专利名称：用于提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法
技术领域：
本发明涉及提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法。
背景技术：
通常，甘草是多年生的植物，属于蔷薇目豆科，它的根是红褐色，生长在深厚土层 中，它的角茎(angular stem)垂直地长至约Im 约1. 5m。它的叶子是带有点尖(pointed tips)的斜椭圆形。叶子约2cm 约5cm长，约Icm 约3cm宽，没有任何内颚叶(Iacinia)。 它的花与大豆的花相似，在夏天开靛紫色花，是一种总状花序。与古老的习语，“东方药房中的甘草”相符地是，这种植物是一种广泛用于东方药 学实践中的草药。根据甘草的药理作用，它结合肝脏中的有毒物质并为肝脏解毒，对治疗吸 毒成瘾、肝炎、荨麻疹、皮炎、湿疹等是有用的。此外，它不仅具有去咳化痰的功效，还具有抗 组胺和抗乙酰胆碱能的功效。它具有缓解由肌肉或组织的突然紧张所致疼痛、减缓体重增 加以及白细胞数量的增加的功效，还具有利尿，抗炎的功效等，特别是其中的成分，如甘草 苷，甘草素等抑制消化性溃疡的产生。据《东医宝鉴》，朝鲜王朝(1392 1910)时期由Huh Jun编写的一部悠久的东方 医学科学纲要，其中记载“甘草消除了所有的药物毒性，集合了 72类不同石药(矿物药)和 约1200类不同草药的功效，所以被称为“国老”，意思是国家的长老。该植物通常控制韩烈 (冷和热)和四齐(暖热凉热)，使耳朵、眼睛、嘴、鼻、尿液和粪便的生理正常，促进血液在 所有血管中的流动，增强肌肉和骨骼，改善全身的营养状况。”已知，在竹笋或蘑菇所致中毒的民间疗法中，人们将所述植物煎煮成药汤饮用，且 已知通过煎煮所述植物并饮用煮沸的植物汤汁，其对烟草中毒、吸毒成瘾和其它成瘾是有 效的。因此，甘草已被用来作为对各种中毒的解毒剂，它已被广泛认为是非常重要的草药 (galenical)如镇咳药、祛痰药、调味品和缓和剂(palliative)，不仅用于东方药物，而且 用于新药和民间医药。甘草提取物含有高含量的甘草苷、甘草素、芹糖甘草苷、异甘草苷、含有异芹糖甘 草苷和苷元的黄酮类化合物，以及主要含有甘草苷和芹糖甘草苷的甲醇流分(Kamei，J等， Eur. J. Pharmacol.，469，ppl59_63，2003)。在这些成分中，已知甘草素显示出各种生理活性 如抗痴呆、抗菌、抗氧化、抗血管生成、抗皮肤癌、为镉中毒解毒等功效。有关甘草素的传统工艺，韩国专利No. 5353872公开了一种治疗和预防由重金属 成瘾所致疾病的含甘草素的组合物，以及韩国专利No. 697056公开了一种治疗和预防肝癌 的含有甘草素作为活性成分的组合物。具有这些不同生理活性的甘草素一般通过传统方法用水或低级醇提取。然而，由 于甘草提取物中的甘草素含量低，已进行了许多研究以提高甘草提取物中的甘草素含量。例如，韩国专利No. 592482公开了一种提高甘草提取物中的甘草素含量的方法， 包括将甘草分割成小段，将小段用水在100°C下回流提取，过滤提取物，然后冷冻干燥滤出物；用具有糖水解活性的细菌或细菌的酶液处理上述步骤得到的冷冻干燥的物质，然 后在约20°C 约50°C下静置约10分钟 约36小时；向上述步骤培养得到的培养物中加入 2倍 10倍量的乙醇，将其分为乙醇可溶部分和乙醇不溶部分，然后减压浓缩乙醇可溶部 分，获得提取物；将上述步骤得到的提取物分散于蒸馏水中进行三相萃取分配，然后浓缩可 溶流分；以及在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中对上述步骤中的第七流分进行重结晶，获得 纯的甘草素。然而，该方法的问题在于由于使用了细菌或细菌的酶液，使各步骤复杂，成本增 加。韩国专利No. 37789公开了一种提高甘草或甘草提取物中的活性成分_甘草素含 量的方法，包括将甘草苷溶解于DMSO中；向溶液中加入IM HCl ；水浴加热所述混合物，进行甘草 苷的酸水解；加入等量的IM HCl以中和酸性部分；以及用含有氯仿和丙酮的溶剂组合进行 硅胶层析以纯化杂质如酸水解过程中产生的糖和盐。然而，由于该方法中高熔点的DMSO难以去除，需要做许多诸如检查残留溶剂的工 作，当使用HCl进行酸水解时，问题产生了，由于缓慢的水解反应，耗时的酸水解是不可避 免的，而产生的甘草素纯度并不好。因此，本发明人研究了一种简单高效的提高甘草提取物中甘草素含量的方法，应 理解为在约80°C 约100°C下，当向提取物中加入强酸或强碱时，生成之后易于分离的含 有甘草素的产物沉淀，所述提取物是通过将甘草加入水、有机溶剂或有机溶剂的混合溶剂 中并使用超声波提取得到的，通过简单的方法使甘草提取物中的甘草素提取含量增加，并 最终形成本发明。
发明内容
技术问题本发明的一个目的是提供一种提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法。技术方案为了实现本发明的目的，本发明提供一种提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的 提取方法，该方法包括用水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂提取甘草得到含甘草苷的产物(步骤 1)；以及将水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂加入步骤1中提取的含甘草苷的产物 中，向溶液中加入酸或碱，水解该混合物以制备含甘草素的产物(步骤2)。有益效果由于本发明方法无需使用高价的溶剂，省略了柱层析过程以简化步骤，比采用传 统方法获得了含更高含量(约8 23% )甘草素的提取物，该方法在甘草素提取过程中是 有用的。最佳实施方式参考附图
并通过以下优选实施方式的详细描述，本发明的特征和优点将被更清楚 地理解。首先指出地是，本文使用的术语或词语应被视为与本发明的精神相应的含义或概 念，依据的原则是发明人可适当定义这些术语的概念以最好的描述他自己的发明。此外，应理解地是，与本发明有关的已知的功能和结构的详细描述将被省略掉，以免不必要地掩盖 了本发明的重点。本发明提供一种提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，该方法包括用水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂提取甘草以得到含甘草苷的产物(步 骤1)；以及将水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂加入步骤1中提取的含甘草苷的产 物中，向溶液中加入酸或碱，水解该混合物以制备含甘草素的产物(步骤2)。以下将详细描述本发明。首先，在步骤1中，用水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂提取甘草以得到含 甘草苷的产物。由于甘草中甘草素的含量近乎为0%，可以首先从甘草中提取甘草苷，然后水解得 到甘草素。在该步骤中，甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)、甘草林恩(Glycyrrhiza glabra Linne.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、甘草林恩(Glycyrrhiza glabra Linne.)、胀果甘草蝙蝠(Glycyrrhiza inflataBat.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)和甘草林恩(Glycyrrhizaglabra Linne.)等,可作为甘草使用。可优选水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂作为该步骤提取过程中的溶剂， 所述有机溶剂可优选包括低级醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇等，丙酮、 乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、二甲醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯等。根据本发明方法，可优选加入甘草重量2倍 10倍量的溶剂用于提取，更优选4 倍 8倍的量，但不限于此。根据本发明方法，提取温度可优选为约30°C 约100°C，更优选为约80°C 约 100°C，但不限于此。根据本发明方法，提取时间可优选为约1小时 约10小时，更优选为约4小时 约8小时，但不限于此。根据本发明方法，提取方法可包括但不限于加热及搅拌提取，回流提取、超声提取 和浸渍。根据本发明方法，提取的次数可优选为但不限于一次 五次。根据所述方法，可提取含甘草苷的甘草提取物，将得到的提取物进行过滤并在减 压下浓缩以得到含甘草苷的产物。接下来，在步骤2中，将水、有机溶剂，或有机溶剂的混合溶剂引入到步骤1中得到 的含甘草苷的产物中，向产物中加入酸或碱，水解产物中含有的甘草苷制备含甘草素的产 物。然后使用的有机溶剂可优选包括低级醇如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔 丁醇等，丙酮、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、二甲醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲 苯等。在有机溶剂中，甲醇或乙醇的浓度可为70% 100%。所述酸可优选为强酸，例如盐酸、硫酸、硝酸或它们的任意混合溶剂。优选使用硫 酸。更优选使用约IM 约5M的硫酸。作为碱，优选使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或 它们的任意混合物，优选使用氢氧化钙。更优选使用约IM 约5M的氢氧化钙。 根据本发明方法，反应温度优选为约50°C 约100°C，更优选为约80°C 约100°C。由于甘草素在水中不溶，在水解后，可将反应混合物降至室温以得到沉淀，甘草素 含量达到约5% 约15%。随后，将沉淀溶于有机溶剂中，用水洗几次，然后浓缩有机层并 在减压下干燥将甘草素含量提高至约8% 约23%。然后使用的有机溶剂可包括低级醇如 正丁醇、叔丁醇等，乙酸乙酯、二甲醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯等。当干燥有机溶剂时，优选减压下干燥，而不是热风干燥，减压干燥所述沉淀的有机 溶剂之后，可将沉淀再次溶于乙醇中并在减压下再次干燥沉淀以更大程度地减少残留溶剂 的量。由于本发明方法无需使用高价的溶剂，省略了柱层析过程以简化步骤，比采用传 统方法获得了含更高含量(约8 23% )甘草素的提取物，该方法在甘草素提取过程中是 有用的。实施方式以下给出优选实施例以更好地理解本发明。然而，以下实施例仅用于理解本发明， 本发明并不限于以下实施例。<实施例1>甘草素1的制备(1)含甘草苷的甘草提取物的制备从东方药商那里购买到甘草并精确区分后，将其分割成小段(甘草段)使用。甘 草中含有的甘草苷的含量不到1%。向约IOOg的甘草段中加入800ml约80% 约90%的 甲醇，并在约85°C下加热搅拌约8小时。随后，冷却并过滤，然后在减压下浓缩，得到含约 25. 8g甘草苷的提取物。1H NMR (CD3OD, 300MHz) δ 7. 61 (1Η, d,8. 6Hz) 7. 08 (2H, d,8. 4Hz)6. 81 (2H, d, 8. 4Hz) 6. 49 (1H, dd, 8. 6Hz)，6. 37 (1H, d, 2. 4Hz)，5. 41 (1H, dd, 13. 2,3. 1) 5. 37 (2H, dd, 13. 0， 2. 9Hz)，3. 49 (3H, t, 2. 4Hz)，3. 05 (1H, dd, 17. 0，13. 0)，2. 68 (1H, dd, 17. 0，2. 9)。在得到的甘草提取物中，按照以下方法测定甘草苷的含量。具体地，精确称量约 0. 5g提取物，用约50ml约80%的甲醇进行超声提取，然后过滤以制备试验溶液。另外，精 确称量约IOmg甘草苷标准品以制备50ml标准溶液，然后各取20 μ 1的试验溶液和标准溶 液用于检测，使用液相色谱按照以下条件测定甘草苷的含量，考虑到稀释因素。*检测器紫外分光光度计(测量波长约254nm)*柱十八烷基硅胶，约5 μ m，约4. 6謹X约15cm*流动相约1 %乙酸混合溶液ACN = 9:1* 流速约 lml/min根据该方法的测定显示从甘草提取物中获得的甘草苷含量约为2. 3%。(2)甘草素的制备将约IOOg(I)中得到的提取物分散于约500ml水中，向其中加入3M硫酸250ml，在 约90°C 约100°C下加热搅拌约2小时。随后，将混合物冷却至室温，过滤生成的沉淀并干 燥产生约34g的深褐色物质(甘草素含量约8. 5% )。随后，将约30g的所述物质溶于约300ml乙酸乙酯中，用约300ml水洗两次，浓缩 并减压干燥除去溶剂，得到约22g深褐色晶体(甘草素含量约11% )。1H NMR (CD3OD, 300MHz) δ 7. 73 (1Η, d，8.6Hz，H_5) 7. 33 (2H，d,8. 4Hz)6. 81 (2H, d,8. 4Hz) 6. 49 (1H, dd, 8. 6Hz)，6. 35 (1H, d, 2. 4Hz)，5. 37 (2H, dd, 13. 0,2. 9Hz)，3. 05 (1H, dd, 17. 0，13. 0)，2. 68 (1H, dd, 17. 0，2. 9)。然后，按照以下方法测定甘草素的含量。具体地，精确称量约0. Ig产物，用约50ml 约80%的甲醇进行超声提取，然后过滤以制备试验溶液。另外，精确称量约IOmg甘草苷标 准品以制备50ml标准溶液，然后各取20 μ 1的试验溶液和标准溶液用于检测，使用液相色 谱按照以下条件测定甘草素的含量，考虑到稀释因素。*检测器紫外分光光度计(测量波长约254nm)*柱十八烷基硅胶，约5 μ m，约4. 6謹X约15cm* 流动相约 0. OlM 磷酸ACN = 67 33* 流速约 lml/min<实施例2>甘草素2的制备采用与实施例1相同的方法得到约23g深褐色物质(甘草素含量约11. 2% )，不 同之处在于向甘草中加入约80%的乙醇以制备提取物。<实施例3>甘草素3的制备采用与实施例1相同的方法得到约23g深褐色物质(甘草素含量约11. 8% )， 不同之处在于向甘草中添加约80 %的甲醇得到提取物后，再向提取物中加入约100 %的甲 醇，得到含甘草苷的提取物(约2. 9% )。<实施例4>甘草素4的制备采用与实施例1相同的方法产生约25g深褐色物质(甘草素含量约12. )，不 同之处在于提取工艺是用约80%的乙醇提取甘草两次。<对比例1>甘草素1的传统制备方法向约IOOg甘草段中加入约800ml约80% 100%的甲醇，室温下静置48小时。随 后，过滤该混合物并减压浓缩，得到约18. 4g 约21. 2g提取物(甘草素含量约1. 3 约 1.6)。将得到的提取物溶于200ml DMSO中，向溶液中加入IN HCl 100ml，100°C水浴加热所 述混合物6小时。将混合物冷却至室温，向其中加入等量的IN NaOH以中和酸性部分，然后 冷冻干燥约48小时，得到约28g提取物(甘草素含量约0. 8% )。<对比例2>甘草素2的传统制备方法采用与实施例1相同的方法得到约29g含甘草素的提取物(甘草素含量约 0.7%)，不同之处在于用乙醇替换甲醇作为溶剂。<实验例1>甘草苷的高效提取实验(1)依照提取溶剂的甘草苷含量，为测定根据提取溶剂的不同，甘草提取物中甘草苷的含量，在表1中给出的提取 溶剂和提取温度的条件下，加热搅拌约IOOg的甘草段8小时，用实施例1中测定甘草苷含 量的方法测定所述提取物中甘草苷的含量，结果列于表1中。表 权利要求
1.一种提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，该方法包括用水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂提取甘草以得到含甘草苷的产物(步骤 1)；以及将水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂加入步骤1中提取的含甘草苷的产物中， 向溶液中加入酸或碱并水解该混合物以制备得到含甘草素的产物(步骤2)。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1和步骤2中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、 正丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、二甲醚、乙醚以及二甲基 甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述甲醇或乙醇的浓度为70% 100%。
4 如权利要求1所述的方法，其中步骤1中所述的提取在30°C 100°C下进行。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤1中所述的提取方法为加热及搅拌提取，回流提 取或超声提取。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤2中所述的酸为硫酸、盐酸、硝酸或它们的混合 溶液，步骤2中所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或它们的任意混合物。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤2中所述的酸为IM 5M的硫酸，步骤2中所述 的碱为IM 5M的氢氧化钙。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤2中所述的水解反应在50°C 100°C下进行。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括将步骤2中得到的含甘草素的产物溶于有机溶剂中，水洗溶液几次，浓缩并减压干燥 有机层以提高甘草素含量。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述有机溶剂选自正丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、二甲 醚、乙醚以及二甲基甲酰胺、苯、甲苯和二甲苯。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述干燥为减压干燥。
12.如权利要9所述的方法，进一步包括将步骤2中得到的含甘草素的产物溶于有机溶剂中，水洗溶液几次，浓缩并减压干燥 有机层，然后将含甘草素的产物溶于乙醇中并减压干燥溶液以减少残留的溶剂的量。
全文摘要
本发明公开了一种提高甘草或甘草提取物中甘草素含量的提取方法，该方法包括用水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂提取甘草得到含甘草苷的产物(步骤1)；以及将水、有机溶剂或水和有机溶剂的混合溶剂加入步骤1中提取得到的含甘草苷的产物中，向溶液中加入酸或碱，水解混合物以制备含甘草素的产物(步骤2)。
文档编号A61K36/484GK102112142SQ200980130875
公开日2011年6月29日 申请日期2009年8月3日 优先权日2008年8月1日
发明者孙世一, 郑灿圭, 金亨善, 金弘起 申请人:大元制药株式会社