专利名称：具有延长的体内效能的缀合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及缀合蛋白、尤其但非唯一的凝血因子、用于制备所述缀合物的方法、包 含所述缀合物的药物组合物以及所述缀合物在治疗中的用途、尤其但非唯一地在治疗由凝 血因子缓解的疾病例如预防性治疗血友病中的用途。
背景技术：
凝血为由各种血液组分(或因子)的复杂相互作用组成的过程，其最终形成 纤维蛋白凝块。一般而言，参与称为凝血“级联”的血液组分，为酶促无活性蛋白(酶原 (proenzyme或zymogen))，其通过激活剂(其自身为活化的凝血因子)的作用转化为蛋白 水解酶。经过这样的转化的凝血因子通常称为“活性因子”，并且通过加字母“a”至该凝血 因子名称中来命名(例如因子Vll (a))。对于重度血友病患者而言，有需要从按需治疗向预防性方案转变以防止出血和继 发的关节损伤。然而，由于其循环半寿期短，凝血因子例如FVIII、FIX和FVIIa对长期预防 性治疗是特别不理想的，因为需要高剂量和频繁注射两者以维持药理学相关的血浆水平。 因此，目前的焦点针对开发较适于预防性用途的长效类似物。聚乙二醇化(Pegylation)为用于延长蛋白的循环半寿期的已确立方法。然而，由 于细胞膜内的凝血因子、其它凝血因子和辅因子的的相互作用界面大，因此进行化学修饰 而不会导致活性有害丧失的可能性很小。因此，有极大的需要为血友病的预防性治疗提供具有血浆半寿期增加的凝血因 子。WO 2005/027978 (Novo Nordisk A/S)描述了具有作用延长特性的胰高血糖素样 肽-I(GLP-I)的衍生物，其中所述多肽通过亲水间隔物连接至白蛋白结合残基。因此，本发明提供具有改进的药理学性质的新型蛋白缀合物以及其制备方法。发明简述本发明的第一个方面提供用于制备缀合蛋白或缀合糖蛋白的方法，所述方法包括 以下步骤在任选取代的环糊精分子存在下，使蛋白或糖蛋白与水不溶性的白蛋白结合物 反应。本发明的第二个方面提供蛋白缀合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药， 所述蛋白缀合物包含通过亲水间隔物连接至白蛋白结合残基的蛋白或糖蛋白。本方面的另一个方面提供下式(I)的蛋白缀合物或其药学上可接受的盐、溶剂化 物或前药(A-W-B)y-P(I)其中P表示蛋白或糖蛋白；B表示亲水间隔物；W为连接A和B的化学基团；A表示白蛋白结合残基；以及
y 表示选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 的整数。本发明的第三个方面提供用于制备缀合凝血因子的方法，所述方法包括以下步 骤使如本文所定义的凝血因子与如本文所定义的修饰基团(modifier group)反应。本发明的另一个方面提供缀合凝血因子，其包含缀合至如本文所定义的修饰基团 的如本文所定义的凝血因子。本发明的另一个方面提供治疗血友病的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量 的如本文所定义的缀合凝血因子。定义本文所用术语“蛋白” “多肽”和“肽”意指由经肽键连接的至少五个组成性氨基酸 (constituent amino acid)组成的化合物。所述组成性氨基酸可来自由遗传密码编码的氨 基酸，而且它们可为非由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。非由遗传密码编码 的天然氨基酸为例如羟脯氨酸、y_羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨 酰胺。合成的氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异 构体例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib (a-氨基异丁酸)、Abu ( α -氨基丁酸)、Tie (叔丁基 甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。应认识到的是，本文所用关于 蛋白或糖蛋白的术语“缀合(的)”是指与本发明白蛋白结合残基的特定缀合。还应认识到 的是，用于本发明缀合方法的蛋白或糖蛋白可已经与其它部分例如糖部分缀合。本文所用术语“糖蛋白”是指包含共价连接至其多肽侧链的寡糖链(聚糖)的蛋 白。应认识到的是，当糖蛋白用于本发明缀合方法中时，白蛋白结合残基可通过聚糖残基连 接至所述糖蛋白。在本文范围之内，本文所用术语“生长激素化合物”意指哺乳动物源的生长激素 (例如人、牛或猪生长激素)和重组生长激素(例如重组人、牛或猪生长激素)以及这类生 长激素的变体。本文所用“GH”和“生长激素化合物”为可交换的。当GH为哺乳动物源生 长激素的变体例如hGH和重组hGH时，所述变体应理解为通过以下步骤获得的化合物用另 一种天然或非天然氨基酸取代生长激素例如hGH序列中的一个或多个氨基酸残基；和/或 将一个或多个天然或非天然氨基酸添加至生长激素例如hGH序列中；和/或在生长激素例 如hGH序列中缺失一个或多个氨基酸残基，其中任何这些步骤可任选后接一个或多个氨基 酸残基的进一步衍生。具体而言，在一个氨基酸残基被来自相同组别的另一个氨基酸残基 (即被具有类似性质的另一个氨基酸残基)所取代的情况下，这类取代为保守的。根据其性 质，氨基酸可适宜地分为以下组别碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基 酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(例如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水氨 基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(例如苯丙氨酸、色 氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常，GH与hGH具有 至少80%的同一性，并且通常具有如本文测定I中测定的hGH生长激素活性的至少20%。在本文范围之内，本文所用术语“白蛋白结合残基”意指非共价地结合至人血清白 蛋白的残基。连接至蛋白或糖蛋白的白蛋白结合残基通常具有低于约10 μ M或甚至低于约 1 μ M的对人血清白蛋白的结合亲和力。已知白蛋白结合残基的范围在含12-40个碳原子的 直链和支链亲脂部分、具有环戊烷并菲骨架的化合物和/或具有10-45个氨基酸残基的肽 等之中。白蛋白结合特性可通过如J.Biol. Chem. 277 (38) ,35035-35042，(2002)中所述的表面等离子共振法测量。本文所用术语“亲水间隔物”意指用化学部分将蛋白或糖蛋白与白蛋白结合残基 间隔开的间隔物，所述化学部分包含至少5个非氢原子，其中非氢原子的30-50%为N或0。术语“水不溶性的”是指具有CLogP > 0的部分。术语“水溶性的”是至具有CLogP < 0的部分。 在本文范围之内，术语“转氨基作用，，和相关术语旨在表示以下反应其中谷氨酰 胺侧链的酰胺氮被来自另一种化合物的氮尤其是来自另一种含氮亲核体的氮所交换。在本文范围之内，术语“不可接近的”旨在表示从其不能被触及的意义而言，某物 不存在或实际上不存在。当表明在待缀合的蛋白中官能团不可接近时，这旨在表示所述官 能团不存在于蛋白中或者如果存在，在某种程度上被妨碍参与反应。作为实例，所述官能团 可深埋于蛋白结构中，使得其被屏蔽而不能参与反应。应认识到的是，官能团是否可接近依 赖于反应条件。可设想的是，例如在存在变性剂或在高温下，蛋白可解折叠而暴露另外的不 可接近的官能团。应理解的是，“不可接近的”意指“在为特定目标反应所选定的反应条件 下不可接近”。术语“烷烃”或“烷基”旨在表示饱和、直链、支链和/或环烃。除非用另一个碳原 子数指明，否则所述术语旨在表示具有1-30个(包括端值)碳原子的烃，例如1-20个(包 括端值)，例如1-10个(包括端值)，例如1-5个(包括端值)。术语烷基和亚烷基分别是 指对应的自由基和双自由基。术语“Cu烷基”是指包含1-6个碳原子的在内直链或支链饱和烃。这类基团的实 例包括但不限于甲基、2-丙基、1- 丁基、2- 丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1- 丁基和正己基。术语“C3_1(1环烷基”通常是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环 壬基和环癸基。术语“烯烃”旨在表示包含至少一个碳-碳双键的直链、支链和/或环烃。除非用 另一个碳原子数指明，否则所述术语旨在表示具有2-30个(包括端值)碳原子的烃，例如 2-20个(包括端值)，例如2-10个(包括端值)，例如2-5个(包括端值)。术语烯基和亚 烯基分别是指对应的自由基和双自由基。术语“炔烃”旨在表示包含至少一个碳-碳三键的直链、支链和/或环烃，并且其 可任选包含一个或多个碳-碳双键。除非用另一个碳原子数指明，否则所述术语旨在表示 具有2-30个(包括端值)碳原子的烃，例如2-20个(包括端值)，例如2-10个(包括端 值)，例如2-5个(包括端值)。术语炔基和亚炔基分别是指对应的自由基和双自由基。术语“同素环状芳族化合物”旨在表示芳族烃，例如苯和萘。术语“杂环化合物”旨在表示以下环状化合物其包含5、6或7个环原子，其中1、 2、3或4个环原子为选自N、0和/或S的杂原子。实例包括杂环芳族化合物，例如噻吩、 呋喃、批喃、批咯、咪唑、批唑、异噻唑、异噁唑、批啶、批嗪、嘧啶、哒嗪以及其部分或完全氢 化的同等物，例如哌啶、吡唑烷(pirazolidine)、吡咯烷、吡咯啉(pyroline)、咪唑烷、咪唑 啉、哌嗪和吗啉。术语“杂烷烃” “杂烯烃”和“杂炔烃”旨在表示其中一个或多个杂原子或基团已插 入所述部分的结构中的如上文所定义的烷烃、烯烃和炔烃。杂基团和杂原子的实例包括-0-、-s-、-s (0) -、-s (0) 2-、_C (0) -、_C (S)-和-NOO _，其中 R* 表示氢或 C「C6-烷基。杂烷烃的
实例包括
权利要求
1.一种用于制备缀合蛋白或缀合糖蛋白的方法，其包括以下步骤在任选取代的环糊 精分子存在下，使蛋白或糖蛋白与水不溶性的白蛋白结合物反应。
2.权利要求1的方法，其中所述环糊精分子包括任选被一个或多个CV6烷基例如甲 基、乙基或丙基取代的环糊精例如β -环糊精，所述Ch6烷基中的每一个可任选被一个或多 个羟基取代，例如羟乙基-环糊精或羟丙基-环糊精，具体地所述任选取代的环糊精包括 2-羟乙基-β-环糊精。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述任选取代的环糊精分子以至10%例 如5%的浓度加入。
4.前述权利要求中任一项的方法，其包括在含水缓冲溶液例如Hepes缓冲液，具体地 50mM Hepes, IOOmM NaCl 和 IOmM CaCl2,中反应。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述白蛋白结合物在1-辛醇、氯仿、环己烷和 二壬酸丙二醇酯(P⑶P)中都具有> 1、例如> 2、例如> 3、具体地> 4例如> 5的CLog P。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白缀合物为下式(I)的蛋白缀合物或其 药学上可接受的盐、溶剂化物或前药(A-W-B)y-P (I) 其中P表示蛋白或糖蛋白； B表示亲水间隔物； W为连接A和B的化学基团； A表示白蛋白结合残基；以及 y表示选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数； 使得所述A-W-B-部分包含水不溶性部分。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白表示凝血因子，例如FVII、FX、FII、 FV、蛋白C、蛋白34卩六、卩六1-1、组织因子、卩父1、卩父11和FXIII以及其序列FVIII、FIX变体、 具体地FVII、例如FVIIa。
8.权利要求6或权利要求7的方法，其中所述亲水间隔物具有下式 -X1-X2-X3-X4-其中X1 为 ^-[(CHROn-lL-IKagmElL-KCHR2、-^；^-，& 为-[(CHR3) I3-ff4] m4- {[ (CH2) n3E2] m5- [ (CHR4) I4-ff5] m6} n4_，)(3为 _[(CHR5)I5-W6]m7-，& SF-D I-(CH2) I6-D2-，II、12、13、14、15 和 16 独立选自 0-16，ml、m3、m4、m6 禾口 m7 独立选自 0-10,m2和m5独立选自0-25，nl、n2、n3和n4独立选自0-16，F为芳基、杂芳基、批咯烷-2，5-二酮c，其中所述芳基和杂芳基任选用卤 素、-CN、-OH、-C (0) OH、-C (0) NH2、-S (0) 20H 或 C^6-烷基取代，R1、R2、R3、R4 和 R5 独立选自氢、-C(0)0H、-C(O)NH2, -S(O)OH、_S(0)20H、-NH-C(=NH)-NH2, CV6-烷基、芳基或杂芳基；其中所述烷基、芳基和杂芳基任选用卤素、-C(O) OH、-C (0) NH2、-S (0) OH、-S (0) 20H、-CN 或-OH 取代，DU D2、El和E2独立选自_0_、-NR6-, -N(CORt)-或价键；其中R6和R7独立表示氢或C1-6_焼基，W1 至 W6 独立选自-C (O)NH-、-NHC(O)-、-C (O)NHCH2-、-CH2NHC (0)-、-C(O) NHS(O)2-, -S(0)2NHC(0)-、-OC(O) NH-, -NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (0)-、-C(O)CH = CH-、-CH = CHC (0) -、- (CH2) s2-、-C (0) -、-C (0) 0_、-OC (0)-或价键；其中 s2 为 0 或 1。
9.权利要求6-8中任一项的方法，其中所述亲水间隔物选自
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述白蛋白结合物选自
11.一种通过前述权利要求任一项的方法得到的缀合蛋白,
12.一种选自以下的蛋白缀合物
13.一种用于治疗的权利要求11或权利要求12的蛋白缀合物。
14.一种药物组合物，其包含任选与药学上可接受的赋形剂联合的权利要求11或权利 要求12的蛋白缀合物。
15. 一种用于血友病的预防性治疗的按照权利要求7的方法得到的缀合蛋白。
全文摘要
本发明涉及缀合蛋白、尤其但非唯一的凝血因子、用于制备所述缀合物的方法、包含所述缀合物的药物组合物以及所述缀合物在治疗中的用途、尤其但非唯一地在治疗由凝血因子缓解的疾病例如预防性治疗血友病中的用途。
文档编号A61K47/48GK102112157SQ200980130961
公开日2011年6月29日 申请日期2009年8月6日 优先权日2008年8月6日
发明者B·佩施克, C·贝伦斯, H·S·安德森, N·L·约翰森, P·W·加里贝, S·奥斯特加尔德, S·巴克 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司