专利名称：Exendin-4缓释微球及其注射剂和该缓释微球的制备方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂领域，具体而言，本发明涉及包含促胰岛素分泌素 (Exendin-4)的长效缓释微球，以及该缓释微球的制备方法和由该缓释微球制得的注射剂。
背景技术：
据流行病学调查估计目前全球糖尿病患者总数已逾1. 2亿，其中90%左右为II型糖尿病，而此数字还将不断上涨，估计到2025年，世界范围将有3亿人患上糖尿病。由此可见，治疗糖尿病药物的市场不仅巨大而且仍有极大的开发空间。促胰岛素分泌素(Exendin-4)是从大毒蜥口腔分泌物中分离出来的一种39个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与类胰高血糖素肽(glucagon-like peptide,GLP-1)有53%的同源性，并在多种动物模型中表现出了与GLP-I类似的抗糖尿病作用。但与GLP-I不同， exendin-4进入体内后不受二肽酶分解的影响，因此半衰期比GLP-I明显延长(Mciire E 等· Pharmacology&Therapeutics 2007(113)546-593)。Exendin-4 通过刺激胰岛 β 细胞的增殖与分化，降低胃排空的速率，促进饱食感等机制达到降低、控制血糖的作用，在治疗2 型糖尿病方面具有广阔的前景。目前国外开发的类似药物是美国Amylin公司和Lilly公司合作开发的 Exenatide (合成促胰岛素分泌素)。促胰岛素分泌素还可以利用基因工程方法制备(例如，参见ZL 200410052039. 4)通过人工合成exendin-4的DNA序列，然后将序列插入到表达质粒pET3h(+)，再转化大肠杆菌DH5ci构建而成。这样制得的产品存放在低温下、1 8°C )是稳定的。与现有的降糖药相比，exendin-4最大的优势在于其独特的作用机制，它可以在高血糖时刺激胰岛素的分泌，而低血糖时不刺激胰岛素的分泌，这样就有效防止了低血糖的发生，大大提高了用药的安全性，减少了胰岛素的用量，有效改善了患者的生活质量及用药危险性。Exendin-4的氨基酸序列为His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met GluGlu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser简写为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVR LFIEffLKNGGPSSGAPPPS药物控制释放体系是指将药物制成一定的剂型，控制药物在人体内的释放度，使药物按照设计的剂量、在要求的时间范围内以一定的速度在体内缓慢释放，以达到治疗疾病的目的。这种药物释放系统包括可注射的油、乳液、悬浮液、脂质体、微粒(微囊或微球)、 植入或凝胶系统等(Baker R W 等.Plenmu, NewYork, 1974，15-71)。近年来生物可降解的高分子材料广泛应用于蛋白质多肽类药物长效缓释微球的制备，以生物可降解材料作载体的缓释微球注射制剂，顺应了制剂学向长效、高效、低毒发展的方向，已成为三十年来药剂学研究的一个热点。缓释微球注射制剂具有以下优点①与普通注射剂相比，长效注射微球显著延长给药间隔，大大提高了病人用药的依从性；②可以持续维持最低有效浓度，因而可以减少总的给药剂量，减轻某些副作用。如亮丙瑞林微球的给药剂量可减少至每日给药剂量的1/4 1/8 ；③生物可降解微球注射剂不需手术植入， 仅肌肉注射，释药后载体可生物降解，其降解物被机体吸收，克服了以往植入剂使用上的不便，为患者提供了一种很好的给药方式。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是由丙交酯(LA)和乙交酯(GA)两种单体在催化剂的作用下聚合而成的高分子共聚物。PLGA具有良好的生物相容性和生物降解性，在生物体内可以降解成乳酸、水和二氧化碳(Anderson JM Shive MS. Adv Drug Deliv Revl997, 28(1) :5- )，参与体内的新陈代谢，在体内不会引起任何毒性反应，可广泛应用于生物医学组织工程(Okada, H. Adv. Drug Deliver. Rev. 1997，28，43)，如药物控制释放体系、生物体吸收缝合材料、骨科固定及组织修复材料等。该材料已被美国FDA批准为药用高分子辅料使用。如iTakeda公司的亮丙瑞林微球Lupron Depot, Debiopharm公司的曲普瑞林微球 Trelstar D印ot和Novartis公司的奥曲肽微球Sandostatin D印ot等。将药物经PLGA包埋，制成缓释微球，可以提高药物的生物利用率，减少给药次数和药量，减轻患者的痛苦，最大限度减少药物对全身特别是肝、肾的毒副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种exendin-4缓释微球。本发明的目的还在于提供一种由所述exendin-4缓释微球制得的注射剂。本发明的目的还在于提供一种exendin-4缓释微球的制备方法。为了实现本发明的目的，本发明提供一种exendin-4缓释微球，包含(1)内水相，该内水相包含exendin-4 ；(2)包封所述内水相的中油相，该中油相包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；以及(3)包封所述中油相的外水相，该外水相包含聚乙烯醇(PVA)；其中所述 exendin-4、PLGA、PVA 的重量配比为(22-44) (1000-20000) (2000-30000)。优选地，PJf 述exendin-4, PLGA, PVA的重量配比为 33 (1800-17200) (2500-20000)。优选地，所述exendin-4缓释微球的粒径为40 100 μ m。优选地，所述中油相中PLGA的分子量为5000 100000，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量百分比为25 75 85 15 ；更优选地，所述PLGA的分子量为6000，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量百分比为40 60 60 40。优选地，exendin-4为通过基因重组或人工合成的方法制备的。本发明还提供一种注射剂，其是将本发明所述的exendin-4缓释微球，通过本领域所属技术人员已知的注射剂制备方法制得的。本发明还提供一种exendin-4缓释微球的制备方法，该方法包括下列步骤1)将exendin-4溶解或混悬于pH为5至7的缓冲水溶液中，制得内水相溶液；2)将PLGA溶解于有机溶剂中，制得中油相溶液；3)将PVA溶解于pH为5至7的缓冲水溶液中，制得外水相溶液；
4)制备初乳(一次乳化)将步骤1)中的内水相溶液加入到步骤2)中的中油相溶液中，进行乳化，制得初乳；5)制备复乳(二次乳化)将步骤4)制得的初乳在搅拌条件下加入到步骤3)中的外水相溶液中，进行第二次乳化，制得复乳；6)溶剂挥发使有机溶剂挥发，得到本发明硬化exendin-4缓释微球。制得的微球采用离心法收集，用注射用水洗涤微球，然后用少量水悬浮后冻干，于干燥器中保存。微球长期不用时，需放置于4°C保存。优选地，在制备内水相溶液的所述步骤1)中，还加入下列物质中的一种或多种 0. 5% 10% (g/ml)的甘氨酸、0. 10% (g/ml)的聚乙烯醇、0. 10% (g/ml)的海藻糖、0.5% 10% (g/ml)的碳酸锌、和0.001% 1.0% (g/ml)的吐温20，以增加重组 exendin-4在包封和/或释放时的稳定性。优选地，所述步骤2)中的中油相溶液中的PLGA分子量为5000 100000，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量百分比为25 75 85 15;更优选地，所述PLGA的分子量为 6000，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量百分比为40 60 60 40。优选地，所述步骤幻中的中油相溶液的有机溶剂为二氯甲烷(DCM)、或是二氯甲烷和乙酸乙酯(EA)的混合液，其中DCM和EA的体积比为60 40 100 0。优选地，其中所述步骤1)中的内水相溶液与所述步骤2、中的中油相溶液的体积比为2 10 100。优选地，所述步骤3)中制得的外水相溶液中PVA的浓度为0. 1 % 5% (g/ml)。优选地，在制备外水相溶液的所述步骤幻中，还加入一种或多种浓度为0 10% (g/ml)无机盐，以增加重组exendin-4的包封率，其中无机盐优选为NaCl。优选地，在制备初乳的步骤4)中，乳化方法为采用间歇式超声(135W，40KHz)法进行乳化，超声的总时间为1 4分钟；或是采用搅拌方式乳化。优选地，在制备复乳的步骤5)中，乳化方法为高速搅拌，搅拌速度为1000 4000rpm，乳化时间为1 5分钟。优选地，在溶剂挥发的步骤6)中，使有机溶剂挥发采用的方法为搅拌法，其中搅拌速度为400-600rpm，温度为室温，溶剂挥发时间为3 4小时。本发明Exendin-4缓释微球的制备方法如图1所示。本发明所制备微球表面光滑，外观均勻，颗粒规则无粘连，平均粒径在40 100 μ m，载药量、包封率高，缓释期在30天左右，可生物降解，生物相容性好，可用于皮下、 肌肉等非静脉形式给药。Exendin-4给药的标准剂量范围为每人每天10-20 μ g(微克)。因此，使用本发明所述的Exendin-4缓释微球治疗2型糖尿病时，可每周给药一次或每两周给药一次，优选给药量为每人每周一次1-140 μ g exendin-4，更优选为每人每周一次10-100 μ g exendin-4。
图1. Exendin-4缓释微球的制备方法流程图。图2. Exendin-4缓释微球体外释放度累积释放曲线图。图3.载有exendin-4的PLGA微球的扫描电镜照片。
图4.各试验组给药后db/db小鼠血糖的变化情况。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
的描述并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例中Exendin-4为自制生产，其制备工艺参见中国专利200410052039. 4 ；其余试剂均为商购PLGA,购于济南岱罡生物科技有限公司，批号20080625，分子量6000 ；PVA，购于国药集团化学试剂有限公司，批号T20071227，分子量1750 ；NaCl，购于广州市金华大化学试剂有限公司，批号20080701 ；甘氨酸，购于上海源聚生物科技有限公司，批号200407 ；二氯甲烷，购于广东省化学试剂工程技术研究开发中心，批号20061107。实施例中涉及粒径、包封率、载药量的测定，参考文献“唐佩福，等，重组人骨形态发生蛋白2缓释微球的制备与评价，中国组织工程研究与临床康复，2008，12(6) 1001-1004”中的测定方法。实施例1 将0. Iml浓度为8. 25mg/ml的exendin-4溶液(0. 02M磷酸盐缓冲液，PH6. 5)加到 4. 3ml浓度为100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液中，将上述混合液在冰浴条件下超声(135W， 40KHz)乳化2分钟，得到ff/Ο乳液。将该乳状液滴加到IOOml #0.5% (g/ml)PVA的0. 02M 磷酸盐缓冲液(PH6.…中，以2000rpm的转速搅拌3分钟制得W/0/W乳状液，然后将转速调节至600rpm，室温下搅拌3-4h，除去有机溶剂，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，冷冻干燥，低温保存。所得微球平均粒径为56 μ m,包封率为87.5%，载药量为0. 67 % (g/g)。实施例2 将0. 2ml浓度为8. 25mg/ml的exendin-4溶液(0. 02M磷酸盐缓冲液，PH6. 5)加到 4. 2ml浓度为100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液中，将上述混合液在冰浴条件下超声(135W， 40KHz)乳化2分钟，得到ff/Ο乳液。将该乳状液滴加到IOOml #0.5% (g/ml)PVA和5% (g/ml)NaCl的0. 02M磷酸盐缓冲液(ρΗ6· 5)中，以2000rpm的转速搅拌3分钟制得W/0/ W乳状液，然后将转速调节至600rpm，室温下搅拌3_4h，除去有机溶剂，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，冷冻干燥，低温保存。所得微球平均粒径为58. 4 μ m，包封率为85. 4%，载药量为0. 63% (g/g)。实施例3 将0. 4ml 浓度为 8. 25mg/ml 的 exendin-4 溶液(含 3 % (g/ml)甘氨酸的 0. 02M 磷酸盐缓冲液，PH6. 5)加到4. Oml浓度为lOOmg/mlPLGA的二氯甲烷溶液中，将上述混合液在冰浴条件下超声(135W，40KHz)乳化2分钟，得到W/0乳液。将该乳状液滴加到IOOml含 0. 5% (g/ml)PVA的0. 02M磷酸盐缓冲液(PH6. 5)中，以2000rpm的转速搅拌3分钟制得W/ Ο/ff乳状液，然后将转速调节至600rpm，室温下搅拌3_4h，除去有机溶剂，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，冷冻干燥，低温保存。
所得微球平均粒径为72 μ m,包封率为78. 1 %，载药量为0. 59 % (g/g)。实施例4 将0. 8ml 浓度为 8. 25mg/ml 的 exendin-4 溶液(含 3 % (g/ml)甘氨酸的 0. 02M 磷酸盐缓冲液，PH6. 5)加到3. 6ml浓度为lOOmg/mlPLGA的二氯甲烷溶液中，将上述混合液在冰浴条件下超声(135W，40KHz)乳化2分钟，得到W/0乳液。将该乳状液滴加到IOOml含 0. 5% (g/ml)PVA 和 5% (g/ml)NaCl 的 0. 02M 磷酸盐缓冲液(pH6. 5)中，以 2000rpm 的转速搅拌3分钟制得W/0/W乳状液，然后将转速调节至600rpm，室温下搅拌3_4h，除去有机溶剂，微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，冷冻干燥，低温保存。所得微球平均粒径为80. 3 μ m,包封率为72.9%，载药量为0. 52 % (g/g)。以上实施例1-4的试验结果表明，本发明的exendin-4缓释微球随着PLGA含量的增加，微球的平均粒径降低，同时，包封率和载药量提高。实施例5 分别精密称取实施例1-4制备的微球50mg，置于容积为5ml聚丙烯管中，并加入释放介质(PH7.4的磷酸盐缓冲液)2ml。将聚丙烯管置于恒温水浴震荡器中，在37°C和75rpm 的条件下恒温震荡，于0、1、2、3、5、7、10、14、18、21、25、28、35天取样取样时将聚丙烯管取出，5000rpm离心10分钟，取上清液Iml作为供试液。取样后，弃去聚丙烯管中剩余的上清液，再添加空白释放介质(PH7. 4的磷酸盐缓冲液)2ml，然后将聚丙烯管放入恒温水浴振荡器继续震荡。用HPLC分别测定各时间点供试液中exendin-4的浓度，计算exendin-4累积释放度。试验结果见表1和图2。 表lExendin-4缓释微球体外释放度试验结果
时间(天)累计释放百分数(％) X±SD(n=3)实施例1实施例2实施例3实施例4111.512.017.719.2223.823.924.625.5326.926.729.727.2427.228.132.831.6531.132.539.240.5734.838.345.645.01059.2554.860.562.81468.0564.570.773.31877.9774.681.182.22285.1284.789.391.92889.9891.594.895.2 以上试验结果表明，本发明的exendin-4缓释微球可以有效延缓exendin-4的释放速度，在第观天累计释放达到90%，具有长效缓释的效果；且随着微球粒径的减小、包封率的提高，释放速度减慢。
实施例6 将实施例3制备的exendin-4缓释微球放在贴有双面胶的金属小柱上，喷金制成扫描电镜标本，在扫描电镜下观察其外形，见图3(标尺为100 μ m)。扫描电镜结果显示本发明的exendin-4缓释微球表面光滑，外观均勻，颗粒规则无粘连。实施例7 :Exendin-4缓释微球的药效学实验实验药品实施例3制备的exendin-4缓释微球，使用注射用水溶解。实验动物6周龄的db/db小鼠，共30只。实验分组将30只小鼠随机分为5组，即Exendin-4对照组(exendin-4给药量0. 2 μ g/kg，每天给药一次，简称对照组)；PLGA微球组(无exendin-4，每周给药一次，简称微球组)；Exendin-4微球大剂量组(exendin-4给药量4 μ g/kg,每两周给药一次，简称大剂量组)；Exendin-4微球中剂量组(exendin-4给药量2 μ g/kg,每两周给药一次，简称中剂量组)；Exendin-4微球小剂量组(exendin-4给药量1 μ g/kg,每两周给药一次，简称小剂
量组)。实验方法将实验动物在温度25°C、相对湿度60%、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周，然后皮下注射给药，每次给药前禁食4小时。给药后于0h、8h、ld、3d、5d、7d、10d、 13d、16d、20d、25d、30d取小鼠尾静脉血进行快速血糖测定(所用血糖仪及血糖试纸均为强生公司生产)。实验结果结果见图4，其中exendin-4微球组均可明显降低血糖；与对照组相比， exendin-4微球组降低血糖稍迟，但8小时左右即可达到显著降低血糖的作用，之后血糖一直维持在正常水平，三个剂量组之间没有显著差异；微球组的动物血糖没有明显变化。
权利要求
1.一种exendin-4缓释微球，包含(1)内水相，该内水相包含exendin-4；(2)包封所述内水相的中油相，该中油相包含分子量为5000 100000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；以及(3)包封所述中油相的外水相，该外水相包含聚乙烯醇(PVA)；其中所述exendin-4、PLGA、PVA 的重量配比为 02-44) (1000-20000) (2000-30000 )；并且所述exendin-4缓释微球的粒径为40 100 μ m。
2.根据权利要求1所述的exendin-4缓释微球，其中所述exendin-4、PLGA,PVA的重量配比为 33 (1800-17200) (2500-20000)。
3.根据权利要求1所述的exendin-4缓释微球，其中所述中油相中PLGA的分子量为 6000。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的exendin-4缓释微球，其中所述exendin-4为通过基因重组或人工合成的方法制备的。
5.一种由权利要求1至4中任一项所述的exendin-4缓释微球制得的注射剂。
6.一种权利要求1至4中任一项所述的exendin-4缓释微球的制备方法，该方法包括下列步骤1)将exendin-4溶解或混悬于pH为5至7的缓冲水溶液中，制得内水相溶液；2)将PLGA溶解于有机溶剂中，制得中油相溶液；3)将PVA溶解于pH为5至7的缓冲水溶液中，制得外水相溶液；4)将步骤1)中的内水相溶液加入到步骤幻中的中油相溶液中，进行乳化，制得初乳；5)将步骤4)制得的初乳在搅拌条件下加入到步骤幻中的外水相溶液中，进行第二次乳化，制得复乳；6)使有机溶剂挥发，制得硬化exendin-4缓释微球。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述步骤幻中的有机溶剂为二氯甲烷、或是二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述步骤4)中的乳化方法为间歇式超声法，超声频率40KHz，超声总时间为1 4分钟。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述步骤幻中的乳化方法为高速搅拌法，搅拌速度为1000 4000rpm，乳化时间为1 5分钟。
全文摘要
本发明涉及一种含exendin-4的缓释微球，该缓释微球经乳化交联技术而得到，为W/O/W的结构，其中内水相包含主药exendin-4，中油相包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，外水相包含聚乙烯醇(PVA)。所获得的微球表面光滑，粒径在40～100μm之间；微球载药量在0.4-0.8％之间。本发明还涉及由该缓释微球制得的注射剂。本发明还涉及该缓释微球的制备方法。该缓释微球具有载药量高，包封率高，释放速率稳定，持续释放时间长(4周以上)以及可生物降解等优点，这样可以明显减少给药次数，避免用药前后的手术植入和取出，从而利于临床应用，大大提高了患者的依从性，从而达到长效抗糖尿病的治疗作用。
文档编号A61K38/17GK102370624SQ20101025753
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者付四海, 何凯, 叶学君, 张仁怀, 杨立明, 汪猜, 王为, 阳勇, 韩为跃 申请人:东莞太力生物工程有限公司