专利名称：一种用于预防和治疗神经损伤或其相关疾病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和/或治疗神经损伤或其相关疾病的药物，具体涉及脂 肪来源的成体干细胞分泌的神经营养因子混合物或脂肪来源的成体干细胞体外培养物在 制备预防和/或治疗神经损伤或其相关疾病的药物中的用途。
背景技术：
脂肪来源的成体干细胞(ASC)是由脂肪组织提取的间充质干细胞，其提供了 丰富的、容易获得的且可补充的用于潜在临床应用的原料。这些多能细胞存在于脂肪 组织的“基质”或“非脂肪细胞”部分，以前被认为是“前脂肪细胞”。由于它们具有分化 成脂肪细胞的能力，ASC已经被作为潜在的软组织替代物研究了几十年(Dardick，I.， et al. ， Ultrastructuralobservations on differentiating human preadipocytes cultured in vitro. TissueCel1，1976. 8 (3) :561-71 ；Rieck，B. and S. Schlaak，In vivo tracking of ratpreadipocytes after autologous transplantation. Ann Plast Surg,2003. 51 (3) :294_300 ；Kimura，Y.，et al.，Adipose tissue engineering based on humanpreadipocytes combined with gelatin microspheres containing basic fibroblastgrowth factor. Biomaterials, 2003. 24 (14) :2513_21)。近来的证据显示 ASC具有相当广泛的分化潜能，并且现在被认为是骨髓基质细胞的替代物(Gimble，J. md F.Guilak, Adipose-derived adult stem cells :isolation， characterization, and differentiation potential. Cytotherapy, 2003. 5(5) :362_9 ；Gronthos，S.，et al.， Surface protein characterization of human adiposetissue-derived stromal cells. J Cell Physiol，2001. 189(1) :54_63)。例如，在种系特异性诱导因子存在下，人体皮下 ASC 會邑够分化为成骨细胞(Dragoo, J. L.，et al.，Bone induction by BMP—2 transduced stem cells derived fromhuman fat. J Orthop Res, 2003. 21 (4) :622_9·)，心肌细胞 (Rangappa, S. ， et al. ， Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissueinto cardiomyocytes. Ann Thorac Surg,2003.75(3) :775_9 ； Planat—Benard，V. ，et al. ，Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stromacells. Circ Res, 2004. 94(2) :223_9)和内皮细胞(Planat-Benard，V.， et al. ， Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells physiological and therapeutic perspectives. Circulation，2004. 109(5) :656_63)。当 移植到免疫缺陷小鼠中时，这些人体的ASC还能分化成软骨细胞(EricksomG.R.，et al.， Chondrogenic potential of adipose tissue-derivedstromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun,2002. 290(2) :763_9)。最近证实了 ASC具有分化成其它种系之外的细胞的能力，其在体内和体外可特 异性地分化成神经胶质细胞(Zuk, P. Α.，et al.，Human AdiposeTissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell,2002. 13(12) :4279_4295. ；Guilak，F.，et al. ， Clonal analysis of the differentiation potential ofhuman adipose-derived
3adult stem cells. J Cell Physiol,2006.206 (1) 229-37 ；Fujimura，J.，et al.， Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolatedfrom GFP transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 333 (1) :116_21 ；Kokai，LE.， J. P. Rubin, and K. G Marra, The potential of adipose-derivedadult stem cells as a source of neuronal progenitor cells. Plast Reconstr Surg,2005. 116 (5) 1453-60)。来源于小鼠、大鼠或人的ASC经过诱导后可表达呈现神经元的特异性标记， 如 NeuN、巢蛋白禾口 tau 蛋白(Safford, K. M. ， etal. ，Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromalcells. Biochem Biophys Res Commun, 2002.294 (2) :371_9 ；Safford, K. Μ. , et al. , Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derivedadult stromal cells.Exp Neurol, 2004. 187 (2) 319-28 ；Tholpady, S. S.，A. J. Katz, and R. C. Ogle, Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibitmultipotential differentiation in vitro. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol, 2003. 272(1) 398-402 ；Yang, L. Y. , et al., Adipose tissue-derived stromal cellsexpress neuronal phenotypes. Chin Med J (Engl),2004. 117(3) :425_9 ；Zuk, P. A. , et al. , Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell,2002. 13(12) 4279-4295 ；Ashjian, P. H., et al. ， In vitro differentiation ofhuman processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast ReconstrSurg,2003. Ill(6) : 1922-31 ；Kang, S. K. , et al. ， Improvement of neurologicaldeficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromalcells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol, 2003. 183(2) :355_66)。当暴露于神经元诱导介质时，小鼠ASC被诱导表达电压依 赖性钙通道以及低水平的巢蛋白和突触蛋白I (Safford, K.M.，et al.，Characterization ofneuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells. ExpNeurol, 2004. 187(2) :319_28)。但这些都只是表达了已分化的神经元中的选择 性蛋白神经元标记，并没有显示出任何神经元的功能。 产前和围产期期间的缺氧缺血性(HI)脑病是胎儿和新生儿常见的脑损伤，是 导致胎儿与新生儿发病与死亡的主要原因(Wei, X.，et al.，Caffeicacid phenethyl ester prevents neonatal hypoxic-ischaemic brain injury. Brain,2004. 127 (Pt 12) :2629-35)。目前还没有避免人类新生儿HI后果的有效疗法。已知缺氧-缺 血诱发新生大鼠脑室下区中的祖细胞增殖，这些祖细胞具有在体外分化成神经元或 少突胶质细胞的會邑力(Yang, Ζ. and S. W. Levison, Hypoxia/ischemia expands the regenerative capacity of progenitors in theperinatal subventricular zone. Neuroscience，2006. 139(2) :555_64)。两种细胞群都对围产期的缺氧-缺血损伤高度敏 感(McQuilien, P.S.，et al.，Selectivevulnerability of subplate neurons after early neonatal hypoxia-ischemia. JNeurosci, 2003. 23(8) :3308_15 ；Nakajima，W.， et al. ， Apoptosis has a prolongedrole in the neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat. TheJournal of Neuroscience, 2000. 20 :7994_8004 ； Ness, J. K.，et al.，Perinatalhypoxia-ischemia induces apoptotic and excitotoxic death of periventricularwhite matter oligodendrocyte progenitors.Dev
4Neurosci,2001. 23(3) :203_8 ；Back, S. A. , et al. , Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors tohypoxia-ischemia. J Neurosci,2002. 22(2) :455_63)。 进一步研究发现，由神经损伤诱发的这种内源性祖细胞的增殖与分化可以进一步被某些神 经营养因子刺激，但是单独使用其中任何一种因子需要高浓度且效果不佳，往往还会引起 不良反应，特别是在使用载体情况下。因此，还需要进一步优化和提高神经营养因子预防和 /或治疗神经损伤的疗效，这具有显著的意义。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种能够更有效地预防和/或治疗神经损伤或其相关 疾病的药物。用于实现上述目的的技术方案如下脂肪来源的成体干细胞分泌的神经营养因子混合物在制备预防和/或治疗神经 损伤或其相关疾病的药物中的用途。具体地，在上述用途中，神经营养因子混合物可以包含肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelium growth factor, VEGF)、神经生长因子(neuronal growth factor, NGF)和胰岛素样生长因子 I (insulin-like growth factor，IGF-I)。优选地，神经营养因子混合物还包含脑源神经营 养因子(brain-derived neurotrophicfactor, BDNF)和/或神经胶质细胞神经营养因子 (glial cell derivedneurotrophic factor, GDNF)。在上述用途中，神经损伤或其相关疾病可以选自缺氧缺血性脑病，例如产前缺氧 缺血性脑病或围产期缺氧缺血性脑病；缺血性心脏病；心律失常；老年性痴呆；脑中风；帕 金森病；肌萎缩性侧索硬化；创伤性脑损伤；脊髓外伤性损伤；亨廷顿氏病(Huntington’ s disease)；新生儿黄疸；癫痫以及痴呆中的一种或多种。本发明还提供了脂肪来源的成体干细胞体外培养物在制备预防和/或治疗神经 损伤或其相关疾病的药物中的用途，该体外培养物包含脂肪来源的成体干细胞分泌的神经 营养因子混合物。具体地，在上述用途中，神经营养因子混合物可以包含肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelium growth factor, VEGF)、神经生长因子(neuronal growth factor, NGF)和胰岛素样生长因子 I (insulin-like growth factor，IGF-I)。优选地，神经营养因子混合物还包含脑源神经营 养因子(brain-derived neurotrophicfactor, BDNF)和/或神经胶质细胞神经营养因子 (glial cell derivedneurotrophic factor, GDNF)。在上述用途中，神经损伤或其相关疾病可以选自缺氧缺血性脑病，例如产前缺氧 缺血性脑病或围产期缺氧缺血性脑病；缺血性心脏病；心律失常；老年性痴呆；脑中风；帕 金森病；肌萎缩性侧索硬化；创伤性脑损伤；脊髓外伤性损伤；亨廷顿氏病(Huntington’ s disease)；新生儿黄疸；癫痫以及痴呆中的一种或多种。在上述用途中，优选地，脂肪来源的成体干细胞体外培养物为脂肪来源的成体干 细胞在37°C、5% (体积/体积)CO2的条件下在微血管内皮细胞培养基中的培养物。更优 选地，脂肪来源的成体干细胞体外培养物的培养方法包括以下步骤
(1)将脂肪组织消化后加入DMEM培养基，离心得到细胞，再加入DMEM培养基使之
悬浮；(2)用100 μ m细胞筛过滤后离心，得到的细胞用红细胞裂解液处理；(3)将处理的细胞悬浮于微血管内皮细胞培养基中，在37°C、5% (体积/体积) CO2的条件下培养。本发明人在ASC的分泌物中，例如存在于ASC体外培养物(ASC-CM)的分泌物中首 次发现并识别了多种营养因子，其中包括血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、 胰岛素样生长因子I (IGF-I)、肝细胞生长因子(HGF)、神经胶质细胞神经营养因子(⑶NF) 以及脑源神经营养因子(BDNF)。实验表明来源于脂肪来源的成体干细胞的肝细胞生长因子 (HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子I (IGF-I)、神经 胶质细胞神经营养因子(GDNF)和脑源神经营养因子(BDNF)均能够刺激内源性干细胞分化 成神经或其它功能性细胞，更重要的是这些细胞因子同时存在于分泌物中，彼此之间能够 产生协同作用，使得所述活性作用大大加强，成功地刺激了内源性神经元的形成并显示出 对动物神经功能的极大改善，还明显降低了临床用量，削减治疗了成本，减少副作用。此外， 脂肪来源的成体干细胞分泌的神经营养因子混合物存在于该细胞体外培养物中，无需进一 步的提取纯化等加工步骤以及添加载体即可直接、有效地用于神经损伤或其相关疾病，例 如缺氧缺血性脑病的预防和/或治疗，弥补了目前神经损伤或其相关疾病的预防和治疗手 段匮乏的缺陷，同时降低了副作用和不良反应也进一步有利于降低药物的生产成本和推广 应用。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1 :ASC体外培养物(ASC-CM)对缺氧-缺血(H-I)脑损伤诱导神经元再生的研 究。其中=Control 对照组；ASC-CM 用ASC-CM对未经H-I处理的动物的实验治疗组；H-I 经过缺氧_缺血处理的动物组；H-I+ASC-CM 用ASC-CM对经过H-I处理的动物的实验治疗 组。结果显示，与对照组相比，静脉注射浓缩的ASC-CM (未采用H-I处理，术前20 μ 1，术后 20 μ 1)显著刺激了内源性神经元的再生(56士8，η = 3vs. 16士4，η = 3广ρ < 0.01)。此 外，与仅采用HI处理的组相比，ASC-CM预处理也明显地刺激了缺氧-缺血脑损伤攻击后的 海马神经元的再生(108 士43，η = 3vs. 53 士 17，η = 3)。图2 =ASC-CM诱导PC-12细胞的神经元分化作用以及AMPK抑制剂对ASC-CM诱导 分化的抑制作用。其中Control 对照组；ASC-CM 用ASC-CM处理的PC12细胞；ASC-CM+C ASC-CM、化合物C与PC12细胞共同培养组。结果显示，与对照相比，ASC-CM(50%的培养基 替换为ASC-CM，连续培养7天)显著地刺激了细胞分化(11% 士4，η = 17vsl% 士0. 5，η =4)。当PC12细胞用AMPK抑制剂-化合物C(Calbiochem)预处理后，明显抑制了 ASC-CM 诱导的神经元分化(11% 士4，η = 17vs. 5. 5士2. 9，η = 3，**ρ < 0. 01)。图3 :NGF(50ng/ml,5天处理)诱导AMPK介导的神经元分化。图3A 与对照相比， NGF 刺激内源性神经元分化(1% 士 1，η = 3vs. 27% 士 7，η = 3，**ρ < 0.01)。NGF 抗体 (Ab)和 AMPK α IsiRNA 的预处理明显抑制 NGF 的作用(2. 9% 士 1. 9，8. 9士 1. 3vs. 27% 士7， **p < 0. 01)。此外，图3B :NGF(50ng/ml,60分钟)诱导AMPK磷酸化并且siRNA阻断该效应。图4 =NGF, IGF-I、VEGF和HGF在神经元分化的诱导中发挥重要作用。加入 NGF(NA)、IGF-I (IA)、VEGF(VA)和HGF(HA)抗体中和ASC-CM对神经元分化的刺激活性。 抗NGF、IGF-I、VEGF和HGF的抗体能够分别在一定程度上中和ASC-CM活性(ASC-CM对照 (hASC) 9. 1% ；抗 NGF 3. 5% ；抗 IGF-I 4.2% ；抗 NGF/IGF-1 3. 1% ；抗 VEGF 5. 5% ；抗 HGF 6. 3% ；抗 VEGF/HGF 4. 3% 抗 NGF/IGF-1/VEGF/HGF 2. 2%，未采用 ASC-CM(no-ASC) 1. 1%)，表明单纯使用一种因子的抗体可部分阻断ASC-CM的诱导神经元分化的作用。如 果同时阻断多种因子，如同时阻断2至4个因子能够更显著地削弱ASC-CM的促神经分化作 用，上述实验数据表明这些生长因子具有诱导神经元分化的协同作用。图5 :NGF和ASC-CM促进PC12细胞分化作用的对比。图5A 表示在PC12细胞 的BME培养基中，加入不同剂量(lng/ml、5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的NGF后，生长出神经 突起的PC12细胞的百分比。■表示在PC12细胞的BME培养基中，加入不同剂量(lng/ml、 5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的NGF以及NGF抗体(50ng/ml)后，生长出神经突起的PCl2细 胞的百分比。结果说明，NGF具有显著的促进神经细胞分化、成熟的作用。图5B: 表示在 包含不同浓度(10%、30%、50%、100% )ASC-CM的BME培养基中培养的生长出神经突起的 PC 12细胞的百分比；·表示在包含不同浓度(10%、30%、50%、100%)六5(义11以及呢？抗 体(50ng/ml)的BME培养基中培养的生长出神经突起的PC12细胞的百分比。在本实验中， ASC-CM中的NGF的浓度为0. 68ng/ml。当细胞培养液用50%的ASC-CM液替换时，NGF的含 量为0. 34ng/ml。对比图5A和5B可以发现，50%的ASC_CM(含0. 34ng/ml的NGF)的促进 神经细胞分化活性的效价相当于单纯应用lOng/ml的NGF的效价，说明ASC-CM中还存在其 它神经生长因子，而且多种神经生长与营养因子的组合比单一神经因子起到更强的作用， 具有显著的差异。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。1.围产期缺氧-缺血模型的制作在单独的笼子中安置怀孕的Sprague Dawley大鼠(Charles River)并用实验室 标准饲料饲喂，自由进食。采用7日龄的大鼠幼崽，手术诱发缺氧-缺血动物模型(Wei，X.， et al. ， Caffeic acid phenethyl ester prevents neonatalhypoxic-ischaemic brain injury.Brain,2004. 127(Pt 12) :2629_35)。其实验过程为首先用氟烷(4%用于诱导，1-1. 5%用于维持)和30%氧气的混合 气体麻醉7天大的大鼠幼崽(体重为13-19克)。暴露每只动物幼崽的左颈总动脉，将其与 神经和静脉分离，并用3-0手术丝线结扎。缝合伤口并将大鼠幼崽送回至其母鼠，恢复3小 时。假手术动物经历相同的操作过程，除了暴露的颈动脉不被结扎(仅缺氧)外，其它过程 与手术组动物相同。之后，将2-3只幼崽置于500ml密闭罐中，并暴露于湿润的氮氧气混合 物(氧气占8%)中，每分钟输送5至6升该氮氧气混合物。在150分钟缺氧期间，将密闭 罐部分浸没在37°C水浴中以维持恒定的热环境。在缺氧-缺血的第三天，每天腹膜内注射 两次Brdu (Sigma, 50mg/kg体重，其溶液浓度为10mg/ml，溶剂为0. 9% NaCl，其中NaCl溶液还含有0. 007N的NaOH)，标记分裂细胞。随后，缺氧后第7天收集脑组织，立即在干冰上冷 冻并在-70°C下保存直至进行分析。2.免疫荧光检测将脑组织固定并用蔗糖防冻保护。将脑组织切成40i!m厚的冰冻切片。采用 常规免疫荧光方法对切片染色。将切片在室温下处理60分钟(至DNA变性)，然后用 0. 1M的pH8. 5的硼酸盐缓冲液中充分清洗，然后将切片与大鼠抗-Brdu抗体(Accurate Chemical, ffestbury, NY, 1 10)以及山羊抗 DCX 抗体(DCX-C00H 末端，1 100，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA) 一起孵育。同时采用小鼠单克隆抗神经元细胞核抗 体(NeuN，Chemicon，CA1 50)将切片染色。4°C下在一抗中孵育过夜后，在室温下用二抗 (Jacksonlmmunoresearch,West Grove,PA)处理切片 2 小时，采用 4，，6，-脉基-2-苯基吲 哚二盐酸盐(DAPI) (Sigma，将lmg/ml储备液稀释至0. 0005mg/ml)对细胞核复染15分钟。3.细胞培养和试剂。在含有10%小牛血清(FBS)，100U/ml青霉素和100iig/ml链霉素的Dulbecco' s 改良Eagle' s培养基(DMEM)中培养大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞。对于在PC12细胞上进 行的实验，细胞以10X104/ml的密度种植于24孔板中。这些培养条件也用在涉及通过 NGF-Ab (2 u g/ml)或化合物c (10 u M)减弱分化的实验中。第一次在种植后4小时加入，然 后每48小时加入一次。针对采用NGF延长刺激来诱导神经元分化，将细胞种植在多聚_右 旋赖氨酸包被的12孔板上，密度为10X104个细胞/ml。在含有1% 83(低密度/低血清 条件)的DMEM中培养细胞，并在NGF抗体(2 y g/ml)或化合物C (10 y M，Calbiochem)存在 下用NGF(50ng/ml)处理。第一次在种植后4小时加入，然后每48小时加入一次。NGF购自 Sigma (St. Louis, M0, USA)，抗大鼠 3-NGF 抗体购自 R&D System (Minneapolis, MN, USA), AMPK 抑制剂购自 Calbiochem(San Diego, CA) 4. RNA 干扰针对AMPK a 1 的小干扰(si) RNA 序列为 5，-UUCCUUCGCACACGCAAAUAAUAGG-3，， 实验与对照组的siRNA均购自Invitrogen公司。首先，将细胞接种于24孔板中，细胞浓 度为50X 104个细胞/孔。培养24小时后，在Opti-MEM (Invitrogen)中，在37°C下用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)将siRNAs递送到细胞中转染。然后将NGF加到转染的细 胞中培养48小时。最后将细胞固定，用于形态观察或从壁上刮下来收集蛋白用于Western 印迹检测。4.蛋白质分析根据标准方法，采用针对总AMPK、磷酸化的AMPK、磷酸化的ACC的抗体进行 Western 印迹分析，这些抗体为 Cell Signaling Technology (Beverley,MA,USA)公司产品。 当Thr172磷酸化时，用磷酸化的AMPK抗体检测内源性AMPK a 1和a 2。5.细胞分化分析如上所述，将PC12细胞种植于12孔板中培养，密度为10 X 104个细胞/孔，然后分 别用NGF、NGF+化合物C (10 y M)或NGF+NGF Ab处理培养的细胞。在加入NGF之前，用NGF Ab或化合物C试剂预处理PC 12细胞1小时，根据细胞形态确定PC12细胞的分化状态。神 经突被定义为等于或大于细胞体直径的细胞体延伸。读取视野中作为神经元样细胞的具有 至少一个神经突的细胞的数量。
6.统计学比较数据以平均值士标准误(SEM)来表示，采用SPSS 12. 0统计分析软件进行对比。 进行配对Student' s t检验，P值< 0. 05被认为是显著差异的。实施例1首先，将获得的脂肪组织用lmg/ml的I型胶原酶在37°C的条件下消化1小时。然 后在消化液中加入50ml的DMEM培养基，以200g离心5分钟。移去上清液，保留离心管底 部的细胞部分。将细胞重新悬浮于新鲜的DMEM培养基中，然后用lOOym细胞筛滤过细胞 悬液。将细胞悬液以200g离心5分钟。移去上清，下部的细胞用红细胞裂解液在37°C下 处理5分钟。然后以300g离心5分钟。将所获得的细胞重新悬浮于微血管内皮细胞培养 基中，然后以4X 106个/cm2的细胞浓度接种于未经过包被处理的T75组织培养瓶中，在C02 孵育箱中培养(37°C，5% C02)。实施例2对ASC分泌的物质刺激大鼠缺氧-缺血脑中的内源性神经形成的能力进行了测 试。从大鼠皮下脂肪组织分离的ASC在EGM2MV培养基中生长至汇合，然后转移至Eagle基 本培养基(包含5mM K+的BME，Invitrogen)中培养24小时(在C02孵育箱中培养，条件为 37°C,5%C02)o收集培养物(ASC-CM)，并采用CentriPluS(截留丽10k)浓缩50倍。将新 生(7天)大鼠进行单侧(左)颈动脉结扎，然后暴露于缺氧条件(含氧气7%)下2小时。 在缺氧_缺血(H-I)前1小时静脉注射10 u 1浓缩(50倍)的ASC-CM。7天后，与仅进行 H-I处理的动物进行比较。结果显示，ASC-CM预处理显著地刺激了缺氧-缺血脑损伤引起 的海马神经元的形成(108士43，n = 3比53士 17，n = 3 ；参见图1)。与对照组(未经H-I 处理)的动物相比，静脉注射浓缩的ASC-CM也显著地刺激了内源性神经元的形成(16士4， n = 3 比 56士8，n = 3 ；参见图 1，**p < 0. 01)。实施例3为了进一步评价浓缩的ASC-CM如何在体内刺激神经形成，我们采用PC12细胞模 型，通过观察ASC-CM对这些细胞中的神经突触生长的影响来研究ASC-CM是否影响神经元 的分化。数据显示ASC-CM显著地刺激了 PC-12细胞的神经元分化(参见图2)，而且显示了 这种影响会被AMPK激酶的特异性抑制剂显著地阻断(参见图3)，这表明AMPK在NGF诱导 的神经元分化中发挥重要的作用。AMPK被包括缺氧、氧化应激、糖剥夺以及运动和饮食激 素，如瘦素和脂肪细胞因子的多种病理性应激所活化。AMPK活化在抗病理性应激，特别是缺 血缺氧应激中发挥保护性作用，能够减小梗死的体积。在饮食限制的条件下，下丘脑神经元 中的AMPK也被活化。最近还显示在白藜芦醇诱导的神经元分化中，活化的AMPK起关键作 用。由于实验表明ASC-CM通过AMPK活化诱导神经元分化，而且NGF是ASC-CM中可能 涉及PC-12分化的成分，所以需要研究涉及刺激PC-12分化的ASC-CM中的NGF是否起作用。 实验数据证实ASC-CM以及其中的NGF能够直接刺激PC-12分化，并且这种作用也特异地通 过AMPK活化(图3)。实施例4我们进行实验分析以检验何种生长因子在刺激神经元分化中起到关键作用。采用 蛋白质组学方法，我们鉴别了几种ASC分泌物(ASC-CM)中的神经营养因子，如源于神经胶
9质细胞神经营养因子(⑶NF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)和胰岛素样 生长因子I (IGF-1)等。结果显示分别来自ASC-CM的NGF、IGF-1、VEGF和HGF等(它们已 经在抗体分析研究中被鉴别)能够在一定程度上刺激神经元分化(参见图4)，而且它们的 抗体能够特异性抑制 ASC-CM 的活性(NGF 70% ；IGF-1 61% ；VEGF 45% ；HGF 35% )。如 果一同加入这些抗体，ASC-CM活性几乎完全被抑制(NGF/IGF-1 75% ；VEGF/HGF :60%，总 抑制率86% )，表明这四种生长因子在ASC-CM刺激活性中发挥重要作用。很明显，它们作 用于不同的途径并彼此协同作用，活性更为强大，因此将ASC-CM中的这4种因子组合在一 起，将具有对神经元分化具有巨大的刺激作用，其他因子例如GDNF可能发挥余下的功能。 有趣的是，GDNF与IGF-1通过相同的途径发挥作用，对抗两种因子的两种抗体的作用不累 加。实施例5NGF和ASC-CM促进PC12细胞分化作用的比较(参见图5)。在包含不同剂量(lng/ ml、5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)NGF的BME培养基中培养PC12细胞；在包含不同剂量(lng/ ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)NGF 以及 NGF 抗体(50ng/ml)的 BME 培养基中培养 PC 12细胞。在包含不同浓度(10%、30%、50%、100% )ASC-CM的BME培养基中培养PC12 细胞；在包含不同浓度(10 %、30%、50%、100%) ASC-CM以及NGF抗体(50ng/ml)的BME培 养基中培养PC 12细胞。其中，培养8天后，对长出神经突起的PC12细胞进行计数。阳性 细胞为长出的神经突起的长度为细胞体长度1. 5倍的细胞，每组总计包括500个细胞。结 果表明，加入lOng/ml的NGF所产生的促进PC-12分化的效果水平与加入50%的ASC-CM的 效果水平相当，而经测定ASC-CM中的NGF浓度为0. 68ng/ml，加入50 %的ASC-CM的BME培 养基中的NGF浓度为0. 34ng/ml，进一步证明NGF与ASC-CM中的其它神经营养因子协同作 用，仅以很低的用量就可以获得相同的作用效果。
权利要求
脂肪来源的成体干细胞分泌的神经营养因子混合物在制备预防和/或治疗神经损伤或其相关疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经营养因子混合物包含肝细胞生 长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子和胰岛素样生长因子I。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述神经营养因子混合物还包括神经 胶质细胞神经营养因子和/或脑源神经营养因子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述神经损伤或其相关疾 病选自缺氧缺血性脑病，例如产前缺氧缺血性脑病或围产期缺氧缺血性脑病；缺血性心脏 病；心律失常；老年性痴呆；脑中风；帕金森病；肌萎缩性侧索硬化；创伤性脑损伤；脊髓外 伤性损伤；亨廷顿氏病；新生儿黄疸；癫痫以及痴呆中的一种或多种。
5.脂肪来源的成体干细胞体外培养物在制备预防和/或治疗神经损伤或其相关疾病 的药物中的用途，该体外培养物包含脂肪来源的成体干细胞分泌的神经营养因子混合物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述神经营养因子混合物包含肝细胞生 长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子和胰岛素样生长因子I。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述神经营养因子混合物还包括神经 胶质细胞神经营养因子和/或脑源神经营养因子。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的用途，其特征在于，所述神经损伤或其相关疾 病选自缺氧缺血性脑病，例如产前缺氧缺血性脑病或围产期缺氧缺血性脑病；缺血性心脏 病；心律失常；老年性痴呆；脑中风；帕金森病；肌萎缩性侧索硬化；创伤性脑损伤；脊髓外 伤性损伤；亨廷顿氏病；新生儿黄疸；癫痫以及痴呆中的一种或多种。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的用途，其特征在于，所述脂肪来源的成体干细胞 体外培养物为脂肪来源的成体干细胞在37°C、5% (体积/体积)CO2的条件下在微血管内 皮细胞培养基中的培养物。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的用途，其特征在于，所述脂肪来源的成体干细 胞体外培养物的培养方法包括以下步骤(1)将脂肪组织消化后加入DMEM培养基，离心得到细胞，再加入DMEM培养基使之悬浮；(2)用100μ m细胞筛过滤后离心，得到的细胞用红细胞裂解液处理；(3)将处理的细 悬浮于微血管内皮细胞培养基中，在37°C、5%(体积/体积)CO2的 条件下培养。
全文摘要
本发明提供一种用于预防和治疗神经损伤或其相关疾病的药物，具体涉及脂肪来源的成体干细胞分泌的神经营养因子混合物或脂肪来源的成体干细胞体外培养物在制备预防和/或治疗神经损伤或其相关疾病的药物中的用途。这些神经营养因子混合物存在于细胞体外培养物中，彼此之间能够产生协同作用，使得活性作用大大加强，明显降低临床用量，降低治疗成本，减少副作用，无需进一步提取纯化等加工步骤以及添加载体即可有效地用于神经损伤或其相关疾病，例如缺氧缺血性脑病的预防和/或治疗，弥补了目前神经损伤或其相关疾病的预防和治疗手段匮乏的缺陷，同时降低了副作用和不良反应，进一步有利于降低药物的生产成本和推广应用。
文档编号A61P9/10GK101940589SQ201010252600
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者杜燕生 申请人:无锡市智昱生物科技有限公司