专利名称：一种水母毒素去溶血毒性的方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种水母毒素去溶血毒性的方法。
背景技术：
水母毒素是一类结构新颖、毒性极强的肽类毒素，具有心血管、溶血、神经、呼吸等多种生物活性。由于水母毒素具有温度敏感、不稳定、易粘附、易失活等特点，其毒性成分的 纯化与鉴定工作进展缓慢，总体上滞后于其他常见生物毒素。水母毒素心血管毒性和溶血毒性在水母蜇伤中毒中发挥重要作用，也是水母毒素 中研究报道最多的两类毒性组分。其中心血管毒性组分丰度较低，但造成的心血管功能 损伤是水母毒素致死的主要原因(Xiao L，Liu GS, Wang QQ, et al.，The lethality of tentacle-only extractfrom jellyfish Cyanea capillata is primarily attributed to cardiotoxicity inanaesthetized SD rats [J].Toxicon. 2010, 55(4) :838_845)。溶 血毒性组分丰度较高，溶血会造成血钾升高，对损伤心血管功能可能起协同作用(Xiao L， Zhang J,Wang QQ,et al. ,In vitro and in vivo haemolyticstudies of tentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata[J]. Toxicol In Vitro. 2010,doi :10.1016/ j. tiv. 2010. 02. 009)。因此，要深入研究水母毒素心血管毒性机理，必须去除水母粗毒中高 丰度的溶血毒性组分，以利于心血管毒性蛋白的分离纯化。研究表明，心血管毒性组分比溶血毒性组分更为耐碱(聂菲，肖良，张静，等.发 形霞水母毒素分离产物溶血活性的比较及其影响因素分析[J].第二军医大学学报.2008， 29(1) :83_86 ；Xiao L，He Q，GuoY, et al.，Cyanea capillata tentacle-only extract as a potential alternativeof nematocyst venom Its cardiovascular toxicity and tolerance toisolation and purification procedures[J]. Toxicon. 2009, 53(1) 146-152)。但至今未见用碱性条件去除水母粗毒中高丰度溶血毒性组分的相关报道。
发明内容
本发明提供一种水母毒素去溶血毒性的方法，步骤如下1.制备水母粗毒提取液1)采样将采集到的水母迅速剪下触手，立即将触手干冰冷冻，运回后置于_70°C 超低温冰箱冻存备用；2)制备水母粗毒提取液将冻存触手用自配海水于4°C自溶4天，磁力搅拌器搅 拌，收集触手自溶液体，IOOOOg离心15min，上清液即水母粗毒提取液；2.制备去溶血毒性的水母毒素溶液1)用碱性条件破坏溶血毒性蛋白将上述制备的水母粗毒提取液用0. lmol/L NaOH调pH至10. 5，静置4h，IOOOOg离心15min去沉淀，取上清；2)纯化选用合适的透析袋及透析缓冲液，采用透析方法可将被破坏的溶血毒性 蛋白或其他杂蛋白和杂质去除，而保留水母毒素的心血管毒性组分。
本发明选用透过分子量为IOkDa的透析袋，将上述上清液先用0. 02mol/L、pH6. 0 醋酸缓冲液透析24h，再将缓冲液更换为0. 02mol/L、pH 9. 5Tris-醋酸缓冲液继续透析 24h，IOOOOg离心15min，弃沉淀，上清液即为去溶血毒性的水母毒素溶液。本发明将水母毒素去溶血毒性前后的蛋白浓度、溶血毒性和心血管毒性进行了对 比实验，结果表明，所制备的去溶血毒性的水母毒素的蛋白浓度大大低于水母粗毒，溶血毒 性基本丧失，而心血管毒性只略低于水母粗毒，说明本发明方法能有效去除水母毒素的溶 血毒性，并能保存其心血管毒性，有利于深入研究水母毒素心血管毒性机理。本发明方法简单，为深入研究水母毒素心血管毒性机理提供了一种去溶血毒性的 简便而有效的方法。
图1.水母粗毒与去溶血毒性水母毒素的溶血活性比较图。图2.水母粗毒与去溶血毒性水母毒素的心血管活性比较图。
具体实施例方式现结合附图和实施例对本发明作详细描述。实施例1.制备去溶血毒性水母毒素1.制备水母粗毒提取液发形霞水母采自浙江省三门湾海域，取触手10g，加入自配海水(NaCl 28g， MgCl2 · 6H20 5g，KCl 0. 8g, CaCl2L 033g，加水至 1000ml) 10ml,自溶 4 天，磁力搅拌器每日 搅拌2次，每次lOmin。100目细胞筛网过滤3次，滤液IOOOOg离心3次，每次15min，收集 上清即水母粗毒提取液(cTOE，crude tentacle-only extract)。制备去溶血毒性的水母
毒素将上述水母粗毒提取液采用0. lmol/L NaOH调pH至10. 5，静置4h，IOOOOg离心 15min去沉淀，取上清；上清液用透过分子量为IOkDa的透析袋进行透析，先用0. 02mol/ L、pH 6. 0醋酸缓冲液透析24h，再将缓冲液更换为0. 02mol/L、pH 9. 5Tris-醋酸缓冲液 继续透析24h，IOOOOg离心15min，弃沉淀，上清液即为去溶血毒性的水母毒素溶液(tTOE， treated tentacle-only extract)0所有操作都在冰水或4°C条件下进行。使用前采用0. 01mol/L、pH7. 4PBS透析8h。水母毒素去溶血毒性前后蛋白浓度、溶血毒性和心血管毒性对比实验1)蛋白浓度比较蛋白浓度测定采用Bradford法进行，测得cTOE蛋白浓度为1. 5mg/ml，而tTOE蛋 白浓度为0.5mg/ml，是cTOE蛋白浓度的1/3。说明通过本方法可以大大降低cTOE中的杂 蛋白浓度。2)溶血毒性比较雄性SD大鼠1只(第二军医大学动物中心提供，下同)，体重250g，用25%乌拉坦 腹腔注射麻醉，按体重麻醉剂量为1. 2g/kg。股动脉插管取大鼠动脉血，等体积50u肝素生 理盐水抗凝，PBS漂洗数次，每次漂洗后3000g离心5min弃上清，直至上清清亮为止。红细 胞与PBS按体积比1 50(2% )稀释成红细胞悬液。反应总体积1.5ml，其中红细胞悬液0. 5ml，实验组cTOE和tTOE各设5个剂量组，分别加入0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，再用PBS加 至反应总体积1. 5ml ；阴性对照组不加毒素(即Oml)，阳性对照组加0. 4ml 0. 2mg/ml皂素， 也用PBS加至反应总体积1. 5ml。37°C水浴30min，3000g离心5min，用分光光度计分别检 测A545，计算溶血分数，溶血分数=[(样品管A545)-(阴性对照A545) ]/[(阳性对照A545)-(阴 性对照A545)] X 100%，结果见图1。由图1可见，cTOE溶血毒性非常强烈，呈剂量依赖性，而 tTOE的溶血毒性几乎完全丧失，说明制备tTOE的过程中成功去除了 cTOE中的溶血毒性。3)心血管毒性比较雄性SD大鼠12只，体重200 250克，随机分为cTOE与tTOE两组，每组6只，25%乌拉坦腹腔注射麻醉，按体重麻醉剂量1. 2g/kg。左侧股动脉插管连接压力感受器， MPA生物信号分析系统监测并记录SD大鼠股动脉血压的变化。右侧颈外静脉置管，按体重 给药，剂量分别为cTOE 10mg/kg, tTOE 3. 3mg/kg(相当于cTOE 10mg/kg)，观察SD大鼠血 压变化，结果见图3。从图3的A、B、C中可以看出，通过本发明方法处理后的tTOE虽然与 cTOE相比心血管毒性稍弱，但仍具有很强的心血管毒性，说明本方法在去除溶血毒性等非 心血管毒性成分的同时，能较好地保存心血管毒性成分。
权利要求
一种水母毒素去溶血毒性的方法，步骤如下1)制备水母粗毒提取液将采集到的水母迅速剪下触手，立即将触手干冰冷冻，再置于-70℃超低温冰箱冻存备用；将冻存触手用自配海水于4℃自溶4天，磁力搅拌器搅拌，收集触手自溶液体，10000g离心15min，上清液即为水母粗毒提取液；所说自配海水为NaCl 28g，MgCl2·6H2O 5g，KCl 0.8g，CaCl2 1.033g，加水至1000ml；2)制备去溶血毒性的水母毒素溶液将上述制备的水母粗毒提取液用0.1mol/L NaOH调pH至10.5，静置4h，10000g离心15min去沉淀，取上清；上清液用透过分子量为10kDa的透析袋进行透析，先用0.02mol/L、pH 6.0醋酸缓冲液透析24h，再将缓冲液更换为0.02mol/L、pH 9.5Tris-醋酸缓冲液继续透析24h，10000g离心15min，弃沉淀，上清液即为去溶血毒性的水母毒素溶液。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种水母毒素去溶血毒性的方法。步骤为1)将水母触手用自配海水于4℃自溶4天，磁力搅拌器搅拌，收集触手自溶液体，10000g离心15min，上清液即为水母粗毒提取液；2)将水母粗毒提取液用0.1mol/L NaOH调pH至10.5，静置4h，10000g离心15min去沉淀，上清液用透过分子量为10kDa的透析袋进行透析，先用0.02mol/L、pH 6.0醋酸缓冲液透析24h，再将缓冲液更换为0.02mol/L、pH 9.5Tris-醋酸缓冲液继续透析24h，10000g离心15min，弃沉淀，上清液即为去溶血毒性的水母毒素溶液。本发明为水母毒素提供了一种去溶血毒性的简便而有效的方法。
文档编号A61P7/00GK101822692SQ201010149779
公开日2010年9月8日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者刘四化, 张黎明, 王倩倩, 肖良 申请人:中国人民解放军第二军医大学