专利名称：拟脂联素多肽片段用于治疗缺血缺氧性脑病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞因子应用领域，更具体地说，涉及一种拟脂联素多肽片段用于治 疗缺血缺氧性脑病药物的应用，特别适用于罹患高原脑水肿患者。
背景技术：
急性高原病(Acute Mountain Sickness，AMS)是指由平原进入高原或由高原进 入更高海拔地区，在短期内(数小时至数日)发生的各种临床症候群，分为急性轻型高原病 (急性高原反应)、高原肺水肿和高原脑水肿。其中，高原脑水肿(High Altitude Cerebral Edema, HACE)多在海拔3700米以上高度发病，起病急骤，病情危重，常合并高原肺水肿、严 重感染、心衰、多系统器官功能衰竭以及并发脑出血等，病死率高，成为目前高原病预防及 治疗的重点。研究证明，血管源性水肿是HACE发生的主要病理基础，缺氧时毛细血管静压 升高，可能通过机械作用使脑静脉破裂，血管通透性增加，牵张内皮细胞可能使血脑屏障开 放增加而导致水肿形成。在特殊条件下，如战争或毁灭性自然灾害如地震时，大量人员快速 集结进入高原，高强度运动时，由于没有充分的时间进行预防性教育及培训，以及无针对病 因的治疗手段，HACE对此类人员的的影响将更为显著。脂联素是一种由脂肪细胞分泌并释放入血液循环而发挥作用的细胞因子，它由22 个胶原重复序列的柄和高度保守的gAd组成，正常人血浆中脂联素含量丰富，是一种与机 体代谢密切相关的激素，具有降血糖、降血脂、胰岛素增敏等作用。近年的研究发现，它与动 脉粥样硬化以及由此引发的缺血性心脏病之间也有一定关联。临床观察表明，血浆中脂联 素水平与心肌梗死的发病危险性明显呈负相关，而糖尿病患者血浆中脂联素的水平会显著 降低，另外，还发现脂联素具有直接的抗细胞凋亡的作用。而直接利用脂联素预防性注射入 小鼠脑内后，可以显著减轻缺血后脑组织的水肿程度。这些结果提示脂联素可能具有直接 的神经保护作用。而给这类患者补充外源性脂联素可能成为一种神经保护的治疗手段。虽然目前人源性脂联素已经成功制备，但因其分子量较大，无法透过血脑屏障发 挥其神经保护作用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种拟脂联素多肽片段用于治疗缺血缺氧性脑病药物的 应用，特别是高原脑水肿发生时，通过外源性给药，以减轻患者脑水肿损伤。申请人:根据脂联素氨基酸序列，利用蛋白质分析技术和多肽合成技术得到了拟脂 联素多肽片段，其氨基酸序列如下NH2-LQVYGDGDHNGLYADNVN-C00H ，并发现该该蛋白在 体内能迅速通过血脑屏障，作用于脑血管内皮细胞，促进eNOS的磷酸化并增加NO的生成， 在预防性给药后，可在急性缺氧条件下，保护脑血管内皮细胞并显著减轻急性缺氧后脑水 肿的程度及范围。并采用SYBYL程序计算多肽片段分子模型并构建3D分子结构。合成的 多肽片段腹腔注射小鼠后，可以有效地通过血脑屏障并和脑内脂联素受体结合而发挥类脂 联素作用。
申请人研究表明，与全长的脂联素相比，拟脂联素多肽片段有着类似的生物学活 性，而且给药后反应迅速，生物利用度好，有着更好的临床应用前景。申请人:在研究中发现
1、人工合成的拟脂联素多肽片段腹腔注射或尾静脉注射小鼠后，可以有效地通过血脑 屏障并和脑内脂联素受体结合而发挥类脂联素作用，并明显减小其缺血后的脑水肿范围。2、拟脂联素多肽片段能够促进脑血管内皮细胞NO生成。3、拟脂联素多肽片段能够促进脑血管内皮细胞eNOS磷酸化。
图1是拟脂联素多肽3D空间结构A 对照多肽片段；B:拟脂联素多肽圆圈勾出 部分为与脂联素受体结合位点。图2是给予小鼠拟脂联素多肽腹腔注射后，可以明显减小其缺血后脑水肿范围图 片。图中表示对不同处理组的脑组织TCC染色，(A):未治疗组，(B):拟脂联素多肽治疗组。图3是给予小鼠拟脂联素腹腔注射，可促进脑血管内皮细胞NO生成。图中，Sham 对照组；Vehicle 缺血缺氧未治疗组，gAD:缺血缺氧前，拟脂联素多肽预防性治疗组。**与 Vehicle 相比，Ρ<0· 01。图4是拟脂联素多肽促进脑血管内皮细胞eNOS磷酸化。图中，Sham:对照组； Vehicle 缺血缺氧未治疗组，gAD:缺血缺氧前，拟脂联素多肽预防性治疗组。**与Vehicle 相比，P<0. 01。以下结合附图和发明人给出的实验及其结果对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式1、拟脂联素多肽人工固相合成
多肽的合成工艺分成了四个步骤，即粗肽合成、粗肽纯化、色谱肽粉、精烘包。(1)粗肽合成
采用固相Fmoc-法拟脂联素多肽合成工艺。用Fmoc-法固相多肽合成工艺合成。以 wang树脂作为固相载体，以DMAP，DIC为缩合剂与第一个氨基酸连接；以活泼酯法连接以 后十八个氨基酸，缩合剂组成为TBTU/H0BT/DIEA ；以甲醇为清洗剂，以25%哌啶的DMF溶液 为脱保护剂；以TFA/T0SLE/EDT/PNL/H20=82. 5/5/2. 5/5/5为切割剂；以自行研制的多肽 合成器为设备建立适于拟脂联素多肽的大规模合成工艺及设备体系。(2)粗肽纯化
HPLC反相色谱法纯化拟脂联素多肽，纯度大于98%。其主要工艺内容为二元梯度洗脱， 流动相A:0. 1%三氟乙酸水溶液，流动相B:0. 1%三氟乙酸乙腈溶液，洗脱时间30分钟，B: 10 40%，流速60ml/min，检测波长215nm，每次粗肽上样量为lg，将主峰分为四段收集，经 HPLC分析，纯度符合要求者合并浓缩，纯度不符合要求的重新纯化。统计对粗肽中目标产 物的生产收率。(3)色谱肽粉
色谱纯拟脂联素多肽浓缩及冷冻干燥。旋转蒸发浓缩，原流动相中的乙腈随浓缩过程 的进行被挥发除去，至肽溶液体积减少至原体积的5% 10%时停止浓缩。浓缩液置-20°C预冻成冰，再置冷冻干燥机内冷冻干燥，使其脱水成为粉末，HPLC分析纯度、醋酸含量及三 氟乙酸残留。(4)精烘包
拟脂联素多肽原料药的精制、干燥、分装。在10000级净化环境下将肽粉用注射用水溶 解，用截流量10000的微孔滤膜过滤，滤液置-20°C预冻成冰，置冷冻干燥机内冻干，再将肽 粉装在含有干燥剂五氧化二磷的真空干燥器内室温下减压脱水24小时，收集，称量，分装。 得到拟脂联素多肽的原料。2、拟脂联素多肽制剂的制备
总体积为IOOOml制剂缓冲液，用氢氧化钠调整PH=7. 0，内含(30g)甘露醇其含量为3%， 计算加入拟脂联素多肽原料使其含量为20(^g/ml，每个2ml西林瓶中灌装0. 6ml,置冷冻干 燥机中冰冻干燥，制成拟脂联素多肽的冻干粉针剂。称取一定量的拟脂联素多肽肽粉原料， 分级混合的方法与赋性剂(淀粉)混勻，装胶囊，制作拟脂联素多肽的胶囊制剂。3、拟脂联素多肽原料和制剂的质量标准研究
原料检定包括纯度(HPLC)、分子量(质谱)、氨基酸组成、氨基酸序列、紫外吸收、红外吸 收等；制剂检定包括鉴别(化学鉴别、高效液相色谱鉴别)，检查(包括有酸碱度、颜色与澄 清度、水分、含量均勻度、装量差异、无菌和细菌内毒素)，含量测定等方法。所得到的拟脂联 素多肽空间结构可见图1，与脂联素受体完全结合，满足设计要求。4、药效学研究
采用小鼠急性脑缺血模型，研究拟脂联素多肽灌胃给药和肌注给药对实验性急性脑缺 氧的防治作用。1)建立动物急性脑缺血模型
小鼠腹腔注射拟脂联素多肽片段后，以2%异氟烷面罩吸入麻醉，术中麻醉机控制持续 吸入异氟烷。参照zea—Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型，用线栓阻 断右侧MCA的血液供应，阻断大脑中动脉2h后退出线栓，而sham组只分离颈总动脉不置入 线拴。术中直肠温度控制在36. 5^37. 5°C，监测小鼠鼠颞温和局部脑血流。2)脑水肿面积检测
于缺血24h处死动物(每组4飞只)，迅速断头取脑，脑组织放入脑槽切成Imm厚的切片。 切片放入1% TTC生理盐水中孵育3-5min (37°C pH 7.4)。采集并分析图像。3)动物处死后，剪取基底动脉并检测血管内皮细胞NO含量。4)检测血管内皮细胞eNOS含量。5)、结果
(1)人工合成的拟脂联素多肽片段腹腔注射小鼠后，可以有效地通过血脑屏障并和脑 内脂联素受体结合而发挥类脂联素作用，并明显减小其缺血后的脑水肿范围(图2)。(2 )拟脂联素多肽片段能够促进脑血管内皮细胞NO生成(图3 )。(3)拟脂联素多肽片段能够促进脑血管内皮细胞eNOS磷酸化(图4)。综上所述，申请人利用DNA重组技术和蛋白修饰技术制作出了拟脂联素多肽片 段，并发现该该蛋白在体内能迅速通过血脑屏障，作用于脑血管内皮细胞，促进eNOS的磷 酸化并增加NO的生成，在预防性给药后，可在急性缺氧条件下，保护脑血管内皮细胞并显 著减轻急性缺氧后脑水肿的程度及范围，有潜在的临床应用价值。
采用本发明的拟脂联素多肽片段制成的药物为静脉注射给药制剂。使用对象是缺 血缺氧性脑病患者，特别是罹患高原脑水肿患者。对患者发生高原脑水肿治疗时，通过外源 性给药，以减轻发病后脑水肿程度。本发明简单易行，且无特殊禁忌症，可在大医院、小诊所 等广泛使用。
权利要求
一种拟脂联素多肽片段用于制备治疗缺血缺氧性脑病药物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的拟脂联素多肽片段的氨基酸序列如 下NH2-LQVY⑶⑶HNGLYADNVN-COOH。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为静脉注射给药制剂。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是对患者发生高原脑水肿治疗 时，通过外源性给药，以减轻发病后脑水肿程度。
全文摘要
本发明公开了一种拟脂联素多肽片段用于治疗缺血缺氧性脑病药物的应用，该拟脂联素多肽片段有着脂联素类似的生物学活性，而且给药后反应迅速，生物利用度好，有着较好的临床应用前景。
文档编号A61P25/00GK101879306SQ201010185120
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者屈延, 廉坤, 张磊, 费舟, 陶凌 申请人:中国人民解放军第四军医大学