专利名称：乌骨鸡黑色素提取物在制备防治帕金森病的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及乌骨鸡黑色素提取物的医药用途，特别涉及乌骨鸡黑色素提取物在制备防治帕金森病的药物中的用途。
背景技术：
帕金森病(PD)也称震颤麻痹，在老年人中患病率仅次于脑血管疾病和老年性痴呆。在临床上表现为静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和姿势不稳等一系列症状。目前帕金森病的病因尚未清楚，一般认为可能与诸如线粒体功能缺陷、蛋白水解应激、免疫异常、 细胞凋亡以及遗传因素等方面的因素相关。帕金森病的主要病理特征为中脑黑质致密带多巴胺(DA)能神经细胞变性。帕金森病的发病与年龄有关，年龄老化是公认的帕金森病发病危险因素，有研究报道正常成年人黑质多巴胺含量以每年7. 4%的速率呈年龄依赖性下降。 当前，世界上许多发达国家和发展中国家已经进入了老龄化社会，在中国，老龄化现象尤为显著。然而，目前用于防治帕金森病的药物相对匮乏，尚无有效的方法可以逆转或阻止其发展。因此，寻求能够有效防治帕金森病的药物成为研究热点。乌骨鸡黑色素是从乌骨鸡提取的一种以吲哚环为主体的含硫异聚物，属于动物源性真黑色素。现代医学研究表明，乌骨鸡黑色素具有抗紫外线、螯合重金属离子、抗肿瘤以及提高机体免疫力等功能。迄今为止，乌骨鸡黑色素或其提取物在制备防治帕金森病的药物方面的用途尚无报道。
发明内容
本发明提供了乌骨鸡黑色素提取物在制备防治帕金森病的药物中的用途，其中， 所述乌骨鸡黑色素提取物作为所述药物的活性成分。根据本发明所述的乌骨鸡黑色素提取物的用途，其中，所述药物还包含药学上可接受的载体。根据本发明所述的乌骨鸡黑色素提取物的用途，其中，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液以及注射剂。本发明中乌骨鸡黑色素提取物可采用如下的提取方法获得，该方法包括如下步骤1).制备乌骨鸡肉泥；2).双酶水解采用木瓜蛋白酶和风味酶消化步骤1)制得的乌骨鸡肉泥；3).采用碱液除蛋白。作为本发明的优选实施方式，上述提取方法中，步骤2)包括如下步骤A.向步骤1)制得的乌骨鸡肉泥中添加重量比为1 1至1 3的蒸馏水，加热至 90°C至100°C并保温10分钟至20分钟，然后冷却至60°C至70°C，调节pH为5. 0至6. 0，然后向其中加入终浓度为3. 0%至4. 0%的木瓜蛋白酶，在60°C至70°C条件下消化2小时至 4小时；
B.将步骤A所得的混合物冷却至50°C至60°C，调节pH为5. 5至6. 5，向所述混合物中加入终浓度为0. 4%至0. 7%的风味酶，在50°C至60°C条件下消化5小时至7小时；C.将步骤B所得的混合物加热至90°C至100°C并保温20分钟至40分钟；静置分层，收集上层黑色素悬浮层；在3500Xg至4500Xg条件下离心10分钟至20分钟。作为本发明的优选实施方式，上述提取方法中，步骤3)的操作方法如下以1 8至1 15(按体积计)的比例向所述步骤2)所得的物质中添加pH为8 至10的NaOH溶液，加热至55°C至75°C并保温1小时至2小时，然后，在3500 X g至4500 X g 条件下离心5分钟至10分钟，收集沉淀。作为本发明的更加优选的实施方式，上述提取方法中，步骤2)包括如下步骤A.向步骤1)制得的乌骨鸡肉泥中添加重量比为1 1的蒸馏水，加热至100°C并保温15分钟，然后冷却至65°C，调节pH至5. 5，然后向其中加入终浓度为3. 8%的木瓜蛋白酶，在65°C下消化2小时；B.将步骤A所得的混合物冷却至55°C，调节pH至6. 0，加入终浓度为0. 6%的风味酶，在55°C下消化6小时；C.将步骤B所得的混合物加热至100°C并保温30分钟；静置分层，收集上层黑色素悬浮层；在4000Xg条件下离心15分钟。作为本发明的更加优选的实施方式，上述提取方法中，步骤3)的操作方法如下以1 10 (按体积计)的比例向所述步骤2)所得的物质中添加pH为10的NaOH 溶液，加热至60°C并保温1. 5小时，然后，在4000Xg条件下离心5分钟，收集沉淀。根据本发明所述的乌骨鸡黑色素提取物的用途，其中，可将所述乌骨鸡黑色素提取物悬浮于生理盐水中使用。通过以下描述的本发明的具体实施方式
可以看出，乌骨鸡黑色素提取物可有效阻止帕金森病发病过程中的多巴胺能神经细胞变性，对多巴胺能神经细胞具有保护作用。本发明将乌骨鸡黑色素提取物应用于防治帕金森病的药物中，从而有效防治帕金森病。
图1是根据本发明实施例1在6-0H DA诱导的SHSY-5Y细胞损伤模型试验中各组的LDH释放量检测值的统计分析图。图2是根据本发明实施例1在6-0H DA诱导的SHSY-5Y细胞损伤模型试验中各组的细胞活力检测值的统计分析图。图3是根据本发明实施例2在MPP+诱导的MN9D细胞损伤模型试验中各组的LDH 释放量检测值的统计分析图。图4是根据本发明实施例2在MPP+诱导的MN9D细胞损伤模型试验中各组的细胞活力检测值的统计分析图。图5是根据本发明实施例3在MPTP诱导的小鼠帕金森病模型试验中各组小鼠转棒仪上停留时间改变值的统计分析图。
具体实施例方式下面将结合附图和具体实施方式
来进一步详细描述本发明。
在本发明的实施方式中，分别利用细胞模型试验和动物模型试验来评价乌骨鸡黑色素提取物对帕金森病发病中多巴胺能神经细胞的保护作用。其中，细胞模型试验所使用的两种细胞株为SHSY-5Y细胞和MN9D细胞，两者均为多巴胺能神经细胞，分别使用6_0H DA 和MPP+来诱导。动物模型使用MPTP来诱导。本发明在细胞模型的试验中分别使用乳酸脱氢酶(LDH)释放量和细胞活力作为检测指标来分析细胞损伤的程度。LDH是存在于细胞胞浆中的一种脱氢酶，在各种细胞中稳定表达，在细胞受损伤之后迅速释放。因此，通过检测细胞培养液的上清液中LDH的含量， 可以反映细胞受损伤的程度。本发明使用商业试剂盒检测LDH的原理如下LDH氧化乳酸生成丙酮酸，后者进一步同四唑盐INT反应生成水溶性的甲臜，甲臜的生成量与细胞受损伤的程度呈正相关，通过比色检测甲臜的含量可以灵敏、快速、准确地反映细胞受损伤的情况。MTS是一种四甲基偶氮唑盐，在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的作用下，被还原成蓝色甲臜颗粒，该蓝色甲臜颗粒的形成量与活细胞数和琥珀酸脱氢酶活性呈正相关，所以MTS与细胞共孵育后，所形成的蓝色甲臜颗粒的量可以反映细胞活力。以下实施例中的试验数据均采用GraphPad Prism 5. 0软件进行统计分析并绘制分析图，多组数据间差异用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，并继之以Tukey氏事后检验法进行检验。乌骨鸡黑色素的提取可以采用本领域已知的方法，本发明采用了双酶水解法并结合碱液除蛋白来提取乌骨鸡黑色素，其中，分别使用木瓜蛋白酶和风味酶(也可使用复合蛋白酶)进行第一步和第二步的酶解。具体操作步骤如下1).制备乌骨鸡肉泥将市售的乌骨鸡屠宰，去毛，去内脏，去骨，保留骨膜，绞成肉泥，取肉泥IOOOg ；2).双酶水解A.向步骤1)制得的乌骨鸡肉泥中添加蒸馏水，蒸馏水与鸡肉泥的重量比为 1 1，搅拌均勻，加热至100°C并保温15分钟，然后冷却至65°C，调节pH至5.5，加入终浓度为3.8%的木瓜蛋白酶(购自广西南宁庞博生物工程有限公司)，搅拌均勻，在65°C下消化2小时；B.将步骤A所得的混合物冷却至55°C，调节pH至6. 0，然后，向所述混合物中加入终浓度为0. 6%的风味酶(购自广西南宁庞博生物工程有限公司)，在55°C下消化6小时；C.通过将步骤B所得的混合物加热至100°C并保温30分钟，对酶进行灭活；静置分层，收集上层黑色素悬浮层；在4000Xg条件下离心15分钟，收集沉淀，得到乌骨鸡黑色素粗提品；3).采用碱液除蛋白。以1 10 (按体积计)的比例向步骤3)所得的粗提品中添加pH为10的NaOH溶液，搅拌均勻，加热至60°C并保温1. 5小时，然后，在4000 X g条件下离心5分钟，收集沉淀；
重复该过程，共4次。使用蒸馏水洗涤上述方法所得的沉淀3次，真空干燥洗涤后的沉淀物，得到乌骨鸡黑色素精提品。由上述步骤1)的IOOOg乌骨鸡肉泥获得了 Ig乌骨鸡黑色素精提品。实施例1、乌骨鸡黑饩素提取物在6-0H DA诱导的SHSY-5Y细胞损伤模型中的保护作用1、实验材料1、乌骨鸡黑色素提取物取根据上述乌骨鸡黑色素提取方法制备的乌骨鸡黑色素精提品，以0. 2g/ml的浓度将其悬浮于生理盐水中备用。2)、IOmM 6_0H DA储存液准确称取5mg的6_0H DA 'HBr (购自SIGMA)，将其溶于 2ml含0. 01 %维生素C的蒸馏水中，使用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，分装保存于_20°C。 使用前将其稀释至相应浓度。3)、SHSY-5Y 细胞购自 ATCC。4)、SHSY-5Y细胞培养液DMEM培养液(购自 SIGMA)，加入 10% FBS(购自 SIGMA)。5)、0· 125% 胰蛋白酶-0.01 % EDTA (ρΗ 7. 4，1L)取 12. 5g 胰蛋白酶(购自 SIGMA)和0. Ig EDTA置于容器中，然后，使用0. OlM PBS (磷酸盐缓冲液)定容至1L，使用 0.22 um微孔滤膜过滤，在-20°C条件下保存。2、实验方法1)、细胞的换液与传代在37°C、5% CO2条件下，在细胞培养箱中进行SHSY-5Y细胞的培养。使用SHSY-5Y 细胞培养液(含10% FBS的DMEM培养液)在培养瓶中培养SHSY-5Y细胞，每2至3天换液一次。待细胞贴壁生长至铺满所述培养瓶底面的80%时，用0. 125%胰酶-0. 01% EDTA将细胞消化至即将漂浮，向培养瓶中加入至少10倍体积的SHSY-5Y细胞培养液终止反应，并用滴管仔细吹打，形成单细胞悬液，以1 3分瓶传代。2)、分组试验将SHSY-5Y细胞接种于聚左旋赖氨酸(购自SIGMA)包被的96孔板，分6组，每组设6个微孔，接种密度为3 X104/ml，每孔接种体积为200μ 1。于37°C和5% CO2条件下培养所述细胞M小时后更换新鲜的SHSY-5Y细胞培养液。向组1的微孔分别添加25 μ M的生理盐水；向组2的微孔分别添加25 μ M的6-0Η DA ；向组6的微孔分别添加100 μ g/ml的乌骨鸡黑色素提取物；组1、组2以及组6的微孔分别在培养箱中于37°C和5% CO2条件下共孵育36小时；向组3、组4以及组5的各微孔分别添加终浓度为1 μ g/ml、10 μ g/ml以及 100 μ g/ml的乌骨鸡黑色素提取物，共孵育1小时，然后分别添加25 μ M的6-0Η DA,在培养箱中于37°C和5% CO2条件下共孵育36小时。3)、LDH释放量的检测采用Cyt0I10x 96 试剂盒(购自Promega公司)，操作方法如下取上述各组的细胞培养液的上清液，在250 X g条件下离心15分钟，然后以50 μ 1/孔将上清液加至96孔板，再加入等量LDH反应混合液，混勻后，避光室温反应20分钟，用酶标仪检测甲臜的生成量，检测波长为490nm。使用SHSY-5Y细胞培养液作为空白对照，使用含1 % Triton X-100 的SHSY-5Y细胞培养液处理SHSY-5Y细胞的上清液作为阳性对照。由此得到的上述各组的 LDH检测数据见表1。表1 :6-0H DA诱导的SHSY-5Y细胞损伤模型试验中各组的LDH释放量检测值
权利要求
1.乌骨鸡黑色素提取物在制备防治帕金森病的药物中的用途，其中，所述乌骨鸡黑色素提取物作为所述药物的活性成分。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物还包含药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液以及注射剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述乌骨鸡黑色素提取物的提取方法包括如下步骤1).制备乌骨鸡肉泥；2).双酶水解采用木瓜蛋白酶和风味酶消化步骤1)制得的乌骨鸡肉泥；3).采用碱液除蛋白。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，步骤2)包括如下步骤A.向步骤1)制得的乌骨鸡肉泥中添加重量比为1 1至1 3的蒸馏水，加热至90°C 至100°C并保温10分钟至20分钟，然后冷却至60°C至70°C，调节pH为5. 0至6. 0，然后向其中加入终浓度为3. 0%至4. 0%的木瓜蛋白酶，在60°C至70°C条件下消化2小时至4小时；B.将步骤A所得的混合物冷却至50°C至60°C，调节pH为5.5至6. 5，向所述混合物中加入终浓度为0. 4%至0. 7%的风味酶，在50°C至60°C条件下消化5小时至7小时；C.将步骤B所得的混合物加热至90°C至10(TC并保温20分钟至40分钟；静置分层， 收集上层黑色素悬浮层；在3500Xg至4500Xg条件下离心10分钟至20分钟。
6.根据权利要求4所述的用途，其中，步骤3)的操作方法如下以1 8至1 15(按体积计)的比例向所述步骤2)所得的物质中添加pH为8至10 的NaOH溶液，加热至55°C至75°C并保温1小时至2小时，然后，在3500 X g至4500 X g条件下离心5分钟至10分钟，收集沉淀。
7.根据权利要求4所述的用途，其中，步骤2)包括如下步骤A.向步骤1)制得的乌骨鸡肉泥中添加重量比为1 1的蒸馏水，加热至100°C并保温 15分钟，然后冷却至65°C，调节pH至5. 5，然后向其中加入终浓度为3. 8%的木瓜蛋白酶， 在65°C下消化2小时；B.将步骤A所得的混合物冷却至55°C，调节pH至6.0，加入终浓度为0. 6%的风味酶， 在55°C下消化6小时；C.将步骤B所得的混合物加热至100°C并保温30分钟；静置分层，收集上层黑色素悬浮层；在4000 Xg条件下离心15分钟。
8.根据权利要求4所述的用途，其中，步骤3)的操作方法如下以1 10(按体积计)的比例向所述步骤2)所得的物质中添加pH为10的NaOH溶液， 加热至60°C并保温1. 5小时，然后，在4000Xg条件下离心5分钟，收集沉淀。
9.根据权利要求1至8任一项所述的用途，其中，将所述乌骨鸡黑色素提取物悬浮于生理盐水中使用。
全文摘要
本发明公开了乌骨鸡黑色素提取物在制备防治帕金森病的药物中的用途，其中，所述乌骨鸡黑色素提取物作为所述药物的活性成分。本发明提供的乌骨鸡黑色素提取物可通过双酶水解法并结合碱液除蛋白来制备。根据本发明可知，乌骨鸡黑色素提取物能够有效阻止帕金森病发病过程中的多巴胺能神经细胞变性，对多巴胺能神经细胞具有保护作用，从而有效防治帕金森病。
文档编号A61P25/16GK102370661SQ20101025774
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者李博, 贺毅 申请人:首都医科大学