专利名称：鸦胆子油乳注射液在抗癌方面的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸦胆子油乳注射液在抗癌方面的新用途，具体地说是涉及其在抗血液 系统肿瘤，泌尿生殖系统肿瘤尤其是抗人白血病方面的用途。
背景技术：
鸦胆子油来源于苦木科常绿灌木或小乔木鸦胆子Brucea javanicaOjMerr的 成熟果实鸦胆子Fructus Bruceae，其抗癌有效成分为鸦胆子油的脂肪酸，其中油酸占 92. 1%。早在50年代，就有报道表明鸦胆子油对外耳道乳头状瘤及喉乳头状瘤有一定疗 效，70年代又发现鸦胆子水针剂及鸦胆子油静脉乳对宫颈癌，消化道癌有良好疗效。目前临 床上主要使用的为鸦胆子油乳注射液，主要用于治疗肺癌，肺癌脑转移以及消化道癌症。恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀 手。白血病是一类常见的造血系统恶性疾病。其特点为白细胞及其前身幼稚细胞在骨髓或 其他造血组织中弥漫性的异常增生，进而浸润人体组织器官，产生各种症状。前列腺癌是男 性生殖系统最常见的恶性肿瘤，发病随年龄而增长。前列腺癌具有易转移的特点，极易转移 至骨，脑以及直肠等器官，恶性程度较高，极大的影响了患者的生存质量。细胞凋亡是在某些生理或病理条件下，细胞接受到某种信号所触发的并按一定程 序缓慢死亡的过程。借此机体让不需要的细胞消亡，维持组织器官细胞数目恒定以维持生 长的平衡。同时，对控制细胞增殖、防止肿瘤的发生与生长有重要意义。恶性肿瘤发生的重 要原因之一是细胞凋亡异常。目前，以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的凋亡干预技术 可能成为治疗恶性肿瘤的基本策略。许多细胞凋亡调节分子被用来作为抗肿瘤药物筛选及 肿瘤基因治疗的靶点。目前未见报道将鸦胆子油乳注射液用于抗血液系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤和人 白血病。
发明内容
本发明的目的是提供鸦胆子油乳注射液在抗肿瘤方面的新用途。本发明提供了鸦胆子油乳注射液在抗血液系统肿瘤方面的新用途。1)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的抑制人白血病U937的成活率。2)鸦胆子油乳注射液剂量依赖性的诱导U937细胞发生凋亡，说明鸦胆子油乳注 射液具有抗白血病的潜力。3)鸦胆子油乳注射液剂量依赖性的抑制人白血病NB4的成活率。4)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的抑制人白血病HL-60的成活率。5)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的诱导HL-60细胞发生凋亡，说明鸦胆子油乳 注射液具有抗白血病的潜力。6)鸦胆子油乳注射液能剂量依赖性的诱导从白血病患者血液中分离的白血病细 胞发生凋亡，说明鸦胆子油乳剂具有临床应用于治疗白血病的潜力。
7)鸦胆子油乳注射液对从健康志愿者血液中分离的正常外周血淋巴细胞的细胞 毒作用较低，说明鸦胆子油乳剂可能对白血病患者的毒副作用较低，具有临床应用于治疗 白血病的潜力。8)鸦胆子油乳注射液对人癌异种移植瘤(U937肿瘤模型)具有明显的抑制作用， 进一步说明了鸦胆子油乳注射液具有抗白血病的潜力。本发明还提供了鸦胆子油乳注射液在抗泌尿生殖系统肿瘤方面的新用途。
图1为鸦胆子油乳注射液对人白血病细胞系和人前列腺癌细胞系成活率的影响结果以Mean士SEM表示。< 0. 001加药组与空白组进行比较)其中A为鸦胆子油乳注射液对三种人白血病细胞系成活率的影响；B为鸦胆子油乳注射液对人前列腺癌细胞Dul45成活率的影响。图2为鸦胆子油乳注射液对人白血病细胞U937细胞周期的影响图3为鸦胆子油乳注射液对人白血病细胞株U937凋亡相关蛋白影响图4为鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞和白血病细胞U937成活率的 影响结果以Mean士SEM表示。< 0. 001加药组与空白组进行比较)图5为鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞和白血病细胞系U937细胞周 期的影响图6为鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞和白血病细胞系U937线粒体 膜电位的影响图7为鸦胆子油乳注射液对人癌异种移植模型瘤重和瘤体积的影响< 0. 001加药组与空白组进行比较)
具体实施例方式试验例1鸦胆子油乳注射液处方及制备工艺1.1执行标准部颁标准中药成方制剂第十四册WS3-B-2739_97药典业发(1999)第254号1. 2 处方精制鸦胆子油10000ml精制豆磷脂1500g甘油2500ml加注射用水至100000ml_制成10000 支1.3制备工艺取处方量的精制豆磷脂与温热的甘油与适量注射用水混合，转入到高速组织捣碎
4机内(8000转/分)，分散二次，第一次5分钟，第二次2分钟，使其分散均勻，加入温热的鸦 胆子油，搅拌3次，每次2分钟，使成初乳剂，加入注射用水至10000ml，再转入到高压乳勻机 内(40MPa)勻化三次，滤过，取滤液，灌封，灭菌，即得鸦胆子油乳注射液。试验例2以人源性白血病HL-60，NB4及U937细胞株，人源性前列腺癌Dul45细胞 株为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对这些细胞的抑制作用实验1 材料人源性白血病HL-60、NB4及U937细胞株，人源性前列腺癌Dul45细胞株由ATCC 提供。RMPI 1640干粉购自Invitrogen/Gibco。胎牛血清购自TBD公司。胰酶购自北 京华美生科生物技术有限公司。四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)购自购自北京华美生科生物技 术有限公司。2 方法将由ATCC提供的人源性白血病HL-60、NB4及U937细胞株、人源性前列腺癌 Du-145细胞株用胰酶消化后，悬浮于含10%胎牛血清的培养液中，轻轻吹打成细胞悬液， 显微镜下用细胞计数板计数活细胞。将肿瘤细胞接种于无菌的96孔培养板，每孔加肿瘤细 胞悬液100 μ 1。将细胞置于37°C、体积百分比为5%的CO2培养箱中贴壁过夜后，弃去上清 液，然后加入不同浓度的鸦胆子油乳注射液药物分别作用一定时间后，转移上清液，在每孔 中加入0. 5mg/ml四唑盐(MTT)的无血清培养液100 μ 1，37°C、体积百分比为5%的CO2培 养箱中继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入100 μ 1 DMS0，测定各孔吸光度，然后按下式 计算平均抑制率。结果采用Mean士SEM表示，数据统计采用ANOVA对组间均数比较进行方 差齐性分析，并运用Durmett，s t_test进行组间比较。计算公式(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值XlOO3 结果结果如表1所示，鸦胆子油乳注射液对人源性白血病HL_60，U937细胞株和人源性 前列腺癌Du-145细胞株具有抑制作用，并随剂量的递增而提高。鸦胆子油乳注射液作用白 血病HL-60及U937细胞6小时后，其IC50分别为312. 7，271. 5，265. 4 μ g/ml。鸦胆子油乳 注射液作用前列腺癌Dul45细胞48和72小时后，其IC50分别为455. 96和334. 00 μ g/ml。此结果表明，鸦胆子油乳注射液具有抗血液系统肿瘤以及泌尿生殖系统肿瘤的潜 力。试验例3以人源性白血病U937细胞株为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对于U937 细胞株细胞周期的影响实验1 材料碘化吡啶(PI)染料购自Sigma公司。Rnases A 购自Sigma公司。流式细胞仪 Becton Dickinson 公司。2 方法将处于对数生长期的白血病U937细胞调整细胞密度为1 1. 5 X 105cellS/ml，加 入一定浓度的药物后，于培养中孵育6小时。然后从培养箱中取出，IOOOrpm离心沉淀细胞， 并用PBS洗涤1次。然后使用70%的酒精于-20度冰箱内固定过夜。待检测时，离心收集 细胞，PBS洗涤一边后，加入20mg/ml的RnaseA 37°C孵育45min，然后加入lmg/ml的PI燃 料，4°C孵育10分钟后，即可用流式细胞仪进行检测。
3 结果结果如图2所示，鸦胆子油乳注射液(125μ g/ml,250y g/ml和500 μ g/ml)均可 使U937细胞株的亚凋亡峰增加，并具有剂量依赖性。细胞的亚凋亡峰为凋亡发生时的重要 特征之一，可部分证明鸦胆子油乳注射液可诱导U937细胞发生凋亡。试验例4以人源白血病U937细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对凋亡蛋白的 影响实验1 材料PARP,procapase-3,procaspase-8,procaspase-9 抗体均购自 CellSignaling 公 司。ECL:购自Thermo Scientific公司。山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗均购自宝信生 物科技有限公司。2 方法Western blot方法。选择依托泊苷注射液为阳性药。鸦胆子油乳注射液作用6小 时后，提取细胞蛋白进行实验。3 结果结果如图3所示Caspase-3，Caspase-9以及Caspase-8均为凋亡通路上的重要 执行蛋白，鸦胆子油乳注射液作用后，均能使他们发生活化。而PARP，作为Casapse-3的作 用底物，当Capsase-3被活化时，能够启动凋亡并使PARP发生裂解。结果表明，鸦胆子油乳 注射液能够使PARP发生裂解，从而进一步证明了凋亡的发生。试验例5以从白血病患者体内分离的白血病细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射 液对分离的白血病细胞细胞周期的影响试验1 材料淋巴分离液购自天津TBD公司2 方法取新诊断的白血病患者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴 加入到2. 5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清 中的淋巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10%。然后加入指 定浓度的鸦胆子油乳注射液，6小时后收集细胞进行细胞周期的测定。3 结果表1中为14名白血病患者的临床指标，以及鸦胆子油乳注射液作用后，白血病细 胞的细胞周期的变化。实验结果表明，鸦胆子油乳注射液可显著升高14名患者白血病细胞 的亚凋亡峰。结果表明，鸦胆子油乳注射液可诱导白血病患者的白血病细胞发生凋亡。表1白血病患者的临床指标以及鸦胆子油乳注射液作用后的凋亡百分比
试验例6以正常外周血淋巴细胞(PBL)为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对正常外 周血淋巴细胞成活率的影响试验1 材料淋巴分离液购自天津TBD公司2 方法取健康志愿者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到 2. 5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋 巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10%。然后加入指定浓度 的鸦胆子油乳注射液，6小时后采用MTT法进行细胞成活率的测定。3 结果结果如图4所示，同样浓度的鸦胆子油乳注射液作用对正常人外周血淋巴细胞成 活率的影响要明显小于白血病细胞系U937。这表明，鸦胆子油乳注射液对正常人血液系统 的毒副作用较低。
试验例7以正常外周血淋巴细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对正常外周血 淋巴细胞细胞周期的影响试验1 材料PI染料美国Sigma公司。淋巴分离液购自天津TBD公司2 方法取健康志愿者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到 2. 5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋 巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10%。然后加入指定浓度 的鸦胆子油乳注射液，6小时后收集细胞，并使用70%酒精于-20度冰箱内固定过夜。待检 测时，离心收集细胞，PBS洗涤一边后，加入20mg/ml的RnaseA 37°C孵育45min，然后加入 lmg/ml的PI燃料，4°C孵育10分钟后，即可用流式细胞仪进行检测。3 结果结果如图5所示，相同剂量鸦胆子油乳注射液作用后，白血病细胞系U937的细胞 周期出现了明显的亚凋亡峰，而正常人外周血淋巴细胞的细胞周期却几乎不受影响。这表 明，鸦胆子油乳注射液可能有选择性作用于肿瘤细胞的特性，提示鸦胆子油乳注射液可作 为一个高效低毒的抗肿瘤药物用于治疗白血病。试验例8以正常外周血淋巴细胞为靶细胞进行鸦胆子油乳注射液对正常外周血 淋巴细胞细胞周期的影响试验1 材料Rh 123染料美国Sigma公司。淋巴分离液购自天津TBD公司2 方法取健康志愿者的外周血5ml，将其分成两等份。与等量PBS混合后，逐滴加入到 2. 5ml的淋巴分离液中。然后2500rpm离心15分钟后，吸取位于淋巴分离液与血清中的淋 巴细胞层。用PBS洗涤后，培养于RMPI 1640培养液中，胎牛血清10%。然后加入指定浓度 的鸦胆子油乳注射液，6小时后收集细胞，细胞(IO6个)经PBS洗涤后，加入Rhl23至终浓 度为0. 2 μ g/mL,于室温避光孵育20分钟。细胞样品经PBS洗涤后经流式细胞仪检测其荧 光强度(激发波长为495nm，吸收波长为535nm)。3 结果结果如图6所示，相同剂量鸦胆子油乳注射液作用后，白血病细胞系U937的线粒 体膜电位发生了明显的下降，而正常人外周血淋巴细胞线粒体膜电位的下降程度却远远低 于U937细胞。这表明，鸦胆子油乳注射液可能有选择性作用于肿瘤细胞的特性，提示鸦胆 子油乳注射液可作为一个高效低毒的抗肿瘤药物用于治疗白血病。试验例9以人癌异种移植模型来进行考察鸦胆子油乳注射液体内抗白血病作用 的实验1试验材料PBS缓冲液，游标卡尺2 方法从北京国家啮齿类动物中心购买体重范围为22 25mg的雄性裸小鼠，动物运 抵中国医科大学SPF级实验室后需渡过7天的检疫期，每隔1天对动物进行称重，观察动
8物是否出现疫病。收集对数生长期的U937细胞，使用高压灭菌后的PBS调整细胞密度为 5X107,于小鼠右侧腋下皮下接种0. 2mL细胞悬液。使用游标卡尺测量动物皮下生长的瘤 块，当瘤块体积达50 SOmm3时，将动物随机分成空白组，阳性药组，低剂量组，中剂量组和 高剂量组。用生理盐水对药物进行稀释，并通过尾静脉注射给予动物剂量分别为5. 5mg/kg, 16. 5mg/kg和49. 5mg/kg的药物。阳性药为2. Smg/kg的依托泊苷注射乳。连续给药10天， 每天给药前称量动物体重。每隔一天称量动物的摄食和饮水，并使用游标卡尺测量动物皮 下生长的瘤块。于第11天脱颈处死动物，进行剥瘤，称量瘤重为肿瘤组织拍照。并使用以 下公式计算瘤体积瘤长度X瘤宽度72。3实验结果结果如图7所示，尾静脉注射鸦胆子油乳注射液10天，可以显著抑制肿瘤的增长。 鸦胆子油乳注射液处理组的瘤重和瘤体积均显著小于空白组。这表明鸦胆子油乳注射液在 人癌异种移植模型中也具有较好的抗白血病作用，提示鸦胆子油乳剂可以作为一个抗肿瘤 药物用于治疗白血病。
权利要求
鸦胆子油乳注射液在制备抗血液系统肿瘤药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血液系统肿瘤为人白血病。
3.鸦胆子油乳注射液在制备抗泌尿生殖系统肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了鸦胆子油乳注射液在抗癌方面的新用途，尤其是在抗白血病方面的新用途。本发明分别以人源性白血病U937，NB4及HL-60细胞株，人源性前列腺癌Du145细胞株为靶细胞，研究了鸦胆子油乳注射液对血液系统肿瘤以及泌尿生殖系统肿瘤的抑制作用。首次发现鸦胆子油乳注射液对人源性白血病HL-60，NB4及U937细胞株和人源性前列腺癌Du145细胞株具有抑制作用，并随剂量的递增而提高。且鸦胆子油乳注射液还能诱导人白血病细胞的凋亡，并对原代分离的白血病细胞也有诱导凋亡的作用。并且，鸦胆子油乳注射液对正常人外周血淋巴细胞的细胞毒作用较低。这些结果表明，鸦胆子油乳注射液在治疗白血病方面具有一定的潜力，可为白血病的治疗提供一个高效低毒的药物。
文档编号A61K131/00GK101879202SQ201010217878
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者吴春福, 张弘, 徐勇猛, 杨静玉, 牟艳华, 王立辉, 王芳, 韩飞 申请人:沈阳药科大学