筛选方法所鉴定的对于受试者相对无毒性。术语“治疗剂”指任何帮助预防或治疗病症或病症并发症的分子、化合物或治疗 物。可制备、封装并标记组合物用于治疗，该组合物包括在兼容的药学运载体中配制 的试剂。如果复合物是水溶性的，那么它可在适当的缓冲液中配制，例如磷酸盐缓冲的生 理盐水或其他生理学兼容的溶液。或者，如果得到的复合物在水性溶剂中具有较差的溶解性，那么它可以与非离子 表面活性剂如Tween，或聚乙二醇一起配制。因此，可配制该化合物和它们生理学可接受溶 质以通过吸入或吹入(经口或鼻)给药或者口服、口腔、非经肠道、直肠给药，或者在肿瘤的 情形下，直接注射实体瘤。对于口服给药，药物制剂可为液体形式，例如溶液、浆液或悬液，或者可作为药物 产品存在以在使用前与水或其他适当介载体重构。此种液体制剂可通过常规手段用可药 用添加剂来制备，所述可药用添加剂如悬浮试剂(如山梨醇浆，纤维素衍生物或氢化食用 脂)；乳化试剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性介载体(如杏仁油、油脂或分馏的植物 油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-P-羟苯甲酸酯或山梨酸)。例如，药学组合物可采用 片剂或胶囊的形式，所述片剂或胶囊通过常规手段用可药用赋形剂来制备，所述药学赋形 剂例如粘合剂(如预胶化的玉米淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(如 乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(如马铃薯淀 粉或羧甲淀粉钠)；或湿润剂(如十二烷基硫酸钠)。可用本领域公知的方法为片剂包衣。可适当地配制用于口服给药的制剂以给予活性化合物的受控释放。对于口腔给药，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。对于吸入给药，使用适当的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、 二氧化碳或其他适当的气体，以来自压缩包装或喷雾器的气雾喷雾呈现形式的常规递送根 据本发明来使用的化合物。在压缩气雾剂的情形下，可通过提供递送测量量的数值来确定 剂量单位。可配制用于吸入者或注入者的诸如胶制剂的胶囊和药筒以含有该化合物与适当 的粉剂基体如乳糖或淀粉的粉剂混合物。该化合物可配制用于通过注射的非经肠道给药，例如，通过快速推注注射或者连 续灌注。用于注射的制剂可以单位剂量形式存在于，例如安瓿或多剂量容器中，它们具有加 入的防腐剂。该组合物可采用悬剂、溶剂或在油性或水性介载体中的乳剂的形式，并且可含有 配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可为粉剂形式以在使用前与适当的 介载体如灭菌无热原水一起构成。该化合物也可配制成直肠组合物，如栓剂或滞留型灌肠剂，如含有常规栓剂基体 如可可油或其他甘油酯。该化合物也可配制作为局部应用，例如乳霜或乳液。除了前述制剂，该化合物也可配制成药性持久的制剂(cbpotpr印aration)。此种 长效制剂可通过埴入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如，该化合物可与适当的聚合材料或疏水材料一起配制(如配制成在可
14接受油中的乳剂)或与离子交换树脂一起配制，或作为略溶的衍生物，例如作为略溶的盐。 脂质体和乳剂是用于亲水药物的递送介载体或运载体的公知实例。需要时，该组合物可在封装或分散装置中存在，该装置可含有一或多个含活性成 分的单位剂量形式。例如，该封装可包括金属或塑料箔，例如水泡眼包装。该封装或分散装 置可带有用于给药的说明书。本发明也提供用于进行本发明治疗方案的试剂盒。此种试剂盒在一或多个容器中 包括治疗或预防上有效量的可药用形式的组合物。在试剂盒的小瓶中的组合物可为可药用溶液的形式，例如，组合灭菌生理盐水，葡 萄糖溶液或缓冲溶液或其他可药用灭菌流体。或者，复合物可为冻干的或脱水的；在这种情 况下，该试剂盒任选地还在容器中包括可药用溶液(例如生理盐水、葡萄糖溶液等)，优选 为灭菌的，以重构该复合物而形成用于注射目的的溶液。在另一个实施方式中，试剂盒还包括针或注射器，优选地以灭菌形式封装用于注 射该复合物，和/或包括封装的醇布。任选地包括说明书用于临床医生或患者进行组合物 给药。在一个实施方式中，包括编码来自古生菌的超极化光门控离子通道或泵基因，或 所述基因的光活性片段的核苷酸序列的分离的核酸分子将最终与视紫红质通道蛋白，如视 紫红质通道蛋白_2(ChR2)仅在ON-双极细胞中表达，而阳离子-指导的视紫红质通道蛋 白，如源自 Volvox carteri 的 vChRl (Zhang 等人，Red-shifted optogenetic excitation a tool for fastneural control derived from Volvox carteri,Nat Neurosci. 2008Apr 23 ；doi :10. 1038/nn. 2120)仅在OFF双极细胞中表达。不受限于任何理论，相信此三种神 经调控子的靶向表达将导致通过蓝光的ON通路的激发(ChR2组分)，以及所述ON通路通过 红光的抑制(NpHR组分)，而OFF通路将通过红光被激发(vChRl组分)。因此，蓝光将模拟 光ON而红光将模拟光OFF。相信这一体系的优点在于OFF双极细胞将被vChRl直接激发 (意味着去极化的)。不希望限于任何理论，相信这一如ChR2、NpHR和vChRl的组合以及靶 向的表达可在光受体大量损耗后提高人工光受体的光谱(更多以及不同的双极细胞，ON和 OFF)以及可建立双色视力(蓝色=白以及红色=黑)。此外，相信在ON双极细胞中的ChR2/NpHR的组合可能有助于在这两种人工光受 体之间建立明显的界限，因为它可以在红光亮时关闭ON信号而打开OFF通路。如在此所 角军释，Grm6 启动子(Masu, M.等人，Specificdeficit of the ON response in visual transmission by targeted disruption ofthe mGluR6gene. Cell 80,757-765(1995))是 能用于驱动ChR2/NpHR在ON双极细胞中表达的示例性启动子。除非另有定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域熟练 技术人员通常理解一致的含义。尽管与在此所述那些相似或等效的方法和材料可以用于实 践或检测本发明，但是下面描述了适当的方法和材料。在有冲突的情形下，本说明书包括定 义将约束。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是说明性的并且并不旨在限制本发明。
实施例遗传学方法本发明的发明人使用腺相关病毒载体AAV2/7 (Allocca等人，NovelAAV serotypes
15efficiently transduce murine photoreceptors, J Virol. (2007))在 C57BL/6 小鼠的光 ^iWrPNpHR(Zhang ^A, Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry, Nature Vol466 (2007))，介导基因转移。NpHR由人视紫红质启动子 驱动。NpHR在感染视网膜中的检测将AAV2/7-Rho-NpHR-EYFP (5. 35E+12 颗粒 /ml)视网膜下注射成年 C57BL/6 小鼠。 在注射后的不同时间点制备感染动物的视网膜。这些视网膜是针对EYFP抗体染色的以标 记表达NpHR的细胞并用DAPI使外核层(ONL)染色以使所有细胞都可视化。进行共聚焦显 微记录并且使用Bitplane’ s Imaris (5. 7. 2)软件分析这些。通过计算在共聚焦切片上相对于DAPI标记的细胞而言的表达NpHR的细胞，完成 感染的光受体的量化。AAV-感染的视网膜的多电极阵列记录通过使用限定波长和强度的光来刺激AAV-感染的视网膜的光受体。以MEA记录 节细胞的峰值输出。相比于对照的未处理视网膜，AAV感染的视网膜的光谱调谐曲线显示 出在更长的波长处，明显更高的光敏感性(图2)。结果通过这些实验，本发明的发明人能够显示出AAV2/7组合人视紫红质启动子是将 NpHR递送到光受体中的出色的工具。NpHR表达的发生非常快(注射后6天)并且在长时 期内是稳定的。如以前所报道，AAV2/7颗粒渗透整个外核层而与注射位点和ONL深度无关 (Li 等人，Cone-specificexpression using a human red opsin promoter in recombinant AAV, VisionResearch 48(2008))。在PO处的AAV感染不很有效并且可能是视杆限制的。 发现红光敏感性氯泵NpHR在视网膜移植体中有功能。所获得的结果表明NpHR可以调节 针对较高波长的光受体活性(Jacobs等人，Emergenceof novel color vision in mice engineered to express a human conephotopigment, Science, VOL 315(2007))。
权利要求
一种用于治疗或改善失明的分离的核酸分子，包括编码来自古生菌的超极化光门控离子通道或泵基因或者所述基因的光活性片段的核苷酸序列，或者与所述核苷酸序列互补的核苷酸。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中光门控离子通道或泵基因是盐细菌视紫红质基因。
3.权利要求1或2的分离的核酸分子，其中超极化光门控离子通道或泵基因是来自 Natronomas pharaonis的盐细菌视紫红质基因(NpHR)。
4.前述权利要求中任一项的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子是通过给予视 锥细胞、视杆细胞、水平细胞、视杆双极细胞、ON-视锥双极细胞、OFF-视锥双极细胞、无长 突细胞、节细胞中的至少一种并在其中表达来使用。
5.前述权利要求中任一项的分离的核酸分子，包括控制光门控离子通道或泵基因表达 的细胞特异性启动子，例如人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子，Grm6启动子。
6.前述权利要求中任一项的分离的核酸分子，其中所述超极化光门控离子通道或泵基 因与去极化光门控离子通道基因同时或顺序使用。
7.权利要求6的分离的核酸分子，其中去极化光门控离子通道基因是视紫红质通道蛋 白，如视紫红质通道蛋白-2。
8.权利要求6或7的分离的核酸分子，其中所述去极化光门控离子通道基因的表达处 于人视紫红质启动子，人红视蛋白启动子和Grm6启动子的控制下。
9.一种治疗失明的分离的核酸分子，包括编码超极化光门控离子通道或泵基因的核酸 序列和编码去极化光门控离子通道或泵基因的核酸序列。
10.权利要求9的分离的核酸分子，其中所述超极化光门控离子通道或泵基因是盐细 菌视紫红质，如来自Natronomas pharaonis的盐细菌视紫红质基因(NpHR)，并且所述去极 化光门控离子通道基因是视紫红质通道蛋白，如视紫红质通道蛋白-2。
11.权利要求9或10的分离的核酸分子，其中超极化光门控离子通道或泵以及去极化 光门控离子通道以在表达时形成融合蛋白的方式被编码。
12.权利要求9、10或11的分离的核酸分子，其中编码超极化光门控离子通道和去极化 光门控离子通道或泵的基因的表达共同地或独立地处于启动子的控制下，该启动子选自人 视紫红质启动子，人红视蛋白启动子和Grm6启动子。
13.包括权利要求1-12中任一项的核酸的重组载体。
14.包括权利要求13的载体的宿主细胞。
15.包括权利要求1-12中任一项的分离的核酸，权利要求13的重组载体或权利要求 14的宿主细胞的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种分离的核酸分子在治疗或改善失明的应用，该分离的核酸分子包括编码来自古生菌的超极化光门控离子通道或泵基因或者所述基因的光活性片段的核苷酸序列，或者与所述核苷酸序列互补的核苷酸。该光门控离子通道或泵基因可以是盐细菌视紫红质基因。
文档编号A61K38/17GK101970013SQ200980113543
公开日2011年2月9日 申请日期2009年4月16日 优先权日2008年4月18日
发明者B·罗斯卡, D·巴尔亚, P·拉加利, V·布斯坎普 申请人:诺瓦提斯研究基金会弗里德里克·米谢尔生物医学研究所