专利名称：新型标准化组合物、制造方法及其在消除rna病毒感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明的公开内容涉及抗病毒制剂。本发明的公开内容提供了从植物中获取的抗 病毒制剂，其改善免疫反应并发现可有效对抗Hiv感染、AIDS以及流感病毒和感染。
背景技术：
儿茶素是属于类黄酮(flavonoid)家族的多酚植物代谢产物。儿茶素的分子式 和分子量为C15H14Odn^OgAioL儿茶素和表儿茶素是差向异构体，用(-)_表儿茶素和 (+)-儿茶素表示，是自然界中发现的最常见的旋光异构体。原花青素或缩合单宁是类黄酮寡聚物，其结构单元(building block)为(+)_儿 茶素和(-)_表儿茶素。它们是类黄酮生物合成途径的寡聚终产物，目前在鉴定和识别它们 对人类的有益效果。它们大量存在于果实、树皮、叶子和种子的植物界中，其中它们提供对 于光、氧化和捕食者的保护。在许多植物中发现原花青素，主要有苹果、松树皮、肉桂树皮、 荔枝果皮、花生、葡萄籽、可可、葡萄皮、山桑子(bilberry)、蔓越莓(cranberry)、黑加仑 (black currant)、绿茶和红茶。基于连续单体单元之间的键合(linkage)，原花青素可以分类为A、B或C型多酚。一般地，在原花青素连续单体单元之间的键合在‘上’单元的第4位和‘下’单元 的第8位之间时，产生B型原花青素。可替换地，当该键合存在于‘上’单元的C4和下单元 的C6之间时，产生C型原花青素。B和C型多酚大量出现在许多植物源中。当连续单体单 元通过‘上’单元的C2和C4与下单元C7位和C6/C8位(各自)处的氧之间的醚键连接时， 形成A型原花青素。当与B和C型多酚相比时，A型多酚很少出现。对抗原的免疫反应免疫系统是在宿主体内通过鉴定和清除病原体而抵御疾病的一系列机制的集合。 免疫系统对病原体的反应从鉴定外源蛋白开始到最终破坏这种外源蛋白来源，从而保护该 宿主。甚至来自单细胞生物的简单蛋白质的识别都涉及一系列复杂步骤，其导致该生物从 宿主中的最终清除。这整个过程是对外源蛋白的存在或抗原的免疫反应。通过免疫系统消除感染(Resolution of infection)是对抗原的免疫反应，并且 其可以分成3阶段激活和动员(Mobilization)白细胞(WBC)在鉴定外源分子或抗原时被激活。免 疫细胞如巨噬细胞和T细胞释放可将其它免疫细胞吸引到鉴定的外源分子部位的物质，并 从而动员无数免疫细胞除去病原体。调节必须控制引发的免疫反应，以便阻止对宿主造成过度损害。调节性T-淋巴 细胞通过分泌用作免疫系统信使的细胞因子使免疫反应容易控制，从而调节放大的免疫反应。消除感染消除涉及限制病原体和从身体中清除它。在清除病原体之后，大部分 WBC被破坏，残留的那些被称为‘记忆细胞’并通过引发对病原体的早期免疫反应保护宿主将来不受相同病原体感染。当宿主不能产生足以清除病原体的强大防御时，病原体可成功地引起感染。在此 种情况下，宿主产生的抗体不足以中和现有数量的抗原。因此，游离的抗原成功地感染宿 主。在此种情况下，可利用如抗生素和抗病毒剂的外部助剂(外援物，external aid)降低 抗原数目。一旦抗原数目降低，则免疫反应足以清除病原体。HIV 感染和 AIDS:人类免疫缺陷病毒(HIV)是破坏免疫系统的逆转录病毒。这种感染可以最终导 致获得性免疫缺陷综合征(ADIS)，这是一种免疫系统无法正常工作的严重和危及生命的病 况。HIV主要感染人免疫系统中的特定细胞“辅助性” T淋巴细胞(具体为CD4+T细胞)、 巨噬细胞和树突细胞。当CD4+T细胞数目下降到低于临界水平时，细胞介导的免疫丧失，身 体逐渐变得对机会性感染更易感。HIV牛侖周期一旦HIV进入宿主，则HIV需要特定宿主细胞以促进它的复制和繁 殖。在HIV情况下，宿主细胞为T-细胞或⑶4细胞。1.宿主识别和结合HIV找到⑶4细胞并通过该细胞表面上的共同受体经由“锁 和钥”系统粘附(连接)到其上。HIV表面上的蛋白质粘附到CD4细胞上的补体蛋白。2.粘附和进入宿主在粘附之后，HIV将病毒蛋白质注射到T-细胞的细胞液(细 胞质)中。这引起该细胞膜融合到HIV外膜中。3.病毒蛋白质的分解(disassembly)为了将其遗传物质(RNA)用于繁殖，围绕 RNA的保护性包膜必须溶解。没有这个步骤，RNA到DNA (新HIV复制的结构单元)的转化 就不能发生，并且复制停止。4.逆转录一旦在细胞里，HIV的单链RNA就必须转化成双链DNA。这个步骤由逆 转录酶引起。逆转录酶利用来自T-细胞的结构单元从而帮助病毒RNA转化成DNA。该DNA 包含HIV复制所需的遗传信息。5.复制和组装成新病毒粒子为了复制，新形成的病毒DNA必须整合到宿主细胞 核中。这个过程还没有完全了解，但据认为是由病毒转运蛋白辅助进行的。在整合时，该病 毒逐步形成，同时宿主细胞制备它需要完成复制的蛋白质。一旦该材料可利用，则它们就被 病毒基于需要和结构而剪切，并随后组装成新HIV。这个过程由蛋白酶辅助进行。6.从宿主细胞中出芽病毒复制周期的最后步骤称为出芽。在遗传物质被包埋和 宿主CD4细胞的膜构成新外膜的情况下，新形成的HIV夹断并进入循环，准备再次开始整个 过程。目前干预目前干扰HIV复制和繁殖的方法包括病毒进入抑制剂、膜融合抑制剂，和逆转录 酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、成熟抑制剂等。FDA已批准许多药物用于治疗HIV 感染。这些药物中的大部分通过它们的抗逆转录病毒(ARV)的作用机制起作用。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染对全世界各国政治、经济、公共健康、社会和科学提 出了挑战。在2007年结束时，全世界估计有3320万人带有HIV/AIDS。因此，迫切需要用更 安全和更有效的药物控制和/或治疗这种疾病。这种病毒呈现的另外的挑战是其对突变的 易感性。HIV的病毒蛋白质容易发生突变，因此耐药株造成另外的威胁，其致使需要更新的 药物。
流感病毒流感是由正粘病毒科(流感病毒)的RNA病毒引起的传染性疾病，其影响鸟类和 哺乳动物。通过这种病毒的感染主要影响鼻、喉、支气管，偶尔影响肺。流感病毒的结构流感病毒分为3类流感病毒A、B和Cf。流感病毒的3种亚 型整体结构非常相似。该病毒由病毒外膜构成，该病毒外膜包含两种主要类型的环绕中心 核的糖蛋白。该中心核包含病毒RNA基因组以及包装和保护这种RNA的其它病毒蛋白。血 凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒粒子外的两种大的糖蛋白。A型流感病毒A型病毒是三种流感类型中毒力最强的人类病原体，并引起最严重 的疾病。A型流感病毒可以基于抗体对这些病毒的反应再分类成不同血清型。已在人类中 证实、按照已知人类流行病死亡人数排序的血清型为H1N1、H2N2、H3N2、H5NUH7N7, H1N2、 H9N2、H7N2、H7N3、H10N7。A型流感病毒在上世纪引起了数次流行，并继续引起每年的流 行。新的流感毒株的出现继续对公众健康和科学界提出挑战。Hmi病毒是A型流感病毒的 血清型，并为已知影响人类的毒力最强的毒株之一。Hmi血清型在1918年(西班牙流感 (Spanish Flu))致使数百万人死亡，并且最近引起猪流感全球流行。流感病毒的牛侖周期流感病毒复制和繁殖过稈概沭如下1.宿主识别和结合靶向宿主细胞的病毒利用HA蛋白结合在唾液酸上，该唾液酸 结合在上皮细胞表面上的糖上。上皮细胞典型地存在于哺乳动物的鼻、喉和肺以及鸟的肠 中。2.粘附和进入宿主在结合之后，HA蛋白被剪切并且病毒通过内吞作用进入细 胞。3.病毒蛋白质的分解病毒一旦进入细胞，内体的pH和环境条件导致a. 一部分HA将病毒包膜融合到液泡膜(vacuole membrane)。b.M2离子通道允许质子进入病毒核心，质子酸化了病毒核心，导致它的分解和病 毒RNA的随后释放以及核心蛋白质进入宿主细胞细胞质中。4.逆转录病毒RNA和核心蛋白此时被运送到细胞核中，其中RNA被转录并进一 步被翻译成病毒蛋白。5.从宿主细胞中出芽HA和NA蛋白在细胞膜附近形成簇，其随后也将病毒RNA和 核心蛋白包在其中，然后导致病毒‘出芽’和用于随后感染的繁殖。从上面详述的感染和繁殖步骤可以看出，HA和NA在感染中发挥重要作用。在释 放病毒粒子之前，NA也剪切唾液酸以便阻止HA结合到唾液酸上。A型流感病毒的目前干预美国FDA批准了两类对抗A型流感病毒的药物离子 通道抑制剂如金刚烷(金刚烷盐酸盐和金刚烷乙胺)，和神经氨酸酶抑制剂，如奥塞米韦 (TAMIFLU)和扎那米韦(RELENZA)。A型流感病毒易于突变。这些突变主要为病毒蛋白质的，如NA、HA和M2离子通道 蛋白质，因而这些蛋白质的抑制剂将对突变株无效。该突变潜力和2009年A型流感全球流 行表明迫切需要提供对抗这种病毒的治疗和预防的选择方案。现有技术Richard Anderson 等人，“Isolation and characterization ofpolyphenols Type A polymers from cinnamon with insulin-likebiological activity，，in theJournal of ARricultural and FoodChemistry, 2004, pp 52,65-70.这篇论文描述了商业肉桂的水性提取物，并且已经鉴定了在体外细胞系中增加葡 萄糖代谢约20倍的多酚聚合物。他们已使用樟属桂皮(Cirmamomum cassia) (Korintji桂 皮)用于制备这种提取物。这种品种具有较高含量的香兰素和肉桂醛。这篇论文进一步描述了用于制备和表征这种水性提取物的制备型HPLC方法。该出版物描述了儿茶素的A型双键结合(doubly linked)的原花青素。这篇论文 已鉴定出从肉桂中分离的儿茶素的三聚体(分子量864)、四聚体(分子量115 和寡聚体。Kilkuskie 等人，“HIV and reverse transcriptase inhibition bytannins，，in the Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,1992, Vol 2，pp 1529—1534.该出版物评价了单宁和缩合单宁的抗HIV活性以及它们抑制逆转录酶的潜力。尽 管这项研究发现了一些具有抗HIV活性的单宁，但它们具有关联毒性。该出版物描述了 3 种儿茶素缩合形式的化合物。分子40、44和45是儿茶素的二聚体、三聚体和四聚体。这篇 论文总结出RT酶的抑制作用与这些单宁的抗HIV活性之间没有关系。另外，分子44和45 分别表现出90%和73%的抗HIV活性，但没有表现出对RT酶的显著抑制。Michael Ovadia 等人，专利申请 US 2006 275515A13 Ira IS § "Anti-viral preparations obtained from a natural cinnamon extract"的专利已描述了从肉桂中获得的天然水性提取物，其具有抗病毒特性。这篇文献 描述了肉桂的水提取物，在有盐的情况下，该水提取物经历盐析析出沉淀。将这种沉淀物再 溶解在水或缓冲液中，并利用琼脂糖凝胶色谱纯化，随后用另外的缓冲液和半乳糖洗脱。常用的盐析过程涉及高分子量分子(通常为肽)的选择。因此，这个过程很显而 易见的是，这篇文献中描述的过程旨在回收高分子量分子(约IOKda)。按照权利要求，该组合物的活性成分具有大于IOKDA的分子量，并且它对应于 在280nm处约15至200D之间的吸光度。这种化合物最终利用磷酸盐缓冲液和半乳糖从 sepharon柱中洗脱。因此，最终的化合物具有高浓度的磷酸盐和半乳糖。此申请中描述的这种高分子量化合物已经在流感A PR 8病毒、副流感(仙台)病 毒、到红细胞中的预吸收，和用流感或仙台病毒感染的小鼠体重增加和HIV合胞体研究进 行了检测。此专利申请的实施例13描述了在MT2细胞中利用这个提取物完成的试验，从 而检查对合胞体形成的影响。按照此申请的图15，在浓度为60 100微克时它抑制 了合胞体形成。合胞体形成不是抗病毒活性的证实试验。这在下面出版物中用证据阐 明。[Gueseppe pantaleo 等人，Eur Jimmunology 1991,21,1771 :1774 ‘dissociation between syncytiaformation and HIV spreading. Suppressing Syncytia formation does notnecessarily reflect inhibition of HIV infection.]尽管所公开的提取物表现出抑制合胞体形成的潜力，但应当注意，仅一些HIV株导 致合胞体形成。另外，合胞体形成不能与HIV感染或AIDS的存在或进展相联系。合胞体形成 仅为可被一些株表达的表型。合胞体形成的缺乏不能与HIV的缺乏或感染的控制相联系。
发明内容
本发明公开的目的
本发明的公开内容的第一个目的在于提供一种组合物，该组合物包含植物来源的 五聚原花青素类黄酮、三聚体和四聚体。本公开内容的第二个目的在于提供一种制备组合物的方法，该组合物包含植物来 源，例如樟属(Cirmamomum)、荔枝(Litchi)和花生属(Arachis)的五聚原花青素类黄酮、三 聚体和四聚体。本公开内容的第三个目的在于提供一种组合物，该组合物可改善受治疗者中的免 疫反应并且也可有效对抗HIV感染、AIDS和流感病毒和感染。本发明公开的陈述因此，本发明的公开内容涉及一种组合物，该组合物包含浓度范围为约55% w/ w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚 体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂；本发明的公开内容还涉及一种用于制备组合物 的方法，该组合物包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度 范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体，所述方法包含以下步骤利用有 机溶剂提取粉碎的植物块从而除去有毒物质、干燥该块从而除去有机溶剂、利用水性溶剂 再次提取该干燥的块从而获得提取物、通过色谱柱纯化该提取物并接着浓缩、纯化、标准化 和干燥，从而获得该组合物；本发明的公开内容还涉及一种改善对其有需要的受治疗者中 的免疫反应的方法，所述方法包括向受治疗者给予药物有效量的组合物的步骤，该组合物 包含浓度范围为约55% w/w约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/ w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及和可选地连同药用赋形剂；本发明的公开内容还涉 及一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的逆转录病毒感染的方法，所述方法包 括向受治疗者给予药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含浓度范围为约55% w/w 约 99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四 聚体、以及可选地连同药用赋形剂。
图1示出了类黄酮五聚体的分子结构。图2示出了类黄酮五聚体的EI-MS。图3示出了类黄酮五聚体的13C NMR。图4示出了组合物的快速色谱从而鉴定类黄酮五聚体。图5示出了黄酮五聚体的HPLC。
具体实施例方式本发明的公开内容涉及一种组合物，该组合物包含浓度范围为约55% w/w 约 99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四 聚体、以及可选地连同药用赋形剂。在本发明的公开内容的一个实施方式中，该组合物从植物来源获得，该植物来源 选自包括樟属、荔枝和花生属的组。在本公开内容的一个另外的实施方式中，五聚原花青素类黄酮的优选浓度范围为 约80% w/w约99% w/w，三聚体和四聚体的浓度范围均为约0. 5% w/w 约20% w/w。
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述五聚原花青素类黄酮具有约 1440的分子量。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述五聚体为A型原花青素五聚 体。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述赋形剂选自包括树胶(gum)、 造粒剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂(矫味剂)、包衣剂、增塑剂、防腐 剂、悬浮剂、乳化剂、防静电剂、和滚圆剂(spheronization agent)的组。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述组合物被配制成各种剂型， 该剂型选自包括片剂、锭剂(troche)、口含片(lozenge)、水性或油性悬浮剂、分散粉剂或 颗粒剂、硬或软凝胶胶囊中的乳剂、糖浆和酏剂的组。本发明的公开内容涉及一种用于制备组合物的方法，该组合物包含浓度范围为约 55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w 的三聚体和四聚体，所述方法包括以下步骤利用有机溶剂提取粉碎的植物块从而除去有 毒物质、干燥该块从而除去有机溶剂、利用水性溶剂再次提取该干燥的块从而获得提取物、 以及通过色谱柱纯化该提取物，接着浓缩、纯化、标准化和干燥，从而获得该组合物。在本发明的公开内容的一个实施方式中，该粉碎的植物块选自包括樟属、荔枝和 花生属的植物的组。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该有机溶剂选自包括乙酸乙酯、 乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸2-乙基己酯以及它们的任何组合的组。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述提取进行从约8小时到约12 小时范围的时间段，优选约10小时。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述有毒物质包括香豆素和醛。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述提取物通过二阶段(两段， two stage)色谱柱过滤。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述色谱柱选自包括XAD-1180、 XAD-7HP 和 XAD-1140 树脂的组。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述用水性溶剂再提取在约 3. 8 约5. 8的pH范围内进行，优选pH为约4. 0。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述再提取在约30°C 90°C的 范围内的温度下，优选在31°C 40°C之间的范围内，进行约8小时 约12小时范围内的时 间段，优选约10小时。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述水溶剂是酸化的去离子水。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述组合物进一步包含赋形剂， 该赋形剂选自包括树胶、造粒剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、 增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、防静电剂、和滚圆剂的组。本发明的公开内容涉及一种改善对其有需要的受治疗者中的免疫反应的方法，所 述方法包括向受治疗者给予药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含浓度范围为约阳％ w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三 聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该免疫反应在选自但不局限于流 感、HIV感染和AIDS的组中的疾病中被改善。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该免疫反应在对其有需要的受治 疗者中被改善。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该药物有效量的组合物在约Img/ kg 约100mg/kg受治疗者体重的范围内。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述方法用于治疗、预防和控制 由受治疗者中的病原体引起的感染。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述病原体包括A型流感病毒和 HIV病毒。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述病毒类型为H1N1、H3N2、X4 和R5热带(tropic)病毒。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该受治疗者为动物或人类。本发明的公开内容涉及一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的病毒感 染的方法，其中所述方法包括给予受治疗者药物有效量的组合物作为抗病毒制剂的步骤， 该组合物包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为 约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及和可选地连同药用赋形剂。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述组合物抑制A型流感病毒、 HIV的X4热带病毒和HIV的R5热带病毒。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该药物有效量的组合物在约Img/ kg 约100mg/kg受治疗者体重的范围内。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该受治疗者是动物或人类。本发明的公开内容涉及一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的逆转录 病毒感染的方法，所述方法包括给予受治疗者药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含 浓度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/ w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。在本发明的公开内容的一个实施方式中，所述逆转录病毒感染包括A型流感感染 和HIV感染和AIDS。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该药物有效量的组合物在约Img/ kg 约100mg/kg受治疗者体重的范围内。在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该受治疗者为动物或人类。本发明的公开内容涉及一种源自植物来源、标准化至如图1所示A型原花青素黄 酮(flavanoid)五聚体的50% 99%的新型标准化组合物。本发明的公开内容还涉及一 种获得源自植物来源、标准化至A型原花青素黄酮五聚体的50% 99%的新型标准化组合 物的方法。本发明的公开内容还涉及源自植物来源、标准化至50% 99%的A型原花青素 黄酮五聚体的新型标准化组合物在预防、治疗和控制HIV和流感感染方面的用途。本发明的公开内容还涉及源自植物来源、标准化至50 % 99 %的A型原花青素黄 酮五聚体的新型标准化组合物在对其有需要的受治疗者中导致改善的对抗原的免疫反应 的用途。
在本发明的公开内容的另外的实施方式中，该免疫反应在性质上可以是治疗、控 制或预防性的。在本发明的公开内容的一个实施方式中，用于获得组合物的植物来源为樟属、荔 枝和花生属。在本发明的公开内容的一个实施方式中，该源自植物来源的新型标准化组合物标 准化为A型原花青素黄酮五聚体。在本发明的公开内容的另一个实施方式中，如图1所示，五聚体具有1440的分子量。在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该组合物包含在50 % 99 %范围内 的五聚体。在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该组合物包含在 35%范围内的 三聚体和四聚体。在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该组合物为如图5中色谱图所表征 的。在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该新型组合物的单体单元选自儿茶素 的组，优选儿茶素或表儿茶素。本发明的公开内容还涉及一种通过本文中示出的方法制造新型组合物的方法。在本发明的公开内容的一个实施方式中，该标准化组合物可选地还包含药用赋形 剂。在本发明的公开内容的另外的实施方式中，该赋形剂选自包括添加剂、树胶、甜味 剂、包衣、粘合剂、崩解剂、润滑剂、崩解剂、悬浮剂、溶剂、着色剂、助流剂、防粘剂、防静电 齐U、表面活性剂、增塑剂、乳化剂、调味剂、粘度增强剂和抗氧化剂的组。在本发明的公开内容的又一个实施方式中，该组合物被配制成这种剂型，如液体、 粉齐 、胶囊剂、片齐 、可注射齐 、贴片、软膏、凝胶剂、乳剂、乳膏齐 、乳液、洁牙齐 、喷雾剂和滴 剂。在本公开内容的又一个实施方式中，该组合物是粉剂或液体。本发明的公开内容还涉及一种获得源自植物来源、标准化至50 % 99 %的A型原 花青素黄酮五聚体的新型标准化组合物的方法，其中该方法包括以下步骤1.将该植物原材料研磨成预定尺寸2.用有机溶剂提取从而除去不需要的有毒物质3.用去离子水对植物粉末进行水性提取4.利用二阶段(两段)色谱纯化装置进行提取物纯化5.干燥、混合和过滤从而获得包含如图1所示纯度为50% 99%的黄酮五聚体的 组合物。本发明的公开内容还涉及本新型组合物可选地连同赋形剂在制造用于治疗和控 制HIV以及预防、治疗和控制流感病毒感染的药剂方面的用途。本发明的公开内容还涉及 本组合物可选地连同赋形剂在制造治疗和控制HIV感染以及预防、治疗和控制对其有需要 的受治疗者中流感感染的药剂方面的用途。本发明的公开内容还涉及本组合物可选地连同赋形剂在制造改善对其有需要的 受治疗者中的免疫反应的药剂方面的用途。本发明的公开内容还涉及本组合物在对其有需
11要的受治疗者中引起免疫反应改善方面的用途。 在本发明的公开内容的又一个实施方式中，该受治疗者是动物和人类。本发明的公开内容还涉及一种制造源自植物来源、标准化至50 % 99 %的A型原 花青素黄酮五聚体新型标准化组合物的方法，该方法包括以下步骤1.研磨植物肉桂或荔枝果皮，或者带有红色种皮的花生壳(groimdnutshell)2.利用主要由乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯或乙酸2-乙基己酯组成的有机(优 选酯)溶剂作为单种溶剂或上述溶剂的混合物，提取该材料从而除去脂肪和毒素以及其它 芳香化合物。这个步骤对于肉桂是可选的3.干燥所提取的植物材料从而不含该溶剂4.用pH为4或pH在3.8 5.8之间，优选pH为4.0的去离子水提取。利用二 阶段(两段)色谱分离法进行提取物纯化，一阶段(一段)用于极性分子而另一阶段(一 段)用于非极性分子5.利用醇溶剂洗脱所吸附的材料6.将所洗脱的溶剂浓缩为细粉末7.用水稀释该浓缩物，并可选地喷雾干燥从而清除残余的溶剂。通过上述方法获得的新型组合物包含50% -99%五聚体、-35%三聚体和 1% -35%四聚体，并如图5中所示表征的。本发明的公开内容利用下面实施例进一步地详细描述。然而，这些实施例不应当 理解为限制本发明公开内容的范围。实施例1将平均尺寸从16网目尺寸(mesh size)起的IOOOg粉碎的肉桂粉末浸泡在 3000ml乙酸乙酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛(perforatedbottom sieve)的提 取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从而在约8小时的时间段内实现有效提取。弃 去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30°C下的强制通风炉(forced draft oven)中进行干 燥。在通过干燥除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填装块用5000ml pH为 4. 0的酸性去离子水提取，将该提取物在35°C下在床层(bed)上循环约8小时从而实现有 效提取。将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得具有80%的分子量为1440的A型 原花青素黄酮五聚体的组合物。将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的 分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为 XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。该柱用不含附着物(adhering substance)的D. Μ.水 彻底清洗，并且洗脱剂是中性的。将该柱进一步用175ml纯异丙醇洗脱，并且所收集的洗脱 剂在低于40°C的真空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。喷雾干燥器并流(同向流)气流(Co current airflow)进口温度140°C出口温度60°C雾化器(Atomizer)RPM14000最终重量为5g。实施例2
将平均尺寸从16网目尺寸起的IOOOg粉碎的肉桂粉末浸泡在3000ml乙酸乙酯 中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从 而在约10小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30°C下的 强制通风炉中进行干燥。在通过干燥除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填 装块用5升pH为4. 0的酸性去离子水提取，将该提取物在35°C下在该床层上循环约8小时 从而实现有效提取。将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得75 %的分子量为1440的A型原花青 素黄酮五聚体的组合物。首先将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的分 子，并且色谱分离的第二阶段用于提取组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别 为XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D. M.水彻底清洗，并且洗 脱剂是中性的。将该柱进一步用250ml纯甲醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40°C的真 空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。喷雾干燥器并流(同向流)气流进口温度145 °C出口温度60°C雾化器RPM14000最终重量为4. 5g。实施例3将平均尺寸从16网目尺寸起的IOOOg粉碎的肉桂粉末浸泡在2500ml乙酸丁酯 中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从 而在10小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30°C下的强 制通风炉中进行干燥。在通过蒸发除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。该填装块 用酸性脱矿质水(demineralised water)提取，将该提取物在30°C下在该床层上循环约12 小时从而实现有效提取。将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得89%的分子量为1440的A型原花 青素黄酮五聚体的组合物。将该提取物首先通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的 分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为 XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D. M.水彻底清洗，并且洗脱剂 是中性的。将该柱进一步用200ml纯乙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40°C的真空下 浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。喷雾干燥器并流(同向流)气流进口温度145 °C出口温度60°C雾化器RPM14000最终重量为4. 8g。实施例4将平均尺寸从16网目尺寸起的IOOOg粉碎的肉桂粉末浸泡在2500ml乙酸丁酯 中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从 而在10小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30°C下的强制通风炉中进行干燥。在通过蒸发除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填装 块用5升酸性去离子水提取，将该提取物在30°C下在该床层上循环约12小时从而实现有效 提取。将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得99%的分子量为1440的A型原花 青素黄酮五聚体的组合物。首先将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的 分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为 XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D. M.水彻底清洗，并且洗脱 剂是中性的。将该柱进一步用纯异丙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40°C的真空下浓 缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。喷雾干燥器并流(同向流)气流进口温度145 °C出口温度60 0C雾化器RPM14000最终重量为5g。实施例5将平均尺寸从16网目尺寸起的IOOOg粉碎的肉桂皮(cirmamoncassia)粉末浸泡 在3000ml乙酸乙酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填 装块上反复循环从而在约8小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出 该块并在30°C下的强制通风炉中进行干燥。在通过干燥除去溶剂之后，将该块再次填装在 提取器中。将该填装块用5000ml pH为4.0的酸性去离子水提取，并且将该提取物在35°C 下在该床层上循环约8小时从而实现有效提取。将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得具有55%的分子量为1440的A型 原花青素黄酮五聚体的组合物。将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的 分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为 XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D. M.水彻底清洗，并且洗脱剂 是中性的。将该柱进一步用175ml纯异丙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40°C的真空 下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。喷雾干燥器并流(同向流)气流进口温度140°C出口温度60°C雾化器RPM14000最终重量为2. 5g。实施例6 荔枝干果皮中的提取物将IOOOg粉碎的干荔枝果皮浸泡在5000ml体积的酸化水中12小时时间并过滤澄 清。将该澄清的滤液通过含有等效于XAD-1140和XAD-7HP的吸附树脂的柱从而捕获极性 和相对非极性化合物。用乙醇洗脱为非极性柱的第一柱，并且浓缩洗脱液从而获得易流动 粉末，产率500mg。用乙醇分开洗脱含有所有极性物质的第二柱，并浓缩从而获得Ig粉末。 在HPLC分析中，这个馏分表示85%的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体。实施例7 磨碎的花生壳连同该磨碎的花生壳的红皮中的提取物
将IOOOg干磨碎的花生壳连同该种子上的红皮浸泡在5000ml体积pH为3. 8的 酸化水中48小时，然后过滤得到澄清液体。使该澄清的滤液通过含有等效于XAD-1140和 XAD-7HP的吸附树脂的柱从而捕获极性和相对非极性化合物。用乙醇洗脱非极性柱的第一 柱，并浓缩洗脱剂从而获得易流动粉末，产率20g。用乙醇分开洗脱含有所有极性物质的第 二柱，并浓缩得500mg粉末。在HPLC分析中，这个馏分表示如图5中所示的82%的分子量 为1440的A型原花青素黄酮五聚体。实施例8 纯化从而获得黄酮五聚体将通过实施例1-6中详述的方法分离出的粉末溶解在200体积的水中，并过滤澄 清。将该澄清的滤液在60°C下用活性炭处理从而脱去该溶液的颜色，并在滤纸上过滤澄清 从而除去所有不溶性颗粒。将由此获得的过滤的溶液用乙酸乙酯提取两次从而除去所有可 溶性溶剂，并浓缩从而得到粉末。使用下面参数以快速色谱利用0. 含水甲酸和0. 甲 醇甲酸以梯度方式，在反向C-18硅胶上对该粉末进行柱色谱分析。设备带有可变UV检测器的Combiflash Companionft =Redisep 12gms(反相硅胶)检测波长254nm和 ^Onm、流速18ml/min峰管体积18ml峰宽Imin阈值0. 20AU溶剂A :0. 含水甲酸溶剂B :0. 的甲酸在乙腈中的溶液弃去1 19号的馏分。收集20 22号的馏分并浓缩从而得到256g淡棕色粉末。 在TLC筛选的0. IM乙酸钠乙腈=7 3比率的溶剂体系中，所得粉末在0. 75Rt处出现 UV吸收点，在用茴香醛/硫酸试剂喷雾时，出现被认为是原花青素特征的橙色斑点。在m/z 1439. 9处的EI-MS(M-H)(如图2中示出的)离子峰对应于相当于总共5 个单元的儿茶素组分088倍)中的多个部分(multicompartment)。分离的化合物的分子 量为1440.9。儿茶素单元的结构与通过偶联模式(coupling pattern)证实的表儿茶素结 构一致。在S 4. 84 4. 91之间有两个信号，在黄烷-3-醇单元中2，3-顺式立体化学单峰 (由于高分子量寡聚体引起的峰加宽)有四个信号。由于高分子量寡聚性质，所以在观察的 δ 2. 6 2. 9m加宽的峰之间观察到在末端单元终环-CH2-亚甲基质子的4位置处的F-环 信号。芳香族区域信号在S 6. 6 7. 6之间，如相对于环B和E的两个体系。在δ 100. 9 处看到的符合C2碳和C4碳顶环C的δ 27. 9的13C碳信号，证实与中间体系环的双键合， 如图3中所示出的。包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为 约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及可选地包括药用赋形剂的组合物，通过 按照如上所述的实施例1 8获得。另外，该组合物用于在下面实施例9 14中所述的体 外和体内活性。实施例9 在用环磷酰胺处理的受治疗者中(受损的(compromised)免疫系统)测 试组合物对体液抗体滴度的影响
基于所接受的治疗，将两种性别的瑞士小白鼠分成5组，每组6只动物。在0天时，所有五组均用生理盐水中的含IxlO8个细胞的绵羊红细胞(SRBC)敏化。 2-5组用标准药物和测试组合物组合处理8天(0天 7天)。在7天时，通过眼球后穿刺 (retro orbital puncture)从五组中的每只小鼠中采集血液样品，用于确定初次抗体滴 度。随后在7天时，在抽血之后，用0.1ml SRBC到足垫(foot pad)中来激发(challenge) 小鼠。在14天时，通过眼球后穿刺从每只小鼠中采集血液样品，用于确定二次抗体滴度。此测试的结果如下
权利要求
1.一种组合物，包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓 度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物从植物来源获得，所述植物来源选 自包括樟属(Cinnamomum)、荔枝(Litchi)和花生属(Arachis)的组。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述五聚原花青素类黄酮的优选浓度范围为 约80% w/w 约98% w/w，三聚体和四聚体的浓度范围均为约0. 5% w/w 约20% w/w。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述五聚原花青素类黄酮具有约1440的分子量。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述五聚体为A型原花青素五聚体。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述赋形剂选自包括树胶、造粒剂、粘结剂、润 滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、防静电齐U、 和滚圆剂的组。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物被配制成各种剂型，所述剂型选 自包括片剂、锭剂、口含片、水性或油性悬浮剂、分散粉剂或颗粒剂、硬或软凝胶胶囊中的乳 剂、糖浆和酏剂的组。
8.一种用于制备组合物的方法，所述组合物包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/ w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体，所 述方法包括以下步骤a)利用有机溶剂提取粉碎的植物块从而除去有毒物质；b)干燥所述块从而除去所述有机溶剂；c)利用水性溶剂再次提取干燥的所述块从而获得提取物；以及d)通过色谱柱纯化所述提取物，接着浓缩、纯化、标准化和干燥从而获得所述组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述粉碎的植物块选自包括樟属、荔枝和花生属 的植物的组。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述有机溶剂选自包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙 酸戊酯、乙酸2-乙基己酯以及它们的任何组合的组。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述提取进行了从约8小时到约12小时范围的 时间段，优选约10小时。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述有毒物质包括香豆素和醛。
13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述提取物通过二阶段色谱柱过滤。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述色谱柱选自包括XAD-1180、XAD-7HP和 XAD-1140树脂的组。
15.根据权利要求8所述的方法，其中，所述用水性溶剂再提取在约3.8 约5. 8的pH 范围内进行，优选pH为约4.0。
16.根据权利要求8所述的方法，其中，所述再提取在约30°C 90°C的范围的温度下， 优选在31°C 40°C之间的范围，进行约8小时 约12小时范围的时间段，优选约10小时。
17.根据权利要求8所述的方法，其中，所述水性溶剂是酸化的去离子水。
18.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物进一步包含赋形剂，所述赋形剂选自 包括树胶、造粒剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、防静电剂、和滚圆剂的组。
19.一种改善对其有需要的受治疗者中的免疫反应的方法，所述方法包括给予所述受 治疗者药物有效量的组合物的步骤，所述组合物包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/w 的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及 可选地连同药用赋形剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，在选自但不局限于流感、HIV感染和AIDS的组 中的疾病中，所述免疫反应被改善。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述免疫反应在对其有需要的受治疗者中被 改善。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述药物有效量的组合物在约lmg/kg 约 100mg/kg受治疗者体重的范围内。
23.根据权利要求19所述的方法，其中，所述方法用于治疗、预防和控制由受治疗者中 的病原体引起的感染。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述病原体包括A型流感病毒和HIV病毒。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述病毒类型为流感病毒Hmi和H3N2。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述病毒类型为HIVX4热带病毒和HIV R5热 带病毒。
27.根据权利要求19所述的方法，其中，所述受治疗者为动物或人类。
28.一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的病毒感染的方法，其中，所述方 法包括给予所述受治疗者药物有效量的组合物作为抗病毒制剂的步骤，所述组合物包含浓 度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。
29.根据权利要求27所述的应用，其中，所述组合物抑制A型流感病毒、HIV的X4热带 病毒和HIV的R5热带病毒。
30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述药物有效量的组合物在约lmg/kg 约 100mg/kg受治疗者体重的范围内。
31.根据权利要求27所述的方法，其中，所述受治疗者为动物或人类。
32.—种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的逆转录病毒感染的方法，所述方 法包括给予所述受治疗者药物有效量的组合物的步骤，所述组合物包含浓度范围为约55% w/w 约99% w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0. 5% w/w 约35% w/w的三 聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。
33.根据权利要求31所述的方法，其中，所述逆转录病毒感染包括A型流感感染、HIV 感染和AIDS。
34.根据权利要求31所述的方法，其中，所述药物有效量的组合物在约lmg/kg 约 100mg/kg受治疗者体重的范围内。
35.根据权利要求31所述的方法，其中，所述受治疗者为动物或人类。
全文摘要
本发明的公开内容涉及从植物来源，即樟属、荔枝和花生属中获得的抗病毒制剂。本发明的公开内容提供了包含五聚原花青素类黄酮、三聚体和四聚体的组合物以及制备该组合物的方法。该组合物可改善免疫反应，并发现该组合物可用于治疗和控制HIV感染和AIDS以及用于预防、治疗和控制流感病毒和感染。
文档编号A61K31/353GK102099028SQ200980127864
公开日2011年6月15日 申请日期2009年9月23日 优先权日2009年8月11日
发明者苏尼尔·布哈斯卡拉恩, 莫汉·维什瓦拉曼 申请人:梧桐生物技术私人有限公司